EA031578B1 - Способ получения напитка на основе ячменя - Google Patents

Abstract

Напитки на основе ячменя получают в больших количествах, применяя высокоэнергоемкие способы, например, на солодовых и пивоваренных заводах для процессов печной сушки и варки сусла соответственно. Настоящее изобретение относится к энергосберегающим способам получения напитков на основе ячменя, а также к растениям ячменя, пригодным в таких способах. В частности, изобретение относится к растениям ячменя с комбинированными признаками отсутствия липоксигеназы-1 (без LOX-1), отсутствия липоксигеназы-2 (без LOX-2) и отсутствия S-аденозилметионин:метионин-3-метилтрансферазы в одном растении, которое особенно пригодно для энергосберегающих способов получения напитков на основе ячменя, таких как пиво.

Description

Изобретение относится к напитку на основе зерен. Например, злаки можно выбирать из группы, состоящей из ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы, риса, сорго, просо, тритикале, гречихи, фонио и киноа. Более предпочтительно зерновое растение выбрано из группы, состоящей из ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы и риса, более предпочтительно зерновое растение представляет собой ячмень.

Таким образом, предпочтительно изобретение относится к напиткам на основе ячменя и растениям ячменя, пригодным для получения напитков по изобретению.

Ячмень представляет собой семейство растений. Прародителем современных культивируемых форм ячменя считается дикий ячмень, Hordeum vulgare подвида spontaneum. Полагают, что переход ячменя из дикого в культивируемое состояние соответствует коренному изменению частот аллелей в многих локусах. Редкие аллели и новые события мутаций положительно отбирали земледельцы, которые быстро определяли новые признаки в популяциях одомашненных растений, обозначаемых местные сорта ячменя. Они являются генетически более близкородственными к современным сортам, чем дикий ячмень. До конца 19 столетия местные сорта ячменя существовали в виде высокогетерогенных смесей инбредных линий и гибридных сегрегатов, включая несколько растений, происходящих вследствие случайных скрещиваний в более ранних поколениях. Большинство местных сортов в передовых сельских хозяйствах заменены на сорта чистых линий. Оставшиеся местные сорта характеризуются промежуточными и высокими уровнями генетического разнообразия. Исходно сорта современного ячменя представляли собой результат отбора из местных сортов. Затем их получали на основе последовательных циклов скрещиваний из полученных чистых линий, таких как линии из различных географических источников. В конечном счете результатом явилось заметное сужение генетической основы во многих, вероятно во всех передовых сельских хозяйствах. По сравнению с местными сортами современные сорта ячменя обладают многими улучшенными свойствами (Nevo, 1992; von Bothmer et al., 1992), например, в качестве неограничивающих примеров, одним или несколькими из следующего: (i) покрытые и голые зерна; (ii) покой семян; (iii) устойчивость к заболеваниям; (iv) устойчивость к факторам окружающей среды (например, к засухе или рН почвы) ; (v) доля лизина и других аминокислот; (vi) содержание белка; (vii) содержание азота; (viii) состав углеводов; (ix) содержание и состав хордеинов; (х) состав (1-3,1-4)-βглюканов и арабиноксиланов; (xi) урожайность; (xii) жесткость соломы и (xiii) высота растения.

В настоящем изобретении термин растение ячменя включает любое растение ячменя, такое как местные сорта ячменя или современные сорта ячменя. Таким образом, изобретение относится к любому растению ячменя, несущему первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-2, и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ. Пример такого растения ячменя описан в примерах ниже в настоящем документе и обозначен как тройной нуль-мутант или ячмень с тройной нульмутацией.

Однако предпочтительные растения ячменя для применения в настоящем изобретении представляют собой современные сорта ячменя или чистые линии. Например, сорт ячменя для применения в настоящем изобретение можно выбирать из группы, состоящей из Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Beka, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin-choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett, Rosalina и Jersey, предпочтительно из группы, состоящей из Haruna Nijo, Sebastian, Quench, Celeste, Lux, Prestige, Saloon, Neruda и Power, предпочтительно из группы, состоящей из

- 25 031578

Harrington, Klages, Manley, Schooner, Stirling, Clipper, Franklin, Alexis, Blenheim, Ariel, Lenka, Maresi, Steffi, Gimpel, Cheri, Krona, Camargue, Chariot, Derkado, Prisma, Union, Века, Kym, Asahi 5, KOU A, Swan Hals, Kanto Nakate Gold, Hakata No. 2, Kirin-choku No. 1, Kanto late Variety Gold, Fuji Nijo, New Golden, Satukio Nijo, Seijo No. 17, Akagi Nijo, Azuma Golden, Amagi Nijpo, Nishino Gold, Misato golden, Haruna Nijo, Scarlett и Jersey, предпочтительно из группы, состоящей из Haruna Nijo, Sebastian, Tangent, Lux, Prestige, Saloon, Neruda, Power, Quench, NFC Tipple, Barke, Class и Vintage.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения растение ячменя представляет собой современный сорт ячменя (предпочтительно сорт, выбранный из группы сортов ячменя, перечисленных выше в настоящем документе), несущих первую мутацию, приводящую к полной потере функциональности LOX-1, и вторую мутацию, приводящую к полной потере функциональной активности LOX-2, и третью мутацию, приводящую к полной потере функциональности ММТ. Таким образом, в этом варианте осуществления предпочтительно, чтобы растение ячменя не являлось местным сортом ячменя.

Растение ячменя может находиться в любой подходящей форме. Например, растение ячменя по изобретению может представлять собой жизнеспособное растение ячменя, высушенное растение, гомогенизированное растение или молотое зерно ячменя. Растение может представлять собой зрелое растение, зародыш, проросшее зерно, осоложенное зерно, молотое осоложенное зерно, молотое зерно или т. п.

Части растений ячменя могут представлять собой любую подходящую часть растения, такую как зерна, зародыши, листья, стебли, корни, цветы или их части. Например, часть может представлять собой часть зерна, зародыша, листа, стебля, корня или цветка. Части растений ячменя также могут представлять собой фракцию гомогената или фракцию молотого растения ячменя или зерна.

В одном из вариантов осуществления изобретения части растений ячменя могут представлять собой клетки указанного растения ячменя, такие как жизнеспособные клетки, которые можно выращивать в тканевых культурах in vitro. Однако в других вариантах осуществления части растений ячменя могут представлять собой жизнеспособные клетки, которые не способны к созреванию в целое растение ячменя, т. е. клетки, которые не являются репродуктивным материалом.

Потеря функциональности LOX.

Настоящее изобретение относится к растениям ячменя, или их частям, или их растительным продуктам, несущим первую мутацию, вторую мутацию и третью мутацию, где первая мутация приводит к полной потере функциональности LOX-1, а вторая мутация приводит к полной потере функциональности LOX-2. Третья мутация приводит к полной потере функциональности ММТ, как более подробно описано в разделе Потеря функциональности ММТ ниже в настоящем документе.

Полная потеря функциональности LOX-1 и полная потеря функциональности LOX-2 могут независимо основываться на различных механизмах. Например, полная потеря функциональности одной или обеих видов активности LOX-1 и LOX-2 может вызываться нефункционирующими белками в растении ячменя, т.е. нефункционирующим белком LOX-1 и/или белком LOX-2, таким как мутантный белок LOX1 с отсутствием детектируемой активности формирования 9-HPODE (где 9-HPODE предпочтительно можно определять, как описано в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355), и/или мутантный белок LOX-2 с отсутствием детектируемой активности формирования 13-HPODE (где 13-HPODE предпочтительно можно определять, как описано в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355).

Полная потеря функциональности LOX-1 и/или LOX-2 может вызываться отсутствием белка LOX-1 и/или белка LOX-2. Очевидно, что отсутствие белка LOX-1 приводит к потере функциональности LOX1, и что отсутствие белка LOX-2 приводит к полной потере функциональности LOX-2. Таким образом, растение ячменя предпочтительно может не содержать или содержать очень мало, более предпочтительно недетектируемые количества белка LOX-1 и/или белка LOX-2. Белок LOX-1 и/или белок LOX-2 можно детектировать любыми подходящими способами, известными специалисту в данной области. Однако предпочтительно белок(ки) детектируют способами, где белок LOX-1 детектируют специфическими антителами к LOX-1 и LOX-2, такими как поликлональные антитела к LOX-1 и LOX-2. Например, указанные способы могут представлять собой вестерн-блоттинг или ELISA. Указанные антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Однако предпочтительно указанные антитела являются поликлональными, распознающими несколько различных эпитопов на белке LOX-1 и белке LOX-2 соответственно. Белок LOX-1 и/или белок LOX-2 также можно детектировать опосредованно, например, способами определения активности LOX-1 или способами определения активности LOX-2. В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения белок LOX-1 детектируют способами, описанными в примере 4 международной патентной заявки WO 2005/087934. Белок LOX-2 можно детектировать сходным образом, используя антитела, связывающиеся с LOX-2 ячменя.

Полная потеря функциональности одной или обоих видов активности LOX-1 и LOX-2 также может представлять собой результат отсутствия или очень небольшой, предпочтительно отсутствия экспрессии транскрипта LOX-1 и/или транскрипта LOX-2. Специалист понимает, что отсутствие транскрипта LOX-1 и/или транскрипта LOX-2 также приводит к отсутствию транслируемого белка LOX-1 и/или белка LOX-2 соответственно. Альтернативно, полная потеря функциональности LOX-1 и функциональности LOX-2

- 26 031578 также может представлять собой результат экспрессии аберрантного транскрипта LOX-1 и/или аберрантного транскрипта LOX-2. Аберрантные транскрипт LOX-1 и/или транскрипт LOX-2 могут вызывать аберрантный сплайсинг транскрипта, например, вследствие мутации в участке сплайсинга. Таким образом, растения ячменя по изобретению могут нести мутацию в участке сплайсинга, таком как 5'-участок сплайсинга или 3'-участок сплайсинга, например, в одном или двух наиболее 5'-концевых нуклеотидов интрона или в одном из большинства 3'-нуклеотидов интрона. Пример мутанта с аберрантным сплайсингом транскрипта LOX-1 описан как мутант А618 в WO 2005/087934. Экспрессию транскриптов, кодирующих LOX-1 или LOX-2, можно детектировать, например, посредством нозерн-блоттинга или экспериментов ОТ-ПЦР.

Мутации вызывают полную потерю функциональности ферментов LOX-1 и LOX-2 растений ячменя по настоящему изобретению. Таким образом, растения ячменя по настоящему изобретению в основном несут мутацию в гене LOX-1. Указанная мутация может находиться в регуляторных областях, например в промоторе или в интронах, или указанная мутация может находиться в кодирующей области. Мутация также может представлять собой делецию гена LOX-1 или его части, например делецию всей кодирующей области. Подобным образом растения ячменя по настоящему изобретению в основном несут мутацию в гене LOX-2. Указанная мутация может находиться в регуляторных областях, например в промоторе или интронах, или указанная мутация может находиться в кодирующей области. Мутация также может представлять собой делецию гена LOX-2 или его части, например делецию всей кодирующей области. Таким образом, причину полной потери функциональности ферментов LOX-1 и/или LOX-2 также можно детектировать посредством идентификации мутаций в гене, кодирующем LOX-1, или в гене, кодирующем LOX-2. Мутации в генах, кодирующих LOX-1 и LOX-2, можно детектировать, например, посредством секвенирования указанных генов.

Предпочтительно после идентификации мутации полную потерю функциональности подтверждают посредством тестирования активности LOX-1 и/или LOX-2.

Термин белок LOX-1 предназначен для обозначения полноразмерного белка LOX-1 ячменя, как приведено в SEQ ID NO:3 (соответствующей SEQ ID NO:3 WO 2005/087934) или в SEQ ID NO:7 WO 2005/087934, или его функционального гомолога. Активный центр LOX-1 расположен в С-концевой части фермента. В частности, полагают, что для активности LOX-1 существенна область, захватывающая аминокислотные остатки 520-862 или ее часть (предпочтительно вся область из положений аминокислот 520-862). Таким образом, в одном из вариантов осуществления ячмень без LOX-1 предпочтительно содержит ген, кодирующий мутантную форму LOX-1, в которой отсутствуют некоторые или все аминокислоты 520-862 LOX-1. В указанном мутантном LOX-1 также могут отсутствовать другие аминокислотные остатки, которые присутствуют в LOX-1 дикого типа.

Таким образом, ячмень без двух LOX по изобретению может содержать укороченную форму LOX1, которая является нефункциональной, например укороченную на N- или С-конце форму. Предпочтительно указанная укороченная форма содержит не более 800, более предпочтительно не более 750, даже более предпочтительно не более 700, еще более предпочтительно не более 690, даже более предпочтительно не более 680, еще более предпочтительно не более 670 последовательных аминокислот LOX-1, например не более 665, например не более 650, например не более 600, например не более 550, например не более 500, например не более 450, например не более 425, например не более 399 последовательных аминокислот LOX-1 SEQ ID NO:3 (соответствующей SEQ ID NO:3 WO 2005/087934). Предпочтительно указанная укороченная форма содержит только N-концевой фрагмент LOX-1, предпочтительно максимально 800, более предпочтительно максимально 750, даже более предпочтительно максимально 700, еще более предпочтительно максимально 690, даже более предпочтительно максимально 680, еще более предпочтительно максимально 670, даже более предпочтительно максимально 665 N-концевых аминокислот SEQ ID NO:3 (соответствующей SEQ ID NO:3 WO 2005/087934), например не более 665, например не более 650, например не более 600, например максимально 550, например максимально 500, например максимально 450, например максимально 425, например максимально 399 N-концевых аминокислот SEQ ID NO:3 (соответствующей SEQ ID NO:3 WO 2005/087934). В дополнение к фрагменту LOX1 указанная укороченная форма необязательно может содержать дополнительные С-концевые последовательности, не представленные в LOX-1 дикого типа. В частности, это может представлять собой случай, когда укороченная форма образуется вследствие аберрантного сплайсинга. Предпочтительно указанные дополнительные С-концевые последовательности состоят максимально из 50, более предпочтительно максимально из 30, даже более предпочтительно максимально из 10, еще более предпочтительно максимально из 4 или максимально из 1 аминокислоты.

В одном очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма может состоять из аминокислот 1-665 SEQ ID NO:3 (соответствующей SEQ ID NO:3 WO 2005/0874).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя содержит ген, кодирующий LOX-1, который транскрибируется в мРНК, содержащую нонсенс-кодон или стоп-кодон выше стоп-кодона мРНК LOX-1 дикого типа. Такой нонсенс-кодон в настоящем документе обозначают как преждевременный нонсенс-кодон. Предпочтительно все кодирующие LOX-1 гены, транскрибируемые в мРНК указанного растения, содержат преждевременный нонсенс-кодон или стоп-кодон. Нонсенс-кодон

- 27 031578 или стоп-кодон предпочтительно расположены максимально на 800, более предпочтительно максимально на 750, даже более предпочтительно максимально на 700, еще более предпочтительно максимально на 690, даже более предпочтительно максимально на 680, еще более предпочтительно максимально на 670, даже более предпочтительно максимально на 665 кодонов ниже стартового кодона. Последовательность геномной ДНК дикого типа, кодирующая LOX-1, приведена в SEQ ID NO:1 (соответствующей SEQ ID NO:1 WO 2005/087934) или SEQ ID NO:5 WO 2005/087934.

В одном предпочтительном варианте осуществления растение ячменя по изобретению содержит ген, кодирующий LOX-1, где соответствующая пре-мРНК, транскрибируемая с указанного гена, содержит последовательность, соответствующую SEQ ID NO:2 WO 2005/087934.

В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения ген, кодирующий мутантный LOX-1 растения ячменя без двух LOX по изобретению, несет нонсенс-мутацию, где указанная мутация соответствует замене G^A в положении 3574 SEQ ID NO:1 WO 2005/087934.

Термин белок LOX-2 предназначен для обозначения полноразмерного белка LOX-2 ячменя, как приведено в SEQ ID NO:7 (соответствующей SEQ ID NO:5 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355) или его функционального гомолога. Активный центр LOX-2 расположен в С-концевой части LOX-2. В частности, полагают, что для активности LOX-2 существенна область, захватывающая аминокислотные остатки 515-717 или ее часть. На основе исследования кристаллической структуры LOX-1 сои, предполагаемые участки последовательности щели активного центра фермента LOX-2 ячменя представлены аминокислотными остатками 515-525 и 707-717. Транслируемый мутантный белок LOX-2, т.е. укороченная на С-конце форма LOX-2 мутанта ячменя без двух LOX, А689, содержит максимально 684 остатков, и таким образом, в ней отсутствует второй участок последовательности щели активного центра, что делает ее неактивной. По одному из вариантов осуществления изобретения ячмень без двух LOX по изобретению предпочтительно содержит ген, кодирующий мутантную форму LOX-2, в которой отсутствуют некоторые или все аминокислоты 515-717 LOX-2, предпочтительно отсутствуют некоторые или все аминокислоты 707-717, даже более предпочтительно отсутствуют все аминокислоты 707-717. У указанного LOX-2 также могут отсутствовать другие аминокислотные остатки, представленные в LOX-2 дикого типа.

Таким образом, ячмень без двух LOX может содержать укороченную форму LOX-2, которая является нефункциональной, например укороченную на N-конце или на С-конце форму. Предпочтительно указанная укороченная форма содержит не более 800, более предпочтительно не более 750, даже более предпочтительно не более 725, еще более предпочтительно не более 700, даже более предпочтительно не более 690, еще более предпочтительно не более 684 последовательных аминокислот LOX-2 SEQ ID NO:7 (соответствующей SEQ ID NO:5 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355). Предпочтительно указанная укороченная форма содержит только N-концевой фрагмент LOX-2. Таким образом, предпочтительно указанная укороченная форма содержит максимально 800, более предпочтительно максимально 750, даже более предпочтительно максимально 725, еще более предпочтительно максимально 700, даже более предпочтительно максимально 690, еще более предпочтительно максимально 684 Nконцевых аминокислот SEQ ID NO:7 (соответствующей SEQ ID NO:5 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355). В дополнение к фрагменту LOX-12 указанная укороченная форма необязательно может содержать дополнительные С-концевые последовательности, не представленные в LOX-2 дикого типа. В частности, это может происходить в случае, если укороченная форма образуется вследствие аберрантного сплайсинга. Предпочтительно указанные дополнительные С-концевые последовательности состоят максимально из 50, более предпочтительно максимально из 30, даже более предпочтительно максимально из 10, еще более предпочтительно максимально из 4 или максимально из 1 аминокислоты.

В одном очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма может состоять из аминокислот 1-684 SEQ ID NO: 7 (соответствующей SEQ ID NO:5 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355).

В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя содержит ген, транскрибируемый в мРНК LOX-2, где указанная мРНК содержит нонсенс-кодон или стоп-кодон выше стопкодона мРНК LOX-2 дикого типа. Такой нонсенс-кодон в настоящем документе обозначают как преждевременный нонсенс-кодон. Предпочтительно все гены, транскрибируемые в мРНК, кодирующую LOX-2 указанного растения, содержат преждевременные нонсенс-кодон или стоп-кодон. Нонсенс-кодон или стоп-кодон предпочтительно расположены максимально на 800, более предпочтительно максимально на 750, даже более предпочтительно максимально на 725, еще более предпочтительно максимально на 700, даже более предпочтительно максимально на 690, еще более предпочтительно максимально на 684 кодонов ниже стартового кодона. Последовательность дикого типа геномной ДНК, кодирующей LOX-2, приведена в SEQ ID NO:5 (соответствующей SEQ ID NO:1 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355).

В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения ген, кодирующий мутантный LOX-2 растения ячменя без двух LOX, содержит нонсенс-мутацию, где указанная мутация соответствует замене G^A в положении 2689 SEQ ID NO:5 (соответствующей SEQ ID NO:1 международной патентной

- 28 031578 заявки PCT/DK 2009/050355).

Растение ячменя по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, предпочтительно одним из способов, описанных ниже в настоящем документе в разделе Получение ячменя без двух LOX-без ММТ.

Потеря функциональности ММТ.

Настоящее изобретение относится к растениям ячменя, или их частям, или их растительным продуктам, несущим первую мутацию, вторую мутацию и третью мутацию, где первая мутация приводит к полной потере функциональности LOX-1, а вторая мутация приводит к полной потере функциональности LOX-2, обе описаны выше в настоящем документе более подробно в разделе Потеря функциональности LOX. Третья мутация приводит к полной потере функциональности ММТ.

Полная потеря функциональности ММТ может основываться на различных механизмах. Например, полная потеря функциональности ММТ может являться результатом нефункционирующего в указанном растении белка, т.е. нефункционирующего фермента ММТ, такого как мутантный белок ММТ с отсутствием детектируемой активности. Например, белок ММТ мутанта может представлять собой укороченный белок. Подобным образом потеря активности ММТ может быть основана на различных механизмах, например может быть вызвана нефункционирующим белком ММТ.

Предпочтительно активность мутантного белка ММТ определяют по его способности катализировать перенос метильной группы с SAM на Met, таким образом, формируя SMM. Это можно проводить, например, как описано в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315. Предпочтительно аминокислотную последовательность мутантной ММТ получают, определяя транслируемую последовательность соответствующей выделенной кДНК ячменя. Это можно проводить, по существу, как описано в примере 8 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315. Альтернативно мутантную ММТ растения ячменя по изобретению получают посредством гетерологической экспрессии в бактериальной клеточной культуре, как описано в примере 11 и примере 12 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, с последующим подтверждением того, что рекомбинантный белок является неактивным в качестве фермента ММТ.

Полную потерю функциональности ММТ можно обеспечить отсутствием белка ММТ. Отсутствие белка ММТ приводит к потере функции ММТ. Таким образом, растение ячменя может не содержать или содержать очень мало, предпочтительно недетектируемое количество белка ММТ. Присутствие или отсутствие белка ММТ можно детектировать любыми подходящими способами, известными специалисту в данной области. Однако белок(ки) предпочтительно анализируют способами, где белок ММТ детектируют специфическими антителами, распознающими ММТ. Указанные способы могут представлять собой, например, вестерн-блоттинг или твердофазный иммуноферментный анализ, а указанные специфические антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Однако предпочтительно указанные антитела являются поликлональными, распознающими несколько различных эпитопов на белке ММТ. Его также можно детектировать опосредованно, например, способами определения активности ММТ. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения считают, что растение ячменя несет мутацию в гене, кодирующем ММТ, таким образом вызывая полную потерю активности ММТ, когда в указанном растении белок ММТ не детектируют. В частности, это происходит в случае, когда в указанном растении, предпочтительно в зернах указанного растения ячменя, не детектируют белка ММТ с массой приблизительно 120 кДа ±10%, как анализируют посредством вестерн-блоттинга.

Полная потеря функциональности ММТ также может представлять собой результат отсутствия или очень небольшой, предпочтительно отсутствия, транскрипции мРНК ММТ. Специалисту очевидно, что отсутствие транскрипта ММТ также приводит к отсутствию белка ММТ.

Однако предпочтительно полная потеря функциональности ММТ является результатом экспрессии аберрантного транскрипта ММТ. Указанный транскрипт предпочтительно может являться результатом события аберрантного сплайсинга первичного транскрипта, например вследствие мутации в участке сплайсинга. Экспрессию транскриптов, кодирующих ММТ, можно детектировать, например, посредством нозерн-блоттинга или способами ОТ-ПЦР.

Полная потеря функциональности ММТ в растениях ячменя по настоящему изобретению вызвана одной или несколькими мутациями. Таким образом, растения ячменя по настоящему изобретению в основном несут по меньшей мере одну мутацию в гене ММТ. Указанная мутация(и) может находиться в регуляторных областях, например в промоторе или интронах, или указанная мутация(и) может находиться в кодирующей белок области. Мутация также может представлять собой делецию гена ММТ или его части, например делецию кодирующей области гена ММТ. Таким образом, потерю функциональности ММТ также можно детектировать посредством анализа мутаций в гене, кодирующем ММТ. Мутации в кодирующем ММТ гене можно детектировать, например, посредством секвенирования указанного гена, с последующим его сравнением с последовательностью дикого типа, предпочтительно с последовательностью дикого типа сорта Prestige, приведенной в SEQ ID NO:9 (соответствующей последовательности, приведенной в международной патентной заявке PCT/DK 2009/050315 как SEQ ID NO:3), или с последовательностью сорта Sebastian (SEQ ID NO:11 соответствующая SEQ ID NO:16 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315). Предпочтительно после идентификации мутации потерю функционально

- 29 031578 сти подтверждают посредством тестирования активности ММТ, например, как описано в примере 2 или примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315.

Термин белок ММТ предназначен для обозначения полноразмерного белка ММТ ячменя как приведено в SEQ ID NO: 13 (соответствующей SEQ ID NO:6 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315) или его функционального гомолога. В этом контексте функциональный гомолог представляет собой белок ММТ с тем же уровнем активности ММТ ±25%, как уровень активности белка ММТ ячменя как приведено в SEQ ID NO:13, где активность ММТ определяют, как описано в примере 2 или примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315.

Растение ячменя, несущее третью мутацию, вызывающую полную потерю активности ММТ, может содержать нефункциональную укороченную форму ММТ, например укороченную на N-конце или на Сконце форму. Растение ячменя может содержать более одной укороченной формы ММТ, например 2, или например 3, или например более 3 различных укороченных форм ММТ, что может являться результатом аберрантного сплайсинга транскриптов. Указанные укороченные формы содержат только N-концевой фрагмент ММТ. В дополнение к N-концевому фрагменту ММТ дикого типа указанные укороченные формы ММТ могут содержать дополнительные С-концевые последовательности, не присутствующие в ММТ дикого типа. Например, указанные дополнительные С-концевые последовательности могут представлять собой транслированные интронные последовательности, такие как интронные последовательности, содержащиеся в мутантной мРНК вследствие аберрантного сплайсинга. Предпочтительно указанные укороченные формы ММТ содержат максимально 500, более предпочтительно максимально 450, даже более предпочтительно максимально 400, еще более предпочтительно максимально 350, даже более предпочтительно максимально 320, еще более предпочтительно максимально 311 или максимально 288 N-концевых аминокислотных остатков SEQ ID NO:13 (соответствующей SEQ ID NO:6 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315). В частности, это происходит в случае, когда у указанного растения ячменя происходит полная потеря активности ММТ. Однако ММТ также может содержать менее, например не более 300, например не более 250, например не более 200, например максимально 150, например не более 147 или не более 133 N-концевых аминокислот SEQ ID NO:13 (соответствующей SEQ ID NO:6 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315).

В одном очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может состоять из аминокислот 1-311 или аминокислот 1-288 SEQ ID NO:13 (соответствующей SEQ ID NO:6 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315) и необязательно дополнительной С-концевой последовательности, не представленной в ММТ дикого типа. Предпочтительно указанная дополнительная Сконцевая последовательности состоит максимально из 50, более предпочтительно максимально из 30, даже более предпочтительно максимально из 10, еще более предпочтительно максимально из 4 или максимально из 1 аминокислоты. В очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может представлять собой белок в соответствии с SEQ ID NO:11 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, или SEQ ID NO:13 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, или SEQ ID NO: 15 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315. Ни один из белков SEQ ID NO:11, или SEQ ID nO:13, или SEQ ID NO:15 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315 не представляет собой функционального фермента ММТ.

В другом очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может состоять из аминокислот 1-147 или аминокислот 1-133 SEQ ID NO: 14 (соответствующей SEQ ID NO:18 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315) и необязательно дополнительной С-концевой последовательности, не представленной в ММТ дикого типа. Предпочтительно указанные дополнительные Сконцевые последовательности состоят максимально из 50, более предпочтительно максимально из 40, даже более предпочтительно максимально из 39, или максимально из 33, или максимально из 30 аминокислот. В очень предпочтительном варианте осуществления укороченная форма ММТ может представлять собой белок, соответствующий SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17 (соответствующей SEQ ID NO:22, или SEQ ID NO:24, или SEQ ID NO:26 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315 соответственно). Ни один из белков SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16 или SEQ ID NO:17 (соответствующих SEQ ID NO:22, или SEQ ID NO:24, или SEQ ID NO:26 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315 соответственно) не являются функциональными ферментами ММТ.

Указанные выше укороченные формы ММТ могут быть представлены, например, в растениях ячменя, несущих мутацию в гене ММТ, где указанная мутация вносит преждевременный стоп-кодон, образующийся в гене, кодирующем указанную выше укороченную форму ММТ.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя содержит ген ММТ, транскрибируемый в мРНК, которая содержит часть, но не весь ген ММТ дикого типа, сплайсируемую без прерывания (интрон-экзонная структура гена ММТ дикого типа ячменя представлена на фиг. 9 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315). Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предпочтительно, чтобы мРНК ММТ растения ячменя по изобретению содержала максимально экзоны 1, 2, 3, 4 и 5, сплайсированные вместе без прерывания, или, например, максимально экзоны 1 и 2, сплайсированные вместе без прерывания. В дополнение к указанным сплайсированным вместе экзонам мРНК ММТ растения ячменя по изобретению может содержать дополнительные

- 30 031578

3'-концевые последовательности, происходящие из интронов и/или экзонов дикого типа, где интроны разделяют последовательности экзонов. Предпочтительные примеры аберрантной мРНК ММТ растений ячменя по изобретению, как определено посредством ОТ-ПЦР и, таким образом, с длинами фрагментов в п.н., проиллюстрированы на фиг. 12 и 16 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315. Более предпочтительно аберрантные мРНК растений ячменя по изобретению являются мРНК, проиллюстрированные на фиг. 12 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, дополнительно содержащая экзоны 1 и 2 на 5'-конце, или мРНК, проиллюстрированная на фиг. 16 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, дополнительно содержащая экзон 1 на 5'-конце.

В очень предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения растение ячменя, несущее третью мутацию в гене ММТ, вызывающую полную потерю функциональности ММТ, несет мутацию в участке сплайсинга в гене ММТ, которая приводит к аберрантно сплайсированной мРНК. Более предпочтительно указанная мутация расположена в интроне гена ММТ, даже более предпочтительно в 5'-участке сплайсинга интрона, например в 5'-участке сплайсинга интрона 1 (интрон, разделяющий экзоны 1 и 2), например в 5'-участке сплайсинга интрона 2 (интрон, разделяющий экзоны 2 и 3), например в 5'-участке сплайсинга интрона 3 (интрон, разделяющий экзоны 3 и 4), например в 5'-участке сплайсинга интрона 4 (интрон, разделяющий экзоны 4 и 5), например в 5'-участке сплайсинга интрона 5 (интрон, разделяющий экзоны 5 и 6), например в 5'-участке сплайсинга интрона 6 (интрон, разделяющий экзоны 6 и 7), наиболее предпочтительно в 5'-участке сплайсинга интрона 2 или интрона 5.

Предпочтительно, чтобы указанная мутация представляла собой мутацию G^A концевого 5'основания указанных выше интронов. Таким образом, очень предпочтительной мутацией является мутация G^A концевого 5'-основания интрона 2 или мутация G^A концевого 5'-основания интрона 5.

Растение ячменя по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным специалисту в данной области, предпочтительно способом, описанным ниже в настоящем документе в разделе Получение ячменя без двух LOX-без ММТ.

Получение ячменя без двух LOX-без ММТ.

Растение ячменя по изобретению можно получать любым подходящим способом, известным специалисту в данной области. Предпочтительно растение ячменя по изобретению получают способом, включающим этапы мутагенеза растения ячменя или его частей, например зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растения ячменя, характеризующегося полной потерей функциональности LOX-1, полной потерей функциональности LOX-2 и/или полной потерей функциональности ММТ.

Растение ячменя по изобретению несет по меньшей мере 3 мутации. Таким образом, растения можно получать, получая отдельные растения ячменя, несущие только одну из мутаций, а затем скрещивая указанные растения ячменя с получением растения ячменя со всеми 3 мутациями, или посредством последовательного введения мутаций в растение ячменя, или посредством комбинации этих способов.

Таким образом, растение ячменя по изобретению можно получать посредством мутагенеза растения ячменя или его частей, например зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности LOX-1, и мутагенеза другого растения ячменя или его частей, например зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности LOX-2, и мутагенеза еще одного растения ячменя или его частей, например зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности ММТ. Затем отобранные растения ячменя можно скрещивать в несколько раундов с получением растений ячменя, несущих все три мутации.

Альтернативно растение ячменя по настоящему изобретению можно получать посредством мутагенеза растений ячменя или их частей, например зерен ячменя, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности XX. Указанные отобранные растения ячменя необязательно можно выращивать, а затем эти растения ячменя, или их части, например зерна ячменя, можно подвергать мутагенезу с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности YY. Указанные отобранные растения ячменя или их части необязательно можно выращивать, а затем:

(i) эти растения ячменя или их части, например зерна ячменя, можно подвергать мутагенезу с последующим скринингом и отбором растений ячменя, характеризующихся полной потерей функциональности ZZ; или (ii) эти растения ячменя можно скрещивать с растением ячменя, характеризующимся полной потерей функциональности ZZ.

В указанных выше скрещиваниях каждый из XX, YY и ZZ обозначает LOX-1, LOX-2 или ММТ, где XX отличается от YY, отличающегося от ZZ.

В одном предпочтительном варианте осуществления растение ячменя можно получать способом, включающим мутагенез растений ячменя или их частей, например зерен ячменя, где указанные растения ячменя уже несут мутацию, вызывающую полную потерю функциональности фермента LOX-1, с последующим скринингом и отбором растений ячменя, дополнительно несущих мутацию, вызывающую полную потерю функциональности LOX-2 (т.е. растений без LOX-1-без LOX-2 или без двух LOX). Кроме

- 31 031578 того, этот способ включает мутагенез других растений ячменя или их частей и скрининг и отбор растений ячменя с полной потерей функциональности ММТ, а затем скрещивания этих растений ячменя с растениями ячменя без LOX-1-без LOX-2.

Подходящие растения ячменя без LOX-1 описаны, например, в международной патентной заявке WO 2005/087934.

Предпочтительно, чтобы в способе скрининга в качестве исходного материала для идентификации растений ячменя, характеризуемых полной потерей функциональности LOX-2, использовались проросшие зародыши. Примечательно, что авторы настоящего изобретения на основе скрининга 21000 зрелых зародышей, который не выявил ни одного мутанта ячменя без LOX-2, выявили, что использование в качестве исходного материала для скрининга активности LOX-2 зрелых зародышей менее предпочтительно.

Задачей настоящего изобретения является предоставление способов получения растений ячменя без двух LOX-без ММТ, включающих этапы: (i) получения растения ячменя без двух LOX, (ii) получение растения ячменя без ММТ; (iii) скрещивание указанных растений ячменя без двух LOX и указанного растения ячменя без ММТ; (iv) отбор растений ячменя без двух LOX-без ММТ.

Получение указанных растений ячменя без двух LOX предпочтительно можно проводить способом, включающим этапы:

(i) предоставления растений ячменя или их частей с полной потерей функциональной активности LOX-1, например полной потерей функциональности фермента LOX-1;

(ii) мутагенеза указанного растения ячменя, и/или клеток ячменя, и/или ткани ячменя, и/или зерен ячменя, и/или зародышей ячменя из указанного растения ячменя, таким образом, получая поколение МО ячменя;

(iii) размножения указанных растений ячменя, зерен и/или зародышей, подвергнутых мутагенезу, в течение по меньшей мере 2 поколений, таким образом, получая поколение Мх растений ячменя, где х представляет собой целое число >2;

(iv) получения зародышей указанных растений ячменя Мх;

(v) проращивания указанных зародышей;

(vi) определения в указанных проросших зародышах или их частях активности LOX-1 и LOX-2;

(vii) отбора растений с полной потерей в проросших зародышах активности LOX-1 и активности LOX-2;

(viii) анализа наличия мутаций в гене LOX-1 и в гене LOX-2;

(ix) отбора растения, несущих мутацию в гене LOX-1 и гене LOX-2, т.е. растений без двух LOX; таким образом, получая растение ячменя, несущее мутации в генах LOX-1 и LOX-2, вызывающие полную потерю функциональности LOX-1 и функциональности LOX-2.

Получение указанных растений ячменя без ММТ предпочтительно можно проводить способом, включающим этапы:

(i) мутагенеза растений ячменя, и/или клеток ячменя, и/или ткани ячменя, и/или зерен ячменя, и/или зародышей ячменя, таким образом, получая поколение МО ячменя;

(ii) размножения, например посредством размножения, указанных растений, зерен и/или зародышей ячменя, подвергнутых мутагенезу, в течение >2 поколений, получая, таким образом, растения ячменя поколения Мх, где х представляет собой целое число >2;

(iii) получения образца указанных растений ячменя Мх;

(iv) определения уровня SMM в указанном образце;

(v) отбор растений, где образец содержит менее 10 млрд.д. SMM, предпочтительно менее 5 млрд.д. SMM, более предпочтительно не содержит детектируемого SMM;

(vi) секвенирование по меньшей мере части гена ММТ; и (vii) отбор растений, несущих мутации в гене ММТ.

Указанное выше растение ячменя с полной потерей активности LOX-1 может представлять, например, собой любое из растений ячменя с полной потерей активности LOX-1, описанное в WO 2005/087934, предпочтительно мутант D112 или его растения-потомки.

Этапы мутагенеза в указанных выше способах могут включать мутагенез жизнеспособного материала, выбранного из группы, состоящей из растений ячменя, клеток ячменя, ткани ячменя, зерен ячменя и зародышей ячменя, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из растений ячменя, зерен ячменя и зародышей ячменя, более предпочтительно зерен ячменя.

Мутагенез можно проводить любым подходящим способом. В одном из вариантов осуществления мутагенез проводят, инкубируя растение ячменя или его части, например зерна ячменя или отдельные клетки ячменя, с мутагенезирующим средством. Указанное средство известно специалисту в данной области, включая в качестве неограничивающих примеров азид натрия (NaN3), этилметансульфонат (EMS), азидоглицерин (AG, 3-азидо-1,2-пропандиол), метилнитрозомочевину (MNU) и малеиновый гидразид (МН).

В другом варианте осуществления мутагенез проводят посредством облучения, например посредст

- 32 031578 вом УФ, растения ячменя или его частей, таких как зерно. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения мутагенез проводят любым из способов, описанных ниже в настоящем документе в разделе Химический мутагенез. Неограничивающий пример подходящего протокола мутагенеза приведен в примере 2 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355.

Предпочтительно, чтобы мутагенез проводили таким образом, чтобы ожидаемая частота желаемых мутантов составляла по меньшей мере 0,5, например, в диапазоне от 0,5 до 5, например, в диапазоне от 0,9 до 2,3 на 10000 зерен при скрининге ячменя поколения М3. В предпочтительном варианте осуществления мутагенез проводят на зернах ячменя. Зерна, к которым применяли мутаген, обозначают как поколение МО (также см. фиг. 8).

Активность LOX можно определять в образце, состоящем из прорастающего зародыша ячменя, предпочтительно в жидком экстракте из прорастающего зародыша ячменя. Указанный образец, такой как указанный экстракт, можно получать из любой подходящей части указанного прорастающего зародыша. В основном перед получением экстракта указанного образца и определения активности LOX-2 образец ячменя необходимо гомогенизировать любым подходящим способом. В частности, предпочтительно, чтобы экстракт белка получали из прорастающего зародыша или его частей, и чтобы активность определяли LOX с использованием указанного экстракта. Гомогенизацию можно проводить, например, с использованием механических сил, например посредством встряхивания или перемешивания, например посредством встряхивания в присутствии гранул, таких как стеклянные гранулы или песок.

В предпочтительном варианте осуществления прорастающий зародыш представляет собой зародыш поколения Мх, где х представляет собой целое число >2; предпочтительно х представляет собой целое число в диапазоне от 2 до 10, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 8. В очень предпочтительном варианте осуществления активность LOX определяют в прорастающих зародышах поколения М3 или в образце, получаемом из таких зародышей. В этом варианте осуществления предпочтительно, чтобы подвергнутые мутагенезу зерна ячменя поколения МО выращивали с получением растений ячменя, которые скрещивают с получением зерен поколения M1. Процедуру повторяют до получения зерен поколения М3 (также см. фиг. 8).

Определение активности LOX можно проводить с использованием любого подходящего анализа, предпочтительно одним из способов, описанных далее в настоящем документе. В частности, предпочтительно, чтобы анализ предоставлял данные об диоксигенации линолевой кислоты до 9-HPODE и 13HPODE под действием LOX-1 и LOX-2. Таким образом в основном анализ включает этапы:

(i) предоставления белкового экстракта, получаемого из проросших зародышей ячменя или их частей;

(ii) предоставления линолевой кислоты;

(iii) инкубации указанного белкового экстракта с указанной линолевой кислотой и (iv) детекции диоксигенации линолевой кислоты до 9-HPODE и 13-HPODE.

Этап (iv) способа предпочтительно включает определение уровня 9-HPODE и 13-HPODE в указанных прорастающих зародышах, предпочтительно в белковом экстракте, получаемом из указанных прорастающих зародышей. Этап может включать прямое и опосредованное определение уровней 9-HPODE и 13-HPODE. Можно определять общий уровень всех HPODE, в случае чего предпочтительно, чтобы проводились измерения конкретных 9-HPODE и 13-HPODE для подтверждения. Например, один из способов может представлять собой способ, где белковые экстракты из прорастающих зародышей инкубируют с линолевой кислотой в качестве субстрата для образования 9-HPODE и 13-HPODE. Затем различными способами детектируют указанные HPODE. Один из способов может включать образование детектируемого соединения, такого как краситель. Например, способ может представлять собой окислительное связывание 3-диметиламинобензойной кислоты и 3-метил-2-бензотиазолинонгидразона в присутствии гемоглобина, катализируемое образуемыми HPODE с формированием индаминового красителя, который можно измерять при А595 с использованием спектрофотометра. Пример такого способа описан в примерах 1 и 2 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355. При использовании этого анализа показатели поглощения менее 0,2 единиц А595 рассматривают как показатель отсутствия активности LOX-1 и LOX-2. Однако более точным способом определения активности LOX-1 и LOX-2 представляет собой инкубацию белкового экстракта из прорастающих зародышей с линолевой кислотой с последующим определением содержания 9-HPODE и 13-HPODE. Например, содержание 9-HPODE и 13-HPODE можно определять с использованием основанного на ВЭЖХ анализа.

Диоксигенацию линолевой кислоты до 9-HPODE и 13-HPODE можно измерять прямо или опосредованно. По настоящему изобретению можно использовать любой подходящий способ детекции. В одном из вариантов осуществления изобретения детектируют гидропероксиды линолевой кислоты. 9HPODE и 13-HPODE можно детектировать прямо, например, хроматографическими способами, такими как ВЭЖХ, как описано в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355.

В настоящем изобретении описано, что для определения активности LOX большую важность имеют определенные аспекты способа экстракции белка из прорастающего зародыша. Таким образом, предпочтительно, чтобы белок экстрагировали с использованием кислотного буфера, предпочтительно буфера с рН в диапазоне от 2 до 6, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 5, даже более предпочтительно

- 33 031578 в диапазоне от 3,5 до 5, еще более предпочтительно в диапазоне от 4 до 5, даже более предпочтительно с рН 4,5. Буфер, используемый для экстракции, предпочтительно основан на органической кислоте, более предпочтительно буфер основан на молочной кислоте. Наиболее предпочтительно белковый экстракт получают с использованием буфера 100 мМ молочной кислоты, рН 4,5.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения описаны способы детекции растений без LOX-1 и без LOX-2, которые включают реакцию 9-HPODE и 13-HPODE с красителем, например 3-метил-2-бензотиазолинонгидразоном. Предпочтительно указанный краситель, например 3метил-2-бензотиазолинонгидразон, добавляют в белковый экстракт после добавления линолевой кислоты. Предпочтительно краситель добавляют по меньшей мере через 1 мин, более предпочтительно по меньшей мере через 5 мин, даже более предпочтительно по меньшей мере через 10 мин, например в диапазоне от 1 до 60 мин, например в диапазоне от 5 до 30 мин, например в диапазоне от 10 до 20 мин после контакта белкового экстракта с линолевой кислотой.

Предпочтительные способы отбора растений ячменя по изобретению подробно описаны в примере 2 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355.

Процедуру отбора можно адаптировать для процедур анализа на основе микропланшетов для титрования или для других известных воспроизводимых, высокопроизводительных форматов анализа, обеспечивающих быстрый скрининг множества образцов. Предпочтительно, чтобы на активность LOX-1 и LOX-2 анализировали по меньшей мере 5000, например, по меньшей мере 7500, например, по меньшей мере 10000, например, по меньшей мере 15000, например, по меньшей мере 20000, например, по меньшей мере 25000 подвергнутых мутагенезу растений ячменя.

Определение мутации в гене, кодирующем LOX-1, можно проводить несколькими различными способами. Например, ген LOX-1 можно полностью или частично секвенировать, и последовательность сравнивать с SEQ ID NO:1 (соответствующей SEQ ID NO:1 WO 2005/087934) или SEQ ID NO:5 WO 2005/087934. Если производится поиск конкретной мутации, можно использовать анализ SNP. Специалист может сконструировать подходящие праймеры для детекции данной конкретной мутации, такой как мутации, приводящей к преждевременному стоп-кодону в кодирующей последовательности LOX-1 (например, любого из преждевременных стоп-кодонов, описываемых выше в настоящем документе). Один из примеров того, как проводить анализ SNP, описан в примере 10 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355 с праймерами, пригодными для детекции мутации G^A в положении нуклеотида 3474 гена LOX-1.

Определение мутации в гене, кодирующем LOX-2, можно проводить несколькими различными способами. Например, ген LOX-2 можно полностью или частично секвенировать, и последовательность сравнивать с SEQ ID NO:5 (соответствующей SEQ ID NO:1 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355). Если производится поиск конкретной мутации, можно использовать анализ SNP. Специалист может сконструировать подходящие праймеры для детекции данной конкретной мутации, такой как мутации, приводящей к преждевременному стоп-кодону в кодирующей последовательности LOX-2 (например, любого из преждевременных стоп-кодонов, описываемых выше в настоящем документе). Один из примеров того, как проводить анализ SNP, описан в примере 10 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355, вместе с праймерами, подходящими для детекции мутации G^A в положении нуклеотида 2689 гена LOX-2.

Также в настоящее изобретении включено, что этапы (viii) и (ix) способа получения растения ячменя без двух LOX, как подробно описано в разделе настоящего документа выше, можно проводить до этапов (vi) и (vii), в случае чего способ включает этапы (i), (ii), (iii), (iv), (v), (viii), (ix), (vi) и (vii) в этом порядке. В частности, это может происходить в случае поиска конкретной мутации, например, в растенияхпотомках, уже идентифицированного растения ячменя без двух LOX.

Предпочтительно отбор растений ячменя с полной потерей функциональности ММТ включает получение образца из подвергнутых мутагенезу растений ячменя, предпочтительно из прорастающего подвергнутого мутагенезу растения ячменя, даже более предпочтительно из подвергаемых мутагенезу растений ячменя, которые прорастали в течение 4 суток. Предпочтительно, чтобы образец представлял собой образец из колеоптиля и/или первичного листа, предпочтительно из листа. Таким образом, образец может находиться, например, в диапазоне от 1 до 3 см ткани листа.

Образец можно экстрагировать и анализировать в соответствии с вновь разработанным многоэтапным протоколом, как описано в настоящем документе, включающим последовательное применение различных растворителей и связывающих веществ. В основном образец можно экстрагировать, например, растворителем или смесью растворителей, предпочтительно водой и/или органическими растворителями. Органический растворитель может представлять собой, например, спирт, предпочтительно метанол, или органический растворитель может представлять собой, например, алкилгалогенид, предпочтительно хлороформ. В одном предпочтительном варианте осуществления растворитель представляет собой смесь воды, метанола и хлороформа. Указанную экстракцию преимущественно можно проводить при смешивании, например, с использованием шейкера или мешалки. В смесь растворитель/образец можно добавлять твердую подложку, например гранулы, такие как стеклянные гранулы.

- 34 031578

В предпочтительном варианте осуществления указанный выше образец листа для определения активности ММТ получают из поколения зерен Мх, где х представляет собой целое число >2, предпочтительно в диапазоне от 2 до 10, более предпочтительно в диапазоне от 3 до 8. В очень предпочтительном варианте осуществления уровень SMM определяют в проросших растениях М3 или в их образцах (таких как листья). В указанном варианте осуществления предпочтительно, чтобы подвергнутые мутагенезу зерна ячменя поколения МО выращивали с получением растений ячменя, которые затем скрещивают с получением зерен поколения M1. Процедуру повторяют до получения зерен поколения М3 (см. фиг. 8).

Определение уровня SMM предпочтительно основано на новом способе, описанном ниже. Примечательно, что этот способ предусматривает высокопроизводительный скрининг, делая возможным идентифицировать растения ячменя, характеризующиеся полной потерей функциональности ММТ.

В основном способ предпочтительно включает реакцию образца или предпочтительно экстракта указанного образца, полученного, как описано выше, с соединением, способным связывать SMM. Выявлено, что для определения уровней SMM особенно пригоден реагент ОРА (Sigma, кат. № Р7914; см. фиг. 2 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315), далее в настоящем документе просто обозначаемый как ОРА. ОРА среди других реагирует с SMM с образованием молекулы, обозначаемой как SMM-OPA (см. фиг. 2 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315). Реакция предпочтительно включает инкубацию ОРА с экстрактом образца, получаемого, как описано выше. Кроме того, предпочтительно, чтобы в реакционную смесь добавляли 3-меркаптопропионовую кислоту. Смесь предпочтительно поддерживают при щелочном рН, предпочтительно в диапазоне от рН 8 до рН 11, более предпочтительно в диапазоне от рН 9 до рН 11, даже более предпочтительно в диапазоне от рН 9,5 до рН 10,5, например при рН 10. Инкубацию предпочтительно проводят при температуре в диапазоне от 0 до 10°С, предпочтительно в диапазоне от 1 до 8°С, даже более предпочтительно в диапазоне от 2 до 6°С, еще более предпочтительно в диапазоне от 3 до 5°С, например при 4°С. Время инкубации предпочтительно составляет >10 мин.

На основе наблюдения того, что SMM-OPA поглощает и испускает свет при 340 и 450 нм соответственно, его детекция возможна при использовании флуоресцентной спектроскопии. Исходный процесс детекции предпочтительно включает разделение экстракта на колонке, предпочтительно на колонке 30x2 мм Gemini 3μ С18 (Phenomenex, кат. № 00А-4439-80; Phenomenex, 2006) с последующей детекцией флуоресценции с использованием системы высокопроизводительной жидкостной хроматографии, предпочтительно сверхэффективной жидкостной хроматографии (система СЭЖХ, Waters), разработанной для идентификации и измерения уровня флуоресценции молекул с возбуждением при 340 нм и испусканием при 450 нм. При использовании этого способа отсутствие детектируемого SMM означает отсутствие детектируемых соединений, которые совместно элюируются с SMM. В этом контексте малое плечо на пике на хроматограмме считают артефактным пиком. Таким образом, малое плечо справа от пика Asn/Ser, см. фиг. 2, не считают представлением пика SMM. Таким образом, в качестве примера две верхние хроматограммы, как приведено на фиг. 2В, рассматривают, как изображающие отсутствие детектируемого SMM, тогда как нижняя хроматограмма на указанной фигуре представляет собой разделение образца, содержащего SMM.

Детекцию SMM предпочтительно можно проводить, как описано в примере 2 или примере 4. Предпочтительный способ отбора растений ячменя по изобретению описан ниже в настоящем документе в примере 2. Образец ткани для анализа предпочтительно получают из прорастающего растения ячменя, даже более предпочтительно из растения ячменя, которое прорастало в течение 4 суток. Следует отметить, что указанный выше способ скрининга является особенно пригодным. Во-первых, этот аналитический способ является новым. Кроме того, значимым преимуществом указанного выше способа является то, что он разработан для определения уровней SMM в прорастающих растениях ячменя, например в листьях прорастающих растений ячменя.

Временные характеристики получения образцов из прорастающих растений ячменя приводят к получению неожиданно чистых препаратов для детекции SMM на основе СЭЖХ. Другие образцы, например образцы сусла из сходных зерен, как описано выше, являются слишком сложными по составу и, как правило, их нельзя использовать в указанном способе хроматографии для определения уровней SMM.

После идентификации растений ячменя, содержащих менее 10 млрд.д. SMM, предпочтительно не содержащих детектируемого SMM, соответствующий ген ММТ или его часть, как правило, секвенируют для определения того, можно ли классифицировать интересующее растение ячменя как содержащее мутацию в гене ММТ. Затем отбирают растения ячменя, характеризующиеся тем, что они не содержат детектируемого SMM, и в них одно или несколько оснований кодирующего ММТ гена отличаются по сравнению с последовательностью дикого типа. В этом контексте последовательность дикого типа предпочтительно представляет собой последовательность, приведенную как SEQ ID NO:9 (соответствующую SEQ ID NO:3 в международной патентной заявке PCT/DK 2009/050315). Предпочтительные мутации описаны выше в настоящем документе.

Затем отобранные мутанты ячменя можно выращивать, и растения последующих поколений можно подвергать повторному скринингу на предмет содержания SMM. После отбора подходящих растений

- 35 031578 ячменя их можно включать в программы селекции с использованием общепринятых способов, описанных в настоящем документе ниже в разделе Селекция растений.

После идентификации растения ячменя без двух LOX-без ММТ, содержащего конкретную мутацию в гене LOX-1, конкретную мутацию в гене LOX-2 и конкретную мутацию в гене ММТ (такие как любые из указанных выше мутаций), общепринятыми способами селекции, такими как способы, хорошо известные специалистам, можно получать дополнительные растения ячменя с идентичными мутациями. Например, указанные растения ячменя без двух LOX можно подвергать возвратному скрещиванию с другим сортом ячменя.

После отбора подходящих растений ячменя с полной потерей функциональности LOX-1, LOX-2 и ММТ можно необязательно проводить один или несколько дополнительных скринингов. Например, отобранные мутанты можно дополнительно выращивать, и растения новых поколений можно тестировать на полную потерю функциональности LOX-1, LOX-2 и ММТ.

В одном из вариантов осуществления изобретения предпочтительно, чтобы растение ячменя без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению обладало физиологией роста растения и развитием зерен, сходными с ячменем дикого типа. Таким образом, предпочтительно, чтобы растение ячменя без двух LOX-1-без ММТ в отношении высоты растения, количества отростков на растение, начала цветения и/или количества зерен на колос было сходным с ячменем дикого типа (предпочтительно с сортом Power, или сортом Quench, или сортом Rosalina).

Также предпочтительно, чтобы растение ячменя без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению в отношении высота растения, срока образования колоса, устойчивости к заболеваниям, полегания, раскрытия колоса, времени созревания и урожайности было сходно с ячменем дикого типа, в частности сходно с сортом Power или сортом Quench. В настоящем контексте сходно следует понимать как такое же ±10% в случае чисел. Эти параметры можно определять, как описано в настоящем документе далее в примере 5.

В очень предпочтительном варианте осуществления изобретения растение ячменя получают скрещиванием ячменя линии А689 (АТСС Patent Deposit Designation: PTA-9640) с ячменем линии 8063 (АТСС Patent Deposit Designation: PTA-9543) и необязательно с последующим дополнительным размножением.

Семена ячменя линии А689 депонированы 4 декабря 2008 под названием Barley, Hordeum vulgare L. ; Line A689 в American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States (номер депозита PTA-9640).

Семена ячменя линии 8063 депонированы 13 октября 2008 в American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States, и обозначены как Barley, Hordeum vulgare; Line 8063 (ATcC Patent Deposit Designation: PTA-9543).

Химический мутагенез.

Для получения растений ячменя без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению получают очень большое количество мутантов ячменя, как правило, в несколько раундов, любым подходящим способом мутагенеза, например с использованием химического мутагенеза зерен ячменя. Известно, что этот способ вносит случайные мутации. Мутагенез ячменя можно проводить с использованием любого химического средства, обеспечивающего мутагенез. Однако предпочтительно проводить его, обрабатывая зерна NaN3, обеспечивая размножение выживших зерен, с последующим анализом растений-потомков. Поколение растений, вырастающее из подвергнутых мутагенезу зерен, обозначаемое как М0, содержит химерные гетерозиготы для любой данной мутации. Растения-потомки, собранные после самоопыления, обозначают как поколение M1, в котором данная мутация сегрегирует на соответствующие гетерозиготы и гомозиготы (см. фиг. 8).

Обработка зерен NaN3 не является эквивалентом обработки одной клетки, так как зерна после обработки сохраняют некоторые немутантные клетки и ряд клеток, несущих мутации ДНК. Так как мутации в линиях клеток, не приводящих к зародышевой линии, теряются, целью является доставка мутагена к тем немногим клеткам, которые развиваются в репродуктивные ткани, участвующие в развитии поколения M1.

Для оценки общей эффективности мутагенеза в поколениях М0 и M1 можно подсчитывать химерыальбиносы и растения-альбиносы. Оценка количества мутантов как функции от выживших растений дает расчет эффективности мутагенеза, тогда как оценка количества мутантов как функции от обработанных семян измеряет комбинацию эффективности мутагенеза и гибели зерен.

Примечательно, что клетки имеют механизмы гарантии качества практически на каждой стадии экспрессии гена, возможно, для ослабления действия повреждающих мутаций. Один из хорошо изученных примеров у эукариот представляет собой опосредованный нонсенс-кодонами распад мРНК, обозначенный NMD, который предотвращает синтез потенциально вредных преждевременно укороченных белков (Maquat and Carmichael, 2001; Wu et al., 2007). При NMD кодон терминации идентифицируется как преждевременный по его положению относительно расположенных ниже дестабилизирующих элементов. Мутации, которые приводят к преждевременным кодонам терминации (нонсенс-кодонам) (РТС), иногда повышают уровень транскриптов с альтернативным сплайсингом, которые пропускают повреж

- 36 031578 дающие мутации, таким образом, потенциально сохраняя функцию белка (Mendell and Dietz, 2001).

Селекция растений.

В одном из вариантов осуществления изобретения задачей является предоставление агрономически пригодных растений ячменя, несущих признак без двух LOX-без ММТ. Часто разработка сельскохозяйственных культур представляет собой длительный и сложный процесс, начинающийся с введения нового признака. Однако с точки зрения растениевода-селекционера этот этап почти всегда приводит к получению растения с менее желательным общим профилем агрономических признаков, чем современные коммерческие разновидности.

В дополнение к признаку без двух LOX-без ММТ существуют дополнительные факторы, которые также можно учитывать в области получения коммерческой разновидности ячменя, пригодной для соложения, и/или пивоварения, и/или в качестве основы для напитков, например, урожай и размер зерна и другие параметры, относящиеся к эффективности соложения или эффективности пивоварения. Так как показано, что многие, если не все, значимые признаки находятся под генетическим контролем, настоящее изобретение также относится к современным, гомозиготным, высокоурожайным осолаживаемым сортам ячменя, которые можно получать посредством скрещивания с растениями ячменя без двух LOXбез ММТ, которые описаны в настоящей публикации. Специалист-селекционер ячменя может отбирать и разрабатывать растения ячменя, которые после скрещивания с ячменем без двух LOX-без ММТ приведут к высококачественным сортам. Альтернативно селекционер ячменя может использовать растения по настоящему изобретению для дальнейшего мутагенеза с получением новых сортов, происходящих из ячменя без двух LOX-без ММТ.

Одним из способов обеспечения поддержания признака без двух LOX-без ММТ в линиях-потомках относится к анализу SNP гена LOX-1, гена LOX-2 и гена ММТ. Предпочтительно также определяют активность LOX-1, LOX-2 и ММТ.

Растения ячменя по настоящему изобретению можно вводить в любую подходящую схему селекции.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление агрономически элитных растений ячменя, несущих признак без двух LOX-без ММТ. Таким образом, изобретение также относится к способам получения нового растения ячменя без двух LOX-без ММТ посредством скрещивания первого родительского растения ячменя со вторым родительским растением ячменя, где первое или второе растение представляет собой ячмень без двух LOX-без ММТ. Кроме того, первое и второе родительские растения ячменя могут происходить из сорта ячменя без двух LOX-без ММТ. Таким образом, любые такие способы с использованием сорта ячменя без двух LOX-без ММТ являются частью настоящего изобретения: самоопыление, возвратное скрещивание, скрещивание по популяциям и т.п. Все растения, получаемые с использованием сорта ячменя без двух LOX-без ММТ в качестве родителя, входят в объем настоящего изобретения, включая растения, разработанные из сортов, получаемых из сорта ячменя без двух LOX-без ММТ. Ячмень без двух LOX-без ММТ также можно использовать для генетической трансформации в таких случаях, где в растение или ткань растения без двух LOX-без ММТ вводят экзогенную ДНК и экспрессируют.

В настоящем изобретении для введения в другой сорт, например сорт Scarlett, или сорт Jersey, или сорт Quench, или сорт Rosalina, которые являются современными, высокоурожайными осолаживаемыми сортами ячменя, признака мутантного растения ячменя без двух LOX-без ММТ, можно использовать способы возвратного скрещивания. В стандартном протоколе возвратного скрещивания исходный интересующий сорт, т.е. рекуррентное родительское растение, скрещивают со вторым сортом (нерекуррентное родительское растение), несущим интересующие мутантные гены LOX для переноса. Затем получаемые после этих скрещиваний растения-потомки без двух LOX скрещивают с рекуррентным родительским растением с повторением процесса до получения растений ячменя, где в дополнение к признаку без двух LOX-без ММТ нерекуррентного родительского растения в получаемом растении восстановлены, по существу, все характеристики, определяемые рекуррентным родителем. Затем последнее полученное подвергнутое возвратному скрещиванию растение подвергают самоопылению с получением чистого селекционного растения-потомка без двух LOX-без ММТ.

Способ ускорения процесса селекции растений включает исходное размножение получаемых мутантов посредством использования тканевой культуры и способов регенерации. Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предоставлены клетки, которые после роста и дифференцировки дают растения ячменя с признаком без двух LOX-без ММТ. Например, размножение может включать традиционное скрещивание с получением растений, происходящих из фертильных пыльников, или использование способов культивирования микроспор.

Продукты пути LOX.

В различных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к растениям ячменя и их продуктам, содержащим низкие уровни T2N и потенциала T2N. Ферменты LOX катализируют диоксигенацию полиненасыщенных жирных кислот с цис-1,цис-4-пентадиеновой системой. В ячмене основными субстратами LOX являются С1₈-полиненасыщенные жирные кислоты, линолевая кислота (18:2^Л9,12) и а

- 37 031578 линоленовая кислота (18:3^Δ9,12,15). Липоксигеназный путь метаболизма жирных кислот ингибируется добавлением молекулярного кислорода в положение С-9 (в основном катализируемым LOX-1) или положение С-13 (в основном катализируемым LOX-2) ацильной цепи с получением соответствующих 9- и 13HPODE [9- и 13-гидропероксиоктадекатриеновые кислоты (НРОТЕ) являются продуктами, когда субстратом является α-линоленовая кислота, но НРОТЕ не функционируют в качестве предшественников для T2N]. В гидропероксидлиазной ветви пути LOX, 9- и 13-HPODE могут расщепляться до короткоцепочечных оксокислот и альдегидов (см. фиг. 1А). В частности, 9-HPODE может расщепляться с формированием цис-ноненаля, который преобразуется в T2N, тогда как 13-HPODE представляет собой предшественника 2-Е-гексеналя. Таким образом, 13-HPODE, основной продукт катализируемой LOX-2 диоксигенации линолевой кислоты, не является предполагаемым предшествующим компонентом в пути, приводящем к формированию затхлого вкуса T2N.

Следует понимать, что настоящее изобретение относится к влиянию на получение последующих метаболитов катализа LOX-1 и LOX-2, которые не являются прямыми продуктами катализируемых LOX-1 или LOX-2 реакций, но являются результатом последующего каскада реакций. Они включают самопроизвольные, индуцируемые факторами или катализируемые ферментами изомеризации и преобразования. Таким образом, на образование этих последующих метаболитов можно влиять, изменяя экспрессию других компонентов пути, например гидропероксидлиазы (HPL).

T2N и DMS и их предшественники.

Настоящее изобретение относится к способам получения напитков с низкими уровнями одного или нескольких веществ с неприятным привкусом и их предшественников. Предпочтительно указанные вещества с неприятным привкусом представляют собой T2N и DMS, а их указанные предшественники представляют собой потенциалы T2N и DMSP соответственно.

Таким образом, одной из задач настоящего изобретения является снижение или устранение потенциала T2N. Таким образом, задачей настоящего изобретения является снижение образования предшественников T2N и альдегидных аддуктов. Хотя некоторые химические реакции, относящиеся к потере свежести пива, остаются невыясненными, образование свободного T2N из потенциала T2N признано основной причиной образования затхлого вкуса в пивных продуктах (Kuroda et al., выше). Таким образом, задачей настоящего изобретения является предоставление напитков с низким уровнем потенциала T2N, а также напитков с низким уровнем предшественников T2N.

Большинство потенциала T2N в готовое пиво, в котором может высвобождаться свободный T2N, переносится из сусла (Liegeois et al., 2002), причем важными в этом процессе являются условия кислотности и температуры. По настоящему изобретению потенциал T2N определяют, как описано выше в настоящем документе в определениях. Также доступны другие способы определения уровня потенциала T2N. Во избежание путаницы значение потенциал T2N в данном контексте является таким, как описано выше в настоящем документе в определениях. Химические вещества, способные высвобождать T2N или преобразовываться в T2N, в настоящем документе обозначены как предшественники T2N, и предшественники T2N, определяемые или измеряемые альтернативными способами, отличными от способа определения потенциала T2N, обозначают предшественниками T2N. В частности, предшественники T2N можно определять обработкой образца так, что, по существу, все (предпочтительно все) его химические вещества, способные высвобождать T2N или преобразовываться в T2N, фактически высвобождают T2N и/или преобразуются в T2N соответственно. После этого определяют уровень T2N.

Зерна ячменя по настоящему изобретению в дополнение к отсутствию активности ММТ не обладают активностью LOX-1 и LOX-2. Примечательно, что такие зерна ячменя содержат очень низкий потенциал T2N.

Таким образом, пиво, получаемое с использованием зерен ячменя без двух LOX-без ММТ, не только содержит очень низкий уровень T2N, но также содержит очень низкий уровень потенциала T2N. В объеме настоящего изобретения находятся зерна ячменя без двух LOX-без ММТ, позволяющие получать пивные продукты, содержащие очень низкие уровни потенциала T2N, предпочтительно менее 60%, более предпочтительно менее 50% уровня потенциала T2N сходного пивного продукта, получаемого сходным способом из ячменя дикого типа (предпочтительно сорта Power).

Также предпочтительно, чтобы растительные продукты, получаемые из зерен ячменя без двух LOXбез ММТ, обладали очень низким уровнем предшественников T2N. В объеме настоящего изобретения находятся растительные продукты, получаемые из зерен ячменя без двух LOX-без ММТ, где указанные растительные продукты содержат менее 60%, более предпочтительно менее 50% предшественников T2N относительно сходного растительного продукта, получаемого таким же способом из ячменя дикого типа (предпочтительно сорта Power).

Следует отметить, что измеряемые величины T2N часто являются более высокими в образцах или продуктах из сырья после микросоложения, чем из сырья, получаемого в большем масштабе, например из осоложенного образца опытного масштаба массой 30 кг. Однако относительные экспериментальные величины T2N в экспериментах в большом и малом масштабах в основном являются сходными.

Подобным образом, следует отметить, что измеряемые величины потенциала T2N и предшествен

- 38 031578 ников T2N часто являются более высокими в образцах или продуктах из сырья после микросоложения, чем из сырья, получаемого в большем масштабе, например из осоложенного образца опытного масштаба массой 30 кг. Однако относительные экспериментальные величины потенциала T2N в экспериментах в большом и малом масштабах в основном являются сходными.

Также целью настоящего изобретения является снижение или устранение DMS и DMSP, где DMSP предпочтительно представляет собой SMM.

Количество SMM и DMS в растительном продукте можно определять любым подходящим способом. SMM можно определять, по существу, как описано выше в настоящем документе в разделе Получение растений ячменя без двух LOX-без ММТ, где описано определение уровней SMM в образце ячменя. Таким образом, SMM можно определять, связывая его с таким соединением, как ОРА, и определяя флуоресценцию, например, с использованием системы СЭЖХ. Для количественного определения можно определять площадь на хроматограмме, соответствующую пику SMM.

Для более точного измерения количества DMS и DMSP (такого как SMM), где последнее соединение измеряют в виде DMS после активации, предпочтительно определяют с использованием капиллярной газовой хроматографии высокого разрешения. Общий DMS в образцах сусла или пива по настоящему документу определяют как количественную сумму свободного DMS и форм его предшественников, обозначаемых DMSP. С использованием этого определения количество DMSP в образце сусла или пива можно определять как различие между общим DMS (измеряемым в прокипяченном образце, предпочтительно в образце, который кипятят в щелочных условиях в течение 1 ч) и свободным DMS (измеряемым в некипяченом образце). В примере 4 подробно описаны предпочтительные способы измерения уровней общего и свободного DMS.

Количество DMSP, а также SMM по настоящему документу приведено в виде концентрации DMS, которая может высвобождаться из указанных DMSP или указанного SMM при кипячении в щелочных условиях в течение 1 ч.

Примеры

Примеры в настоящем документе иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления изобретения, и их не следует рассматривать как ограничение изобретения.

Если не указано иначе, основные молекулярно-биологические способы для манипуляций с нуклеиновыми кислотами и бактериями проводили, как описано Sambrook and Russel (2001).

Пример 1. Скрининг на низкую активность LOX-2 в прорастающих зародышах ячменя.

Материал для улучшенного скрининга.

Зерна, собранные из растений ячменя без LOX-1 линии Са211901, полученной посредством скрещивания (мутанта D112 без LOX-1xJersey) xSebastian, инкубировали с мутагеном NaN₃ в соответствии с подробным описанием, предоставленным в Kleinhofs et al. (1978). Мутант ячменя без LOX-1 D112 описан в WO 2005/087934 и депонирован в American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110, USA 11 сентября 2003 года, под номером РТА-5487.

Этот способ выбирали, так как известно, что он индуцирует в геномной ДНК ячменя точечные мутации, определяющие затем замены аминокислотных остатков или укорочения в белках, кодируемых мутантной ДНК. В экспериментах с мутагенезом в данной публикации выбирали мутантные зерна поколения M1 для размножения на полевых участках в течение двух последовательных поколений, получая затем высокую пропорцию гомозиготных растений с целью скрининга (см. фиг. 8). В то время как зерна поколения М2 скринингу не подвергали, преимущественно потому, что ожидали относительно высокого содержания гетерозиготных точечных мутаций, в качестве материала для скрининга использовали мутантные зерна поколения М3, ожидая 0,9-2,3 мутации на 10000 зерен (Kleinhofs et al., выше).

Неожиданно авторы настоящего изобретения обнаружили, что анализ прорастающих зародышей обеспечивал намного более хорошие результаты анализа по сравнению с анализом экстрактов зрелых зародышей (как описано в примере 1 международной заявки PCT/DK 2009/050355). Таким образом, способ высокопроизводительного скрининга проводили для измерения активности LOX-2 в прорастающих зародышах, включая их ткань щитка.

Из зрелых зерен 35125 колосьев ячменя выделяли по два зародыша (20977 линий поколения М4 мутанта D112 без LOX-1 и 14148 линий поколения М3 линии Са211901 без LOX-1) и переносили в 96луночные планшеты для хранения (ABgene). Проращивание зародышей начинали после добавления в каждую лунку, которую покрывали влажной тканью Kimnett и пластиковой крышкой, 20 мкл воды. Планшеты инкубировали в пластиковых пакетах при 20°С в течение 48 ч. После инкубации экстрагировали фермент LOX-2; в каждую лунку сначала добавляли стеклянную гранулу диаметром 5 мм и 200 мкл буфера для экстракции (100 мМ раствор молочной кислоты, рН 4,5) с последующим размалыванием в течение 35 с при частоте 27 с^-1 в лабораторной мельнице ММ 300 (Retsch). Затем планшет в течение 10 мин при 4°С центрифугировали при 4000 об/мин в центрифуге Allegra 6R Centrifuge (Beckman-Coulter) для осаждения нерастворимого материала. Активность LOX-2 определяли в основном, как описано для анализа активности LOX-2 экстрактов зрелых зародышей (см. пример 1 в международной заявке PCT/DK 2009/050355), с тем различием, что для одного анализа вместо 40 мкл использовали только 30 мкл экс

- 39 031578 тракта.

Идентификация потенциальных мутантов.

Как описано выше, два зерна каждой из указанных выше 35125 линий ячменя анализировали на активность LOX-2 с целью идентификации зерен с сильно сниженной указанной активностью по сравнению с зернами без LOX-1 и дикого типа. Всего в поколении МЗ линии Са211901 идентифицировали 7 потенциальных исходных мутантов. Их дополнительно размножали в оранжерее, собирали, а затем повторно подвергали скринингу на признак, связанный с очень низкой активностью LOX. В конечном счете было показано, что только один мутант линии Са211901, обозначенный мутантом А689, по существу, не демонстрировал активности LOX-2. Подробные измерения общей активности LOX проводили с использованием экстрактов проросших зародышей, в которых активность LOX обеспечивалась почти исключительно LOX-2 (Schmitt and van Mechelen, 1997). Для проросших зародышей зерен М3 мутанта А689 общая активность LOX, как определено посредством колориметрического анализа LOX, составляла 0,163±5,5% Ед А₅₉₅/проросший зародыш, тогда как общая активность LOX для материнского сорта Са211901 без LOX-1 составляла 1,224±3,8% Ед А₅₉₅/проросший зародыш (соответствующая величина для исходного мутанта D112 без LOX-1 составляла 1,215±6,0% Ед А595/проросший зародыш.

Семена ячменя линии А689 депонированы 4 декабря 2008 г. под названием Barley, Hordeum vulgare L.; Line A689 в American Type Culture Collection (ATCC), Patent Depository, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, United States (номер депозита РТА-9640).

Анализ на HPODE у мутанта А689 описан в примере 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355.

Свойства мутанта А689 описаны в примере 5 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355.

Секвенирование гена LOX-2 у мутанта ячменя А689 описано в примере 10 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355, а в табл. 7 в нем обобщены мутации в генах LOX-1 и LOX-2 мутанта А689.

Способ детекции мутанта А689 без двух LOX описан в примере 11 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050355. Способ представляет собой основанный на SNP способ детекции мутации в LOX-1 и мутации в LOX-2.

Пример 2. Скрининг мутантов ячменя без ММТ.

Зерна, собранные из растений ячменя сорта Prestige и сорта Sebastian, инкубировали раздельно с мутагеном NaN₃ с последующими экспериментальными подробностями, предоставленными Kleinhofs et al. (1978). Эту процедуру выбирали, потому что известен ее потенциал в отношении индукции точечных мутаций в геномной ДНК ячменя.

В экспериментах мутантные зерна поколения M1 выращивали на полевых участках в течение двух последующих поколений с получением в итоге высокой доли гомозиготных растений поколения М3 для цели скрининга. Мутантные зерна поколения М3, как ожидалось, содержали генные мутации с частотой 0,9-2,3 на 10000 зерен (Kleinhofs et al., выше). Следует отметить, что зерна М2 скринингу не подвергали.

Представляет интерес, что в настоящем изобретении описана процедура быстрого высокопроизводительного скрининга для детекции мутантных зерен ячменя М3 с отсутствующей активностью ММТ при условии отсутствия детектируемого синтеза SMM при соложении. Таким образом, авторами изобретения выявлено, что SMM в основном накапливается в колеоптиле и первичном листе прорастающего ячменя, и что детекцию SMM можно проводить посредством экстракции аминокислот из раздавленной ткани листа пророщенных зерен с возрастом 4 суток с последующей реакцией экстрагированных аминокислот с ОРА с образованием продуктов с высокой флуоресценцией (см. фиг. 2).

На практике каждый анализ проводили посредством проращивания в закрытом пластиковом контейнере с одним куском фильтровальной бумаги Whatman № 1 (296x20,9 мм) с использованием двух зерен от каждого из 94 потенциальных мутантов и двух растений дикого типа. Анализ повторяли для многих потенциально мутантных зерен (см. ниже). В начале проращивания в указанный пластиковый контейнер добавляли 25 мл водопроводной воды с последующим добавлением дополнительных 15 мл водопроводной воды на 2 сутки проращивания. Через 4 суток проращивания 1-3 см тканей листа переносили в планшеты для хранения (ABgene), в которых каждая из 96 лунок объемом 1,2 мл содержала стеклянную гранулу диаметром 5 мм и 500 мкл 12:5:6 (об./об./об. ) смеси вода:метанол:хлороформ. Планшет встряхивали в течение 45 с с частотой 30 Гц в лабораторной мельнице ММ 300 (Retsch). Затем планшет переносили в центрифугу (Rotanta 460R, Hettich) и центрифугировали при 4000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре для осаждения нерастворимого материала. 10 мкл супернатанта переносили в 96-луночный планшет для хранения (Waters, кат. № 186002481) и смешивали с 200 мкл Н₂О и 60 мкл реакционного раствора, содержащего смесь 15000:45 (об./об.) реагента ОРА (Sigma, кат. № Р7914):3меркаптопропионовой кислоты (Aldrich, кат. № М5801). Смесь инкубировали при 4°С в течение по меньшей мере 10 мин с получением количественной дериватизации аминокислот образца посредством ОРА. С использованием основанной на Waters системы СЭЖХ, оборудованной флуоресцентным детектором, 2 мкл дериватизированной смеси разделяли на колонке 2,1x30 мм С18 Gemini с частицами 3 мкм

- 40 031578 (Phenomenex, кат. № 00А-4439-80) с использованием градиентной элюции посредством смешивания подвижной фазы А (40 мМ буфер NaH2PO4 с рН доведенным до 7,8) и подвижной фазы В [45:45:10 (об./об./об.) раствора ацетонитрил:метанол:вода, как описано (Phenomenex, 2006)]. Возбуждение элюируемых производных ОРА осуществляли при 340 нм, тогда как испускание измеряли при 450 нм. Пример хроматограммы представлен на фиг. 2 с иллюстрацией профиля элюции аспарагиновой кислоты (Asp), глутаминовой кислоты (Glu), аспарагина (Asn), серина (Ser) и SMM. Последнее соединение включали, поскольку общая цель проекта состояла в идентификации растения ячменя с отсутствием способности синтезировать SMM, т.е. растения, для которого соответствующий пик хроматограммы был очень малым или предпочтительно отсутствовал.

Всего скринингу на содержание SMM с целью идентификации зерен с сильно сниженным указанным содержанием по сравнению с зернами дикого типа подвергали 10248 и 3858 мутантных под действием NaN₃ зерен сорта Prestige и сорта Sebastian соответственно. Идентифицировали только 2 потенциальных мутанта поколения М3, а именно зерна образца № 8063 (происходящего из сорта Prestige и обозначенного далее в настоящем документе как мутант 8063, обозначение также использовали для зерен последующих поколений) и зерна образца № 14018 (происходящий из сорта Sebastian и обозначенный далее в настоящем документе как мутант 14018, обозначение также использовали для зерен последующих поколений). Зерна каждого мутанта выращивали до поколения М4, затем собирали и затем анализировали повторно. В результате подтверждали, что зерна мутанта 8063 и мутанта 14018 имели исключительно низкое содержание SMM, возможно, вообще не содержали SMM.

Анализ вестерн-блоттинга подтвердил, что у мутанта 8063 и мутанта 14018 отсутствовал фермент ММТ (см. пример 3 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315).

Также измерения активности ММТ подтвердили, что у мутанта 8063 отсутствует активность ММТ (см. пример 4 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315).

Секвенирование гена ММТ у мутанта ячменя 8063, как описано в примере 9 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, выявило транзицию оснований G^A в первом основании интрона 5 (положение нуклеотида 3076 SEQ ID NO:10, соответствующей SEQ ID NO:8 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315). Секвенирование гена ММТ в мутанте ячменя 14018, как описано в примере 14 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, выявило транзицию оснований G^A в донорном участке сплайсинга, непосредственно ниже экзона 2 в первом основании интрона 2, более конкретно в положении нуклеотида 1462.

Кроме того, подтверждено, что мРНК ММТ у мутанта 8063 является укороченной (см. пример 11 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315), и что мутантный белок ММТ, кодируемый указанной укороченной мРНК не обладает активностью ММТ (см. пример 12 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315). Также подтверждено, что мРНК ММТ у мутанта 14018 является укороченной (см. пример 15 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315), и что мутантный белок ММТ, кодируемый указанной укороченной мРНК, не обладает активностью ММТ (см. пример 16 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315).

Способ детекции наличия мутации в гене ММТ мутанта 8063 описан в примере 11 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315, а способ детекции наличия мутации в гене ММТ мутанта 14018 описан в примере 17 международной патентной заявки PCT/DK 2009/050315.

Пример 3. Скрещивания ячменя.

На фиг. 3 обобщены способы получения ячменя линии без двух LOX-без ММТ по настоящему изобретению посредством первого скрещивания ячменя линии А689 [без двух LOX см. патентную заявка РСТ № PCT/DK 2009/050355] с линией 8063 [без ММТ см. патентную заявка РСТ № PCT/DK 2009/050315]. С использованием стандартных способов селекции получали двойные гаплоидные линии и выращивали в теплицах. Из них для дальнейшего размножения и анализа выбирали наиболее эффективные линии относительно агрономической продуктивности, а также отсутствия активности LOX-1 (см. пример 2 в патенте США № 7420105 Breddam K. et al.), отсутствия активности LOX-2 (см. пример 2 в заявке РСТ КуРСТ/DK 2009/050355 и пример 1 в настоящем документе), а также отсутствия SMM и активности ММТ (примеры 2 и 4 в заявке РСТ № PCT/DK 2009/050315 и пример 2 в настоящем документе). Эти линии в настоящем документе обозначены как тройной нуль-мутант. В основном для определений активности LOX собирали семена двойных гаплоидов с последующим анализом 12 зерен каждой линии и контрольных сортов, допуская для каждого из измерений стандартное отклонение <5% (фиг. 4).

Пример 4. Определение уровней SMM.

Измерение SMM проводили, по существу, как описано в заявке РСТ PCT/DK 2009/050315. Сначала SMM экстрагировали из срезов листьев ячменя длиной 1-3 см, которые помещали в 1,2 мл лунки микропланшетов для титрования, где каждая лунка содержала стеклянную гранулу диаметром 5 мм и 500 мкл смеси 12:5:6 (об./об./об.) вода:метанол:хлороформ. Затем планшет в течение 45 с инкубировали в лабораторной мельнице ММ 300 (Retsch), электронным способом доведенной до встряхивания при частоте 30 Гц. После центрифугирования 10 мкл супернатанта переносили в 96-луночные планшеты для хранения (Waters, каталожный номер 186002481) и смешивали с 200 мкл воды и 60 мкл реакционного раствора,

- 41 031578 содержащего смесь 15000:45 (об./об.) реагента ОРА (Sigma, каталожный номер Р7914):3меркаптопропионовой кислоты (Aldrich, каталожный номер М5801). Смесь инкубировали при 4°С в течение по меньшей мере 10 мин с количественной дериватизацией аминокислот образец ОРА. С использованием системы СЭЖХ (Waters), оборудованной флуориметром, 2 мкл дериватизированной смеси разделяли на колонке 2,1x30 мм С18 Gemini с частицами 3 мкм (Phenomenex, кат. № 00А-4439-80) с использованием 40 мМ Na-фосфатного буфера, доведенного до рН 7,8 и содержащего раствор ацетонитрила:метанола:воды 45:45:10 (об./об./об.) в качестве подвижной фазы (Phenomenex 2006). Возбуждение производных ОРА проводили при 340 нм, тогда как испускание измеряли при 450 нм. Пример хроматограммы представлен на фиг. 5 с иллюстрацией профиля элюции аспарагиновой кислоты (Asp), глутаминовой кислоты (Glu), аспарагина (Asn), серина (Ser) и SMM дикого типа и тройного нуль-мутанта. Для тройного нуль-мутанта наблюдали заметное отсутствие способности к синтезу SMM.

Пример 5. Агрономическая продуктивность.

Коммерческие сорта ячменя Quench и Power, а также растения без LOX-1, без ММТ, без LOX-1-без LOX-2 (без двух LOX), без LOX-1-без ММТ и тройного нуль-мутанта тестировали в полевых испытаниях для сравнения их агрономической продуктивности. Регулярно получали данные для высоты растений, срока образования колоса, устойчивости к заболеваниям, полегания, времени созревания и урожайности (см. табл. 1).

Испытания проводили в соответствии со стандартными процедурами для полевых испытаний. Таким образом, высевали равные количества зерен коммерческих сортов и мутантных линий на участки 7,88 м² в 2 местоположениях, где каждое включало 3 повторения. Больших отличий в отношении агрономических признаков между мутантами и коммерческими сортами не наблюдали. Анализ качества ячменя различных мутантных линий и сортов продемонстрировал, что все собираемые зерна обладали хорошими и приемлемыми свойствами в отношении соложения и пивоварения.

Пример 6. Микросоложение и микрозатирание.

Условия эксперимента.

Эксперименты по микросоложению и -затиранию проводили с приведенными ниже шестью различными линиями и сортами ячменя (фиг. 6А, которая также иллюстрирует ход эксперимента, описываемого ниже в настоящем документе): (1) тройной нуль-мутант; (2) без LOX-1-без ММТ; (3) без LOX-1без LOX-2 (линия ячменя А689) ; (4) без ММТ (линия ячменя 8063); (5) без LOX-1 (линия ячменя D112); (6) сорт Power.

Эксперимент по микросоложению проводили с тремя образцами ячменя массой 225 г из каждой указанной выше линии или сорта. Замачивание и проращивание проводили следующим образом:

(i) замачивание при 16°С: 3 ч влажными; 21 ч сухими; 3 ч влажными; 21 ч сухими; 3 ч влажными; 21 ч сухими; конечное содержание воды 45%;

(ii) проращивание: 48-72 ч при 16°С до модификации >95%.

После проращивания три образца подвергали различным режимам сушки (обозначаемой на фиг. 6А как печная сушка):

(i) 85°C - сушка: 12,5 ч, начиная при 30°С и линейно увеличивая до 55°С с последующими 7,5 ч линейного увеличения до 85°С; 1,5 ч при 85°С;

(ii) 75°C - сушка: 12,5 ч, начиная при 30°С и линейно увеличивая до 55°С с последующими 7,5 ч линейного увеличения до 75°С; 1,5 ч при 75°С;

(iii) 40°С - сушка: 48 ч при 40°С.

Образцы, высушенные при 85°С и при 40°С, перерабатывали непосредственно после проращивания, тогда как оставшиеся образцы замораживали на 2 суток, размораживали, а затем сушили при 75°С, как описано выше.

Микрозатирание проводили, смешивая образцы молотого солода массой 90 г с 270 мл водопроводной воды с последующей инкубацией в 500 мл бутылках при 40°С в течение 20 мин. Температуру линейно повышали до 65°С в течение 25 мин с последующей паузой для засахаривания при 65°С длительностью 60 мин. Затем температуру перед фазой затирания при 78°С длительностью 10 мин линейно повышали до 78°С в течение 13 мин. Затем полученное сусло охлаждали на льду, разбавляли 700 мл ледяной водопроводной воды и фильтровали через фильтр MN-616 1/4 (Macherey-Nagel). 400 мл сусла переносили в 500 мл бутылки, плотно закрывали и нагревали в течение 60 мин в кипящей водяной бане. Бутылки оставляли в водяной бане без дальнейшего нагревания в течение дополнительного периода времени 60 мин.

Данные об уровнях DMSP.

Для анализа того, как различные температуры печной сушки влияют на содержание DMSP в солоде из дикого типа и мутантов по настоящей заявке, зерна сначала подвергали микросоложению, а затем перед печной сушкой при трех различных температурах, 40, 75 и 85°С, разделяли на аликвоты.

Линии зерен ячменя, содержащие ген ММТ дикого типа, характеризовались высокими уровнями DMSP в конечном солоде. Однако после печной сушки при повышенных температурах выявляли сниженные уровни (табл. 2). В отличие от этого во всех солодах генотипов без ММТ выявляли исключи

- 42 031578 тельно низкие уровни DMSP.

Уровни DMSP также измеряли в сусле, получаемом из указанных выше видов солода, получая уровни DMSP, соответствующие уровням DMSP, измеряемым в солодах. Эти результаты соответствуют предыдущим результатам Dickenson and Anderson (1981), описывающим тесную корреляцию между содержанием DMSP в солоде и сусле. Для всех генотипов без ММТ в соответствующем сусле измеряли исключительно низкие уровни DMSP вне зависимости от температуры печной сушки, при которой получали солод.

Данные об уровнях предшественников T2N и свободного T2N.

Для анализа того, как различные температуры печной сушки влияют на уровни свободного T2N и предшественников T2N, концентрации указанных соединений определяли в сладком сусле и охлажденном сусло, получаемым посредством микросоложения и -затирания, как описано выше в настоящем документе. Результаты приведены в табл. 3.

Для сусла из солода дикого типа температура печной сушки оказывала заметное влияние на концентрацию T2N и предшественников T2N. При использовании солода дикого типа для устранения высокой продукции предшественников T2N высокая температура печной сушки была абсолютно необходима.

Для солода без LOX-1-без ММТ температура печной сушки оказывала меньшее влияние на образование T2N и его аддукта.

Также следует отметить, что для сусла из солода из тройного нуль-мутанта, концентрации свободного T2N и его предшественников были низкими во всех образцах вне зависимости от температуры печной сушки.

Пример 7. Микрозатирание с неосоложенным ячменем.

Микрозатирание неосоложенного ячменя сорта Power и тройного нуль-мутанта проводили, смешивая образцы молотого ячменя массой 90 г с 270 мл водопроводной воды, а также 0,12 г ферментной смеси для сбраживания ячменя Ondea Pro (Novozymes) с последующей инкубацией в 500 мл бутылках при 54°С в течение 30 мин. Температуру линейно повышали до 64°С в течение 10 мин с последующей паузой для засахаривания при 64°С длительностью 45 мин. Затем за этим следовало 14 мин линейное повышение до 78°С перед фазой затирания в течение 10 мин при указанной температуре. Дальнейшие процедуры охлаждения, разбавления, фильтрации и нагревание проводили, как описано для микрозатирания солода (см. пример 4).

Уровни DMSP измеряли в сусле, получаемом из ячменной муки сорта Power и тройного нульмутанта (табл. 4). Было очевидно, что содержание DMSP в сусле, получаемом из ячменя с тройной нульмутацией, было значительно меньшим содержания DMSP в сусле из сорта Power. Это было неожиданным открытием, так как считалось, что ячмень не содержит DMSP (Yang В. et al.: Factors involved in the formation of two precursors of dimethylsulphide during malting, J. Am. Soc. Brew. Chem. 56:85-92, 1998).

Как представлено в патентной заявке РСТ № PCT/DK 2009/050355 (см. фиг. 12 и пример 9 в указанной заявке), уровни предшественников T2N в вареном, получаемом из сброженного ячменя, и нормальном сусле в образцах из ячменя без двух LOX были заметно ниже. Таким образом, ожидается, что подобное свойство является характеристикой ячменя с тройной нуль-мутацией, делая ячмень с тройной нуль-мутацией высококачественным сырьем для напитков из сброженного ячменя с низким содержанием веществ с неприятным привкусом T2N и DMS или их полным отсутствием.

Пример 8. Соложение и пивоварение в опытном масштабе.

Условия эксперимента.

Анализ соложения и пивоварения с солодом из тройного нуль-мутанта и сорта Quench (эталонный солод) включал следующие этапы: (i) соложение; (ii) получение сусла; (iii) разделение сусла; (iv) варка сусла; (v) ферментация сусла дрожжами Saccharomyces carlsbergensis; (vi) осветление пива; (vii) фильтрация светлого пива и (viii) бутилирование пива (см. фиг. 6В,С).

Эксперименты по соложению проводили с зернами тройного нуль-мутанта и сорта Quench в масштабе 20 кг, и их проводили на солодовом заводе следующим образом:

(i) замачивание при 16°С: 1 ч влажными; 1 ч сухими; 1 ч влажными; 1 ч сухими; 1 ч влажными; конечное содержание воды 45%;

(ii) проращивание в течение 120 ч, начиная от 16°С и линейно снижая до 14°С;

(iii) сушка в течение 14 ч, начиная от 65°С и линейно повышая до 85°С; 3 ч при 85°С.

Для затирания тройного нуль-мутанта и сорта Quench (последний использовали как эталон) использовали образцы солода массой 25 кг. После перемалывания отдельных образцов солода добавляли водопроводную воду с получением объемов 146 л. Затирание проводили при 40°С в течение 20 мин с последующим 25 мин линейным повышением от 40 до 65°С. Пауза для засахаривания при 65°С продолжалась в течение 60 мин с последующим 13 мин фазой нагревания до 78°С и 10 мин затирания при 78°С.

Один образец сусла сорта дикого типа Quench и один образец сусла тройного нуль-мутанта раздельно варили в течение 60 мин при 101°С (что приводило к выпариванию 6,7%), тогда как остальные два образца сусла нагревали при 98°С в течение 60 мин (что приводило к выпариванию 3,9%). Остальные этапы пивоварения, как указано выше в данном разделе, т.е. фильтрацию, вихревое разделение, фермен

- 43 031578 тацию, осветление и упаковку в зеленые стеклянные бутылки, проводили в соответствии с описаниями стандартов практики пивоварения.

Уровни DMSP и DMS измеряли, по существу, как описано в Hysert et al. (1980) со специфичной для серы детекцией с использованием статической газовой хроматографии в свободном объеме над продуктом на хемилюминесцентном серном детекторе 350В (Sievers). Забор образца в свободном объеме над продуктом проводили с использованием автоматического оборудования HS-40 (Perkin Elmer).

Общие уровни DMS, т.е. сумму свободных DMS и DMSP в сусле и экстрактах зеленого и высушенного солода, получали посредством кипячения соответствующих образцов в щелочных условиях в течение 1 ч. Затем сваренные и несваренные образцы подвергали анализу свободного объема над продуктом с определением уровней DMS. Разницу между общими DMS (измеряемыми в сваренных образцах) и свободными DMS (измеряемыми в несваренных образцах) определяли как эквивалентное количество DMSP, присутствующих в образцах. Количество свободных DMS в пиве определяли, по существу, как количество свободных DMS в сусле (Hysert et al., выше).

Данные об уровнях DMSP/DMS и предшественников Т2№свободного T2N в образцах сусла.

С использованием современного оборудования для пивоварения в норме предусмотрено выпаривание 6-10% сусла для достижения удовлетворительных уровней DMS в соответствующем готовом пиве, т.е. [DMS]<50 млрд.д., что представляет собой уровень порога вкусового ощущения неприятного привкуса человека. На основе этих фактов планировали испытания опытного пивоварения, как описано выше. Целью являлось тестирование влияния сниженного потребления энергии, такого как отсутствие варки при инкубации под давлением, на уровни DMS в сусле и в готовом пиве. Таким образом, условия эксперимента включали сравнение с варкой сусла в стандартных условиях.

При нагревании сусла из сорта Quench измеряли высокие уровни DMSP и свободных DMS с возрастанием уровней свободных DMS, наблюдаемым с течением времени в сусле под давлением. В отличие от этого вареное выпариваемое сусло до конца варки накапливало меньше DMS, после чего свободные DMS накапливались снова. Параллельно результатам после микрозатирания, как описано выше в настоящем документе, сусло из солода из тройного нуль-мутанта в опытном масштабе характеризовалось значительно более низкими уровнями DMSP и свободных DMS по сравнению со сходными образцами, получаемыми из сорта Quench (см. табл. 5). Примечательно, что даже в сусле указанные уровни DMS солода из тройного нуль-мутанта были значительно ниже 50-млрд.д. уровня вкусового порога.

Концентрации предшественников T2N и свободного T2N в сусле и пиве из солода из сорта дикого типа Quench и из солода из тройного нуль-мутанта определяли посредством GC-MS после дериватизации карбонилов О-(2,3,4,5,6-пентафторбензил)гидроксиламином, по существу, как описано в Gronqvist et al. (1993).

При нагревании сусла из сорта Quench измеряли высокие концентрации предшественников T2N с максимумом, выявляемым в начале варки/тепловой обработки (табл. 6). Для сусла, получаемого из солода из солода из тройного нуль-мутанта, выявляли значительно более низкими уровнями предшественников T2N (приблизительно 40% от уровней при использовании сырья дикого типа), также с максимумом в начале варки/тепловой обработки. Режим низкоэнергетического нагревания (т.е. применение тепловой обработки под давлением) оказывал только незначительное влияние на уровни предшественников T2N для обоих типов солода. Во всех образцах сусла определяли низкие уровни свободного T2N.

Следует отметить, что положительное воздействие мутаций без LOX-1 и без LOX-2 отчетливо заметно даже когда при нагревании сусла используют сниженное поступление энергии.

Данные об уровнях DMS и предшественниках T2N/свободного T2N в образцах пива.

Концентрацию DMS измеряли в свежем пиве, получаемом из солода из тройного нуль-мутанта, а также из солода из сорта дикого типа Quench с использованием двух различных режимов варки/нагревания, как описано выше в настоящем документе. Результаты обобщены в табл. 7.

Пиво, получаемое из солода из сорта Quench дикого типа с использованием стандартного режима варки, содержит 65 млрд.д. DMS, т.е. немного выше порога вкусового ощущения 50 млрд.д.

Применение энергосберегающего способа, такого как отсутствие варки при инкубации под давлением, как описано выше в настоящем документе, для солода дикого типа приводило к очень высокой концентрации DMS (151 млрд.д.) в готовом пиве.

В отличие от этого пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, содержало очень низкие уровни DMS вне зависимости от способа нагревания.

Вне зависимости от используемого способа получения сусла пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, содержало намного меньше предшественников T2N (в размере снижения от 56 до 58%), чем пиво, получаемое из солода из сорта дикого типа Quench вне зависимости от способа варки (табл. 7).

Уровни свободного T2N в свежем пиве были низки для всех четырех тестируемых образцов пива (т.е. с использованием солода из сорта Quench или из тройного нуль-мутанта, комбинированных с получением сусла с обеспечением выпаривания или под давлением), но после ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С наблюдали значительные различия. Тогда как оба типа пива, полученные из солода дикого типа со стандартной варкой или нагреванием под давлением, содержали 0,041 и 0,061 млрд.д. T2N соответственно, соответствующие значения для пива, получаемого из солода из тройного нуль

- 44 031578 мутанта, являлись более низкими, т.е. сниженными до 95 и 64% соответственно (табл. 7).

Данные о пивной пене.

Сравнивали сваренное в опытном масштабе пиво, получаемое с выпариванием или под давлением при нагревании сусла из солода из сорта Quench (см. фиг. 6В) и из тройного нуль-мутанта (см. фиг. 6С). Пиво перед добавлением 50 мл Н₂О в 150 мл пива отбирали в точке отбора образца 9 (см. фиг. 6В,С), дегазировали в течение 20 мин в ультразвуковой бане. Смесь медленно выливали в башню подачи пены, состоящую из стеклянной трубы 16 см в длину, 7 см в ширину (со стеклянным фильтром и коннектором внизу и вверху соответственно). Через смесь снизу барботировали газообразный N₂ при скорости потока 400 мл/мин для получения пивной пены. Ее пропускали через трубу и собирали в градуированный седиментационный конус, размеченный по массе.

Общую массу пены для всех четырех видов пива записывали с 5 мин интервалами до прекращения образования пены (фиг. 7). Уровни пены являлись сходными вне зависимости от способов с выпариванием или под давлением. Однако в пиве, где в качестве сырья использовали солод из тройного нульмутанта, образование пены значительно улучшалось.

Дегустация пива.

Получаемые четыре вида пива (т. е. с использованием солода из сорта Quench или из тройного нульмутанта в комбинации с получением сусла с обеспечением выпаривания или под давлением), свежеполученное пиво и пиво после ускоренного старения в течение 1 и 2 недель при 37°С оценивала дегустационная комиссия экспертов (табл. 8).

Свежее пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, получило высший общий показатель вкуса вне зависимости от способа варки. В отличие от этого для пива, получаемого из солода дикого типа и с использованием стандартного режима варки, получали немного меньший общий показатель вкуса; его признавали с незначительными количествами DMS. Использование способа нагревания под давлением приводило к пиву с очень низким общим показателем вкуса, и его признавали со значительными количествами DMS.

После ускоренного старения в течение 1 или 2 недель при 37°С пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, получило значительно меньший общий показатель старения, чем пиво, получаемое из солода дикого типа, особенно вследствие сниженного показателя для признака привкус картона, получаемого вследствие сниженных концентраций компонента старения T2N.

Пример 9. Соложение и пивоварение в опытном масштабе.

Условия эксперимента.

Анализы соложения и пивоварения с солодом из тройного нуль-мутанта (без двух LOX-без ММТ) и сорта Rosalina (эталон дикого типа) включали следующие этапы: (i) соложение; (ii) получение сусла; (iii) разделение сусла; (iv) ферментация сусла дрожжами Saccharomyces carlsbergensis; (vi) осветление пива; (vii) фильтрация светлого пива и (viii) бутилирование пива.

Эксперименты по соложению проводили с зернами тройного нуль-мутанта и сорта Rosalina в масштабе 21 кг, и их проводили на солодовом заводе следующим образом:

(i) замачивание при 16°С: 1 ч влажными; 1 ч сухими; 1 ч влажными; 1 ч сухими; 1 ч влажными; капельное добавление воды в течение 36 ч до конечного содержания воды 45%;

(ii) проращивание в течение 120 ч, начиная от 16°С и линейно снижая до 14°С;

(iii) сушку/печную сушку проросших зерен проводили при нормальной температурной программе или при низкотемпературной программе в опытной печной сушке;

(iv) нормальная программа сушки/печной сушки, начиная от 45°С с линейным повышением до 85°С в течение 14 ч с последующей инкубацией в течение 2 ч при 85°С;

(v) программа низкотемпературной сушки/печной сушки, начиная от 45°С и с линейным повышением до 75°С в течение 12 ч с последующей инкубацией в течение 2 ч при 75°С.

Для затирания тройного нуль-мутанта и сорта Rosalina использовали образцы солода массой 34 кг. После перемалывания отдельных образцов солода добавляли водопроводную воду с получением объемов 180 л. Затирание проводили при 60°С в течение 20 мин с последующим 5 мин линейным повышением от 60 до 65°С. Пауза для засахаривания при 65°С продолжалась в течение 60 мин с последующим 13 мин фазой нагревания до 78°С и 10 мин затирания при 78°С.

Образец сусла сорта дикого типа Rosalina и образец сусла тройного нуль-мутанта раздельно варили в течение 60 мин при 101°С в открытом сосуде (что приводило к выпариванию 4,5%) или нагревали до 99,5°С и поддерживали при 99,5°С в течение 60 мин в закрытом сосуде (что приводило к выпариванию 0%). Остальные этапы пивоварения, как указано выше в данном разделе, т. е. фильтрацию, вихревое разделение, ферментацию, осветление и упаковку в зеленые стеклянные бутылки, проводили в соответствии с описаниями стандартов практики пивоварения.

Получали шесть различных видов сусла с различными комбинациями сорта, условий печной сушки и условий варки (см. табл. 9).

Остальные этапы пивоварения, как указано выше в данном разделе, т. е. фильтрацию, вихревое разделение, ферментацию, осветление, фильтрацию и упаковку в зеленые стеклянные бутылки, проводили в

- 45 031578 соответствии с описаниями стандартов практики пивоварения.

Уровни DMSP и DMS измеряли, как описано выше в настоящем документе в примере 8.

Данные об уровнях DMSP/DMS в образцах солода.

При современном соложении растений в норме для снижения DMSP в солоде до низкого уровня, т.е. менее 4,5 мг/кг солода, для получения солода из которого можно получать сусло с удовлетворительным уровнем DMS, требуется сушка зерна с температурой сушки при 85°С в течение по меньшей мере 2 ч (см. ниже).

На основе этих фактов планировали испытания соложения в опытном масштабе, как описано выше. Целью являлось тестирование влияния сниженного потребления энергии, такого как низкотемпературная сушка, на уровни DMS в солоде, сусле и в готовом пиве. Таким образом, условия эксперимента включали сравнение с сушкой зерна в стандартных условиях.

В солоде, получаемом из сорта Rosalina с использованием стандартной сушки при 85°С, DMSP измеряли на уровне 4,7 мг/кг солода. В солоде из сорта Rosalina, получаемого с сушкой при 75°С, DMSP измеряли на уровне 16,2 мг/кг (табл. 10). В солоде, получаемом из зерен тройного нуль-мутанта, получали экстремально низкие уровни DMSP, фактически ниже предела детекции, вне зависимости от температуры сушки.

Данные об уровнях DMSP/DMS в образцах сусла.

С использованием современных способов пивоварения для достижения удовлетворительных уровней DMS в соответствующем готовом пиве, предпочтительно [DMS]<50 млрд.д., в норме необходим по меньшей мере один час варки с выпариванием 4,5-10% сусла. На основе этих фактов планировали испытания пивоварения, как описано выше. Целью являлось тестирование влияния сниженного потребления энергии, такого как низкотемпературная сушка зерна или тепловая обработка без выпаривания в закрытом сосуде, на уровни DMS в сусле и готовом пиве. Таким образом, условия эксперимента включали сравнение с сушкой зерна и варкой сусла в стандартных условиях.

При нагревании сусла из сорта Rosalina, получаемого с нормальной сушкой, измеряли высокие уровни DMSP и свободных DMS. С течением времени в закрытом сосуде наблюдали увеличение уровней свободных DMS. В отличие от этого вареное выпариваемое сусло до конца варки накапливало меньше DMS, после чего свободные DMS накапливались снова (табл. 11). При использовании низкотемпературной сушки с сортом Rosalina уровни DMSP и DMS были намного выше, чем при нормальной сушке. Во всех трех видах сусла, получаемого из сорта Rosalina, конечное сусло содержало уровень DMS выше 50 млрд.д.

Параллельно с другими результатами, описываемыми выше в настоящем документе, сусло из солода из тройного нуль-мутанта характеризовалось экстремально низкими уровнями DMSP и свободных DMS по сравнению со сходными образцами, получаемыми из сорта Rosalina. Примечательно, что даже в сусле указанные уровни DMS солода из тройного нуль-мутанта были значительно ниже 50-млрд.д. вне зависимости от режимов печной сушки и варки.

Данные об уровнях предшественников T2N/свободного T2N в образцах сусла.

Концентрации предшественников T2N и свободного T2N в сусле и пиве из солода из сорта дикого типа Rosalina и из солода из тройного нуль-мутанта определяли посредством GC-MS после дериватизации карбонилов О-(2,3,4,5,6-пентафторбензил)гидроксиламином, по существу, как описано в Gronqvist et al. (1993).

В сусле из сорта Rosalina измеряли высокие концентрации предшественников T2N (табл. 12). Для сусла, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта, выявляли более низкие уровни предшественников T2N, =40% от уровней предшественников T2N при использовании сырья дикого типа. Режим низкоэнергетического нагревания, т. е. низкотемпературной печной сушки или тепловой обработки сусла без выпаривания в закрытом сосуде, для обоих типов солода оказывал только небольшое влияние на уровни предшественников T2N. Во всех образцах сусла определяли низкие уровни свободного T2N.

Следует отметить, что положительное воздействие мутаций без LOX-1 и без LOX-2 отчетливо заметно, даже когда используют сниженное поступление энергии.

Данные об уровнях DMS и предшественниках T2N/свободного T2N в образцах пива.

Концентрации DMS измеряли в свежем пиве, получаемом из солода из тройного нуль-мутанта, а также из солода из сорта дикого типа Rosalina с использованием двух различных режимов сушки зерна и варки/нагревания, как описано выше в настоящем документе. Результаты обобщены в табл. 13.

Пиво, получаемое с использованием стандартного режима варки, из солода из сорта дикого типа Rosalina, получаемого в условиях стандартной сушки, содержало 117 млрд.д. DMS, т.е. выше 50 млрд.д.. Применение энергосберегающего способа, такого как отсутствие выпаривания в закрытом сосуде, как описано выше в настоящем документе, для солода дикого типа приводило к 174 млрд.д. DMS, т.е. очень высокой концентрации неприятного привкуса в готовом пиве.

В отличие от этого пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, содержало очень низкие уровни DMS, вне зависимости от способов варки и печной сушки.

Уровни свободного T2N в свежем пиве были низки во всех тестируемых образцах пива (т.е. с ис

- 46 031578 пользованием солода из сорта Rosalina или из тройного нуль-мутанта, комбинированных с получением сусла с обеспечением выпаривания или тепловой обработкой без выпаривания в закрытом сосуде), но после ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С наблюдали значительные различия. Тогда как пиво, полученное из солода дикого типа со стандартной варкой и тепловой обработкой без выпаривания в закрытом сосуде, содержало 0,055 и 0,035 млрд.д. T2N соответственно, соответствующие значения для пива, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта, являлись значительно более низкими, т.е. сниженными на 67 и 51% соответственно (см. табл. 13).

Дегустация пива.

Получаемые 6 видов пива (т.е. с использованием солода из сорта Rosalina или из тройного нульмутанта в комбинации с получением сусла с обеспечением выпаривания или тепловой обработкой без выпаривания в закрытом сосуде или стандартной или низкотемпературной сушкой), свежеполученное пиво и пиво после ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С оценивала дегустационная комиссия экспертов (табл. 14).

Свежее пиво, получаемое из солода из тройного нуль-мутанта, получило высший общий показатель вкуса вне зависимости от способов печной сушки и варки. В отличие от этого для пива, получаемого из солода дикого типа, высушиваемого при 85°С и с использованием стандартного режима варки, получали значительно меньший общий показатель вкуса; его признавали с заметными количествами DMS. Использование для получения сусла способа тепловой обработки без выпаривания в закрытом сосуде приводило к пиву с еще более низким общим показателем вкуса, который признавали со значительными количествами DMS.

После ускоренного старения в течение 2 недель при 37°С пиво, получаемое с нормальной варкой из солода из тройного нуль-мутанта, высушиваемого при 85°С, получило значительно меньший общий показатель старения, чем соответствующее пиво, получаемое из солода дикого типа, особенно вследствие сниженного показателя для признака привкус картона, получаемого вследствие сниженных концентраций компонента старения T2N.

Для пива, получаемого из солода дикого типа, оценка характеристик потери свежести была не совсем возможной преимущественно вследствие неприятного вкуса DMS от заметного до значительного.

Пример 10. Сравнение пива из сброженного ячменя и нормального пива -ТНА.

Специфичные для пива ТНА, получаемые из линолевой кислоты, были уже описаны несколько десятилетий назад (Drost et al., 1974). С того времени в различных публикациях подтверждено, что общее содержание ТНА в пиве находится в диапазоне =5-12 м.д. (Hamberg, 1991 и ссылки в ней). Хотя 9,12,13ТНА в норме составляет 75-85% ТНА в пиве, 9,10,13-ТНА насчитывает 15-25%; в незначительных количествах выявлены другие изомеры.

В пиве, получаемом из сусла, получаемого из солода из ячменя тройного нуль-мутанта (см. пример 9), концентрация 9,12,13-ТНА по сравнению с контрольным пивом, получаемом из солода сорта Rosalina, снижалась на 80-87% (табл. 15). Для изомера 9,10,13-ТНА наблюдали снижение на 65-72%. Эти измерения проводили с использованием стандартных анализов ВЭЖХ-масс-спектрометрии (Hamberg, выше).

Пример 11. Амплификация происходящей из сырья ДНК в пиве.

Когда для оценки наличия или отсутствия видоспецифичных последовательностей ДНК в смесях муки из солода можно использовать способ ПЦР, определение образцов пива становится более интересным. При производстве пива комбинированное действие происходящих из сырья нуклеаз, повышенных температур и фильтрации обеспечивает получение пивных продуктов, которые содержат только низкие уровни интактной ДНК для амплификации фрагментов генов растений. В настоящем примере описан новый эффективный способ для комбинированных выделения и амплификации ДНК, позволяющий получать ДНК достаточного для визуализации качества.

Для определения сырья в образцах пива разработан новый протокол из четырех этапов. В нем последовательно используют реагенты и протоколы трех биомолекулярных наборов, затем обеспечивая амплификацию фрагментов ДНК для визуализации:

(i) выделение ДНК из пива посредством связывания с магнитными бусами [в соответствии с рекомендациями в инструкциях для набора выделения ДНК из жидких образцов DNA Extraction Kit, Speciation (Tepnel Biosystems Ltd., каталожный номер 901040N)];

(ii) амплификация ДНК посредством изотермического замещения цепи (набор для амплификации ДНК Illustra GenomiPhi V2, GE Healthcare, каталожный номер 25-6600-30);

(iii) ПЦР с праймерами для детекции конкретных мутаций ДНК с использованием смеси для ПЦР REDExtract-N-Amp PCR ReadyMix (Sigma, каталожный номер XNAP-1KT);

(iv) электрофорез в агарозном геле для разделения продуктов амплификации с последующим окрашиванием бромистым этидием для их визуализации.

Этап (i) выше относится к очистке ДНК из 400 мкл аликвот из следующих образцов:

(a) Tuborg Gron Pilsner, получаемое с использованием муки из смеси 75%: 25% солода:ячменя дикого типа (Carlsberg Breweries A/S; подпись на этикетке 26.11.11 704);

(b) пиво, получаемое в опытном масштабе с использованием смеси, содержащей 50% солода без

- 47 031578

LOX-1 (Carlsberg trial identifier 2C10084);

(c) несваренное сусло, получаемое в опытном масштабе с использованием солода, получаемого из ячменя с тройной нуль-мутацией (Carlsberg trial identifier 2C11001);

(d) вареное сусло, получаемое в опытном масштабе с использованием солода из тройного нульмутанта (Carlsberg trial identifier 2C11001), т.е. сусла, получаемого из сусла, описанного в (с) выше.

ДНК, очищенную из каждого из указанных выше образцов (а), (b), (с) и (d), в завершении ресуспендировали в 50 мкл 10 мМ буфера Tris-ЭДТА, рН 7,4.

На этапе (ii) выше 1 мкл аликвот образцов, полученных из сусла или пива ДНК, очищенных, как подробно изложено в (i), подвергали амплификации. В кратком изложении ДНК подвергали тепловой денатурации, а затем охлаждали в образце буфера, содержащего случайные гексамеры, которые неспецифически связываются с ДНК. Добавляли основную смесь, содержащую ДНК-полимеразу, случайные гексамеры, нуклеотиды, соли и буферы, и проводили изотермическую амплификацию при 30°С в течение 2 ч с использованием конечного объема реакционной смеси 20 мкл. Затем полимеразу инактивировали нагреванием в течение 10 мин инкубации при 65°С.

В отношении этапа (iii) выше параметры реакции амплификации ПЦР в объеме 14 мкл, включающем 1,0 или 4,2 мкл аликвот матриц образцов, получаемых, как описано в (ii) выше, и 7 пмоль каждого из праймеров FL820 (SEQ ID NO:10 WO 2010/075860) и FL823 (SEQ ID NO:11 WO 2010/075860) для детекции мутации без LOX-1; см. фиг. 18В в WO 2010/075860 Skadhauge В. et al., являлись следующими:

(i) 1 цикл с денатурацией при 96°С в течение 2 мин;

(ii) 30 циклов с:

(a) денатурацией при 95°С в течение 1 мин;

(b) отжигом при 68°С в течение 1 мин;

(c) достройкой при 72°С в течение 1 мин;

(iii) конечная достройка при 72°С в течение 10 мин;

(iv) хранение.

Этап (iv) выше состоит из электрофоретического разделения всей смеси ПЦР в 2% (мас./об.) агарозном геле, куда добавлен бромистый этидий. После электрофореза гель облучали УФ-светом и фотографировали (фиг. 10).

Анализ профиля полос ДНК, приведенный на фиг. 10, выявил отсутствие продукта амплификации из аликвоты пива Tuborg, ожидаемый результат, так как сырье получали из дикого типа, т. е. не получали из ячменя без LOX-1. Однако в образцах пива, сваренного из смеси, содержащей 50% солода без LOX-1, можно детектировать продукты амплификации ожидаемой длины. Подобным образом, но более отчетливо, получали окраску для несваренного сусла, получаемого из солода из тройного нуль-мутанта. В образце из вареного сусла из сырья тройного нуль-мутанта амплифицировали меньше продукта ПЦР, возможно вследствие теплового повреждения и после осаждения.

Используя продукты амплификации, описанные выше в (ii) с парой праймеров FL1034-FL1039 (SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:8 WO 2010/075860 соответственно; также см. фиг. 18 в WO 2010/075860 Skadhauge et al.), набором праймеров 20 (SEQ ID NO:77 и SEQ ID NO:81 WO 2010/063288) и набором праймеров 21 (SEQ ID NO:78 и SEQ ID NO:82 WO 2010/063288; также см. фиг. 15 в WO 2010/063288 А2 Knudsen et al.) в отдельных ПЦР, но в условиях, сходных с условиями, подробно описанными выше в настоящем примере, подтверждали, получен ли образец сусла или пиво с использованием сырья из тройного нуль-мутанта.

Таблица 1 Сравнение агрономических данных [полевые испытания в 2009 г. (в Fyn, Denmark)]

	сорт Quench	сорт Power	без LOX-1	без ММТ	без LOX-1- без LQX-2	без LOX-1- без ммт	тройной нуль-мутант
Дата посева	4 апреля	4 апреля	4 апреля	4 апреля	4 апреля	4 апреля	4 апреля
Срок образования колоса	18 июня	15 июня	16 июня	15 июня	16 июня	16 июня	17 июня
Длина соломины при созревании (см)	81	84	87	80	87	85	81
Мучнистая роса	0	5	0	0	0	0	0
Гельминтоспориоз корней зерновых1	2	3	3	4	2	3	3
Листовая ржавчина1	8	1	3	3	3	3	4
Полегание1	2	6	4	4	2	3	3
Дата созревания	3 августа	31 июля	1 августа	31 июля	1 августа	1 августа	2 августа
Относительная урожайность (%)2	103	98	92	93	103	100	101
Масса 1000 зерен (г)	49	48	53	54	53	47	49
Белок (%Р	10,5	10,2	10,3	10,5	10,5	10, 4	10,5
Крахмал (-)3	63, 0	62,1	62,5	62, 9	62, 4	63, 1	62,7

- 48 031578

Размер зерна (%>2,5 мм)

95,7

92,4

96,8

94, 6

99, 2

99,1

95, 3

¹ - по шкале от 0 до 9, где 0 представляет собой отсутствие инфекции или полегания, а 9 представляет собой экстремальную инфекцию или полегание;

² - относительная средняя урожайность трех повторов в двух различных местоположениях по сравнению с официальным смесью сортов ячменя Danish Spring смесь в 2009 году. Стандартную урожайность смеси установили как относительную урожайность 100%;

³ - измеряли посредством спектроскопии пропускания в ближнем инфракрасном диапазоне (NIT).

Уровни DMSP при микросоложении и -затирании

Таблица 2

	Тип ячменя	Описание образцов (см. фиг. 6А)
1	2	3	4
Солод	Сладкое сусло	Вареное сусло	Охлажденное сусло
мкг/г		мкг/'л
Печная сушка при 4 0®С	тройной нуль-мутант	0,2	8	6	-
без LOX-1-без ммт	0, 4	37	19	-
без LOX-1-без LOX-2	21,3	-	-	-
без ммт	-	-	-	-
без LOX-1	17,3	-	-	-
Сорт дикого типа Power	21,3	2348	950	-

Печная сушка при 75°С	тройной нуль-мутант	0,2	9	7	-
без LOX-1-без ММТ	0,1	9	8	-
без LOX-1-без LOX-2	11,9	-	-	-
без ММТ	-	-	-	-
без LOX-1	8,8	-	-	-
Сорт дикого типа Power	7,7	1017	393	-
Печная сушка при 85°С	тройной нуль-мутант	0,1	4	5	-
без LOX-1-без ММТ	0,1	7	6	-
без LOX-1-без LOX-2	5,7	656	247	-
без ММТ	о,1	5	4	-
без LOX-1	6,5	684	212	-
Сорт дикого типа Power	7,1	880	286	-

Таблица 3 Уровни T2N и предшественников T2N (пре^2^ при микросоложении и затирании

	Тип ячменя	Описание образца (см. фиг. 6А)
1	4
Солод	Охлажденное сусло
Т2Ы | Пре-Т2Ц	T2N I Пре-Т2Ы
млрд.д.
Печная сушка при 40фС	тройной нуль-мутант	0,0 | 2,3 | 0, 1 | 3, 6

	без LOX-1-без ММТ	0,0	4,3	0,1	7, 5
без LOX-1-без LOX-2	-	-	-	-
без ММТ	-	-	-	-
без LOX-1	-	-	-	-
Сорт дикого типа Power	0,1	8,3	0,4	15,7
Печная сушка при 75°С	тройной нуль-мутант	о,1	2,3	0,2	3,3
без LOX-1-без ММТ	0,1	3,1	0,2	4, 9
без LOX-1-без LOX-2	-	-	-	-
без ммт	-	-	-	-
без LOX-1	-	-	-	-
Сорт дикого типа Power	0,2	5,2	0,3	8,2
Печная сушка при 85°С	тройной нуль-мутант	0,1	1,8	о,1	2,5
без LOX-1-без ММТ	0,1	2,1	0,1	3, 1
без LOX-1-без LOX-2	0,1	1,8	0,1	2, 5
без ММТ	0,4	4,2	0,4	6, 4
без LOX-1	0,1	2,2	0,1	6, 6
Сорт дикого типа Power	0,2	4,8	0,1	9, 0

- 49 031578

Уровни DMSP при микрозатирании

Таблица 4

	Описание образца
2	3	3	4
Тип ячменя	Сладкое сусло	Сусло, вареное 30 мин	Сусло, вареное 60 мин	Охлажденное сусло
мкг/л
Сорт дикого типа Power	10,9	12,0	6,3	3,8
тройной нуль-мутант	0/ 1	0, б	0,6	0,3

Уровни DMSP и DMS в двух типах затирания в опытном масштабе

Таблица 5

	Описание образца (см. фиг. 6В,С)
1	2 I	3 1	4 I	5 I	6 1	7	3
		Солод	Нагревание сладкого сусла с обеспечением выпаривания (мин; °C)
Тип ячменя			0; 67	22; 99	37; 101	52; 101	67; 101	82; 101	142; 90
		мкг/г	мкг/л
Сорт дикого типа Quench	DMSP	4,7	725	682	516	369	288	219		101

DMS	4,3	93	85	50	47	33	31	127
тройной нуль-мутант	DMSP	0,1	3	2	3	2	1	1	1
DMS	0,1	14	13	11	12	11	12	12
			Нагревание	сладкого сусла под давлением (мин;°C)
			0; 69	22; 9 9	37; 98	52; 98	67; 98	82; 98	142; 80
Сорт дикого типа Quench	DMSP	4,7	564	508	408	340	273	219	161
DMS	4,8	51	51	60	64	76	80	164
тройной нуль-мутант	DMSP	0,0	15	5	3	3	3	2	2
DMS	0,1	20	20	19	18	19	20	20

Таблица 6

Уровни предшественников T2N (пре-’ГЗХ) и свободного T2N в двух типах затирания в опытном масштабе

- 50 031578

Таблица 7

DMS, предшественники T2N и свободный T2N в свежем и передержанном пиве

	Условия инкубации пива
Свежее	2 недели при 37*С
Тип ячменя	Тип варки	DMS (млрд.д.)	Предшественники T2N (млрд.д.)	Свободный T2N (млрд.д. )	$О2 (М.д.)	Свободный T2N (млрд.д.)
О -Й Ен Сч г0 О & О Й Й О К 2 Ф О X Ен 3 Ч си	Нагревание с обеспечением выпаривания сладкого сусла	65	3,0	0, 025	5	0,041
тройной нульмутант	2	1,3	0, 018	3	0,039
О Л Еч Сч ИЗ О £h О й й о х х а> О X ЕН Э Ч О'	Нагревание под давлением сладкого сусла	151	3,3	0, 024	6	0,061
тройной нульмутант	3	1,4	0, 020	4	0,039

Таблица 8

Органолептическая оценка свежего и передержанного пива, получаемого из сорта дикого типа Quench и солода из тройного нуль-мутанта

	Условия инкубации пива
Свежее	1 неделя при 37°С	2 недели при 37®С
= Ϊ S §	С X X Ch Е-ч лэ ш	Показатель вкуса1	Комментарии	Показатель старения2	Показатель картонного привкуса2	Показатель старения	Показатель картонного привкуса
Сорт дикого типа Quench	Нагревание с обеспечением выпаривания сладкого сусла	4,4	Заметно прокисшее	3,1	2,4	2, 4	2,1
	Немного окислившееся
	с незначительными DMS
	с незначительными соединениями серы
	с незначительными эфирами
г & >х 2 ° > >s S о Ch н	4,8	с незначительными соединениями серы	2,1	1, 6	1, 9	1, з
	с незначительными жирными кислотами
	Незначительно зернистое
о о s ф х Сч е и	о ς х ф « т т ф х а	2,8	С незначительными	3,5	2,3	3, 3	2,4
			эфирами
	Немного передержанное
	Со значительными DMS
	с незначительным американским запахом
	Незначительно зернистое
тройной нуль-мутант	4,8	Незначительно зернистое	2, 6	1, 9	1,9	1,1
	С незначительным фруктовым вкусом
	Незначительно прокисшее
	Немного затхлое

- по шкале 1-9, где 9 является наилучшим;

- по шкале 0-5, где 0 означает свежее пиво, а 5 представляет собой очень передержанное пиво;

- по шкале 0-5, где 5 означает пиво с сильным привкусом картона.

- 51 031578

Экспериментальный обзор

Таблица 9

		Сушка/печная сушка	Варка
Варка №	Сорт	Программа	Curring температура (°C)	Сосуд	Выпаривание
1	Rosalina	Нормальная	85	Открытый	4,5
2	Тройной нуль-мутант	Нормальная	85	Открытый	4,5
3	Rosalina	Нормальная	85	Закрытый	0
4	Тройной нуль-мутант	Нормальная	85	Закрытый	0
5	Rosalina	Низкотемпературная	75	Открытый	4,5
6	Тройной нуль-мутант	Низкотемпературная	75	Открытый	4,5

DMS и DMSP в образцах солода

Таблица 10

	Сушка/печная сушка	DMS	DMSP
Сорт	Программа	Температура сушки (°C)	(мг/кг)	(мг/кг)
Rosalina	Нормальная	85	4,1	4,7
Rosalina	Низкотемпературная	75	2,8	16,2
Тройной нуль-мутант	Нормальная	85	<DL*	<DL*
Тройной нуль-мутант	Низкотемпературная	75	<DL*	<DL*

* - ниже предела детекции.

Таблица 11 Уровни DMSP и DMS в двух типах варки в опытном масштабе. Нормальная сушка зерна при 85°С и нагревание с обеспечением выпаривания сусла в открытом сосуде

	Описание образца (см. фиг	. 6)
		2	2	3	4	5	7
Тип ячменя		Нагревание сладкого сусла (мин;еС)
		0; 67	22; 99	31; 100	52; 100	82; 100	142; 90
		мкг/л
сорт Rosalina дикого типа	DMSP	1245	1257	882	759	415	208
DMS	212	190	102	56	31	178
тройной нуль-мутант	DMSP	следы	-	-	-	-	следы
DMS	следы	-	-	-	-	следы

Таблица 11 (продолжение)

Уровни DMSP и DMS в двух типах варки в опытном масштабе. Нормальная сушка зерна при 85°С и нагревание сусла в закрытом сосуде без выпаривания

	Описание образца (см. фиг. 6)
		1	2	3	4	5	7
Тип ячменя			Нагревание сладкого сусла	(мин;°C)
	0; 67	22; 99	37; 100	52; 100	82; 100	142; 90
		мкг/л
Сорт дикого типа Rosalina	DMSP	1180	1061	732	576	396	274
DMS	183	227	410	412	471	709
тройной нуль-мутант	DMSP	следы	-	-	-	-	следы
DMS	следы	-	-	-	-	следы

Таблица 11 (продолжение) Уровни DMSP и DMS в двух типах варки в опытном масштабе. Низкотемпературная сушка зерен при 75 °С и нагревание с обеспечением выпаривания сусла в открытом сосуде

	Описание образца (см. фиг. 6)
		1	2	3	4	5	7
Тип ячменя			Нагревание сладкого сусла	(мин;°C)
	0; 67	22; 9 9	37; 100	52; 100	82; 100	142; 90
		мкг/л
Сорт дикого типа Rosalina	DMSP	1825	1665	1262	1005	611	376
DMS	155	178	74	32	27	154
тройной нуль-мутант	DMSP	11	-	-	-	-	2
DMS	4	-	-	-	-	4

- 52 031578

Таблица 12

Уровни предшественников T2N (Пре-Т2Щ и свободного T2N в сусле в опытном масштабе, получаемом с использованием различных режимов печной сушки и варки

Тип ячменя	Тип варки *)	На старте нагревания	Нагретое сусло
		T2N (млрд.д.)	Пре-Т2И (млрд.д.)	T2N (млрд.д.)	Пре-Т2Ы (млрд.д.)
Нормальная сушка при 8 5 °C
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	0/ 39	5,3	0,21	4,2
тройной нуль-мутант	Откр. сосуд; выпар.	0у 24	1,8	0,08	1, 8
Сорт дикого типа Rosalina	Закр. сосуд; без выпар.	0,40	5,3	0,36	4, 1
тройной нуль-мутант	Закр. сосуд; без выпар.	О, 28	2,2	0,11	1, 8
Низкотемпературная сушка при 75°С
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	Оу 21	4,4	0,27	4, 7
тройной нуль-мутант	Откр, сосуд; выпар.	Оу 31	1, э	0,18	1, 8

*) - сокращения: открытый сосуд (откр. сосуд) или закрытый сосуд (закр. сосуд); без выпаривания (без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.).

DMS и свободный T2N в свежем и передержанном пиве

Таблица 13

Тип ячменя	Тип варки *)	DMS (млрд.д.)	Свободный T2N **) (млрд.д.)	so2 (м.д.)	Свободный T2N ***) (млрд.д.)
Нормальная сушка при 85 °C
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	117	0, 011	5	0, 055
тройной нуль-мутант	Откр. сосуд; выпар.	1	0, 011	5	0, 018
Сорт дикого типа Rosalina	Закр. сосуд; без выпар.	326	0, 011	5	0, 035
тройной нуль-мутант	Закр. сосуд; без выпар.	2	0, 012	4	0, 017
Низкотемпературная сушка при 75* С
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	174	-	10	-
тройной нуль-мутант	Откр. сосуд; выпар.	5	-	5	-

*) - сокращения: открытый сосуд (откр. сосуд) или закрытый сосуд (закр. сосуд); без выпаривания (без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.);

**) - в свежем пиве;

***) - в пиве, инкубируемом в течение 2 недель при 37°С.

Таблица 14

Органолептическая оценка свежего и передержанного пива, получаемого из сорта дикого типа Rosalina и солода из тройного нуль-мутанта

		Условия инкубации пива
Свежее	2 недели при 37°С
Тип ячменя	Тип варки *)	Показатель вкуса1	Комментарии	Показатель старения2	Показатель картонного привкуса3
Нормальная сушка зерен при 85°С
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	3,4	с незначительными соединениями серы
со значительными DMS
тройной нуль-мутант	Откр. сосуд; выпар.	5,7	Незначительное горькое послевкусие	2,4	1
Сорт дикого типа Rosalina	Закр. сосуд; без выпар.	3, 1	с незначительными DMS
тройной нуль-мутант	Закр. сосуд; без выпар.	5,0	Незначительно прокисшее	2,7	2,0
Незначительно хмелевое
Незначительный резкий горький привкус
Незначительно зернистое

- 53 031578

Низкотемпературная сушка зерен при 756С
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	4,8	Незначительно фруктовое
с заметными DMS
тройной нуль-мутант	Откр. сосуд; выпар.	5, 2	Незначительно горькое	2,1	0,7
Незначительно кислое

*) - сокращения: открытый сосуд (откр. сосуд) или закрытый сосуд (закр. сосуд);

без выпаривания (без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.);

¹ - по шкале 1-9, где 9 является наилучшим;

² - по шкале 0-5, где 0 означает свежее пиво, а 5 представляет собой очень передержанное пиво;

³ - по шкале 0-5, где 5 означает пиво с сильным привкусом картона.

Таблица 15

ТНА в пиве, получаемом из солода из сорта Rosalina и из тройного нуль-мутанта

Тип ячменя	Тип варки *)	9,12,13-Hodea (мг/л)	9,10,13-Hodea (мг/л)	9.12.13- Hodea/ 9.10.13- Hodea
Нормальная сушка при 85°С
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	3,68	0, 84	4,4
тройной нуль-мутант	Откр. сосуд; выпар.	0,75	0, 29	2,5
Сорт дикого типа Rosalina	Закр. сосуд; без выпар.	3,28	0, 78	4,2
тройной нуль-мутант	Закр. сосуд; без выпар.	0,51	0, 23	2,2
Низкотемпературная сушка при 7 5 °C
Сорт дикого типа Rosalina	Откр. сосуд; выпар.	3,77	0, 8	4,7
тройной нуль-мутант		0,49	0, 22	2,2

*) - сокращения: открытый сосуд (откр. сосуд) или закрытый сосуд (закр. сосуд); без выпаривания (без выпар.) или с обеспечением выпаривания (выпар.)

Список последовательностей

Таблица 16

SEQ ID NO	Соответствует	Описание
SEQ ID NO: 1	SEQ ID N0:1 международной патентной заявки W02005/087934	гДНК ячмень сорта Barke, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена, кодирующего LOX-1
SEQ TD NO: 2	SEQ ID N0:2 международной патентной заявки WO2005/087934	гДНК ячменя мутанта D112, перекрывающая область между старт- и стоп-кодонами соответствующего гена, кодирующего LOX-1 сорта Barke
SEQ ID N0:3	SEQ ID N0:3 международной патентной заявки W02005/087934	Белковая последовательность полноразмерного белка LOX-1 сорта Barke
SEQ ID N0:4	SEQ ID N0:4 международной патентной заявки W02005/087934	Белковая последовательность неактивного укороченного LOX-1 мутанта D112
SEQ ID N0:5	SEQ ID N0:1 международной патентной заявки PCT/DK2009/050 355, опубликованной как W02010/075860	Последовательность геномной ДНК дикого типа, кодирующая L0X-2 из сорта Barke
SEQ ID NO: 6	SEQ ID N0:2 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как WQ2010/075860	Последовательность геномной ДНК мутантного LOX-2 из мутанта ячменя А689
SEQ ID N0:7	SEQ ID N0:5 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как W02010/075860	Последовательность полноразмерного белка LOX-2 ячменя дикого типа, сорт Barke

- 54 031578

SEQ ID NO: 8	SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050355, опубликованной как W02010/075860	Последовательность белка мутанта LQX-2 без активности LOX-2 из мутанта ячменя А689.
SEQ ID NO: 9	SEQ ID N0:3 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как W02010/063288	гДНК ячменя сорта Prestige, геномная последовательность, перекрывающая старт- и стопкодоны гена ММТ
SEQ ID NO: 10	SEQ ID N0:8 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как W02010/063288	гДНК ячменя мутанта 8063, Геномная последовательность ММТ, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID N0:11	SEQ ID N0:16 международной патентной заявки PCT/DK2009./050315, опубликованной как W02010/063288	гДНК ячменя сортов Sebastian, геномная последовательность ММТ, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID NO: 12	SEQ ID N0:19 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как W02010/063288	гДНК ячменя мутанта 14018, геномная последовательность ММТ, перекрывающая старт- и стоп-кодоны гена ММТ
SEQ ID NO: 13	SEQ ID N0:6 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как W02010/063288	Последовательность ячмень ММТ сорта Prestige
SEQ ID NO: 14	SEQ ID N0:18 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как W02010/063288	Последовательность ММТ ячменя сорта Sebastian

SEQ ID NO: 15	SEQ ID NO;22 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WO2010/063288	Полная транслируемая последовательность, получаемая из неправильно сплайсированной РНК мутанта 14018
SEQ ID N0:16	SEQ TD N0:24 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как WQ2010/063288	Полная транслируемая последовательность, получаемая из неправильно сплайсированной РНК мутанта ячменя 14018
SEQ ID NO: 17	SEQ ID N0:26 международной патентной заявки PCT/DK2009/050315, опубликованной как W02010/063288	Полная транслируемая последователь ность, получаемая из неправильно сплайсированной РНК мутанта ячменя 14018

Цитируемые ссылки. Патентные документы. Патент США № 4683195 Mullis K.B. et al., патент США № 4800159 Mullis K.B. et al., патентная заявка РСТ WO 02/053721 Douma А.С. et al., патентная заявка РСТ WO 2005/087934 Breddam K. et al., патент Европы № ЕР 1609866 Hirota N. et al., PCT/DK 2009/050315 Knudsen S. et al., PCT/DK 2009/050355 Skadhauge B. et al.

Другие публикации.

American Association of Cereal Chemists, Approved methods of the American Association of Cereal Chemists. ISBN 0-91325086-4 (1995).

American Society of Brewing Chemists, Methods of analysis of the American Society of Brewing Chemists. ISBN 1-881696-014 (1992).

Baur, C. and Grosch. W., Investigation about the taste of di-, tri- and tetrahydroxy fatty acids. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 165: 82-84 (1977).

Baur, C. et al., Enzymatic oxidation of linoleic acid: Formation of bittertasting fatty acids. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 164:171-176 (1977).

B. Bonacchelli, C. De Brackeleire and F. Harmegnies Wort boiling - the Meura's concept with wortstripping Proceedings of the 31st International Congress of the European Brewery Convention Venice, Italy, 6-10 May 2007, Contribution no. 58, ISBN 978-90-70143-24-4

Briggs, D.E. et al., Malting and brewing science. Volume I Malt and sweet wort. Chapman and Hall. New York. USA. ISBN 0412165805 (1981) .

Durai, S. et al., Zinc finger nucleases: custom-designed molecular scissors for genome engineering of plant and mammalian cells. Nucleic Acids Res. 33:5978-5990 (2005).

European Brewery Convention. Analytics - EBC. ISBN 3418-00759-7 (1998).

Groenqvist, A. et al., Carbonyl compounds during beer

- 55 031578 production in beer. Proceedings of the 24th EBC Congress,

Oslo, pp. 421-428 (1993) .

Hamberg, M. ,	Trihydroxyoctadecenoic	acids	in	beer :
Qualitative and quantitative analysis. J. 39:1568-1572 (1991).	Agric.	Food	Chem.
Hansen, M. et al	., Antisense—mediated	suppression	of C-

hordein biosynthesis in the barley grain results in correlated changes in the transcriptome, protein profile, and amino acid composition. J. Exp. Bot. 58:3987-3995 (2007).

Hough, J.S. et al., Malting and brewing science. Volume II Hopped wort and beer. Chapman and Hall, New York, USA. ISBN 0412165902 (1982).

Iida, S. and Terada, R., Modification of endogenous natural genes by gene targeting in rice and other higher plants. Plant Mol. Biol. 59:205-219 (2005).

Institute of Brewing, Institute of Brewing. Methods of analysis. ISBN 0-900489-10-3 (1997).

Jamieson, A.M. and van Gheluwe, J.E.A., Identification of a compound responsible for cardboard flavor in beer. Proc. Am. Soc. Brew. Chem. 29:192-197 (1970).

Kleinhofs, A. et al·., Induction and selection of specific gene mutations in Hordeum and Pisum. Mut. Res. 51:29-35 (1978) .

Kumar, S. et al·., Gene targeting in plants: fingers on the move. Trends Plant Sci. 11:159-161 (2006).

Kuroda, H. et al., Characterization of factors involved in the production of 2(E)-nonenal during mashing. Biosci. Biotechnol. Biochem. 67:691-697 (2003).

Kuroda, H. et al., Characterization of 9-fatty acid hydroperoxide lyase-like activity in germinating barley seeds that transforms 9(S)-hydroperoxy-10 (E) .12 (Z)-octadecadienoic acid into 2 (E)-nonenal. Biosci. Biotechnol. Biochem. 69:16611668 (2005).

Lermusieau, G. et al., Nonoxidative mechanism for development of trans-2-nonenal in beer. J. Am. Soc. Brew. Chem. 57:29-33 (1999).

Liegeois, C. et al., Release of deuterated (E)-2-nonenal during beer aging from labeled precursors synthesized before boiling. J. Agric. Food Chem. 50:7634-7638 (2002).

Maquat, L.E. and Carmichael, G.G., Quality control of mRNA function. Cell 104:173-176 (2001).

Meilgaard, M.C., Flavor chemistry of beer: Part II: Flavor and threshold of 239 aroma volatiles. Tech. Q. MBAA 12:151-167 (1975) .

Mendell, J.T. and Dietz, H.C., When the message goes awry: Disease-producing mutations that influence mRNA content and performance. Cell 107:411-414 (2002).

Nevo, E., Resources for Breeding of Wild Barley. In: Barley: Genetics. Biochemistry. Molecular Biology and

Biotechnology. Shewry. P.R., ed., pp. 3-18. C.A.B. International. ISBN 0-85198-725-7 (1992).

Nyborg, M. et al., Investigations of the protective mechanism of sulfite against beer staling and formation of adducts with trans-2-nonenal. J. Am. Soc. Brew. Chem. 57:24-28 (1999).

Rasmussen, S.K. and Hatzack, F., Identification of two low-phytate barley (Hordeum vulgare L.) grain mutants by TLC and genetic analysis. Hereditas 129:107-112 (1998).

Robbins, M.P. et al., Gene manipulation of condensed tannins in higher plants. Plant Physiol. 116:1133-1144 (1998).

Sambrook, J. and Russell. D.W., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York. ISBN 0-87969-577-3 (2001).

Schmitt, N.F. and van Mechelen. J.R., Expression of lipoxygenase isoenzymes in developing barley grains. Plant Sci. 128:141-150 (1997).

Stahl, Y. et al., Antisense downregulation of the barley limit dextrinase inhibitor modulates starch granule sizes distribution, starch composition and amylopectin structure. Plant J. 39:599-611 (2004).

Tzfira, T. and White. C., Towards targeted mutagenesis and gene replacement in plants. Trends Biotechnol. 23:567-569

- 56 031578 (2005) .

von Bothmer, R. et al., Diversity in barley (Hordeum vulgare). In: Diversity in Barley (Hordeum vulgare). von Bothmer, R., van Hintum, T., Kntipffer, H., Sato. K., eds., pp. 129-136. ISBN 0-444-50587-7 (2003). Также предоставленный на http://www. genres . de/.

Wackerbauer, K. and Meyna, S., Freie und triglyceridegebundene Hydroxyfettsauren in Gerste und Malz, Monatsschrift fur Brauwissenschaft, heft 3/4: 52-57 (2002).

Wu, J. et al., Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) silences the accumulation of aberrant trypsin proteinase inhibitor mRNA in Nicotiana attenuata. Plant J. 51:693-706 (2007) .

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Carlsberg Breweries A/S Heineken Supply Chain B.V.

<120> СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НАПИТКА НА ОСНОВЕ ЯЧМЕНЯ <130> P2253PC00 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4165 <212> ДНК <213> Hordeum vulgare сорт Barke <400> 1

atgctgctgg	gagggctgat	cgacaccctc	acgggggcga	acaagagcgc	ccggctcaag	60
ggcacggtgg	tgctcatgcg	caagaacgtg	ctggacctca	acgacttcgg	cgccaccatc	120
atcgacggca	tcggcgagtt	cctcggcaag	ggcgtcacct	gccagcttat	cagctccacc	180
gccgtcgacc	aaggtaatca	ctaccctcct	ccggccttct	cctctgttta	caagatatag	240
tatttctttc	gtgtgggccg	gcggccatgg	atggatggat	gtgtctggat	cggctaaaga	300
agataggata	gctagccctg	gccggtcgtc	tttacctgag	catgggcata	tgccatcgaa	360
aaaagagaca	acagcatgca	tgcatggtgc	gcgcaccaga	ccacgcagag	caccggatgc	420
tcgagacaaa	gcaacacaac	aagcaaggac	gacacgtcaa	aagcaacaca	acaagcaagg	480
acggcacgtc	aaaagcaaca	caaacctaaa	ctaaagcaca	aagacgtaag	agcaagcaca	540
caatcagcag	gctataaaca	gttgtcatca	aaaacaacgc	tggaagagag	agagaaggaa	600
ggaagtagta	gccatgaaaa	attaaatcac	cgggcgttgc	tctttgccca	acaattaatc	660
aagcaggata	cgtggcatgt	atagttcttg	taagtaaact	aagcatgtga	tatgagaagg	720
tacgtggtgg	tgcagacaac	ggcggtcgcg	ggaaggtggg	cgcggaggcg	gagctggagc	780
agtgggtgac	gagcctgccg	tcgctgacga	cgggggagtc	caagttcggc	ctcaccttcg	840
actgggaggt	ggagaagctc	ggggtgccgg	gcgccatcgt	cgtcaacaac	taccacagct	900
ccgagttcct	gcttaaaacc	atcaccctcc	acgacgtccc	cggccgcagc	ggcaacctca	960

- 57 031578

ccttcgtcgc	caactcatgg	atctaccccg	ccgccaacta	ccgatacagc	cgcgtcttct	1020
tcgccaacga	cgtgcgtgga	ttttcctcta	ctttcctctc	ctttcatttt	caccgccttc	1080
gtcattcatg	gtcgatcatt	aagtcttgcc	aggacaatag	atgatgagct	aggagtggtt	1140
accacttagc	agtacgtaca	ttatttattc	cgtgttggta	gaaaaggata	tggtttggtg	1200
cagatcgaca	caagattgaa	tgaaagttgc	accgtggcac	cgtggcagcg	tggtaggtga	1260
aaataactgt	tgcacggatc	cacccacatg	attgttttca	tgaataaact	ttttaaggat	1320
gtgtctagcc	acatctagat	gcatgtcaca	taattattgc	ataccaaaac	gattaaatta	1380
agcataaaaa	gaaaaggaaa	aaaatactca	catatctcga	cgtaagatca	atgatatagt	1440
atttagatat	gcaatattta	tcttacatct	aaacctttct	tcattcctaa	atataagaca	1500
tttgtaagat	ttcactatgg	acaacatacg	aaacaaaatc	agtggatctc	tctatgcatt	1560
cattatgtag	tctataataa	aatctttaaa	agatcgtata	ttttgcaacg	gagggagtaa	1620
aacataactt	tttaatagta	atgttgcacg	gctccacact	cgcagacgta	cctgccgagc	1680
cagatgccgg	cggcgctgaa	gccgtaccgc	gacgacgagc	tccggaacct	gcgtggcgac	1740
gaccagcagg	gcccgtacca	ggagcacgac	cgcatctacc	gctacgacgt	ctacaacgac	1800
ctcggcgagg	gccgccccat	cctcggcggc	aactccgacc	acccttaccc	gcgccgcggc	1860
cgcacggagc	gcaagcccaa	cgccagcgac	ccgagcctgg	agagccggct	gtcgctgctg	1920
gagcagatct	acgtgccgcg	ggacgagaag	ttcggccacc	tcaagacgtc	cgacttcctg	1980
ggctactcca	tcaaggccat	cacgcagggc	atcctgccgg	ccgtgcgcac	ctacgtggac	2040
accacccccg	gcgagttcga	ctccttccag	gacatcatca	acctctatga	gggcggcatc	2100
aagctgccca	aggtggccgc	cctggaggag	ctccgtaagc	agttcccgct	ccagctcatc	2160
aaggacctcc	tccccgtcgg	cggcgactcc	ctgcttaagc	tccccgtgcc	ccacatcatc	2220
caggagaaca	agcaggcgtg	gaggaccgac	gaggagttcg	cacgggaggt	gctcgccggc	2280
gtcaacccgg	tcatgatcac	gcgtctcacg	gtgagtcagc	gattatttgt	tcattgtgtg	2340
tgtatggtgt	ccatggtgag	aaagtgcaga	tcttgatttg	cgttgggtcg	catgcacgca	2400
tgctgcatgc	atgcaggagt	tcccgccaaa	aagtagtctg	gaccctagca	agtttggtga	2460
ccacaccagc	accatcacgg	cggagcacat	agagaagaac	ctcgagggcc	tcacggtgca	2520
gcaggtaatt	ggtccaagcc	atcgacatca	actatgattt	acctaggagt	aattggtagc	2580
tgtagataat	ttggcttcgt	tgcaattaat	ttgatgctgg	ccgatcaagt	gatcgtattg	2640
ggtttgaaat	ttgcaggcgc	tggaaagcaa	caggctgtac	atccttgatc	accatgaccg	2700
gttcatgccg	ttcctgatcg	acgtcaacaa	cctgcccggc	aacttcatct	acgccacgag	2760
gaccctcttc	ttcctgcgcg	gcgacggcag	gctcacgccg	ctcgccatcg	agctgagcga	2820

- 58 031578

gcccatcatc	cagggcggcc	ttaccacggc	caagagcaag	gtttacacgc	cggtgcccag	2880
cggctccgtc	gaaggctggg	tgtgggagct	cgccaaggcc	tacgtcgccg	tcaatgactc	2940
cgggtggcac	cagctcgtca	gccactggta	cgttctccac	ggtcgatgtg	attcagtcag	3000
tcgatgcaca	acaactgatc	gaaatatgat	tgattgaaac	gcgcaggctg	aacactcacg	3060
cggtgatgga	gccgttcgtg	atctcgacga	accggcacct	tagcgtgacg	cacccggtgc	3120
acaagctgct	gagcccgcac	taccgcgaca	ccatgaccat	caacgcgctg	gcgcggcaga	3180
cgctcatcaa	cgccggcggc	atcttcgaga	tgacggtgtt	cccgggcaag	ttcgcgttgg	3240
ggatgtcggc	cgtggtgtac	aaggactgga	agttcaccga	gcagggactg	ccggacgatc	3300
tcatcaagag	gtacgtacct	ggtaaatgtt	atgaatgtgt	aaaacaaatt	gggcgtctcg	3360
ctcactgaca	ggaacgtggt	aaaaaaaatg	caggggcatg	gcggtggagg	acccgtcgag	3420
cccgtacaag	gtgcggttgc	tggtgtcgga	ctacccgtac	gcggcggacg	ggctggcgat	3480
ctggcacgcc	attgagcagt	acgtgagcga	gtacctggcc	atctactacc	cgaacgacgg	3540
cgtgctgcag	ggcgatacgg	aggtgcaggc	gtggtggaag	gagacgcgcg	aggtcgggca	3600
cggcgacctc	aaggacgccc	catggtggcc	caagatgcaa	agtgtgccgg	agctggccaa	3660
ggcgtgcacc	accatcatct	ggatcgggtc	ggcgctgcat	gcggcagtca	acttcgggca	3720
gtacccctac	gcggggttcc	tcccgaaccg	gccgacggtg	agccggcgcc	gcatgccgga	3780
gcccggcacg	gaggagtacg	cggagctgga	gcgcgacccg	gagcgggcct	tcatccacac	3840
catcacgagc	cagatccaga	ccatcatcgg	cgtgtcgctg	ctggaggtgc	tgtcgaagca	3900
ctcctccgac	gagctgtacc	tcgggcagcg	ggacacgccg	gagtggacct	cggacccaaa	3960
ggccctggag	gtgttcaagc	ggttcagcga	ccggctggtg	gagatcgaga	gcaaggtggt	4020
gggcatgaac	catgacccgg	agctcaagaa	ccgcaacggc	ccggctaagt	ttccctacat	4080
gctgctctac	cccaacacct	ccgaccacaa	gggcgccgct	gccgggctta	ccgccaaggg	4140
catccccaac	agcatctcca	tctaa				4165

<210> 2 <211> 4165 <212> ДНК <213> Hordeum vulgare мутант D112 <400> 2

atgctgctgg	gagggctgat	cgacaccctc	acgggggcga	acaagagcgc	ccggctcaag	60
ggcacggtgg	tgctcatgcg	caagaacgtg	ctggacctca	acgacttcgg	cgccaccatc	120
atcgacggca	tcggcgagtt	cctcggcaag	ggcgtcacct	gccagcttat	cagctccacc	180
gccgtcgacc	aaggtaatca	ctaccctcct	ccggccttct	cctctgttta	caagatatag	240
tatttctttc	gtgtgggccg	gcggccatgg	atggatggat	gtgtctggat	cggctaaaga	300

- 59 031578

agataggata	gctagccctg	gccggtcgtc	tttacctgag	catgggcata	tgccatcgaa	360
aaaagagaca	acagcatgca	tgcatggtgc	gcgcaccaga	ccacgcagag	caccggatgc	420
tcgagacaaa	gcaacacaac	aagcaaggac	gacacgtcaa	aagcaacaca	acaagcaagg	480
acggcacgtc	aaaagcaaca	caaacctaaa	ctaaagcaca	aagacgtaag	agcaagcaca	540
caatcagcag	gctataaaca	gttgtcatca	aaaacaacgc	tggaagagag	agagaaggaa	600
ggaagtagta	gccatgaaaa	attaaatcac	cgggcgttgc	tctttgccca	acaattaatc	660
aagcaggata	cgtggcatgt	atagttcttg	taagtaaact	aagcatgtga	tatgagaagg	720
tacgtggtgg	tgcagacaac	ggcggtcgcg	ggaaggtggg	cgcggaggcg	gagctggagc	780
agtgggtgac	gagcctgccg	tcgctgacga	cgggggagtc	caagttcggc	ctcaccttcg	840
actgggaggt	ggagaagctc	ggggtgccgg	gcgccatcgt	cgtcaacaac	taccacagct	900
ccgagttcct	gcttaaaacc	atcaccctcc	acgacgtccc	cggccgcagc	ggcaacctca	960
ccttcgtcgc	caactcatgg	atctaccccg	ccgccaacta	ccgatacagc	cgcgtcttct	1020
tcgccaacga	cgtgcgtgga	ttttcctcta	ctttcctctc	ctttcatttt	caccgccttc	1080
gtcattcatg	gtcgatcatt	aagtcttgcc	aggacaatag	atgatgagct	aggagtggtt	1140
accacttagc	agtacgtaca	ttatttattc	cgtgttggta	gaaaaggata	tggtttggtg	1200
cagatcgaca	caagattgaa	tgaaagttgc	accgtggcac	cgtggcagcg	tggtaggtga	1260
aaataactgt	tgcacggatc	cacccacatg	attgttttca	tgaataaact	ttttaaggat	1320
gtgtctagcc	acatctagat	gcatgtcaca	taattattgc	ataccaaaac	gattaaatta	1380
agcataaaaa	gaaaaggaaa	aaaatactca	catatctcga	cgtaagatca	atgatatagt	1440
atttagatat	gcaatattta	tcttacatct	aaacctttct	tcattcctaa	atataagaca	1500
tttgtaagat	ttcactatgg	acaacatacg	aaacaaaatc	agtggatctc	tctatgcatt	1560
cattatgtag	tctataataa	aatctttaaa	agatcgtata	ttttgcaacg	gagggagtaa	1620
aacataactt	tttaatagta	atgttgcacg	gctccacact	cgcagacgta	cctgccgagc	1680
cagatgccgg	cggcgctgaa	gccgtaccgc	gacgacgagc	tccggaacct	gcgtggcgac	1740
gaccagcagg	gcccgtacca	ggagcacgac	cgcatctacc	gctacgacgt	ctacaacgac	1800
ctcggcgagg	gccgccccat	cctcggcggc	aactccgacc	acccttaccc	gcgccgcggc	1860
cgcacggagc	gcaagcccaa	cgccagcgac	ccgagcctgg	agagccggct	gtcgctgctg	1920
gagcagatct	acgtgccgcg	ggacgagaag	ttcggccacc	tcaagacgtc	cgacttcctg	1980
ggctactcca	tcaaggccat	cacgcagggc	atcctgccgg	ccgtgcgcac	ctacgtggac	2040
accacccccg	gcgagttcga	ctccttccag	gacatcatca	acctctatga	gggcggcatc	2100
aagctgccca	aggtggccgc	cctggaggag	ctccgtaagc	agttcccgct	ccagctcatc	2160
aaggacctcc	tccccgtcgg	cggcgactcc	ctgcttaagc	tccccgtgcc	ccacatcatc	2220

- 60 031578

caggagaaca	agcaggcgtg	gaggaccgac	gaggagttcg	cacgggaggt	gctcgccggc	2280
gtcaacccgg	tcatgatcac	gcgtctcacg	gtgagtcagc	gattatttgt	tcattgtgtg	2340
tgtatggtgt	ccatggtgag	aaagtgcaga	tcttgatttg	cgttgggtcg	catgcacgca	2400
tgctgcatgc	atgcaggagt	tcccgccaaa	aagtagtctg	gaccctagca	agtttggtga	2460
ccacaccagc	accatcacgg	cggagcacat	agagaagaac	ctcgagggcc	tcacggtgca	2520
gcaggtaatt	ggtccaagcc	atcgacatca	actatgattt	acctaggagt	aattggtagc	2580
tgtagataat	ttggcttcgt	tgcaattaat	ttgatgctgg	ccgatcaagt	gatcgtattg	2640
ggtttgaaat	ttgcaggcgc	tggaaagcaa	caggctgtac	atccttgatc	accatgaccg	2700
gttcatgccg	ttcctgatcg	acgtcaacaa	cctgcccggc	aacttcatct	acgccacgag	2760
gaccctcttc	ttcctgcgcg	gcgacggcag	gctcacgccg	ctcgccatcg	agctgagcga	2820
gcccatcatc	cagggcggcc	ttaccacggc	caagagcaag	gtttacacgc	cggtgcccag	2880
cggctccgtc	gaaggctggg	tgtgggagct	cgccaaggcc	tacgtcgccg	tcaatgactc	2940
cgggtggcac	cagctcgtca	gccactggta	cgttctccac	ggtcgatgtg	attcagtcag	3000
tcgatgcaca	acaactgatc	gaaatatgat	tgattgaaac	gcgcaggctg	aacactcacg	3060
cggtgatgga	gccgttcgtg	atctcgacga	accggcacct	tagcgtgacg	cacccggtgc	3120
acaagctgct	gagcccgcac	taccgcgaca	ccatgaccat	caacgcgctg	gcgcggcaga	3180
cgctcatcaa	cgccggcggc	atcttcgaga	tgacggtgtt	cccgggcaag	ttcgcgttgg	3240
ggatgtcggc	cgtggtgtac	aaggactgga	agttcaccga	gcagggactg	ccggacgatc	3300
tcatcaagag	gtacgtacct	ggtaaatgtt	atgaatgtgt	aaaacaaatt	gggcgtctcg	3360
ctcactgaca	ggaacgtggt	aaaaaaaatg	caggggcatg	gcggtggagg	acccgtcgag	3420
cccgtacaag	gtgcggttgc	tggtgtcgga	ctacccgtac	gcggcggacg	ggctggcgat	3480
ctggcacgcc	attgagcagt	acgtgagcga	gtacctggcc	atctactacc	cgaacgacgg	3540
cgtgctgcag	ggcgatacgg	aggtgcaggc	gtgatggaag	gagacgcgcg	aggtcgggca	3600
cggcgacctc	aaggacgccc	catggtggcc	caagatgcaa	agtgtgccgg	agctggccaa	3660
ggcgtgcacc	accatcatct	ggatcgggtc	ggcgctgcat	gcggcagtca	acttcgggca	3720
gtacccctac	gcggggttcc	tcccgaaccg	gccgacggtg	agccggcgcc	gcatgccgga	3780
gcccggcacg	gaggagtacg	cggagctgga	gcgcgacccg	gagcgggcct	tcatccacac	3840
catcacgagc	cagatccaga	ccatcatcgg	cgtgtcgctg	ctggaggtgc	tgtcgaagca	3900
ctcctccgac	gagctgtacc	tcgggcagcg	ggacacgccg	gagtggacct	cggacccaaa	3960
ggccctggag	gtgttcaagc	ggttcagcga	ccggctggtg	gagatcgaga	gcaaggtggt	4020
gggcatgaac	catgacccgg	agctcaagaa	ccgcaacggc	ccggctaagt	ttccctacat	4080

- 61 031578 gctgctctac cccaacacct ccgaccacaa gggcgccgct gccgggctta ccgccaaggg catccccaac agcatctcca tctaa

4140

4165 <210> 3 <211> 862 <212> БЕЛОК <213> Hordeum vulgare сорт Barke <400> 3

Met 1

Leu

Leu

Gly Gly Leu 5

Ile Asp

Thr Leu 10

Thr

Gly Ala

Asn

Lys 15

Ser

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Thr

Val

Val

Leu

Met

Arg

Lys

Asn

Val

Leu

Asp

20

25

30

Leu

Asn

Asp

Phe

Gly

Ala

Thr

Ile

Ile

Asp

Gly

Ile

Gly

Glu

Phe

Leu

35

40

45

Gly

Lys

Gly

Val

Thr

Cys

Gln

Leu

Ile

Ser

Ser

Thr

Ala

Val

Asp

Gln

50

55

60

Asp

Asn

Gly

Gly

Arg

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Ala

Glu

Leu

Glu

Gln

65

70

75

80

Trp

Val

Thr

Ser

Leu

Pro

Ser

Leu

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Lys

Phe

Gly

85

90

95

Leu

Thr

Phe

Asp

Trp

Glu

Val

Glu

Lys

Leu

Gly

Val

Pro

Gly

Ala

Ile

100

105

110

Val

Val

Asn

Asn

Tyr

His

Ser

Ser

Glu

Phe

Leu

Leu

Lys

Thr

Ile

Thr

115

120

125

Leu

His

Asp

Val

Pro

Gly

Arg

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Phe

Val

Ala

Asn

130

135

140

Ser

Trp

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Asn

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Arg

Val

Phe

Phe

145

150

155

160

Ala

Asn

Asp

Thr

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gln

Met

Pro

Ala

Ala

Leu

Lys

Pro

165

170

175

Tyr

Arg

Asp

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

Asp

Asp

Gln

Gln

Gly

180

185

190

Pro

Tyr

Gln

Glu

His

Asp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Tyr

Asp

Val

Tyr

Asn

Asp

195

200

205

- 62 031578

Leu Gly

Glu

Gly Arg

Pro

Ile 215

Leu Gly

Gly Asn

Ser 220

Asp

His

Pro

Tyr

210

Pro

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Glu

Arg

Lys

Pro

Asn

Ala

Ser

Asp

Pro

Ser

225

230

235

240

Leu

Glu

Ser

Arg

Leu

Ser

Leu

Leu

Glu

Gln

Ile

Tyr

Val

Pro

Arg

Asp

245

250

255

Glu

Lys

Phe

Gly

His

Leu

Lys

Thr

Ser

Asp

Phe

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

260

265

270

Lys

Ala

Ile

Thr

Gln

Gly

Ile

Leu

Pro

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Val

Asp

275

280

285

Thr

Thr

Pro

Gly

Glu

Phe

Asp

Ser

Phe

Gln

Asp

Ile

Ile

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

Glu

Gly

Gly

Ile

Lys

Leu

Pro

Lys

Val

Ala

Ala

Leu

Glu

Glu

Leu

Arg

305

310

315

320

Lys

Gln

Phe

Pro

Leu

Gln

Leu

Ile

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Val

Gly

Gly

325

330

335

Asp

Ser

Leu

Leu

Lys

Leu

Pro

Val

Pro

His

Ile

Ile

Gln

Glu

Asn

Lys

340

345

350

Gln

Ala

Trp

Arg

Thr

Asp

Glu

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Val

Leu

Ala

Gly

355

360

365

Val

Asn

Pro

Val

Met

Ile

Thr

Arg

Leu

Thr

Glu

Phe

Pro

Pro

Lys

Ser

370

375

380

Ser

Leu

Asp

Pro

Ser

Lys

Phe

Gly

Asp

His

Thr

Ser

Thr

Ile

Thr

Ala

385

390

395

400

Glu

His

Ile

Glu

Lys

Asn

Leu

Glu

Gly

Leu

Thr

Val

Gln

Gln

Ala

Leu

405

410

415

Glu

Ser

Asn

Arg

Leu

Tyr

Ile

Leu

Asp

His

His

Asp

Arg

Phe

Met

Pro

420

425

430

Phe

Leu

Ile

Asp

Val

Asn

Asn

Leu

Pro

Gly

Asn

Phe

Ile

Tyr

Ala

Thr

435

440

445

Arg

Thr

Leu

Phe

Phe

Leu

Arg

Gly

Asp

Gly

Arg

Leu

Thr

Pro

Leu

Ala

450 455 460

- 63 031578

Ile 465

Glu

Leu

Ser

Glu

Pro 470

Ile

Ile

Gln

Gly

Gly 475

Leu

Thr

Thr

Ala

Lys 480

Ser

Lys

Val

Tyr

Thr

Pro

Val

Pro

Ser

Gly

Ser

Val

Glu

Gly

Trp

Val

485

490

495

Trp

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Tyr

Val

Ala

Val

Asn

Asp

Ser

Gly

Trp

His

500

505

510

Gln

Leu

Val

Ser

His

Trp

Leu

Asn

Thr

His

Ala

Val

Met

Glu

Pro

Phe

515

520

525

Val

Ile

Ser

Thr

Asn

Arg

His

Leu

Ser

Val

Thr

His

Pro

Val

His

Lys

530

535

540

Leu

Leu

Ser

Pro

His

Tyr

Arg

Asp

Thr

Met

Thr

Ile

Asn

Ala

Leu

Ala

545

550

555

560

Arg

Gln

Thr

Leu

Ile

Asn

Ala

Gly

Gly

Ile

Phe

Glu

Met

Thr

Val

Phe

565

570

575

Pro

Gly

Lys

Phe

Ala

Leu

Gly

Met

Ser

Ala

Val

Val

Tyr

Lys

Asp

Trp

580

585

590

Lys

Phe

Thr

Glu

Gln

Gly

Leu

Pro

Asp

Asp

Leu

Ile

Lys

Arg

Gly

Met

595

600

605

Ala

Val

Glu

Asp

Pro

Ser

Ser

Pro

Tyr

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

Val

Ser

610

615

620

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Ala

Asp

Gly

Leu

Ala

Ile

Trp

His

Ala

Ile

Glu

625

630

635

640

Gln

Tyr

Val

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asn

Asp

Gly

Val

645

650

655

Leu

Gln

Gly

Asp

Thr

Glu

Val

Gln

Ala

Trp

Trp

Lys

Glu

Thr

Arg

Glu

660

665

670

Val

Gly

His

Gly

Asp

Leu

Lys

Asp

Ala

Pro

Trp

Trp

Pro

Lys

Met

Gln

675

680

685

Ser

Val

Pro

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Cys

Thr

Thr

Ile

Ile

Trp

Ile

Gly

690

695

700

Ser

Ala

Leu

His

Ala

Ala

Val

Asn

Phe

Gly

Gln

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Gly

- 64 031578

705 710 715720

Phe

Leu

Pro

Asn Arg 725

Pro

Thr

Val

Ser Arg 730

Arg

Arg

Met

Pro

Glu 735

Pro

Gly

Thr

Glu

Glu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Glu

Arg

Asp

Pro

Glu

Arg

Ala

Phe

740

745

750

Ile

His

Thr

Ile

Thr

Ser

Gln

Ile

Gln

Thr

Ile

Ile

Gly

Val

Ser

Leu

755

760

765

Leu

Glu

Val

Leu

Ser

Lys

His

Ser

Ser

Asp

Glu

Leu

Tyr

Leu

Gly

Gln

770

775

780

Arg

Asp

Thr

Pro

Glu

Trp

Thr

Ser

Asp

Pro

Lys

Ala

Leu

Glu

Val

Phe

785

790

795

800

Lys

Arg

Phe

Ser

Asp

Arg

Leu

Val

Glu

Ile

Glu

Ser

Lys

Val

Val

Gly

805

810

815

Met

Asn

His

Asp

Pro

Glu

Leu

Lys

Asn

Arg

Asn

Gly

Pro

Ala

Lys

Phe

820

825

830

Pro

Tyr

Met

Leu

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Ser

Asp

His

Lys

Gly

Ala

Ala

835

840

845

Ala

Gly

Leu

Thr

Ala

Lys

Gly

Ile

Pro

Asn

Ser

Ile

Ser

Ile

850

855

860

<210>4 <211>665 <212> БЕЛОК <213> Hordeum vulgare мутант D112 <400>4

Met 1

Leu

Leu

Gly

Gly Leu 5

Ile Asp

Thr

Leu Thr Gly Ala Asn Lys

Ser

10

15

Ala

Arg

Leu

Lys

Gly

Thr

Val

Val

Leu

Met

Arg

Lys

Asn

Val

Leu

Asp

20

25

30

Leu

Asn

Asp

Phe

Gly

Ala

Thr

Ile

Ile

Asp

Gly

Ile

Gly

Glu

Phe

Leu

35

40

45

Gly

Lys

Gly

Val

Thr

Cys

Gln

Leu

Ile

Ser

Ser

Thr

Ala

Val

Asp

Gln

50

55

60

Asp

Asn

Gly

Gly

Arg

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Ala

Glu

Leu

Glu

Gln

- 65 031578

Trp

Val

Thr

Ser

Leu 85

Pro

Ser

Leu

Thr

Thr 90

Gly

Glu

Ser

Lys

Phe 95

Gly

Leu

Thr

Phe

Asp

Trp

Glu

Val

Glu

Lys

Leu

Gly

Val

Pro

Gly

Ala

Ile

100

105

110

Val

Val

Asn

Asn

Tyr

His

Ser

Ser

Glu

Phe

Leu

Leu

Lys

Thr

Ile

Thr

115

120

125

Leu

His

Asp

Val

Pro

Gly

Arg

Ser

Gly

Asn

Leu

Thr

Phe

Val

Ala

Asn

130

135

140

Ser

Trp

Ile

Tyr

Pro

Ala

Ala

Asn

Tyr

Arg

Tyr

Ser

Arg

Val

Phe

Phe

145

150

155

160

Ala

Asn

Asp

Thr

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gln

Met

Pro

Ala

Ala

Leu

Lys

Pro

165

170

175

Tyr

Arg

Asp

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

Asp

Asp

Gln

Gln

Gly

180

185

190

Pro

Tyr

Gln

Glu

His

Asp

Arg

Ile

Tyr

Arg

Tyr

Asp

Val

Tyr

Asn

Asp

195

200

205

Leu

Gly

Glu

Gly

Arg

Pro

Ile

Leu

Gly

Gly

Asn

Ser

Asp

His

Pro

Tyr

210

215

220

Pro

Arg

Arg

Gly

Arg

Thr

Glu

Arg

Lys

Pro

Asn

Ala

Ser

Asp

Pro

Ser

225

230

235

240

Leu

Glu

Ser

Arg

Leu

Ser

Leu

Leu

Glu

Gln

Ile

Tyr

Val

Pro

Arg

Asp

245

250

255

Glu

Lys

Phe

Gly

His

Leu

Lys

Thr

Ser

Asp

Phe

Leu

Gly

Tyr

Ser

Ile

260

265

270

Lys

Ala

Ile

Thr

Gln

Gly

Ile

Leu

Pro

Ala

Val

Arg

Thr

Tyr

Val

Asp

275

280

285

Thr

Thr

Pro

Gly

Glu

Phe

Asp

Ser

Phe

Gln

Asp

Ile

Ile

Asn

Leu

Tyr

290

295

300

Glu

Gly

Gly

Ile

Lys

Leu

Pro

Lys

Val

Ala

Ala

Leu

Glu

Glu

Leu

Arg

305

310

315

320

- 66 031578

Lys

Gln

Phe

Pro

Leu 325

Gln

Leu

Ile

Lys

Asp 330

Leu

Leu

Pro

Val

Gly 335

Gly

Asp

Ser

Leu

Leu

Lys

Leu

Pro

Val

Pro

His

Ile

Ile

Gln

Glu

Asn

Lys

340

345

350

Gln

Ala

Trp

Arg

Thr

Asp

Glu

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Val

Leu

Ala

Gly

355

360

365

Val

Asn

Pro

Val

Met

Ile

Thr

Arg

Leu

Thr

Glu

Phe

Pro

Pro

Lys

Ser

370

375

380

Ser

Leu

Asp

Pro

Ser

Lys

Phe

Gly

Asp

His

Thr

Ser

Thr

Ile

Thr

Ala

385

390

395

400

Glu

His

Ile

Glu

Lys

Asn

Leu

Glu

Gly

Leu

Thr

Val

Gln

Gln

Ala

Leu

405

410

415

Glu

Ser

Asn

Arg

Leu

Tyr

Ile

Leu

Asp

His

His

Asp

Arg

Phe

Met

Pro

420

425

430

Phe

Leu

Ile

Asp

Val

Asn

Asn

Leu

Pro

Gly

Asn

Phe

Ile

Tyr

Ala

Thr

435

440

445

Arg

Thr

Leu

Phe

Phe

Leu

Arg

Gly

Asp

Gly

Arg

Leu

Thr

Pro

Leu

Ala

450

455

460

Ile

Glu

Leu

Ser

Glu

Pro

Ile

Ile

Gln

Gly

Gly

Leu

Thr

Thr

Ala

Lys

465

470

475

480

Ser

Lys

Val

Tyr

Thr

Pro

Val

Pro

Ser

Gly

Ser

Val

Glu

Gly

Trp

Val

485

490

495

Trp

Glu

Leu

Ala

Lys

Ala

Tyr

Val

Ala

Val

Asn

Asp

Ser

Gly

Trp

His

500

505

510

Gln

Leu

Val

Ser

His

Trp

Leu

Asn

Thr

His

Ala

Val

Met

Glu

Pro

Phe

515

520

525

Val

Ile

Ser

Thr

Asn

Arg

His

Leu

Ser

Val

Thr

His

Pro

Val

His

Lys

530

535

540

Leu

Leu

Ser

Pro

His

Tyr

Arg

Asp

Thr

Met

Thr

Ile

Asn

Ala

Leu

Ala

545

550

555

560

Arg

Gln

Thr

Leu

Ile

Asn

Ala

Gly

Gly

Ile

Phe

Glu

Met

Thr

Val

Phe

565

570

575

- 67 031578

Pro

Gly

Lys

Phe 580

Ala Leu

Gly Met

Ser Ala 585

Val

Val

Tyr

Lys 590

Asp

Trp

Lys

Phe

Thr

Glu

Gln

Gly

Leu

Pro

Asp

Asp

Leu

Ile

Lys

Arg

Gly

Met

595

600

605

Ala

Val

Glu

Asp

Pro

Ser

Ser

Pro

Tyr

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

Val

Ser

610

615

620

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Ala

Asp

Gly

Leu

Ala

Ile

Trp

His

Ala

Ile

Glu

625

630

635

640

Gln

Tyr

Val

Ser

Glu

Tyr

Leu

Ala

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asn

Asp

Gly

Val

645

650

655

Leu

Gln

Gly

Asp

Thr

Glu

Val

Gln

Ala

660

665

<210>	5
<211>	3229
<212>	ДНК
<213>	Hordeum vulgare сорт Barke
<400>	5

atgtttggcg	tcggcggcat	cgtgagcgac	ctgacggggg	gcctccgggg	cgcccacctc
aagggctccg	tcgtcctcat	gcgcaagaac	gcgctcgact	tcaacgactt	cggcgccacc
gtcatggacg	gcgtcaccga	gctcctcggc	cgcggcgtca	cctgccagct	catcagctcc
accaacgtcg	accacagtga	gcactcactc	gccactcccc	gttttgtaat	ccctgccact
gtgatacatg	gaaaacggaa	gcagatccgc	atcctcacgc	ccgaaccaag	caaataatat
atataaagaa	ctaaaatgca	cgtatggtta	cggatgcatg	cttatgcttg	agcttgagct
tgagcttgag	agacagggac	gtgcaaaaaa	taacttaata	atggagtaac	taatgtgaga
catgacgcac	ggaggggttt	accttactac	taattaattg	tcgagcagac	aacggtgggc
gcgggaaggt	gggcgcggag	gcgaacctgg	agcagtggct	cctgccgacg	aacctgccgt
tcatcaccac	cggcgagaac	aagttcgccg	tcaccttcga	ctggtcggtg	gacaagctgg
gggtgccggg	ggccatcatc	gtcaagaaca	accacgcctc	cgagttcttc	ctcaagacca
tcaccctcga	caacgtgccc	ggccgcggca	ccatcgtctt	cgtcgccaac	tcatgggtct
acccgcaggc	caagtaccgc	tacaaccgcg	tcttcttcgc	caacgacgtg	agtattttat
acgagtacca	ctccatggta	gctagtacga	tggatttcgc	ttgctcgatg	cctgactggt
cggttccgtt	gggacatacg	tgccgcagac	gtacctgccg	caccagatgc	cggcggcgct
gaagccgtac	cgcgacgacg	agctccggaa	cctgaggggc	gacgaccagc	aggggcccta

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

- 68 031578

cctggaccac	gaccgcgtct	accgctacga	cgtctacaac	gacctcggcg	actcccgcga	1020
cgtcctcggc	ggctccaagg	acctccccta	cccgcgccgc	tgccgcaccg	gccggaagcc	1080
ctcggacagc	agtgcgtgtc	tcctcccttc	tccttccttt	cgatctcccc	ataacgtgta	1140
cttggtctga	caagcatgtg	tggccgacgc	agagcccgac	cacgagagcc	ggctgctgcc	1200
gctggtgcag	aacgtctacg	tgccgcgcga	cgagctcttc	ggccacctca	agcagtcgga	1260
cttcctgggc	tacacgctca	aggcgctggt	ggacgggatc	ataccggcca	tccgcaccta	1320
cgtcgacctc	tcccccggcg	agttcgactc	cttcgccgac	atcctcaagc	tctacgaggg	1380
cggcatcaag	ctgcccaaca	tcccggccct	cgaggaggtg	cgcaagcgct	tcccgctcca	1440
gctcgtcaag	gacctcatcc	ccaagggcgg	cgacttcctc	ctcaagctcc	ccaagccgga	1500
gatcatcaag	gtagaccaga	aagcgtggat	gactgacgag	gagttcgcca	gggagatgct	1560
cgccggcgtc	aaccccatga	tgatcaaacg	cctcaccgtg	agtgacccac	tccatctacc	1620
ggccattgaa	caaaatcgtc	catacatgtc	actaatcaat	actcacaccg	ttttgaccgc	1680
gtgtgcagga	gttccctccc	aagagcactc	tggatccgag	caagtacggc	gaccacacca	1740
gcaccatgac	cgaggagcac	gtggccaaga	gcctggaggg	cctcaccgtg	cagcaggcgc	1800
tcgccggcaa	caggctctac	atcgtagacc	agcacgacaa	cctgatgccg	ttcctgatcg	1860
acatcaacaa	cctcgacgcc	agcttcgtgt	acgccacaag	gacgctgctc	ttcctgcgag	1920
gggacggcac	gctggcgccg	gtcgccatcg	agctgagctc	gccgctgatc	cagggcgagc	1980
tgaccaccgc	caagagcgcc	gtgtacacgc	cgcagcacgc	cggcgtggag	ggctggatat	2040
ggcagctcgc	caaggcctac	gcctccgtga	acgactacgg	gtggcaccag	ctcatcagcc	2100
actggctcaa	cacgcacgcc	gtcatggagc	ccttcgtcat	cgccaccaac	aggcagctca	2160
gcgtcaccca	cccggtctac	aagctcctgc	acccgcacta	ccgcgacacc	atgaacatca	2220
acgcgcgggc	gcgcgggctg	ctcatcaacg	ccggcggcgt	catcgagatg	accgtgttcc	2280
cgcacaagca	cgccatgccc	atgtcctcca	tggtctacaa	gcactggaac	ttcaccgaac	2340
aagctctccc	cgccgatcta	atcaagaggt	gcaacatgtt	tacattatat	aattgacgaa	2400
acggtccttg	atttgatcaa	aatgattaat	cgatcttgat	ggttgatgat	gatgtagggg	2460
catggcggtg	gaggacgcat	cgagcccgca	caaggtgcgg	ctgctgatca	aggactaccc	2520
gtacgcgacc	gacgggctgg	ccgtgtggga	cgccatcgag	cagtgggtgt	cggactacct	2580
gaccatctac	taccccaacg	acggcgtgct	gcagggcgac	gtggagctgc	aggcgtggtg	2640
gaaggaggtg	agggaggtcg	ggcacggcga	cctcaaggac	gcggcgtggt	ggccaaagat	2700
gcagacggtg	gcggagctga	tcaaggcgtg	cgccaccatc	atctggaccg	ggtcggcgct	2760
ccacgcggcc	gtcaacttcg	ggcagtaccc	ctactcgggc	taccacccca	acaagccgtc	2820
ggcgagccgg	aggccgatgc	cggtgcaggg	gagcgaggag	tacgcggagc	tggagcgaga	2880

- 69 031578

cccggagaag	gccttcatcc	gcaccatcac	cagccagttc	catgccctgg	tgggcatctc	2940
gctcatggag	atcctctcca	agcactcctc	cgacgaggtc	tacctgggcc	agcacgacac	3000
gccggcgtgg	acgtcggacg	ccaaggcgct	ggaggcgttc	aagcggttcg	gggcgaagct	3060
ggagggcatc	gagaagcagg	tggtggccat	gaactcggac	ccgcagctaa	agaaccgcac	3120
cgggccggcc	aagttcccat	acatgctgct	ctacccaaac	acctccgacc	acacgggaca	3180
ggccgagggg	ctcaccgcca	ggggcatccc	gaacagcata	tccatctga		3229

<210> 6 <211> 3229 <212> ДНК <213> Hordeum vulgare Мутант A689 <400> 6 atgtttggcg aagggctccg gtcatggacg accaacgtcg gtgatacatg atataaagaa tgagcttgag catgacgcac gcgggaaggt tcatcaccac gggtgccggg tcaccctcga acccgcaggc acgagtacca cggttccgtt gaagccgtac cctggaccac cgtcctcggc ctcggacagc cttggtctga gctggtgcag cttcctgggc tcggcggcat tcgtcctcat gcgtcaccga accacagtga gaaaacggaa ctaaaatgca agacagggac ggaggggttt gggcgcggag cggcgagaac ggccatcatc caacgtgccc caagtaccgc ctccatggta gggacatacg cgcgacgacg gaccgcgtct ggctccaagg agtgcgtgtc caagcatgtg aacgtctacg tacacgctca cgtgagcgac gcgcaagaac gctcctcggc gcactcactc gcagatccgc cgtatggtta gtgcaaaaaa accttactac gcgaacctgg aagttcgccg gtcaagaaca ggccgcggca tacaaccgcg gctagtacga tgccgcagac agctccggaa accgctacga acctccccta tcctcccttc tggccgacgc tgccgcgcga aggcgctggt ctgacggggg gcgctcgact cgcggcgtca gccactcccc atcctcacgc cggatgcatg taacttaata taattaattg agcagtggct tcaccttcga accacgcctc ccatcgtctt tcttcttcgc tggatttcgc gtacctgccg cctgaggggc cgtctacaac cccgcgccgc tccttccttt agagcccgac cgagctcttc ggacgggatc gcctccgggg tcaacgactt cctgccagct gttttgtaat ccgaaccaag cttatgcttg atggagtaac tcgagcagac cctgccgacg ctggtcggtg cgagttcttc cgtcgccaac caacgacgtg ttgctcgatg caccagatgc gacgaccagc gacctcggcg tgccgcaccg cgatctcccc cacgagagcc ggccacctca ataccggcca cgcccacctc cggcgccacc catcagctcc ccctgccact caaataatat agcttgagct taatgtgaga aacggtgggc aacctgccgt gacaagctgg ctcaagacca tcatgggtct agtattttat cctgactggt cggcggcgct aggggcccta actcccgcga gccggaagcc ataacgtgta ggctgctgcc agcagtcgga tccgcaccta

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

- 70 031578

cgtcgacctc	tcccccggcg	agttcgactc	cttcgccgac	atcctcaagc	tctacgaggg	1380
cggcatcaag	ctgcccaaca	tcccggccct	cgaggaggtg	cgcaagcgct	tcccgctcca	1440
gctcgtcaag	gacctcatcc	ccaagggcgg	cgacttcctc	ctcaagctcc	ccaagccgga	1500
gatcatcaag	gtagaccaga	aagcgtggat	gactgacgag	gagttcgcca	gggagatgct	1560
cgccggcgtc	aaccccatga	tgatcaaacg	cctcaccgtg	agtgacccac	tccatctacc	1620
ggccattgaa	caaaatcgtc	catacatgtc	actaatcaat	actcacaccg	ttttgaccgc	1680
gtgtgcagga	gttccctccc	aagagcactc	tggatccgag	caagtacggc	gaccacacca	1740
gcaccatgac	cgaggagcac	gtggccaaga	gcctggaggg	cctcaccgtg	cagcaggcgc	1800
tcgccggcaa	caggctctac	atcgtagacc	agcacgacaa	cctgatgccg	ttcctgatcg	1860
acatcaacaa	cctcgacgcc	agcttcgtgt	acgccacaag	gacgctgctc	ttcctgcgag	1920
gggacggcac	gctggcgccg	gtcgccatcg	agctgagctc	gccgctgatc	cagggcgagc	1980
tgaccaccgc	caagagcgcc	gtgtacacgc	cgcagcacgc	cggcgtggag	ggctggatat	2040
ggcagctcgc	caaggcctac	gcctccgtga	acgactacgg	gtggcaccag	ctcatcagcc	2100
actggctcaa	cacgcacgcc	gtcatggagc	ccttcgtcat	cgccaccaac	aggcagctca	2160
gcgtcaccca	cccggtctac	aagctcctgc	acccgcacta	ccgcgacacc	atgaacatca	2220
acgcgcgggc	gcgcgggctg	ctcatcaacg	ccggcggcgt	catcgagatg	accgtgttcc	2280
cgcacaagca	cgccatgccc	atgtcctcca	tggtctacaa	gcactggaac	ttcaccgaac	2340
aagctctccc	cgccgatcta	atcaagaggt	gcaacatgtt	tacattatat	aattgacgaa	2400
acggtccttg	atttgatcaa	aatgattaat	cgatcttgat	ggttgatgat	gatgtagggg	2460
catggcggtg	gaggacgcat	cgagcccgca	caaggtgcgg	ctgctgatca	aggactaccc	2520
gtacgcgacc	gacgggctgg	ccgtgtggga	cgccatcgag	cagtgggtgt	cggactacct	2580
gaccatctac	taccccaacg	acggcgtgct	gcagggcgac	gtggagctgc	aggcgtggtg	2640
gaaggaggtg	agggaggtcg	ggcacggcga	cctcaaggac	gcggcgtgat	ggccaaagat	2700
gcagacggtg	gcggagctga	tcaaggcgtg	cgccaccatc	atctggaccg	ggtcggcgct	2760
ccacgcggcc	gtcaacttcg	ggcagtaccc	ctactcgggc	taccacccca	acaagccgtc	2820
ggcgagccgg	aggccgatgc	cggtgcaggg	gagcgaggag	tacgcggagc	tggagcgaga	2880
cccggagaag	gccttcatcc	gcaccatcac	cagccagttc	catgccctgg	tgggcatctc	2940
gctcatggag	atcctctcca	agcactcctc	cgacgaggtc	tacctgggcc	agcacgacac	3000
gccggcgtgg	acgtcggacg	ccaaggcgct	ggaggcgttc	aagcggttcg	gggcgaagct	3060
ggagggcatc	gagaagcagg	tggtggccat	gaactcggac	ccgcagctaa	agaaccgcac	3120
cgggccggcc	aagttcccat	acatgctgct	ctacccaaac	acctccgacc	acacgggaca	3180

- 71 031578 ggccgagggg ctcaccgcca ggggcatccc gaacagcata tccatctga

3229 <210>7 <211>864 <212> БЕЛОК <213> Hordeum vulgare сорт Barke <400>7

Met 1

Leu

Gly

Val

Gly 5

Gly

Ile Val

Ser

Asp 10

Leu

Thr Gly

Gly

Ile 15

Arg

Gly

Ala

His

Leu

Lys

Gly

Ser

Val

Val

Leu

Met

Arg

Lys

Asn

Ala

Leu

20

25

30

Asp

Phe

Asn

Asp

Phe

Gly

Ala

His

Val

Met

Asp

Gly

Val

Thr

Glu

Leu

35

40

45

Leu

Gly

Arg

Gly

Val

Thr

Cys

Gln

Leu

Ile

Ser

Ser

Thr

Asn

Val

Asp

50

55

60

His

Asn

Asn

Gly

Gly

Arg

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Ala

Asn

Leu

Glu

65

70

75

80

Gln

Trp

Leu

Leu

Pro

Thr

Asn

Leu

Pro

Phe

Ile

Thr

Thr

Gly

Glu

Asn

85

90

95

Lys

Phe

Ala

Val

Thr

Phe

Asp

Trp

Ser

Val

Asp

Lys

Leu

Gly

Val

Pro

100

105

110

Gly

Ala

Ile

Ile

Val

Lys

Asn

Asn

His

Ala

Ser

Glu

Phe

Phe

Leu

Lys

115

120

125

Thr

Ile

Thr

Leu

Asp

Asn

Val

Pro

Gly

Arg

Gly

Thr

Ile

Val

Phe

Val

130

135

140

Ala

Asn

Ser

Trp

Val

Tyr

Pro

Gln

Ala

Lys

Tyr

Arg

Tyr

Asn

Arg

Val

145

150

155

160

Phe

Phe

Ala

Asn

Asp

Thr

Tyr

Leu

Pro

His

Gln

Met

Pro

Ala

Ala

Leu

165

170

175

Lys

Pro

Tyr

Arg

Asp

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

Asp

Asp

Gln

180

185

190

Gln

Gly

Pro

Tyr

Leu

Asp

His

Asp

Arg

Val

Tyr

Arg

Tyr

Asp

Val

Tyr

195

200

205

Asn

Asp

Leu

Gly

Asp

Ser

Arg

Asp

Val

Leu

Gly

Gly

Ser

Lys

Asp

Leu

- 72 031578

210

215

220

Pro 225

Tyr

Pro

Arg

Arg

Cys 230

Arg

Thr

Gly Arg

Lys 235

Pro

Ser

Asp

Ser

Lys 240

Pro

Asp

His

Glu

Ser

Arg

Leu

Leu

Leu

Leu

Val

Gln

Asn

Val

Tyr

Val

245

250

255

Leu

Arg

Asp

Glu

Leu

Phe

Gly

His

Leu

Lys

Gln

Ser

Asp

Leu

Leu

Gly

260

265

270

Tyr

Thr

Leu

Lys

Gly

Trp

Leu

Asp

Gly

Ile

Ile

Leu

Ala

Ile

Arg

Thr

275

280

285

Tyr

Val

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Phe

Asp

Ser

Phe

Ala

Asp

Ile

Leu

290

295

300

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gly

Gly

Ile

Lys

Leu

Pro

Asn

Ile

Pro

Ala

Leu

Glu

305

310

315

320

Glu

Val

Arg

Lys

Arg

Phe

Pro

Leu

Gln

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Ile

Pro

325

330

335

Lys

Gly

Gly

Asp

Phe

Leu

Leu

Lys

Leu

Pro

Lys

Pro

Glu

Ile

Ile

Lys

340

345

350

Val

Asp

Gln

Lys

Ala

Trp

Met

Thr

Asp

Glu

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Met

355

360

365

Leu

Ala

Gly

Val

Asn

Pro

Met

Met

Ile

Lys

Arg

Leu

Thr

Glu

Phe

Pro

370

375

380

Pro

Lys

Ser

Thr

Leu

Asp

Pro

Ser

Lys

Tyr

Gly

Asp

His

Thr

Ser

Thr

385

390

395

400

Met

Thr

Glu

Glu

His

Val

Ala

Lys

Ser

Leu

Glu

Gly

Leu

Thr

Val

Gln

405

410

415

Gln

Ala

Leu

Ala

Gly

Asn

Arg

Leu

Tyr

Ile

Val

Asp

Gln

His

Asp

Asn

420

425

430

Leu

Met

Pro

Phe

Leu

Ile

Asp

Ile

Asn

Asn

Leu

Asp

Ala

Ser

Phe

Val

435

440

445

Tyr

Ala

Thr

Arg

Thr

Leu

Leu

Phe

Leu

Arg

Gly

Asp

Gly

Thr

Leu

Ala

450

455

460

- 73 031578

Pro 465

Val

Ala

Ile

Glu

Leu 470

Ser

Ser

Pro

Leu

Ile 475

Gln

Gly

Glu

Leu

Thr 480

Thr

Ala

Lys

Ser

Ala

Val

Tyr

Thr

Pro

Gln

His

Ala

Gly

Val

Glu

Gly

485

490

495

Trp

Ile

Trp

Gln

Leu

Ala

Lys

Ala

Tyr

Ala

Ser

Val

Asn

Asp

Tyr

Gly

500

505

510

Trp

His

Gln

Leu

Ile

Ser

His

Trp

Leu

Asn

Thr

His

Ala

Val

Met

Glu

515

520

525

Pro

Phe

Val

Ile

Ala

Thr

Asn

Arg

Gln

Leu

Ser

Val

Thr

His

Pro

Val

530

535

540

Tyr

Lys

Leu

Leu

His

Pro

His

Tyr

Arg

Asp

Thr

Met

Asn

Ile

Asn

Ala

545

550

555

560

Arg

Ala

Arg

Gly

Leu

Leu

Ile

Asn

Ala

Gly

Gly

Val

Ile

Glu

Met

Thr

565

570

575

Val

Phe

Pro

His

Lys

His

Ala

Met

Pro

Met

Ser

Ser

Met

Val

Tyr

Lys

580

585

590

His

Trp

Asn

Phe

Thr

Glu

Gln

Ala

Leu

Pro

Ala

Asp

Leu

Ile

Lys

Arg

595

600

605

Gly

Met

Ala

Val

Glu

Asp

Ala

Ser

Ser

Pro

His

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

610

615

620

Ile

Lys

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Thr

Asp

Gly

Leu

Ala

Val

Trp

Asp

Ala

625

630

635

640

Ile

Glu

Gln

Trp

Val

Ser

Asp

Tyr

Leu

Thr

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asn

Asp

645

650

655

Gly

Val

Leu

Gln

Gly

Asp

Val

Glu

Leu

Gln

Ala

Trp

Trp

Lys

Glu

Val

660

665

670

Arg

Glu

Val

Gly

His

Gly

Asp

Leu

Lys

Asp

Ala

Ala

Trp

Trp

Pro

Lys

675

680

685

Met

Gln

Thr

Val

Ala

Glu

Leu

Ile

Lys

Ala

Cys

Ala

Thr

Ile

Ile

Trp

690

695

700

Thr

Gly

Ser

Ala

Leu

His

Ala

Ala

Val

Asn

Phe

Gly

Gln

Tyr

Pro

Tyr

705

710

715

720

- 74 031578

Ser

Gly

Tyr

His

Pro 725

Asn

Lys

Pro

Ser

Ala 730

Ser Arg

Arg

Pro

Met 735

Pro

Val

Gln

Gly

Ser

Glu

Glu

Tyr

Ala

Glu

Leu

Glu

Arg

Asp

Pro

Glu

Lys

740

745

750

Ala

Phe

Ile

Arg

Thr

Ile

Thr

Ser

Gln

Phe

His

Ala

Leu

Val

Gly

Ile

755

760

765

Ser

Leu

Met

Glu

Ile

Leu

Ser

Lys

His

Ser

Ser

Asp

Glu

Val

Tyr

Leu

770

775

780

Gly

Gln

His

Asp

Thr

Pro

Ala

Trp

Thr

Ser

Asp

Ala

Lys

Ala

Leu

Glu

785

790

795

800

Ala

Phe

Lys

Arg

Phe

Gly

Ala

Lys

Leu

Glu

Gly

Ile

Glu

Lys

Gln

Val

805

810

815

Val

Ala

Met

Asn

Ser

Asp

Pro

Gln

Leu

Lys

Asn

Arg

Thr

Gly

Pro

Ala

820

825

830

Lys

Phe

Pro

Tyr

Met

Leu

Leu

Tyr

Pro

Asn

Thr

Ser

Asp

His

Thr

Gly

835

840

845

Gln

Ala

Glu

Gly

Leu

Thr

Ala

Arg

Gly

Ile

Pro

Asn

Ser

Ile

Ser

Ile

850

855

860

<210> 8 <211> 684 <212> БЕЛОК <213> Hordeum vulgare мутант A689 <400> 8

Met 1

Leu Gly

Val

Gly 5

Gly

Ile

Val

Ser

Asp 10

Leu

Thr

Gly Gly

Ile 15

Arg

Gly

Ala

His

Leu

Lys

Gly

Ser

Val

Val

Leu

Met

Arg

Lys

Asn

Ala

Leu

20

25

30

Asp

Phe

Asn

Asp

Phe

Gly

Ala

His

Val

Met

Asp

Gly

Val

Thr

Glu

Leu

35

40

45

Leu

Gly

Arg

Gly

Val

Thr

Cys

Gln

Leu

Ile

Ser

Ser

Thr

Asn

Val

Asp

50

55

60

His

Asn

Asn

Gly

Gly

Arg

Gly

Lys

Val

Gly

Ala

Glu

Ala

Asn

Leu

Glu

65

70

75

80

- 75 031578

Gln

Trp

Leu

Leu

Pro 85

Thr

Asn Leu

Pro

Phe 90

Ile

Thr

Thr

Gly

Glu 95

Asn

Lys

Phe

Ala

Val

Thr

Phe

Asp

Trp

Ser

Val

Asp

Lys

Leu

Gly

Val

Pro

100

105

110

Gly

Ala

Ile

Ile

Val

Lys

Asn

Asn

His

Ala

Ser

Glu

Phe

Phe

Leu

Lys

115

120

125

Thr

Ile

Thr

Leu

Asp

Asn

Val

Pro

Gly

Arg

Gly

Thr

Ile

Val

Phe

Val

130

135

140

Ala

Asn

Ser

Trp

Val

Tyr

Pro

Gln

Ala

Lys

Tyr

Arg

Tyr

Asn

Arg

Val

145

150

155

160

Phe

Phe

Ala

Asn

Asp

Thr

Tyr

Leu

Pro

His

Gln

Met

Pro

Ala

Ala

Leu

165

170

175

Lys

Pro

Tyr

Arg

Asp

Asp

Glu

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

Asp

Asp

Gln

180

185

190

Gln

Gly

Pro

Tyr

Leu

Asp

His

Asp

Arg

Val

Tyr

Arg

Tyr

Asp

Val

Tyr

195

200

205

Asn

Asp

Leu

Gly

Asp

Ser

Arg

Asp

Val

Leu

Gly

Gly

Ser

Lys

Asp

Leu

210

215

220

Pro

Tyr

Pro

Arg

Arg

Cys

Arg

Thr

Gly

Arg

Lys

Pro

Ser

Asp

Ser

Lys

225

230

235

240

Pro

Asp

His

Glu

Ser

Arg

Leu

Leu

Leu

Leu

Val

Gln

Asn

Val

Tyr

Val

245

250

255

Leu

Arg

Asp

Glu

Leu

Phe

Gly

His

Leu

Lys

Gln

Ser

Asp

Leu

Leu

Gly

260

265

270

Tyr

Thr

Leu

Lys

Gly

Trp

Leu

Asp

Gly

Ile

Ile

Leu

Ala

Ile

Arg

Thr

275

280

285

Tyr

Val

Asp

Leu

Ser

Pro

Gly

Glu

Phe

Asp

Ser

Phe

Ala

Asp

Ile

Leu

290

295

300

Lys

Leu

Tyr

Glu

Gly

Gly

Ile

Lys

Leu

Pro

Asn

Ile

Pro

Ala

Leu

Glu

305

310

315

320

Glu

Val

Arg

Lys

Arg

Phe

Pro

Leu

Gln

Leu

Val

Lys

Asp

Leu

Ile

Pro

325 330 335

- 76 031578

Lys

Gly

Gly

Asp 340

Phe

Leu

Leu

Lys

Leu 345

Pro

Lys

Pro

Glu

Ile 350

Ile

Lys

Val

Asp

Gln

Lys

Ala

Trp

Met

Thr

Asp

Glu

Glu

Phe

Ala

Arg

Glu

Met

355

360

365

Leu

Ala

Gly

Val

Asn

Pro

Met

Met

Ile

Lys

Arg

Leu

Thr

Glu

Phe

Pro

370

375

380

Pro

Lys

Ser

Thr

Leu

Asp

Pro

Ser

Lys

Tyr

Gly

Asp

His

Thr

Ser

Thr

385

390

395

400

Met

Thr

Glu

Glu

His

Val

Ala

Lys

Ser

Leu

Glu

Gly

Leu

Thr

Val

Gln

405

410

415

Gln

Ala

Leu

Ala

Gly

Asn

Arg

Leu

Tyr

Ile

Val

Asp

Gln

His

Asp

Asn

420

425

430

Leu

Met

Pro

Phe

Leu

Ile

Asp

Ile

Asn

Asn

Leu

Asp

Ala

Ser

Phe

Val

435

440

445

Tyr

Ala

Thr

Arg

Thr

Leu

Leu

Phe

Leu

Arg

Gly

Asp

Gly

Thr

Leu

Ala

450

455

460

Pro

Val

Ala

Ile

Glu

Leu

Ser

Ser

Pro

Leu

Ile

Gln

Gly

Glu

Leu

Thr

465

470

475

480

Thr

Ala

Lys

Ser

Ala

Val

Tyr

Thr

Pro

Gln

His

Ala

Gly

Val

Glu

Gly

485

490

495

Trp

Ile

Trp

Gln

Leu

Ala

Lys

Ala

Tyr

Ala

Ser

Val

Asn

Asp

Tyr

Gly

500

505

510

Trp

His

Gln

Leu

Ile

Ser

His

Trp

Leu

Asn

Thr

His

Ala

Val

Met

Glu

515

520

525

Pro

Phe

Val

Ile

Ala

Thr

Asn

Arg

Gln

Leu

Ser

Val

Thr

His

Pro

Val

530

535

540

Tyr

Lys

Leu

Leu

His

Pro

His

Tyr

Arg

Asp

Thr

Met

Asn

Ile

Asn

Ala

545

550

555

560

Arg

Ala

Arg

Gly

Leu

Leu

Ile

Asn

Ala

Gly

Gly

Val

Ile

Glu

Met

Thr

565

570

575

Val

Phe

Pro

His

Lys

His

Ala

Met

Pro

Met

Ser

Ser

Met

Val

Tyr

Lys

- 77 031578

580 585590

His

Trp Asn 595

Phe

Thr Glu

Gln

Ala Leu 600

Pro

Ala

Asp

Leu 605

Ile

Lys

Arg

Gly

Met

Ala

Val

Glu

Asp

Ala

Ser

Ser

Pro

His

Lys

Val

Arg

Leu

Leu

610

615

620

Ile

Lys

Asp

Tyr

Pro

Tyr

Ala

Thr

Asp

Gly

Leu

Ala

Val

Trp

Asp

Ala

625

630

635

640

Ile

Glu

Gln

Trp

Val

Ser

Asp

Tyr

Leu

Thr

Ile

Tyr

Tyr

Pro

Asn

Asp

645

650

655

Gly

Val

Leu

Gln

Gly

Asp

Val

Glu

Leu

Gln

Ala

Trp

Trp

Lys

Glu

Val

660

665

670

Arg

Glu

Val

Gly

His

Gly

Asp

Leu

Lys

Asp

Ala

Ala

675

680

<210>9 <211>6459 <212> ДНК <213> Ячмень сорт Prestige

<400> 9
atggctgcgg	cggcggggga	cgtggaggcg	ttcctggcgg	cgtgccaggc	gtcgggcgac	60
gcggcgtacg	gcgccgccaa	ggccgtgctg	gagcggctcg	aggcgccggc	cacgcgcgcc	120
gaggccaggc	ggctcctcgg	cgccgtgcga	cggcgcttcg	ccgccggcgg	cccggccgcg	180
gggctcgagt	gcttccgcac	cttccacttc	cgcatccacg	acgtcgtcct	cgacccccac	240
ctccaaggtt	gcccggcccc	ttccctacac	acccgttgtc	gacccgcatc	tctttcgccg	300
atctggccgt	caaaagcacg	cggcttggta	gaaatcaagc	ctgcaatcct	gatccgttta	360
tggctggcca	gtcgatcagt	aatttggcca	taactggagt	ataaccttgg	tctctaatct	420
ctacctgacc	atataccgag	ttggttttct	ttcttcttgt	ttccgtattt	gtgtagtttt	480
ttcttttctt	tcgagcatga	tgttctttga	attaatgcgt	accagactcc	agtaattcga	540
cattttgaat	tttggcgagt	gttcttggaa	tttataacac	aacgaggctt	tgatcaagtg	600
gtttatgtag	aggagtgttt	ttgttcttgt	gcaccgtata	caattctcta	tttcccaaca	660
attttgatgg	cctctaagca	tcctgtagtc	atgtctactg	tgtaagctac	agatttattc	720
atgtctatgt	gtaagctgca	aatggagaga	aaagctatct	atttggttgt	tccagcttgt	780
tctttggcag	aacaatcctg	cccatcctat	caccataagt	ataaaagcac	gacaaatgag	840
tggggcaagc	atgctgccaa	gctaatacac	gacataagct	acatattttg	aggggcatgt	900

- 78 031578

tatctttttt	tttcccttct	actcagtttc	ttctttggga	gaacaatcct	actcaaccta	960
taatcataag	aataaaagca	agacagatga	gtgctgcaga	ctattggcat	atataacaac	1020
taaataggac	atctgtccgc	tatatcttta	gttaataatt	gtatatagac	gcagtctttg	1080
tgctggaaaa	actgcaacta	aatattttct	tacattatat	ggaatctggg	tgtgatatga	1140
cttctttgtt	acgttttgtg	tgcataaagc	attaacttct	gtctttagtt	ggcgcagcgg	1200
taaaaacacc	cattgcttaa	tattttattt	gctttccgta	gcttgataaa	atttcaactg	1260
cttctaggat	tccagcaaag	aaagaagcta	acaatgatgg	agatacccag	cattttcatt	1320
ccagaagact	ggtcattcac	tttctacgag	ggtctcaacc	ggcatccaga	ttccatcttc	1380
agggataaga	cagtagcaga	gctgggatgt	ggcaatggtt	ggatatccat	tgcacttgca	1440
gaaaagtggt	gcccttcgaa	ggttggcacc	tcttgttccg	tagatattta	tcttatctcg	1500
tttgttgcaa	acatgggacc	tgcagaagtt	agacatttac	tcaggttact	ttatatgaaa	1560
cttttaggtg	tctgccagta	gtctgctggt	ggtctaattt	tcttggtata	cctgatgccg	1620
tcgagcatat	tgctttcaaa	ttttgggcaa	ggcattacca	ccacatattg	tttctacaat	1680
gctgaacaat	tgctctcctt	tgaaaggaag	aaaaacaaga	atgacatgca	ccttagtagt	1740
ttaagccaca	aataccagcg	aatcaaatta	gtttgcagtc	agcttggcat	taccttactt	1800
gagccttggt	tgttcttttg	aaggtttatg	gtctggatat	aaacccaaga	gctatcaaga	1860
ttgcatggat	aaacctttac	ttgaatgcac	tagacgacga	tggtctccca	atctatgatg	1920
cggaggggaa	aacattgctt	gacagagtcg	aattctatga	atctgatctt	ctttcttact	1980
gtagagataa	caagatagaa	cttgatcgca	ttgttggatg	cataccacag	gtacggtcag	2040
gtttttacca	atttcctgtg	aatggggatt	atagtcgatc	agaacttgat	caaaatgccc	2100
ttaatatctg	cctttcagat	tcttaacccc	aatccagagg	caatgtcaaa	gattgtaact	2160
gaaaattcaa	gtgaggagtt	cttgtactcc	ttgagcaact	actgtgctct	ccaggtgagt	2220
tgagatctat	ttaaactcaa	gccattcagt	ttacctgtta	ctaaatggtt	acccatgtca	2280
gagtctccaa	atctttttct	tttctcaaac	agcaaagaga	gaagaaaact	tttaagttct	2340
atcctgaaat	tgactttaca	atgcttgttc	ataatctgct	tacgaaatat	gcgtttgaac	2400
atttctcttt	tccttgtagg	catgtggtca	gacctttata	taagaaaatg	aagtttttgt	2460
agaaataatg	tatgctttgt	acttatgaca	tggttccacc	agtataatca	atttaagtct	2520
aggtagttag	gaacctagga	tggagagcac	cgacagtgta	taatatatat	atgtcgatag	2580
ggggttagca	gtccaaatcc	acctcaagtt	caacctattg	cataactttt	ggtcttacaa	2640
cctgtatgga	caaatgtgat	cagcacccca	gtctttccta	taaaaatgtc	tgctggaata	2700
tggaattatt	aacagcggta	tttattttta	ccctgtttaa	ttttttcctt	tgctaaaaga	2760
atgataatcc	ttatgccacg	aggttacatt	gtattactca	agtcaatatt	tgttactatg	2820

- 79 031578

gctgattgta	cgattccagc	ttccggttgt	taattttgtt	atgtttgtga	actttgctgc	2880
attcagggtt	ttgttgagga	ccaatttggc	ctcgggttga	ttgctcgggc	tgttgaagaa	2940
gggatatctg	tgataaagcc	tagtggtctt	atggtattca	acatgggagg	ccggccagga	3000
caaggtgtct	gtgagcgcct	atttctacgc	cgtggatttc	gcatcaataa	gctctggcaa	3060
acaaaaatta	tgcaggtagc	aattctttga	gtgactagat	gttaactaat	cccagtgttt	3120
ttccatgcca	gcaacagcat	tatatcctgg	ttagaggaat	atgctcttca	tgttgcacac	3180
caatcttcag	ctgggcctag	aattttcatc	taccggctta	catttttaca	ttacagaacc	3240
aatttttgtt	gaggatcatt	accaactagt	tgggtctttg	caggctgctg	acacagacat	3300
ctccgcttta	gttgaaattg	agaaaaatag	ccgacatcgc	ttcgagttct	ttatggatct	3360
tgttggggat	cagcctgtgt	gtgcgcgcac	agcatgggca	tacatgaaat	ctggtggccg	3420
catttcacat	gctttgtctg	tgtatagctg	tcaacttcgc	cagcccaacc	aggtacctat	3480
actctctgat	tagatcttta	caacaataat	atagtaatgt	caggaataat	aataatttgg	3540
agaatttcag	gtgaagaaaa	tatttgagtt	ccttaaagac	ggattccatg	aagtcagcag	3600
ctccctcgat	ttgtcctttg	atgatgattc	tgttgctgat	gaaaaaattc	ctttcctagc	3660
atacctagct	agtttcttgc	aagagaataa	gtctaatcct	tgtgagcctc	cagctggatg	3720
tttaaatttc	cggaatcttg	ttgctggatt	tatgaagagt	taccaccaca	tcccattaac	3780
tcctgatgta	agacttggtg	tctattgcct	acaattatgt	ttgcttatta	gaaattcata	3840
agatcaacct	atttgatgct	tctcacgtat	gcttcatgtg	acacttcctt	ttcctctggt	3900
gcaccagaat	gttgttgtgt	tcccatcccg	tgctgttgca	atcgaaaatg	ctcttcggtt	3960
gttctcacct	ggacttgcaa	ttgttgacga	acacctaacc	agacacttgc	ccaagcaatg	4020
gttaacatct	ttagcaattg	aggtactttg	accgatactc	ccctctttct	ttctgtgttt	4080
ggaactgtgg	aaaatacatg	tgttctgtga	agaaaaagtt	atgctgacaa	gaatttcgat	4140
gttattgcca	ttcttctaaa	tttcaggaaa	gtaaccatgc	taaagataca	gtaactgtaa	4200
tcgaagcacc	acgccaatca	gatttgctga	ttgagttgat	caggaaactg	aagcctcagg	4260
ttgttgttac	tggcatggct	cagtttgagg	ctatcaccag	tgctgctttc	gtgaacttat	4320
taagtgtaac	gaaagatgtt	ggttcccgat	tattactaga	tatttcagaa	catctggaat	4380
tgtctagtct	gccaagctca	aatggtgtat	tgaaatatct	tgctgggaag	accctgcctt	4440
cacatgcggc	tatattgtgt	ggcttagtta	agaatcaggt	gtgtgtcaat	cagcctgaac	4500
tctagttgaa	ctgttgtgca	tactatatag	aatatcttga	cttttatatg	tactttagaa	4560
acactgttta	aatgtactca	tttctttttg	cttcatttta	cttgcaggtt	tattctgatc	4620
tggaagttgc	ttttgctatc	tctgaagatc	caactgttta	taaggcattg	tcacaaacta	4680

- 80 031578

ttgagctatt	ggaaggacat	acttctgtga	tcagccagca	ctattatggt	tgtcttttcc	4740
atgagctgct	ggcatttcaa	attggtgacc	ggcatccaca	acaagaggta	aacatggctt	4800
gcctcttcca	gttctccatc	tcactcagtt	ctgtccacaa	ggtgccgaat	gatctgttca	4860
agtggacact	cccctcagca	cgggcaagct	agtccatgaa	tttggattag	ttccctctta	4920
gctgggtact	tcgattacac	cacaatgagc	tcctcaacgt	ggtctggttt	atgtttttca	4980
tgttttccct	ctaatgtttg	gttgctcttt	ttcagagaga	acctgcagaa	gtgatatcta	5040
aggagatgat	agggttttca	agttcagcta	tgtccaccct	agaaggagct	gagtttttcg	5100
ttcctggttc	catggaatcc	ggtgtcatac	atatggatct	ggaccgcagc	ttcttgccag	5160
taccttctgc	agtaaacgcc	tccattttcg	aaagttttgt	tcgtcagaac	atcactgatt	5220
ctgaaaccga	tgtccgttcc	agcattcagc	agctggtgaa	agatagctat	ggtttctcag	5280
caggcggtgc	ttctgaaatt	atatacggga	acacctgtct	cgcgctcttc	aacaagcttg	5340
ttctttgctg	catgcaagaa	cagggcacct	tgcttttccc	cttgggaacc	aacgggcatt	5400
acgtcaacgc	agcaaagttt	gtgaatgcaa	ccaccttgac	tattccaacg	aaggcagatt	5460
caggcttcaa	gatcgaacca	agtgctctag	ccgacacact	agagaaggtg	tctcagccgt	5520
gggtctatat	ttctggcccc	acaatcaacc	ctactggctt	cctgtacagt	gacgacgata	5580
tagcagagct	gctttctgtc	tgtgcgacat	acggagccag	ggtggtgata	gatacctcct	5640
cctctggtct	ggagttccaa	gccaccggct	gcagccagtg	gaatttggaa	agatgtcttt	5700
ctaatgtcaa	gtcttcaaag	ccctcgttct	ccgttgtcct	gctcggagag	ctgtcctttg	5760
agctgaccac	ggctgggctt	gatttcgggt	ttctgattat	gagcgactcg	tccttggttg	5820
acacatttta	cagtttccca	agcttgagtc	ggccacacag	cacgttgaag	tacacgttca	5880
ggaagctgtt	gggtcttaag	aaccagaagg	atcagcattt	ctctgatctc	atccttgagc	5940
agaaggagac	gttgaagaat	cgtgccgacc	agttgatcaa	ggtatgcctt	ttgggatatc	6000
ctgtgtttag	gctctctgtt	ttcttcccct	gatcagctct	ccgatcccct	tacatcctta	6060
ggctaatttc	agtacttcaa	gtttgccacg	catttctgac	atattctttc	ctcttgtttt	6120
attttcctgt	gatgtgatga	acagacgctt	gagagctgcg	gctgggacgc	tgtgggctgc	6180
catggcggca	tctcgatgct	tgcaaaaccg	accgcctaca	ttggcaaatc	gctcaaggtg	6240
gacggctttg	agggcaagct	ggacagccac	aacatgaggg	aagccctcct	gaggtccacc	6300
gggctgtgca	ttagcagcag	cgggtggaca	ggggtgccgg	actactgccg	cttcagcttt	6360
gctctggaga	gcggcgactt	cgaccgggcc	atggagtgca	tcgcccggtt	cagggagctg	6420
gtccttggtg	gcggtgctaa	ggtgaatggt	agcaactag			6459

<210> 10 <211> 6459

- 81 031578 <212> ДНК <213> Ячмень, Мутант <400> 10 atggctgcgg cggcggggga gcggcgtacg gcgccgccaa gaggccaggc ggctcctcgg gggctcgagt gcttccgcac ctccaaggtt gcccggcccc atctggccgt caaaagcacg tggctggcca gtcgatcagt ctacctgacc atataccgag ttcttttctt tcgagcatga cattttgaat tttggcgagt gtttatgtag aggagtgttt attttgatgg cctctaagca atgtctatgt gtaagctgca tctttggcag aacaatcctg tggggcaagc atgctgccaa tatctttttt tttcccttct taatcataag aataaaagca taaataggac atctgtccgc tgctggaaaa actgcaacta cttctttgtt acgttttgtg taaaaacacc cattgcttaa cttctaggat tccagcaaag ccagaagact ggtcattcac agggataaga cagtagcaga gaaaagtggt gcccttcgaa tttgttgcaa acatgggacc cttttaggtg tctgccagta tcgagcatat tgctttcaaa gctgaacaat tgctctcctt ttaagccaca aataccagcg

8063 cgtggaggcg ggccgtgctg cgccgtgcga cttccacttc ttccctacac cggcttggta aatttggcca ttggttttct tgttctttga gttcttggaa ttgttcttgt tcctgtagtc aatggagaga cccatcctat gctaatacac actcagtttc agacagatga tatatcttta aatattttct tgcataaagc tattttattt aaagaagcta tttctacgag gctgggatgt ggttggcacc tgcagaagtt gtctgctggt ttttgggcaa tgaaaggaag aatcaaatta ttcctggcgg gagcggctcg cggcgcttcg cgcatccacg acccgttgtc gaaatcaagc taactggagt ttcttcttgt attaatgcgt tttataacac gcaccgtata atgtctactg aaagctatct caccataagt gacataagct ttctttggga gtgctgcaga gttaataatt tacattatat attaacttct gctttccgta acaatgatgg ggtctcaacc ggcaatggtt tcttgttccg agacatttac ggtctaattt ggcattacca aaaaacaaga gtttgcagtc cgtgccaggc aggcgccggc ccgccggcgg acgtcgtcct gacccgcatc ctgcaatcct ataaccttgg ttccgtattt accagactcc aacgaggctt caattctcta tgtaagctac atttggttgt ataaaagcac acatattttg gaacaatcct ctattggcat gtatatagac ggaatctggg gtctttagtt gcttgataaa agatacccag ggcatccaga ggatatccat tagatattta tcaggttact tcttggtata ccacatattg atgacatgca agcttggcat gtcgggcgac cacgcgcgcc cccggccgcg cgacccccac tctttcgccg gatccgttta tctctaatct gtgtagtttt agtaattcga tgatcaagtg tttcccaaca agatttattc tccagcttgt gacaaatgag aggggcatgt actcaaccta atataacaac gcagtctttg tgtgatatga ggcgcagcgg atttcaactg cattttcatt ttccatcttc tgcacttgca tcttatctcg ttatatgaaa cctgatgccg tttctacaat ccttagtagt taccttactt

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

- 82 031578

gagccttggt	tgttcttttg	aaggtttatg	gtctggatat	aaacccaaga	gctatcaaga	1860
ttgcatggat	aaacctttac	ttgaatgcac	tagacgacga	tggtctccca	atctatgatg	1920
cggaggggaa	aacattgctt	gacagagtcg	aattctatga	atctgatctt	ctttcttact	1980
gtagagataa	caagatagaa	cttgatcgca	ttgttggatg	cataccacag	gtacggtcag	2040
gtttttacca	atttcctgtg	aatggggatt	atagtcgatc	agaacttgat	caaaatgccc	2100
ttaatatctg	cctttcagat	tcttaacccc	aatccagagg	caatgtcaaa	gattgtaact	2160
gaaaattcaa	gtgaggagtt	cttgtactcc	ttgagcaact	actgtgctct	ccaggtgagt	2220
tgagatctat	ttaaactcaa	gccattcagt	ttacctgtta	ctaaatggtt	acccatgtca	2280
gagtctccaa	atctttttct	tttctcaaac	agcaaagaga	gaagaaaact	tttaagttct	2340
atcctgaaat	tgactttaca	atgcttgttc	ataatctgct	tacgaaatat	gcgtttgaac	2400
atttctcttt	tccttgtagg	catgtggtca	gacctttata	taagaaaatg	aagtttttgt	2460
agaaataatg	tatgctttgt	acttatgaca	tggttccacc	agtataatca	atttaagtct	2520
aggtagttag	gaacctagga	tggagagcac	cgacagtgta	taatatatat	atgtcgatag	2580
ggggttagca	gtccaaatcc	acctcaagtt	caacctattg	cataactttt	ggtcttacaa	2640
cctgtatgga	caaatgtgat	cagcacccca	gtctttccta	taaaaatgtc	tgctggaata	2700
tggaattatt	aacagcggta	tttattttta	ccctgtttaa	ttttttcctt	tgctaaaaga	2760
atgataatcc	ttatgccacg	aggttacatt	gtattactca	agtcaatatt	tgttactatg	2820
gctgattgta	cgattccagc	ttccggttgt	taattttgtt	atgtttgtga	actttgctgc	2880
attcagggtt	ttgttgagga	ccaatttggc	ctcgggttga	ttgctcgggc	tgttgaagaa	2940
gggatatctg	tgataaagcc	tagtggtctt	atggtattca	acatgggagg	ccggccagga	3000
caaggtgtct	gtgagcgcct	atttctacgc	cgtggatttc	gcatcaataa	gctctggcaa	3060
acaaaaatta	tgcagatagc	aattctttga	gtgactagat	gttaactaat	cccagtgttt	3120
ttccatgcca	gcaacagcat	tatatcctgg	ttagaggaat	atgctcttca	tgttgcacac	3180
caatcttcag	ctgggcctag	aattttcatc	taccggctta	catttttaca	ttacagaacc	3240
aatttttgtt	gaggatcatt	accaactagt	tgggtctttg	caggctgctg	acacagacat	3300
ctccgcttta	gttgaaattg	agaaaaatag	ccgacatcgc	ttcgagttct	ttatggatct	3360
tgttggggat	cagcctgtgt	gtgcgcgcac	agcatgggca	tacatgaaat	ctggtggccg	3420
catttcacat	gctttgtctg	tgtatagctg	tcaacttcgc	cagcccaacc	aggtacctat	3480
actctctgat	tagatcttta	caacaataat	atagtaatgt	caggaataat	aataatttgg	3540
agaatttcag	gtgaagaaaa	tatttgagtt	ccttaaagac	ggattccatg	aagtcagcag	3600
ctccctcgat	ttgtcctttg	atgatgattc	tgttgctgat	gaaaaaattc	ctttcctagc	3660

- 83 031578

atacctagct	agtttcttgc	aagagaataa	gtctaatcct	tgtgagcctc	cagctggatg	3720
tttaaatttc	cggaatcttg	ttgctggatt	tatgaagagt	taccaccaca	tcccattaac	3780
tcctgatgta	agacttggtg	tctattgcct	acaattatgt	ttgcttatta	gaaattcata	3840
agatcaacct	atttgatgct	tctcacgtat	gcttcatgtg	acacttcctt	ttcctctggt	3900
gcaccagaat	gttgttgtgt	tcccatcccg	tgctgttgca	atcgaaaatg	ctcttcggtt	3960
gttctcacct	ggacttgcaa	ttgttgacga	acacctaacc	agacacttgc	ccaagcaatg	4020
gttaacatct	ttagcaattg	aggtactttg	accgatactc	ccctctttct	ttctgtgttt	4080
ggaactgtgg	aaaatacatg	tgttctgtga	agaaaaagtt	atgctgacaa	gaatttcgat	4140
gttattgcca	ttcttctaaa	tttcaggaaa	gtaaccatgc	taaagataca	gtaactgtaa	4200
tcgaagcacc	acgccaatca	gatttgctga	ttgagttgat	caggaaactg	aagcctcagg	4260
ttgttgttac	tggcatggct	cagtttgagg	ctatcaccag	tgctgctttc	gtgaacttat	4320
taagtgtaac	gaaagatgtt	ggttcccgat	tattactaga	tatttcagaa	catctggaat	4380
tgtctagtct	gccaagctca	aatggtgtat	tgaaatatct	tgctgggaag	accctgcctt	4440
cacatgcggc	tatattgtgt	ggcttagtta	agaatcaggt	gtgtgtcaat	cagcctgaac	4500
tctagttgaa	ctgttgtgca	tactatatag	aatatcttga	cttttatatg	tactttagaa	4560
acactgttta	aatgtactca	tttctttttg	cttcatttta	cttgcaggtt	tattctgatc	4620
tggaagttgc	ttttgctatc	tctgaagatc	caactgttta	taaggcattg	tcacaaacta	4680
ttgagctatt	ggaaggacat	acttctgtga	tcagccagca	ctattatggt	tgtcttttcc	4740
atgagctgct	ggcatttcaa	attggtgacc	ggcatccaca	acaagaggta	aacatggctt	4800
gcctcttcca	gttctccatc	tcactcagtt	ctgtccacaa	ggtgccgaat	gatctgttca	4860
agtggacact	cccctcagca	cgggcaagct	agtccatgaa	tttggattag	ttccctctta	4920
gctgggtact	tcgattacac	cacaatgagc	tcctcaacgt	ggtctggttt	atgtttttca	4980
tgttttccct	ctaatgtttg	gttgctcttt	ttcagagaga	acctgcagaa	gtgatatcta	5040
aggagatgat	agggttttca	agttcagcta	tgtccaccct	agaaggagct	gagtttttcg	5100
ttcctggttc	catggaatcc	ggtgtcatac	atatggatct	ggaccgcagc	ttcttgccag	5160
taccttctgc	agtaaacgcc	tccattttcg	aaagttttgt	tcgtcagaac	atcactgatt	5220
ctgaaaccga	tgtccgttcc	agcattcagc	agctggtgaa	agatagctat	ggtttctcag	5280
caggcggtgc	ttctgaaatt	atatacggga	acacctgtct	cgcgctcttc	aacaagcttg	5340
ttctttgctg	catgcaagaa	cagggcacct	tgcttttccc	cttgggaacc	aacgggcatt	5400
acgtcaacgc	agcaaagttt	gtgaatgcaa	ccaccttgac	tattccaacg	aaggcagatt	5460
caggcttcaa	gatcgaacca	agtgctctag	ccgacacact	agagaaggtg	tctcagccgt	5520
gggtctatat	ttctggcccc	acaatcaacc	ctactggctt	cctgtacagt	gacgacgata	5580

- 84 031578

tagcagagct	gctttctgtc	tgtgcgacat	acggagccag	ggtggtgata	gatacctcct	5640
cctctggtct	ggagttccaa	gccaccggct	gcagccagtg	gaatttggaa	agatgtcttt	5700
ctaatgtcaa	gtcttcaaag	ccctcgttct	ccgttgtcct	gctcggagag	ctgtcctttg	5760
agctgaccac	ggctgggctt	gatttcgggt	ttctgattat	gagcgactcg	tccttggttg	5820
acacatttta	cagtttccca	agcttgagtc	ggccacacag	cacgttgaag	tacacgttca	5880
ggaagctgtt	gggtcttaag	aaccagaagg	atcagcattt	ctctgatctc	atccttgagc	5940
agaaggagac	gttgaagaat	cgtgccgacc	agttgatcaa	ggtatgcctt	ttgggatatc	6000
ctgtgtttag	gctctctgtt	ttcttcccct	gatcagctct	ccgatcccct	tacatcctta	6060
ggctaatttc	agtacttcaa	gtttgccacg	catttctgac	atattctttc	ctcttgtttt	6120
attttcctgt	gatgtgatga	acagacgctt	gagagctgcg	gctgggacgc	tgtgggctgc	6180
catggcggca	tctcgatgct	tgcaaaaccg	accgcctaca	ttggcaaatc	gctcaaggtg	6240
gacggctttg	agggcaagct	ggacagccac	aacatgaggg	aagccctcct	gaggtccacc	6300
gggctgtgca	ttagcagcag	cgggtggaca	ggggtgccgg	actactgccg	cttcagcttt	6360
gctctggaga	gcggcgactt	cgaccgggcc	atggagtgca	tcgcccggtt	cagggagctg	6420
gtccttggtg	gcggtgctaa	ggtgaatggt	agcaactag			6459

<210> 11 <211> 6459 <212> ДНК <213> Ячмень сорт Sebastian <400> 11

atggctgcgg	cggcggggga	cgtggaggcg	ttcctggcgg	cgtgccaggc	gtcgggcgac	60
gcggcgtacg	gcgccgccaa	ggccgtgctg	gagcggctcg	aggcgccggc	cacgcgcgcc	120
gaggccaggc	ggctcctcgg	cgccgtgcga	cggcgcttcg	ccgccggcgg	cccggccgcg	180
gggctcgagt	gcttccgcac	cttccacttc	cgcatccacg	acgtcgtcct	cgacccccac	240
ctccaaggtt	gcccggcccc	ttccctacac	acccgttgtc	gacccgcatc	tctttcgccg	300
atctggccgt	caaaagcacg	cggcttggta	gaaatcaagc	ctgcaatcct	gatccgttta	360
tggctggcca	gtcgatcagt	aatttggcca	taactggagt	ataaccttgg	tctctaatct	420
ctacctgacc	atataccgag	ttggttttct	ttcttcttgt	ttccgtattt	gtgtagtttt	480
ttcttttctt	tcgagcatga	tgttctttga	attaatgcgt	accagactcc	agtaattcga	540
cattttgaat	tttggcgagt	gttcttggaa	tttataacac	aacgaggctt	tgatcaagtg	600
gtttatgtag	aggagtgttt	ttgttcttgt	gcaccgtata	caattctcta	tttcccaaca	660
attttgatgg	cctctaagca	tcctgtagtc	atgtctactg	tgtaagctac	agatttattc	720
atgtctatgt	gtaagctgca	aatggagaga	aaagctatct	atttggttgt	tccagcttgt	780

- 85 031578

tctttggcag	aacaatcctg	cccatcctat	caccataagt	ataaaagcac	gacaaatgag	840
tggggcaagc	atgctgccaa	gctaatacac	gacataagct	acatattttg	aggggcatgt	900
tatctttttt	tttcccttct	actcagtttc	ttctttggga	gaacaatcct	actcaaccta	960
taatcataag	aataaaagca	agacagatga	gtgctgcaga	ctattggcat	atataacaac	1020
taaataggac	atctgtccgc	tatatcttta	gttaataatt	gtatatagac	gcagtctttg	1080
tgctggaaaa	actgcaacta	aatattttct	tacattatat	ggaatctggg	tgtgatatga	1140
cttctttgtt	acgttttgtg	tgcataaagc	attaacttct	gtctttagtt	ggcgcagcgg	1200
taaaaacacc	cattgcttaa	tattttattt	gctttccgta	gcttgataaa	atttcaactg	1260
cttctaggat	tccagcaaag	aaagaagcta	acaatgatgg	agatacccag	cattttcatt	1320
ccagaagact	ggtcattcac	tttctacgag	ggtctcaacc	ggcatccaga	ttccatcttc	1380
agggataaga	cagtagcaga	gctgggatgt	ggcaatggtt	ggatatccat	tgcacttgca	1440
gaaaagtggt	gcccttcgaa	ggttggcacc	tcttgttccg	tagatattta	tcttatctcg	1500
tttgttgcaa	acatgggacc	tgcagaagtt	agacatttac	tcaggttact	ttatatgaaa	1560
cttttaggtg	tctgccagta	gtctgctggt	ggtctaattt	tcttggtata	cctgatgccg	1620
tcgagcatat	tgctttcaaa	ttttgggcaa	ggcattacca	ccacatattg	tttctacaat	1680
gctgaacaat	tgctctcctt	tgaaaggaag	aaaaacaaga	atgacatgca	ccttagtagt	1740
ttaagccaca	aataccagcg	aatcaaatta	gtttgcagtc	agcttggcat	taccttactt	1800
gagccttggt	tgttcttttg	aaggtttatg	gtctggatat	aaacccaaga	gctatcaaga	1860
ttgcatggat	aaacctttac	ttgaatgcac	tagacgacga	tggtctccca	atctatgatg	1920
cggaggggaa	aacattgctt	gacagagtcg	aattctatga	atctgatctt	ctttcttact	1980
gtagagataa	caagatagaa	cttgatcgca	ttgttggatg	cataccacag	gtacggtcag	2040
gtttttacca	atttcctgtg	aatggggatt	atagtcgatc	agaacttgat	caaaatgccc	2100
ttaatatctg	cctttcagat	tcttaacccc	aatccagagg	caatgtcaaa	gattgtaact	2160
gaaaattcaa	gtgaggagtt	cttgtactcc	ttgagcaact	actgtgctct	ccaggtgagt	2220
tgagatctat	ttaaactcaa	gccattcagt	ttacctgtta	ctaaatggtt	acccatgtca	2280
gagtctccaa	atctttttct	tttctcaaac	agcaaagaga	gaagaaaact	tttaagttct	2340
atcctgaaat	tgactttaca	atgcttgttc	ataatctgct	tacgaaatat	gcgtttgaac	2400
atttctcttt	tccttgtagg	catgtggtca	gacctttata	taagaaaatg	aagtttttgt	2460
agaaataatg	tatgctttgt	acttatgaca	tggttccacc	agtataatca	atttaagtct	2520
aggtagttag	gaacctagga	tggagagcac	cgacagtgta	taatatatat	atgtcgatag	2580
ggggttagca	gtccaaatcc	acctcaagtt	caacctattg	cataactttt	ggtcttacaa	2640

- 86 031578

cctgtatgga	caaatgtgat	cagcacccca	gtctttccta	taaaaatgtc	tgctggaata	2700
tggaattatt	aacagcggta	tttattttta	ccctgtttaa	ttttttcctt	tgctaaaaga	2760
atgataatcc	ttatgccacg	aggttacatt	gtattactca	agtcaatatt	tgttactatg	2820
gctgattgta	cgattccagc	ttccggttgt	taattttgtt	atgtttgtga	actttgctgc	2880
attcagggtt	ttgttgagga	ccaatttggc	ctcgggttga	ttgctcgggc	tgttgaagaa	2940
gggatatctg	tgataaagcc	tagtggtctt	atggtattca	acatgggagg	ccggccagga	3000
caaggtgtct	gtgagcgcct	atttctacgc	cgtggatttc	gcatcaataa	gctctggcaa	3060
acaaaaatta	tgcaggtagc	aattctttga	gtgactagat	gttaactaat	cccagtgttt	3120
ttccatgcca	gcaacagcat	tatatcctgg	ttagaggaat	atgctcttca	tgttgcacac	3180
caatcttcag	ctgggcctag	aattttcatc	taccggctta	catttttaca	ttacagaacc	3240
aatttttgtt	gaggatcatt	accaactagt	tgggtctttg	caggctgctg	acacagacat	3300
ctccgcttta	gttgaaattg	agaaaaatag	ccgacatcgc	ttcgagttct	ttatggatct	3360
tgttggggat	cagcctgtgt	gtgcgcgcac	agcatgggca	tacatgaaat	ctggtggccg	3420
catttcacat	gctttgtctg	tgtatagctg	tcaacttcgc	cagcccaacc	aggtacctat	3480
actctctgat	tagatcttta	caacaataat	atagtaatgt	caggaataat	aataatttgg	3540
agaatttcag	gtgaagaaaa	tatttgagtt	ccttaaagac	ggattccatg	aagtcagcag	3600
ctccctcgat	ttgtcctttg	atgatgattc	tgttgctgat	gaaaaaattc	ctttcctagc	3660
atacctagct	agtttcttgc	aagagaataa	gtctaatcct	tgtgagcctc	cagctggatg	3720
tttaaatttc	cggaatcttg	ttgctggatt	tatgaagagt	taccaccaca	tcccattaac	3780
tcctgatgta	agacttggtg	tctattgcct	acaattatgt	ttgcttatta	gaaattcata	3840
agatcaacct	atttgatgct	tctcacgtat	gcttcatgtg	acacttcctt	ttcctctggt	3900
gcaccagaat	gttgttgtgt	tcccatcccg	tgctgttgca	atcgaaaatg	ctcttcggtt	3960
gttctcacct	ggacttgcaa	ttgttgacga	acacctaacc	agacacttgc	ccaagcaatg	4020
gttaacatct	ttagcaattg	aggtactttg	accgatactc	ccctctttct	ttctgtgttt	4080
ggaactgtgg	aaaatacatg	tgttctgtga	agaaaaagtt	atgctgacaa	gaatttcgat	4140
gttattgcca	ttcttctaaa	tttcaggaaa	gtaaccatgc	taaagataca	gtaactgtaa	4200
tcgaagcacc	acgccaatca	gatttgctga	ttgagttgat	caggaaactg	aagcctcagg	4260
ttgttgttac	tggcatggct	cagtttgagg	ctatcaccag	tgctgctttc	gtgaacttat	4320
taagtgtaac	gaaagatgtt	ggttcccgat	tattactaga	tatttcagaa	catctggaat	4380
tgtctagtct	gccaagctca	aatggtgtat	tgaaatatct	tgctgggaag	accctgcctt	4440
cacatgcggc	tatattgtgt	ggcttagtta	agaatcaggt	gtgtgtcaat	cagcctgaac	4500
tctagttgaa	ctgttgtgca	tactatatag	aatatcttga	cttttatatg	tactttagaa	4560

- 87 031578

acactgttta	aatgtactca	tttctttttg	cttcatttta	cttgcaggtt	tattctgatc	4620
tggaagttgc	ttttgctatc	tctgaagatc	caactgttta	taaggcattg	tcacaaacta	4680
ttgagctatt	ggaaggacat	acttctgtga	tcagccagca	ctattatggt	tgtcttttcc	4740
atgagctgct	ggcatttcaa	attggtgacc	ggcatccaca	acaagaggta	aacatggctt	4800
gcctcttcca	gttctccatc	tcactcagtt	ctgtccacaa	ggtgccgaat	gatctgttca	4860
agtggacact	cccctcagca	cgggcaagct	agtccatgaa	tttggattag	ttccctctta	4920
gctgggtact	tcgattacac	cacaatgagc	tcctcaacgt	ggtctggttt	atgtttttca	4980
tgttttccct	ctaatgtttg	gttgctcttt	ttcagagaga	acctgcagaa	gtgatatcta	5040
aggagatgat	agggttttca	agttcagcta	tgtccaccct	agaaggagct	gagtttttcg	5100
ttcctggttc	catggaatcc	ggtgtcatac	atatggatct	ggaccgcagc	ttcttgccag	5160
taccttctgc	agtaaacgcc	tccattttcg	aaagttttgt	tcgtcagaac	atcactgatt	5220
ctgaaaccga	tgtccgttcc	agcattcagc	agctggtgaa	agatagctat	ggtttctcag	5280
caggcggtgc	ttctgaaatt	atatacggga	acacctgtct	cgcgctcttc	aacaagcttg	5340
ttctttgctg	catgcaagaa	cagggcacct	tgcttttccc	cttgggaacc	aacgggcatt	5400
acgtcaacgc	agcaaagttt	gtgaatgcaa	ccaccttgac	tattccaacg	aaggcagatt	5460
caggcttcaa	gatcgaacca	agtgctctag	ccgacacact	agagaaggtg	tctcagccgt	5520
gggtctatat	ttctggcccc	acaatcaacc	ctactggctt	cctgtacagt	gacgacgata	5580
tagcagagct	gctttctgtc	tgtgcgacat	acggagccag	ggtggtgata	gatacctcct	5640
cctctggtct	ggagttccaa	gccaccggct	gcagccagtg	gaatttggaa	agatgtcttt	5700
ctaatgtcaa	gtcttcaaag	ccctcgttct	ccgttgtcct	gctcggagag	ctgtcctttg	5760
agctgaccac	ggctgggctt	gatttcgggt	ttctgattat	gagcgactcg	tccttggttg	5820
acacatttta	cagtttccca	agcttgagtc	ggccacacag	cacgttgaag	tacacgttca	5880
ggaagctgtt	gggtcttaag	aaccagaagg	atcagcattt	ctctgatctc	atccttgagc	5940
agaaggagac	gttgaagaat	cgtgccgacc	agttgatcaa	ggtatgcctt	ttgggatatc	6000
ctgtgtttag	gctctctgtt	ttcttcccct	gatcagctct	ccgatcccct	tacatcctta	6060
ggctaatttc	agtacttcaa	gtttgccacg	catttctgac	atattctttc	ctcttgtttt	6120
attttcctgt	gatgtgatga	acagacgctt	gagagctgcg	gctgggacgc	tgtgggctgc	6180
catggcggca	tctcgatgct	tgcaaaaccg	accgcctaca	ttggcaaatc	gctcaaggtg	6240
gacggctttg	agggcaagct	ggacagccac	aacatgaggg	aagccctcct	gaggtccacc	6300
gggctgtgca	ttagcagcag	cgggtggaca	ggggtgccgg	actactgccg	cttcagcttt	6360
gctctggaga	gcggcgactt	cgaccgggcc	atggagtgca	tcgcccggtt	cagggagctg	6420

- 88 031578 gtccttggtg gcggtgctaa ggtgaatggt agcaactag 6459 <210> 12 <211> 6459 <212> ДНК <213> Ячмень, Мутант 14018

<400> 12
atggctgcgg	cggcggggga	cgtggaggcg	ttcctggcgg	cgtgccaggc	gtcgggcgac	60
gcggcgtacg	gcgccgccaa	ggccgtgctg	gagcggctcg	aggcgccggc	cacgcgcgcc	120
gaggccaggc	ggctcctcgg	cgccgtgcga	cggcgcttcg	ccgccggcgg	cccggccgcg	180
gggctcgagt	gcttccgcac	cttccacttc	cgcatccacg	acgtcgtcct	cgacccccac	240
ctccaaggtt	gcccggcccc	ttccctacac	acccgttgtc	gacccgcatc	tctttcgccg	300
atctggccgt	caaaagcacg	cggcttggta	gaaatcaagc	ctgcaatcct	gatccgttta	360
tggctggcca	gtcgatcagt	aatttggcca	taactggagt	ataaccttgg	tctctaatct	420
ctacctgacc	atataccgag	ttggttttct	ttcttcttgt	ttccgtattt	gtgtagtttt	480
ttcttttctt	tcgagcatga	tgttctttga	attaatgcgt	accagactcc	agtaattcga	540
cattttgaat	tttggcgagt	gttcttggaa	tttataacac	aacgaggctt	tgatcaagtg	600
gtttatgtag	aggagtgttt	ttgttcttgt	gcaccgtata	caattctcta	tttcccaaca	660
attttgatgg	cctctaagca	tcctgtagtc	atgtctactg	tgtaagctac	agatttattc	720
atgtctatgt	gtaagctgca	aatggagaga	aaagctatct	atttggttgt	tccagcttgt	780
tctttggcag	aacaatcctg	cccatcctat	caccataagt	ataaaagcac	gacaaatgag	840
tggggcaagc	atgctgccaa	gctaatacac	gacataagct	acatattttg	aggggcatgt	900
tatctttttt	tttcccttct	actcagtttc	ttctttggga	gaacaatcct	actcaaccta	960
taatcataag	aataaaagca	agacagatga	gtgctgcaga	ctattggcat	atataacaac	1020
taaataggac	atctgtccgc	tatatcttta	gttaataatt	gtatatagac	gcagtctttg	1080
tgctggaaaa	actgcaacta	aatattttct	tacattatat	ggaatctggg	tgtgatatga	1140
cttctttgtt	acgttttgtg	tgcataaagc	attaacttct	gtctttagtt	ggcgcagcgg	1200
taaaaacacc	cattgcttaa	tattttattt	gctttccgta	gcttgataaa	atttcaactg	1260
cttctaggat	tccagcaaag	aaagaagcta	acaatgatgg	agatacccag	cattttcatt	1320
ccagaagact	ggtcattcac	tttctacgag	ggtctcaacc	ggcatccaga	ttccatcttc	1380
agggataaga	cagtagcaga	gctgggatgt	ggcaatggtt	ggatatccat	tgcacttgca	1440
gaaaagtggt	gcccttcgaa	gattggcacc	tcttgttccg	tagatattta	tcttatctcg	1500
tttgttgcaa	acatgggacc	tgcagaagtt	agacatttac	tcaggttact	ttatatgaaa	1560
cttttaggtg	tctgccagta	gtctgctggt	ggtctaattt	tcttggtata	cctgatgccg	1620

- 89 031578

tcgagcatat	tgctttcaaa	ttttgggcaa	ggcattacca	ccacatattg	tttctacaat	1680
gctgaacaat	tgctctcctt	tgaaaggaag	aaaaacaaga	atgacatgca	ccttagtagt	1740
ttaagccaca	aataccagcg	aatcaaatta	gtttgcagtc	agcttggcat	taccttactt	1800
gagccttggt	tgttcttttg	aaggtttatg	gtctggatat	aaacccaaga	gctatcaaga	1860
ttgcatggat	aaacctttac	ttgaatgcac	tagacgacga	tggtctccca	atctatgatg	1920
cggaggggaa	aacattgctt	gacagagtcg	aattctatga	atctgatctt	ctttcttact	1980
gtagagataa	caagatagaa	cttgatcgca	ttgttggatg	cataccacag	gtacggtcag	2040
gtttttacca	atttcctgtg	aatggggatt	atagtcgatc	agaacttgat	caaaatgccc	2100
ttaatatctg	cctttcagat	tcttaacccc	aatccagagg	caatgtcaaa	gattgtaact	2160
gaaaattcaa	gtgaggagtt	cttgtactcc	ttgagcaact	actgtgctct	ccaggtgagt	2220
tgagatctat	ttaaactcaa	gccattcagt	ttacctgtta	ctaaatggtt	acccatgtca	2280
gagtctccaa	atctttttct	tttctcaaac	agcaaagaga	gaagaaaact	tttaagttct	2340
atcctgaaat	tgactttaca	atgcttgttc	ataatctgct	tacgaaatat	gcgtttgaac	2400
atttctcttt	tccttgtagg	catgtggtca	gacctttata	taagaaaatg	aagtttttgt	2460
agaaataatg	tatgctttgt	acttatgaca	tggttccacc	agtataatca	atttaagtct	2520
aggtagttag	gaacctagga	tggagagcac	cgacagtgta	taatatatat	atgtcgatag	2580
ggggttagca	gtccaaatcc	acctcaagtt	caacctattg	cataactttt	ggtcttacaa	2640
cctgtatgga	caaatgtgat	cagcacccca	gtctttccta	taaaaatgtc	tgctggaata	2700
tggaattatt	aacagcggta	tttattttta	ccctgtttaa	ttttttcctt	tgctaaaaga	2760
atgataatcc	ttatgccacg	aggttacatt	gtattactca	agtcaatatt	tgttactatg	2820
gctgattgta	cgattccagc	ttccggttgt	taattttgtt	atgtttgtga	actttgctgc	2880
attcagggtt	ttgttgagga	ccaatttggc	ctcgggttga	ttgctcgggc	tgttgaagaa	2940
gggatatctg	tgataaagcc	tagtggtctt	atggtattca	acatgggagg	ccggccagga	3000
caaggtgtct	gtgagcgcct	atttctacgc	cgtggatttc	gcatcaataa	gctctggcaa	3060
acaaaaatta	tgcaggtagc	aattctttga	gtgactagat	gttaactaat	cccagtgttt	3120
ttccatgcca	gcaacagcat	tatatcctgg	ttagaggaat	atgctcttca	tgttgcacac	3180
caatcttcag	ctgggcctag	aattttcatc	taccggctta	catttttaca	ttacagaacc	3240
aatttttgtt	gaggatcatt	accaactagt	tgggtctttg	caggctgctg	acacagacat	3300
ctccgcttta	gttgaaattg	agaaaaatag	ccgacatcgc	ttcgagttct	ttatggatct	3360
tgttggggat	cagcctgtgt	gtgcgcgcac	agcatgggca	tacatgaaat	ctggtggccg	3420
catttcacat	gctttgtctg	tgtatagctg	tcaacttcgc	cagcccaacc	aggtacctat	3480
actctctgat	tagatcttta	caacaataat	atagtaatgt	caggaataat	aataatttgg	3540

- 90 031578

agaatttcag	gtgaagaaaa	tatttgagtt	ccttaaagac	ggattccatg	aagtcagcag	3600
ctccctcgat	ttgtcctttg	atgatgattc	tgttgctgat	gaaaaaattc	ctttcctagc	3660
atacctagct	agtttcttgc	aagagaataa	gtctaatcct	tgtgagcctc	cagctggatg	3720
tttaaatttc	cggaatcttg	ttgctggatt	tatgaagagt	taccaccaca	tcccattaac	3780
tcctgatgta	agacttggtg	tctattgcct	acaattatgt	ttgcttatta	gaaattcata	3840
agatcaacct	atttgatgct	tctcacgtat	gcttcatgtg	acacttcctt	ttcctctggt	3900
gcaccagaat	gttgttgtgt	tcccatcccg	tgctgttgca	atcgaaaatg	ctcttcggtt	3960
gttctcacct	ggacttgcaa	ttgttgacga	acacctaacc	agacacttgc	ccaagcaatg	4020
gttaacatct	ttagcaattg	aggtactttg	accgatactc	ccctctttct	ttctgtgttt	4080
ggaactgtgg	aaaatacatg	tgttctgtga	agaaaaagtt	atgctgacaa	gaatttcgat	4140
gttattgcca	ttcttctaaa	tttcaggaaa	gtaaccatgc	taaagataca	gtaactgtaa	4200
tcgaagcacc	acgccaatca	gatttgctga	ttgagttgat	caggaaactg	aagcctcagg	4260
ttgttgttac	tggcatggct	cagtttgagg	ctatcaccag	tgctgctttc	gtgaacttat	4320
taagtgtaac	gaaagatgtt	ggttcccgat	tattactaga	tatttcagaa	catctggaat	4380
tgtctagtct	gccaagctca	aatggtgtat	tgaaatatct	tgctgggaag	accctgcctt	4440
cacatgcggc	tatattgtgt	ggcttagtta	agaatcaggt	gtgtgtcaat	cagcctgaac	4500
tctagttgaa	ctgttgtgca	tactatatag	aatatcttga	cttttatatg	tactttagaa	4560
acactgttta	aatgtactca	tttctttttg	cttcatttta	cttgcaggtt	tattctgatc	4620
tggaagttgc	ttttgctatc	tctgaagatc	caactgttta	taaggcattg	tcacaaacta	4680
ttgagctatt	ggaaggacat	acttctgtga	tcagccagca	ctattatggt	tgtcttttcc	4740
atgagctgct	ggcatttcaa	attggtgacc	ggcatccaca	acaagaggta	aacatggctt	4800
gcctcttcca	gttctccatc	tcactcagtt	ctgtccacaa	ggtgccgaat	gatctgttca	4860
agtggacact	cccctcagca	cgggcaagct	agtccatgaa	tttggattag	ttccctctta	4920
gctgggtact	tcgattacac	cacaatgagc	tcctcaacgt	ggtctggttt	atgtttttca	4980
tgttttccct	ctaatgtttg	gttgctcttt	ttcagagaga	acctgcagaa	gtgatatcta	5040
aggagatgat	agggttttca	agttcagcta	tgtccaccct	agaaggagct	gagtttttcg	5100
ttcctggttc	catggaatcc	ggtgtcatac	atatggatct	ggaccgcagc	ttcttgccag	5160
taccttctgc	agtaaacgcc	tccattttcg	aaagttttgt	tcgtcagaac	atcactgatt	5220
ctgaaaccga	tgtccgttcc	agcattcagc	agctggtgaa	agatagctat	ggtttctcag	5280
caggcggtgc	ttctgaaatt	atatacggga	acacctgtct	cgcgctcttc	aacaagcttg	5340
ttctttgctg	catgcaagaa	cagggcacct	tgcttttccc	cttgggaacc	aacgggcatt	5400

- 91 031578

acgtcaacgc	agcaaagttt	gtgaatgcaa	ccaccttgac	tattccaacg	aaggcagatt	5460
caggcttcaa	gatcgaacca	agtgctctag	ccgacacact	agagaaggtg	tctcagccgt	5520
gggtctatat	ttctggcccc	acaatcaacc	ctactggctt	cctgtacagt	gacgacgata	5580
tagcagagct	gctttctgtc	tgtgcgacat	acggagccag	ggtggtgata	gatacctcct	5640
cctctggtct	ggagttccaa	gccaccggct	gcagccagtg	gaatttggaa	agatgtcttt	5700
ctaatgtcaa	gtcttcaaag	ccctcgttct	ccgttgtcct	gctcggagag	ctgtcctttg	5760
agctgaccac	ggctgggctt	gatttcgggt	ttctgattat	gagcgactcg	tccttggttg	5820
acacatttta	cagtttccca	agcttgagtc	ggccacacag	cacgttgaag	tacacgttca	5880
ggaagctgtt	gggtcttaag	aaccagaagg	atcagcattt	ctctgatctc	atccttgagc	5940
agaaggagac	gttgaagaat	cgtgccgacc	agttgatcaa	ggtatgcctt	ttgggatatc	6000
ctgtgtttag	gctctctgtt	ttcttcccct	gatcagctct	ccgatcccct	tacatcctta	6060
ggctaatttc	agtacttcaa	gtttgccacg	catttctgac	atattctttc	ctcttgtttt	6120
attttcctgt	gatgtgatga	acagacgctt	gagagctgcg	gctgggacgc	tgtgggctgc	6180
catggcggca	tctcgatgct	tgcaaaaccg	accgcctaca	ttggcaaatc	gctcaaggtg	6240
gacggctttg	agggcaagct	ggacagccac	aacatgaggg	aagccctcct	gaggtccacc	6300
gggctgtgca	ttagcagcag	cgggtggaca	ggggtgccgg	actactgccg	cttcagcttt	6360
gctctggaga	gcggcgactt	cgaccgggcc	atggagtgca	tcgcccggtt	cagggagctg	6420
gtccttggtg	gcggtgctaa	ggtgaatggt	agcaactag			6459

<210> <211> <212> <213>	13 1088 БЕЛОК Ячмень сорт Prestige
<400>	13

Met 1

Ala

Ala

Ala

Ala 5

Gly Asp Val

Glu

Ala 10

Phe

Leu Ala

Ala

Cys 15

Gln

Ala

Ser

Gly

Asp

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Gly

Ala

35

40

45

Val

Arg

Arg

Arg

Phe

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Phe

Arg

Thr

Phe

His

Phe

Arg

Ile

His

Asp

Val

Val

Leu

Asp

Pro

His

65

70

75

80

- 92 031578

Leu

Gln

Gly

Phe

Gln Gln 85

Arg

Lys

Lys

Leu 90

Thr

Met

Met

Glu

Ile 95

Pro

Ser

Ile

Phe

Ile

Pro

Glu

Asp

Trp

Ser

Phe

Thr

Phe

Tyr

Glu

Gly

Leu

100

105

110

Asn

Arg

His

Pro

Asp

Ser

Ile

Phe

Arg

Asp

Lys

Thr

Val

Ala

Glu

Leu

115

120

125

Gly

Cys

Gly

Asn

Gly

Trp

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Ala

Glu

Lys

Trp

Cys

130

135

140

Pro

Ser

Lys

Val

Tyr

Gly

Leu

Asp

Ile

Asn

Pro

Arg

Ala

Ile

Lys

Ile

145

150

155

160

Ala

Trp

Ile

Asn

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ala

Leu

Asp

Asp

Asp

Gly

Leu

Pro

165

170

175

Ile

Tyr

Asp

Ala

Glu

Gly

Lys

Thr

Leu

Leu

Asp

Arg

Val

Glu

Phe

Tyr

180

185

190

Glu

Ser

Asp

Leu

Leu

Ser

Tyr

Cys

Arg

Asp

Asn

Lys

Ile

Glu

Leu

Asp

195

200

205

Arg

Ile

Val

Gly

Cys

Ile

Pro

Gln

Ile

Leu

Asn

Pro

Asn

Pro

Glu

Ala

210

215

220

Met

Ser

Lys

Ile

Val

Thr

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Glu

Phe

Leu

Tyr

Ser

225

230

235

240

Leu

Ser

Asn

Tyr

Cys

Ala

Leu

Gln

Gly

Phe

Val

Glu

Asp

Gln

Phe

Gly

245

250

255

Leu

Gly

Leu

Ile

Ala

Arg

Ala

Val

Glu

Glu

Gly

Ile

Ser

Val

Ile

Lys

260

265

270

Pro

Ser

Gly

Leu

Met

Val

Phe

Asn

Met

Gly

Gly

Arg

Pro

Gly

Gln

Gly

275

280

285

Val

Cys

Glu

Arg

Leu

Phe

Leu

Arg

Arg

Gly

Phe

Arg

Ile

Asn

Lys

Leu

290

295

300

Trp

Gln

Thr

Lys

Ile

Met

Gln

Ala

Ala

Asp

Thr

Asp

Ile

Ser

Ala

Leu

305

310

315

320

Val

Glu

Ile

Glu

Lys

Asn

Ser

Arg

His

Arg

Phe

Glu

Phe

Phe

Met

Asp

325 330 335

- 93 031578

Leu Val

Gly Asp 340

Gln

Pro Val

Cys

Ala 345

Arg

Thr

Ala

Trp

Ala 350

Tyr

Met

Lys

Ser

Gly

Gly

Arg

Ile

Ser

His

Ala

Leu

Ser

Val

Tyr

Ser

Cys

Gln

355

360

365

Leu

Arg

Gln

Pro

Asn

Gln

Val

Lys

Lys

Ile

Phe

Glu

Phe

Leu

Lys

Asp

370

375

380

Gly

Phe

His

Glu

Val

Ser

Ser

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asp

Asp

Asp

385

390

395

400

Ser

Val

Ala

Asp

Glu

Lys

Ile

Pro

Phe

Leu

Ala

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe

405

410

415

Leu

Gln

Glu

Asn

Lys

Ser

Asn

Pro

Cys

Glu

Pro

Pro

Ala

Gly

Cys

Leu

420

425

430

Asn

Phe

Arg

Asn

Leu

Val

Ala

Gly

Phe

Met

Lys

Ser

Tyr

His

His

Ile

435

440

445

Pro

Leu

Thr

Pro

Asp

Asn

Val

Val

Val

Phe

Pro

Ser

Arg

Ala

Val

Ala

450

455

460

Ile

Glu

Asn

Ala

Leu

Arg

Leu

Phe

Ser

Pro

Gly

Leu

Ala

Ile

Val

Asp

465

470

475

480

Glu

His

Leu

Thr

Arg

His

Leu

Pro

Lys

Gln

Trp

Leu

Thr

Ser

Leu

Ala

485

490

495

Ile

Glu

Glu

Ser

Asn

His

Ala

Lys

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Ile

Glu

Ala

500

505

510

Pro

Arg

Gln

Ser

Asp

Leu

Leu

Ile

Glu

Leu

Ile

Arg

Lys

Leu

Lys

Pro

515

520

525

Gln

Val

Val

Val

Thr

Gly

Met

Ala

Gln

Phe

Glu

Ala

Ile

Thr

Ser

Ala

530

535

540

Ala

Phe

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

Val

Thr

Lys

Asp

Val

Gly

Ser

Arg

Leu

545

550

555

560

Leu

Leu

Asp

Ile

Ser

Glu

His

Leu

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Pro

Ser

Ser

565

570

575

Asn

Gly

Val

Leu

Lys

Tyr

Leu

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Pro

Ser

His

Ala

- 94 031578

580

585

590

Ala

Ile

Leu

Cys

Gly

Leu

Val

Lys

Asn

Gln

Val

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

595

600

605

Val

Ala

Phe

Ala

Ile

Ser

Glu

Asp

Pro

Thr

Val

Tyr

Lys

Ala

Leu

Ser

610

615

620

Gln

Thr

Ile

Glu

Leu

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Ser

Val

Ile

Ser

Gln

His

625

630

635

640

Tyr

Tyr

Gly

Cys

Leu

Phe

His

Glu

Leu

Leu

Ala

Phe

Gln

Ile

Gly

Asp

645

650

655

Arg

His

Pro

Gln

Gln

Glu

Arg

Glu

Pro

Ala

Glu

Val

Ile

Ser

Lys

Glu

660

665

670

Met

Ile

Gly

Phe

Ser

Ser

Ser

Ala

Met

Ser

Thr

Leu

Glu

Gly

Ala

Glu

675

680

685

Phe

Phe

Val

Pro

Gly

Ser

Met

Glu

Ser

Gly

Val

Ile

His

Met

Asp

Leu

690

695

700

Asp

Arg

Ser

Phe

Leu

Pro

Val

Pro

Ser

Ala

Val

Asn

Ala

Ser

Ile

Phe

705

710

715

720

Glu

Ser

Phe

Val

Arg

Gln

Asn

Ile

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Asp

Val

Arg

725

730

735

Ser

Ser

Ile

Gln

Gln

Leu

Val

Lys

Asp

Ser

Tyr

Gly

Phe

Ser

Ala

Gly

740

745

750

Gly

Ala

Ser

Glu

Ile

Ile

Tyr

Gly

Asn

Thr

Cys

Leu

Ala

Leu

Phe

Asn

755

760

765

Lys

Leu

Val

Leu

Cys

Cys

Met

Gln

Glu

Gln

Gly

Thr

Leu

Leu

Phe

Pro

770

775

780

Leu

Gly

Thr

Asn

Gly

His

Tyr

Val

Asn

Ala

Ala

Lys

Phe

Val

Asn

Ala

785

790

795

800

Thr

Thr

Leu

Thr

Ile

Pro

Thr

Lys

Ala

Asp

Ser

Gly

Phe

Lys

Ile

Glu

805

810

815

Pro

Ser

Ala

Leu

Ala

Asp

Thr

Leu

Glu

Lys

Val

Ser

Gln

Pro

Trp

Val

820

825

830

- 95 031578

Tyr

Ile

Ser 835

Gly

Pro

Thr

Ile

Asn 840

Pro

Thr

Gly

Phe

Leu 845

Tyr

Ser

Asp

Asp

Asp

Ile

Ala

Glu

Leu

Leu

Ser

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Gly

Ala

Arg

850

855

860

Val

Val

Ile

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

Gly

Leu

Glu

Phe

Gln

Ala

Thr

Gly

865

870

875

880

Cys

Ser

Gln

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Cys

Leu

Ser

Asn

Val

Lys

Ser

Ser

885

890

895

Lys

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Val

Leu

Leu

Gly

Glu

Leu

Ser

Phe

Glu

Leu

900

905

910

Thr

Thr

Ala

Gly

Leu

Asp

Phe

Gly

Phe

Leu

Ile

Met

Ser

Asp

Ser

Ser

915

920

925

Leu

Val

Asp

Thr

Phe

Tyr

Ser

Phe

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Pro

His

Ser

930

935

940

Thr

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Leu

Gly

Leu

Lys

Asn

Gln

Lys

945

950

955

960

Asp

Gln

His

Phe

Ser

Asp

Leu

Ile

Leu

Glu

Gln

Lys

Glu

Thr

Leu

Lys

965

970

975

Asn

Arg

Ala

Asp

Gln

Leu

Ile

Lys

Thr

Leu

Glu

Ser

Cys

Gly

Trp

Asp

980

985

990

Ala Val Gly Cys

995

His Gly Gly Ile

1000

Ser Met Leu Ala Lys Pro Thr Ala 1005

Tyr

Ile 1010

Gly

Lys

Ser Leu Lys 1015

Val

Asp Gly

Phe

Glu 1020

Gly

Lys

Leu

Asp

Ser

His

Asn

Met

Arg

Glu

Ala

Leu

Leu

Arg

Ser

Thr

Gly

Leu

1025

1030

1035

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Trp

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

Tyr

Cys

Arg

1040

1045

1050

Phe

Ser

Phe

Ala

Leu

Glu

Ser

Gly

Asp

Phe

Asp

Arg

Ala

Met

Glu

1055

1060

1065

Cys

Ile

Ala

Arg

Phe

Arg

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Gly

Gly

Ala

Lys

1070

1075

1080

- 96 031578

Val Asn Gly Ser Asn

1085

<210> <211> <212> <213>

14 1088 БЕЛОК Ячмень сорт Sebastian

<400> 14

Met 1

Ala

Ala Ala

Ala 5

Gly Asp Val

Glu

Ala 10

Phe

Leu Ala

Ala

Cys 15

Gln

Ala

Ser

Gly

Asp

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Gly

Ala

35

40

45

Val

Arg

Arg

Arg

Phe

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Phe

Arg

Thr

Phe

His

Phe

Arg

Ile

His

Asp

Val

Val

Leu

Asp

Pro

His

65

70

75

80

Leu

Gln

Gly

Phe

Gln

Gln

Arg

Lys

Lys

Leu

Thr

Met

Met

Glu

Ile

Pro

85

90

95

Ser

Ile

Phe

Ile

Pro

Glu

Asp

Trp

Ser

Phe

Thr

Phe

Tyr

Glu

Gly

Leu

100

105

110

Asn

Arg

His

Pro

Asp

Ser

Ile

Phe

Arg

Asp

Lys

Thr

Val

Ala

Glu

Leu

115

120

125

Gly

Cys

Gly

Asn

Gly

Trp

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Ala

Glu

Lys

Trp

Cys

130

135

140

Pro

Ser

Lys

Val

Tyr

Gly

Leu

Asp

Ile

Asn

Pro

Arg

Pro

Ile

Lys

Ile

145

150

155

160

Ala

Trp

Ile

Asn

Leu

Tyr

Leu

Asn

Ala

Leu

Asp

Asp

Asp

Gly

Leu

Pro

165

170

175

Ile

Tyr

Asp

Ala

Glu

Gly

Lys

Thr

Leu

Leu

Asp

Arg

Val

Glu

Phe

Tyr

180

185

190

Glu

Ser

Asp

Leu

Leu

Ser

Tyr

Cys

Arg

Asp

Asn

Lys

Ile

Glu

Leu

Asp

195

200

205

- 97 031578

Arg

Ile 210

Val

Gly

Cys

Ile

Pro 215

Gln

Ile

Leu Asn

Pro 220

Asn

Pro

Glu

Ala

Met

Ser

Lys

Ile

Val

Thr

Glu

Asn

Ser

Ser

Glu

Glu

Phe

Leu

Tyr

Ser

225

230

235

240

Leu

Ser

Asn

Tyr

Cys

Ala

Leu

Gln

Gly

Phe

Val

Glu

Asp

Gln

Phe

Gly

245

250

255

Leu

Gly

Leu

Ile

Ala

Arg

Ala

Val

Glu

Glu

Gly

Ile

Ser

Val

Ile

Lys

260

265

270

Pro

Ser

Gly

Leu

Met

Val

Phe

Asn

Met

Gly

Gly

Arg

Pro

Gly

Gln

Gly

275

280

285

Val

Cys

Glu

Arg

Leu

Phe

Leu

Arg

Arg

Gly

Phe

Arg

Ile

Asn

Lys

Leu

290

295

300

Trp

Gln

Thr

Lys

Ile

Met

Gln

Ala

Ala

Asp

Thr

Asp

Ile

Ser

Ala

Leu

305

310

315

320

Val

Glu

Ile

Glu

Lys

Asn

Ser

Arg

His

Arg

Phe

Glu

Phe

Phe

Met

Asp

325

330

335

Leu

Val

Gly

Asp

Gln

Pro

Val

Cys

Ala

Arg

Thr

Ala

Trp

Ala

Tyr

Met

340

345

350

Lys

Ser

Gly

Gly

Arg

Ile

Ser

His

Ala

Leu

Ser

Val

Tyr

Ser

Cys

Gln

355

360

365

Leu

Arg

Gln

Pro

Asn

Gln

Val

Lys

Lys

Ile

Phe

Glu

Phe

Leu

Lys

Asp

370

375

380

Gly

Phe

His

Glu

Val

Ser

Ser

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser

Phe

Asp

Asp

Asp

385

390

395

400

Ser

Val

Ala

Asp

Glu

Lys

Ile

Pro

Phe

Leu

Ala

Tyr

Leu

Ala

Ser

Phe

405

410

415

Leu

Gln

Glu

Asn

Lys

Ser

Asn

Pro

Cys

Glu

Pro

Pro

Ala

Gly

Cys

Leu

420

425

430

Asn

Phe

Arg

Asn

Leu

Val

Ala

Gly

Phe

Met

Lys

Ser

Tyr

His

His

Ile

435

440

445

Pro

Leu

Thr

Pro

Asp

Asn

Val

Val

Val

Phe

Pro

Ser

Arg

Ala

Val

Ala

- 98 031578

450

455

460

Ile 465

Glu

Asn

Ala

Leu

Arg 470

Leu

Phe

Ser

Pro

Gly 475

Leu

Ala

Ile

Val

Asp 480

Glu

His

Leu

Thr

Arg

His

Leu

Pro

Lys

Gln

Trp

Leu

Thr

Ser

Leu

Ala

485

490

495

Ile

Glu

Glu

Ser

Asn

His

Ala

Lys

Asp

Thr

Val

Thr

Val

Ile

Glu

Ala

500

505

510

Pro

Arg

Gln

Ser

Asp

Leu

Leu

Ile

Glu

Leu

Ile

Arg

Lys

Leu

Lys

Pro

515

520

525

Gln

Val

Val

Val

Thr

Gly

Met

Ala

Gln

Phe

Glu

Ala

Ile

Thr

Ser

Ala

530

535

540

Ala

Phe

Val

Asn

Leu

Leu

Ser

Val

Thr

Lys

Asp

Val

Gly

Ser

Arg

Leu

545

550

555

560

Leu

Leu

Asp

Ile

Ser

Glu

His

Leu

Glu

Leu

Ser

Ser

Leu

Pro

Ser

Ser

565

570

575

Asn

Gly

Val

Leu

Lys

Tyr

Leu

Ala

Gly

Lys

Thr

Leu

Pro

Ser

His

Ala

580

585

590

Ala

Ile

Leu

Cys

Gly

Leu

Val

Lys

Asn

Gln

Val

Tyr

Ser

Asp

Leu

Glu

595

600

605

Val

Ala

Phe

Ala

Ile

Ser

Glu

Asp

Pro

Thr

Val

Tyr

Lys

Ala

Leu

Ser

610

615

620

Gln

Thr

Ile

Glu

Leu

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Ser

Val

Ile

Ser

Gln

His

625

630

635

640

Tyr

Tyr

Gly

Cys

Leu

Phe

His

Glu

Leu

Leu

Ala

Phe

Gln

Ile

Gly

Asp

645

650

655

Arg

His

Pro

Gln

Gln

Glu

Arg

Glu

Pro

Ala

Glu

Val

Ile

Ser

Lys

Glu

660

665

670

Met

Ile

Gly

Phe

Ser

Ser

Ser

Ala

Met

Ser

Thr

Leu

Glu

Gly

Ala

Glu

675

680

685

Phe

Phe

Val

Pro

Gly

Ser

Met

Glu

Ser

Gly

Val

Ile

His

Met

Asp

Leu

690

695

700

- 99 031578

Asp 705

Arg

Ser

Phe

Leu

Pro 710

Val

Pro

Ser

Ala

Val 715

Asn

Ala

Ser

Ile

Phe 720

Glu

Ser

Phe

Val

Arg

Gln

Asn

Ile

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Asp

Val

Arg

725

730

735

Ser

Ser

Ile

Gln

Gln

Leu

Val

Lys

Asp

Ser

Tyr

Gly

Phe

Ser

Ala

Gly

740

745

750

Gly

Ala

Ser

Glu

Ile

Ile

Tyr

Gly

Asn

Thr

Cys

Leu

Ala

Leu

Phe

Asn

755

760

765

Lys

Leu

Val

Leu

Cys

Cys

Met

Gln

Glu

Gln

Gly

Thr

Leu

Leu

Phe

Pro

770

775

780

Leu

Gly

Thr

Asn

Gly

His

Tyr

Val

Asn

Ala

Ala

Lys

Phe

Val

Asn

Ala

785

790

795

800

Thr

Thr

Leu

Thr

Ile

Pro

Thr

Lys

Ala

Asp

Ser

Gly

Phe

Lys

Ile

Glu

805

810

815

Pro

Ser

Ala

Leu

Ala

Asp

Thr

Leu

Glu

Lys

Val

Ser

Gln

Pro

Trp

Val

820

825

830

Tyr

Ile

Ser

Gly

Pro

Thr

Ile

Asn

Pro

Thr

Gly

Phe

Leu

Tyr

Ser

Asp

835

840

845

Asp

Asp

Ile

Ala

Glu

Leu

Leu

Ser

Val

Cys

Ala

Thr

Tyr

Gly

Ala

Arg

850

855

860

Val

Val

Ile

Asp

Thr

Ser

Ser

Ser

Gly

Leu

Glu

Phe

Gln

Ala

Thr

Gly

865

870

875

880

Cys

Ser

Gln

Trp

Asn

Leu

Glu

Arg

Cys

Leu

Ser

Asn

Val

Lys

Ser

Ser

885

890

895

Lys

Pro

Ser

Phe

Ser

Val

Val

Leu

Leu

Gly

Glu

Leu

Ser

Phe

Glu

Leu

900

905

910

Thr

Thr

Ala

Gly

Leu

Asp

Phe

Gly

Phe

Leu

Ile

Met

Ser

Asp

Ser

Ser

915

920

925

Leu

Val

Asp

Thr

Phe

Tyr

Ser

Phe

Pro

Ser

Leu

Ser

Arg

Pro

His

Ser

930

935

940

Thr

Leu

Lys

Tyr

Thr

Phe

Arg

Lys

Leu

Leu

Gly

Leu

Lys

Asn

Gln

Lys

945

950

955

960

- 100 031578

Asp Gln His Phe Ser Asp Leu Ile 965

Leu Glu Gln Lys Glu Thr Leu Lys

970 975

Asn Arg Ala Asp Gln Leu

980

Ile Lys Met Leu Glu Ser Cys Gly Trp Asp

985 990

Ala Val Gly Cys His Gly Gly Ile

Ser Met Leu Ala Lys

Pro Thr Ala

995

1000

1005

Tyr

Ile 1010

Gly

Lys

Ser Leu Lys 1015

Val

Asp Gly

Phe

Glu 1020

Gly

Lys

Leu

Asp

Ser

His

Asn

Met

Arg

Glu

Ala

Leu

Leu

Arg

Ser

Thr

Gly

Leu

1025

1030

1035

Cys

Ile

Ser

Ser

Ser

Gly

Trp

Thr

Gly

Val

Pro

Asp

Tyr

Cys

Arg

1040

1045

1050

Phe

Ser

Phe

Ala

Leu

Glu

Ser

Gly

Asp

Phe

Asp

Arg

Ala

Met

Glu

1055

1060

1065

Cys

Ile

Ala

Arg

Phe

Arg

Glu

Leu

Val

Leu

Gly

Gly

Gly

Ala

Lys

1070

1075

1080

Val Asn Gly Ser Asn

1085

<210> <211> <212> <213>	15 186 БЕЛОК Ячмень, Мутант 14018
<400>	15

Met Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val

Glu

Ala 10

Phe

Leu

Ala Ala

Cys 15

Gln

1

5

Ala

Ser

Gly

Asp

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Gly

Ala

35

40

45

Val

Arg

Arg

Arg

Phe

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Phe

Arg

Thr

Phe

His

Phe

Arg

Ile

His

Asp

Val

Val

Leu

Asp

Pro

His

70 75 80

- 101 031578

Leu

Gln

Gly

Phe

Gln 85

Gln Arg

Lys

Lys

Leu 90

Thr

Met

Met

Glu

Ile 95

Pro

Ser

Ile

Phe

Ile

Pro

Glu

Asp

Trp

Ser

Phe

Thr

Phe

Tyr

Glu

Gly

Leu

100

105

110

Asn

Arg

His

Pro

Asp

Ser

Ile

Phe

Arg

Asp

Lys

Thr

Val

Ala

Glu

Leu

115

120

125

Gly

Cys

Gly

Asn

Gly

Trp

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Ala

Glu

Lys

Trp

Cys

130

135

140

Pro

Ser

Lys

Ile

Gly

Thr

Ser

Cys

Ser

Val

Asp

Ile

Tyr

Leu

Ile

Ser

145

150

155

160

Phe

Val

Ala

Asn

Met

Gly

Pro

Ala

Glu

Val

Arg

His

Leu

Leu

Arg

Leu

165

170

175

Leu

Tyr

Met

Lys

Leu

Leu

Gly

Val

Cys

Gln

180

185

<210> <211> <212> <213>	16 180 БЕЛОК Ячмень, Мутант 14018
<400>	16

Met Ala Ala Ala Ala

Gly

Asp Val

Glu

Ala 10

Phe

Leu

Ala

Ala

Cys 15

Gln

1

5

Ala

Ser

Gly

Asp

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Gly

Ala

35

40

45

Val

Arg

Arg

Arg

Phe

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Phe

Arg

Thr

Phe

His

Phe

Arg

Ile

His

Asp

Val

Val

Leu

Asp

Pro

His

65

70

75

80

Leu

Gln

Gly

Phe

Gln

Gln

Arg

Lys

Lys

Leu

Thr

Met

Met

Glu

Ile

Pro

85

90

95

Ser

Ile

Phe

Ile

Pro

Glu

Asp

Trp

Ser

Phe

Thr

Phe

Tyr

Glu

Gly

Leu

- 102 031578

100

105

110

Asn

Arg

His

Pro

Asp

Ser

Ile

Phe

Arg

Asp

Lys

Thr

Val

Ala

Glu

Leu

115

120

125

Gly

Cys

Gly

Asn

Gly

Trp

Ile

Ser

Ile

Ala

Leu

Ala

Glu

Lys

Trp

Cys

130

135

140

Pro

Ser

Lys

Ile

Gly

Thr

Ser

Cys

Ser

Val

Asp

Ile

Tyr

Leu

Ile

Ser

145

150

155

160

Phe

Val

Ala

Asn

Met

Gly

Pro

Ala

Glu

Val

Arg

His

Leu

Leu

Arg

Phe

165

170

175

Met Val Trp Ile

180

<210>	17
<211>	163
<212>	БЕЛОК
<213>	Ячмень, Мутант 14018
<400>	17

Met 1

Ala Ala

Ala Ala 5

Gly Asp Val

Glu Ala 10

Phe

Leu

Ala

Ala

Cys 15

Gln

Ala

Ser

Gly

Asp

Ala

Ala

Tyr

Gly

Ala

Ala

Lys

Ala

Val

Leu

Glu

Arg

20

25

30

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Thr

Arg

Ala

Glu

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Gly

Ala

35

40

45

Val

Arg

Arg

Arg

Phe

Ala

Ala

Gly

Gly

Pro

Ala

Ala

Gly

Leu

Glu

Cys

50

55

60

Phe

Arg

Thr

Phe

His

Phe

Arg

Ile

His

Asp

Val

Val

Leu

Asp

Pro

His

65

70

75

80

Leu

Gln

Gly

Phe

Gln

Gln

Arg

Lys

Lys

Leu

Thr

Met

Met

Glu

Ile

Pro

85

90

95

Ser

Ile

Phe

Ile

Pro

Glu

Asp

Trp

Ser

Phe

Thr

Phe

Tyr

Glu

Gly

Leu

100

105

110

Asn

Arg

His

Pro

Asp

Ser

Ile

Phe

Arg

Asp

Lys

Thr

Val

Ala

Glu

Leu

115

120

125

- 103 031578

Gly Cys

Gly Asn Gly

Leu Trp 135

Ser Gly Tyr Lys

Pro Lys 140

Ser Tyr Gln

130

Asp

Cys

Met Asp

Lys

Pro

Leu

Leu Glu

Cys

Thr

Arg

Arg

Arg

Trp

Ser

145

150

155

160

Pro Asn Leu

Claims (16)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Растение ячменя или его часть для приготовления напитка с уровнем диметилсульфида (DMS) ниже 20 млрд.д. и уровнем S-метилметионина (SMM) менее чем 20 млрд.д., где в указанном растении ячменя:

   a) отсутствует детектируемая активность липоксигеназы 1 (LOX-1) или растение характеризуется полной потерей функциональности LOX-1, что вызвано мутацией в гене (SEQ ID NO: 1), кодирующем LOX-1, и

   b) отсутствует детектируемая активность липоксигеназы 2 (LOX-2) или растение характеризуется полной потерей функциональности LOX-2, что вызвано мутацией в гене (SEQ ID NO: 5), кодирующем LOX-2, и

   c) отсутствует детектируемая активность метионин^-метилтрансферазы (ММТ) или растение характеризуется полной потерей функциональности ММТ, что вызвано мутацией в гене (SEQ ID NO: 9), кодирующем ММТ.
2. 2. Растение ячменя или его часть по п.1, где мутация в гене, кодирующем LOX-1, включает нонсенс-кодон, находящийся максимально на 705, предпочтительно максимально на 665 кодонов ниже стартового кодона.
3. 3. Растение ячменя или его часть по любому из пп.1 и 2, где указанная мутация в гене, кодирующем LOX-2, включает нонсенс-кодон, находящийся максимально на 707, предпочтительно максимально на 684 кодонов ниже стартового кодона.
4. 4. Растение ячменя или его часть по любому из пп.1 и 2, где указанная мутация в гене, кодирующем ММТ, представляет собой мутацию G^A 5'-концевого основания интрона.
5. 5. Растение ячменя или его часть по любому из пп.1-4, где мутация в гене ММТ обеспечивает образование укороченной формы ММТ, содержащей N-концевой фрагмент ММТ дикого типа и необязательно дополнительные С-концевые последовательности, не представленные в ММТ дикого типа, где указанный N-концевой фрагмент содержит максимально 500, более предпочтительно максимально 450, даже более предпочтительно максимально 400, еще более предпочтительно максимально 350, даже более предпочтительно максимально 320, еще более предпочтительно максимально 311 или максимально 288 N-концевых аминокислотных остатков последовательности SEQ ID NO: 13.
6. 6. Способ получения напитка на основе ячменя менее чем с 20 млрд.д. диметилсульфида (DMS) и менее чем 20 млрд.д. S-метилметионина (SMM), включающий следующие этапы:

   (i) затирание растения ячменя по п.1 или его части с получением сусла;

   (ii) выпаривание указанного сусла, где выпаривается максимально 4% объема сусла; и (iii) переработка указанного сусла в напиток.
7. 7. Способ по п.6, в котором затирают зерна указанного растения ячменя и/или солод, полученный по меньшей мере из части зерен указанного растения.
8. 8. Способ по п.7, где указанные зерна осоложены способом, включающим этапы:

   a) замачивания указанных зерен;

   b) проращивания указанных зерен и

   c) печной сушки полученного солода, причем печную сушку указанных зерен проводят при температуре максимально 80°С, еще более предпочтительно при температуре максимально 75°С, предпочтительно при температуре максимально 70°С, более предпочтительно при температуре максимально 65°С, еще более предпочтительно при температуре максимально 60°С, еще более предпочтительно при температуре максимально 55°С, еще более предпочтительно при температуре максимально 50°С, еще более предпочтительно при температуре максимально 45°С, еще более предпочтительно при температуре максимально 40°С.
9. 9. Способ по любому из пп.6-8, где указанное сусло выпаривают путем нагревания до температуры максимально 99,8°С, более предпочтительно максимально 99,5°С, еще более предпочтительно максимально 99°С.
10. 10. Способ по любому из пп.6-9, включающий дополнительный этап iv) ферментации сусла.

    - 104 031578
11. 11. Способ по любому из пп.6-10, где указанное сусло выпаривают путем нагревания до температуры выше 80°С в течение менее 30 мин, предпочтительно в течение менее 20 мин.
12. 12. Солод, полученный из зерен растения ячменя по любому из пп.1-5.
13. 13. Напиток, получаемый из растения ячменя или его части по любому из пп.1-5, где указанный напиток имеет уровень диметилсульфида (DMS) ниже 20 млрд.д и уровень S-метилметионина (SMM) менее чем 20 млрд.д и потенциал T2N на 50% менее по сравнению с композицией сусла, получаемой тем же способом из ячменя сорта Power.
14. 14. Напиток по п.13, полученный способом по любому из пп.6-11.
15. 15. Напиток по любому из пп.13 и 14, представляющий собой пиво.
16. 16. Напиток по любому из пп.13 и 14, представляющий собой неалкогольный солодовый напиток.

    /4/4/==4/=°