TW201138806A - CDCA5 peptides and vaccines including the same - Google Patents

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201138806 gastric prostate cancer, esophagus cancer, gastric cancer, diffuse-type cancer, lung cancer, lymphoma, cancer, SCLC and soft tissue tumor. 四、指定代表圖： (一） 本案指定代表圖為：第（1)圖。 (二） 本代表圖之元件符號簡單 ”、、 五本案右有化學式時，请揭示最能顯示發明特徵的化學式： fe 〇 Μ»、 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於生物科學領域，更特別對於癌症治療領 域。特別是’本發明係關於新賴之胜肽，彡當作癌症疫苗 及治療與避免腫瘤之藥物為非常有效。 【先前技術】 已證貫CD8陽性細胞毒殺性τ淋巴球辨認來自建造於 主要組織相容性抗原複合體Ua j〇r hist〇c〇mpatiM丨ity complex’ MHC) class I分子上之腫瘤相關抗原（tum〇r_ associated antigens，TAAs)的抗原決定位胜肽，且之後 殺死腫瘤細胞。自從發現黑色素瘤抗原（melan〇maantigen， MAGE)家族為腫瘤相關抗原之第一個例子，藉由免疫方法， 201138806 已發現許多其他腫瘤相關抗原（NPL 1，Boon T, Int J Cancer 1 993 May 8, 54(2): 1 77-80； NPL 2, Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1 996 Mar 1, 183(3)： 725-9) 〇 這些腫瘤相關抗原的一些目前受到臨床發展作為免疫治療 標的。 合適的腫瘤相關抗原係對於癌症細胞增殖與存活為必 須的。使用此腫瘤相關抗原作為免疫治療之標的可將廣為 敘述之癌細胞免疫逃脫（immune escape)的風險最小化，而 癌細胞免疫逃脫為治療性驅使免疫筛選的結果，歸因於腫 瘤相關抗原的刪除、突變或向下調控。因此，能誘導有效 且專一之抗腫瘤免疫反應的新腫瘤相關抗原的辨認授予更 進一步發展，因此多種形式之癌症的胜肽疫苗接種策略 (vaccination strategies)的臨床應用為正進行著（NPL 3, Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 88(20): 1442-55; NPL 4, Butterfield LH et al. , Cancer Res 1999 Jul 1, 59(13): 3134-42; NPL 5, Vissers JL et al., Cancer Res 1 999 Nov 1, 59 (21 ): 5554-9; NPL 6, van der Burg SH et al. , J Immunol 1 996 May 1, 1 56(9): 3308-14; NPL 7, Tanaka F et al. , Cancer Res 1997 Oct 15, 57(20): 4465-8； NPL 8, Fujie T et al., Int J Cancer 1 999 Jan 18, 80(2): 169-72; NPL 9, Kikuchi M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 459-66; NPL 10, Oiso M et a/· ， Int J Cancer 1999 May 5， 81(3): 387-94)。因此， 仍然維持作為免疫治療標的之新穎腫瘤相關抗原的需要。 4 201138806 CDCA5，（GenBank Accession No: NM_080668)，細胞 v 分裂週期相關 5 (cell division cycle associated 5)， 已被鑑定為在對於細胞週期控制蛋白質之篩選中之姊妹染 色分體内聚（sister chromatid cohesion)的調控子（NPL 14, Rankin S, Ayad NG, Kirschner MW. Mol Cell. 2005 Apr 15;18(2):185-200. NPL 15, Erratum in: Mol Cell. 2005 May 27;18 (5):609)。此35-kDa蛋白質經由細胞分 裂後期（anaphase)被降解，促進在G1相中之複合物依賴泛 素化作用（ubiquitination)。CDCA5 在相間（inter phase) 期間與在染色質（chromat i η)上之内聚互相作用並起作用 以支持姊妹染色分體内聚。比起一般在多數G2細胞中，姊 妹染色質被更進一步分離，證明CDCA5在S相期間已為内 聚之建立所需要（NPL 16，Schmi tz J，eia/.，CurrBiol. 2007 Apr 3;1 7(7):630-6. Epub, 2007 Mar 8)。北方墨點 分析已證明CDCA5被顯著表現於肺與食道癌中，但不表現 於正常器官中，除了睪丸。此外，藉由siRNA之CDCA5的 抑制導致在肺癌細胞株中的生長延遲。綜合上述，此資料 建議CDCA5可提供用途為癌症免疫治療之標的。 【引用文獻】 非專利文獻（Non Patent Literature) [NPL 1] Boon T, Int J Cancer 1 993 May 8, 54(2): 177-80 [NPL 2] Boon T & van der Bruggen P, J Exp Med 1 996 Mar 1» 183(3)： 725-9 [NPL 3] Harris CC, J Natl Cancer Inst 1996 Oct 16, 201138806 88(20): 1442-55 [NPL 4] Butterfield LH et al., Cancer Res 1 999 Jul 1, 59(13): 3134-42 [NPL 5] Vissers JL et al., Cancer Res 1999 Nov 1, 59(21): 5554-9 [NPL 6] van der Burg SH et al. , J Immunol 1 996 May 1, 156(9): 3308-14 [NPL 7] Tanaka F et al. , Cancer Res 1 997 Oct 1 5, 57 (20 ): 4465-8 [NPL 8] Fujie T et al. , Int J Cancer 1999 Jan 18, 80(2): 169-72 [NPL 9] Kikuchi M et al. , Int J Cancer 1 999 May 5, 81(3): 459-66 [NPL 10] Oiso M et al., Int J Cancer 1999 May 5, 81(3): 387-94 [NPL 11] Belli F et al., J Clin Oncol 2002 Oct 15, 20(20): 4169-80 [NPL 12] Coulie PG et al., Immunol Rev 2002 Oct, 188: 33-42 [NPL 13] Rosenberg SA et al. , Nat Med 2004 Sep, 10(9): 909-15 [NPL 14] Rankin S, Ayad NG, Kirschner MW. Mol Cell. 2005 Apr 15;18(2):185-200 [NPL 15] Erratum in: Mol Cell. 2005 May 27;18 (5):609 201138806 _ [NPL 16] Schmitz J, et al., Curr Biol. 2007 Apr 3;17(7)：630-6. Epub, 2007 Mar 8 【發明内容】 本發明部分至少基於發現免疫治療之適合標的。由於 腫瘤相關抗原（tumor-associated antigens, TAAs)有時被 免疫系統感知為“自身”且因此常不具有免疫抗原性 (immunogenicity)，所以適合標的的發現極度重要。認定 CDCA5(例如由GenBank獲得編號關_080668 (序列辨識 5虎.2 0 )之基因所編碼出之序列辨識號：2丨）已確認為在 癌症中為向上調控’癌症之例子包括，但不限於急性骨髓 |·生白 jk 病（acute myei〇gen〇us ieukemia，aml)、膀胱癌、 乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌（ch〇langi〇cellular caixinoma)、慢性骨髓性白血病（CML)、大腸癌、食道癌、 胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺 癌（small cell lung cancer，SCLC)與軟組織腫瘤。因此 本發明聚焦於CDCA5為一癌症/腫瘤免疫治療之標的的候 選物更特別是可作為適合之免疫治療標的之新穎cj)CA5 抗原決定位胜肽。 為此目的，本發明至少部分關於具有誘導專一於CDCA5 之細胞毒殺性T淋巴球之能力之在CDCA5之基因產物中的 疋彳几原決疋位胜肽的確認。詳細如下所討論，使用與 (人類白血球組織抗原）_A*〇2〇1結合之來自cdCA5的候 選胜狀來刺激自冑康提供者獲得之周★血液單核球細胞 201138806 (peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。之後以 抗（against)經各候選胜肽脈衝（puised)之HLA-A2陽性目 標細胞的細胞毒性建立細胞毒殺性T淋巴球。此處結果證 明這些胜肽為HLA-A2限制的抗原決定位胜肽，其可誘導強 而專一之抗表現CDCA5之細胞的免疫反應。這些結果更顯 示CDCA5為強效致免疫性且其抗原決定位為癌症/腫瘤免 疫治療之有效目標。 因此’本發明一目的為提供與HLA抗原結合之經分離 的胜肽，包括CDCA5 (序列辨識號：21 )與其免疫活性片 段。此類胜肽可被可被預期具有細胞毒殺性T淋巴球誘發 能力’且因此可被來h 誘導細胞毒殺性T淋巴球或 可被技予一個體以誘導抗癌症的免疫反應，癌症的例子包 括，但不限於急性骨髓性白血病、膀胱癌 '乳癌、子宮頸 癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、 胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺 癌與軟組織腫瘤。較佳胜肽為九胜肽與十胜肽，更佳為具 有擇自序列辨識號：2至19中之一胺基酸序列的九胜肽與 十胜肽。具有擇自序列辨識號：6、9與16中之一胺基酸 序列的胜肽顯示強的細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力，且因 此被特別的喜好。 本發明也考慮經修飾之胜肽，其具有擇自序列辨識 號.2至19中之一胺基酸序列，於其中一' 二或多個胺基 西欠被取代刪除、插人或加人，只要經修飾之胜肽維持最 初胜狀之必不可少的細胞毒殺性Τ淋巴球誘發能力。例 8 201138806 如’本發明提供在長度小於14、13、12、11或l〇個胺基 酸的一經分離的胜肽，其包括擇自由下列所組成之群組的 胺基酸序列： (i) 一胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：2至9所 組成之群組，其中1、2或數個胺基酸被取代，其中該胜肽 與HLA抗原結合且誘發細胞毒殺性τ淋巴球，與 (i i ) ( i )之胺基酸序列，其中此胺基酸序列具有下列 特徵之一或兩者： (a) 來自此序列辨識號之N端之第二個胺基酸為擇 自由白胺酸或甲硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) 此序列辨識號之C端胺基酸為擇自由纈氨酸或 白胺酸所組成之群組。 此外’本發明也提供在長度小於15、14、13、12或 11個胺基酸的一經分離的胜肽，其包括擇自由下列所組成 之群組的胺基酸序列： (1 ’ ） 一胺基酸序列，其擇自由序列辨識號：1 〇至 19所組成之群組’其中丨、2或數個胺基酸被取代，其中 該胜肽與HLA抗原結合且誘發細胞毒殺性τ淋巴球，與 (ii，) (Γ )之胺基酸序列’其中此胺基酸序列具有 下列特徵之一或兩者： (a) 來自此序列辨識號之N端之第二個胺基酸為擇 自由白胺酸或甲硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) 此序列辨識號之C端胺基酸為擇自由纈氨酸或 白胺酸所組成之群組。 201138806 备化些胜肽與抗原呈現細胞接觸或被引入抗原呈現細 胞時，在抗原呈現細胞中處理這些胜肽以呈現（i)、（u)、 (1 )與（ii，）的胜肽於其上。 再者’本發明考慮經修飾之胜肽，其具有在擇自序列 辨識號· 2至19中之胺基酸序列中之—、二或多個胺基酸 取代、刪除、插入及/或加入的一胺基酸序列只要經修飾 之胜肽維持原始胜肽之必不可缺的細胞毒殺性T淋巴球誘 發能力°例如’本發明提供在長度小於丨4、丨3、丨2、丨1或 1 0個胺基酸的一經分離的胜肽，其包括擇自由下列所組成 之群組的胺基酸序列： (1)在擇自由序列辨識號：2至9所組成之群組之胺 基酸序列中，1、2或數個胺基酸被取代的胺基酸序列，其 中該胜肽與HLA抗原結合且誘發細胞毒殺性τ淋巴球，與 (i i) (i)之胺基酸序列，其中此胺基酸序列具有下列 特徵之一或兩者： (a) 來自此序列辨識號之N端之第二個胺基酸為擇 自由白胺酸或甲硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) 此序列辨識號之C端胺基酸為擇自由纈氨酸或 白胺酸所組成之群組。 此外，本發明也提供在長度小於1 5、14、1 3、12或 11個胺基酸的一經分離的胜肽，其包括擇自由下列所組成 之群組的胺基酸序列： (Γ )在擇自由序列辨識號：10至19所組成之群組 之胺基酸序列中，卜2或數個胺基酸被取代的胺基酸序列， 10 201138806 其中該胜肽與HLA抗原結合且誘發細胞毒殺性τ淋巴球， ν 與 (i i ’ ） （ i ’ ）之胺基酸序列’其中此胺基酸序列具有 下列特徵之一或兩者： (a) 來自此序列辨識號之N端之第二個胺基酸為擇 自由白胺酸或甲硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) 此序列辨識號之C端胺基酸為擇自由纈氨酸或 白胺酸所組成之群組。 當這些胜肽與抗原呈現細胞接觸或被引入抗原呈現細 胞時’在抗原呈現細胞中處理這些胜肽以呈現（i )、（ i丨）、 (i’ ）與（ii’ ）的胜肽於其上。 本發明更包括編碼出本發明任何胜肽之經分離之多核 苷酸。這些多核苷酸可被用來誘導或製備具有細胞毒殺性 淋巴球誘發此力的抗原呈現細胞，或如同上述本發明胜 肽，可被投予至一個體以誘導抗癌之免疫反應。 _ π、队今、々τ、土祝 表面以便誘導將分別之胜肽做為目標之細胞毒殺性 η ΙΧΙ.ι . 虽才又予一個體時，本發 之 ▼ 一，炉、…八^ '1不〜次W /3C*嘗攸 巴球。因此，本發明一目標為提供誘導細胞毒殺性τ淋e 球之5式劑、組合物或物質，此種試劑組合物或物質包括4 發月任何胜肽或多核苷酸。此試劑、組合物或物質可用方 癌症之治療及/或預防，及/或避免其手術後復發，特別肩 癌症，例如急性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌 δ 胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、胃癌、 溺漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺癌與軟 11 201138806 組織腫瘤。因&，本發明又另—目標為提供用於癌症之治 療及/或預防，及/或其手術後復發的避免的藥學試劑、組 合物或物質，此藥物被配製來包括或合併一或多個本發明 之胜肽或多核苷酸。除了本發明胜肽或多核苷酸外/代替本 發明胜肽或多核苷酸，本發明藥學試劑、組合物或物質可 包括呈現任何之本發明胜肽的抗原呈現細胞或外吐小體為 活性成分。 本發明之胜肽或多核苷酸可被用來誘導於其表面上呈 現HLA抗原與本發明胜肽之複合物的抗原呈現細胞例 如，藉由將來自一個體之抗原呈現細胞與胜肽接觸或將編 碼出本發明胜肽的多核苷酸引入抗原呈現細胞。此種抗原 呈現細胞具有高的抗目標胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球誘發 月色力且提供用途於癌症免疫治療。因此，本發明包括誘導 具細胞毒殺性Τ淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法與 藉由此方法獲得之抗原呈現細胞。 本發明更進一步之一目標為提供誘導細胞毒殺性Τ淋 巴球的方法’此種方法包括將CD8陽性細胞與表現本發明 胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或外吐小體共培養之步 驟’或引入包括編碼出與本發明胜肽結合之Τ細胞受體（τ cell receptor，TCR)次單元多胜肽之多核苷酸的基因的步 驟°藉由此種方法獲得之細胞毒殺性T淋巴球可在癌症之 ’/台療及/或避免中提供用途，癌症之例子包括，但不限於急 性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、 慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、 12 201138806 肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、 J、，，田胞肺癌與軟組織腫瘤。因

此，本發明又另一目樺A 標為柃供藉由本發明方法獲得之細胞 毒殺性τ淋巴球。 本發明又另一目標兔担/j... 、為乂供於一需要之個體中誘導抗癌 症之免疫反應的方法’此方法由紅讲工 , 々法包括投予一包含CDCA5多胜 肽或其免疫活性片段、編屣ψ ΓηΓ Λ c夕 碼崎出CDCA5多胜肽之多核苷酸、 呈現CDCA5多胜狀之外吐，〗、和 J體或抗原呈現細胞之試劑、組 合物或物質的步驟。 本發明之應用性擴展至—些關於或起因於CDa5過度 表現的疾病的任-冑’例如癌症，癌症的例子包括，但不 限於急性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管 細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、胃癌、瀰 沒型月癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺癌與軟組 織腫瘤。 又’本發明提供下列事項： [1 ] 一種經分離的胜肽’係由序列辨識號：21之胺 基酸序列或一其免疫活性片段所組成，其中該胜肽與一人 類白血球組織抗原結合且誘發細胞毒殺性τ淋巴球，或一 種經分離的胜肽’包括或係由由序列辨識號：21之胺基酸 序列所組成之胜肽之免疫活性片段的一胺基酸序列所組 成，其中該胜肽與一人類白血球組織抗原結合且誘發細胞 毒殺性T淋巴球。 [2 ] [ 1 ]之經分離的胜肽，其中該人類白血球組織抗 原為人類白血球組織抗原-A2。 13 201138806 [3] [1]或[2]之經分離的胜肽，其中該胜肽包括一胺 基酸序列，係擇自由序列辨識號：2至19所組成之群組。 [4] 一種經分離的胜肽，係擇自由下列所組成之群 組： (a) 一種經分離的胜肽，其與一人類白血球組織抗原 結合且誘發細胞毒殺性T淋巴球且係由序列辨識號：21之 胺基酸序列或一其免疫活性片段所組成，，或一種經分離 的胜肽，包括或係由由序列辨識號：21之胺基酸序列所組 成之胜肽之免疫活性片段的一胺基酸序列所組成，其中該 胜肽與一人類白血球組織抗原結合且誘發細胞毒殺性T淋 巴球。 (b) (a)之該經分離的胜肽’其中該人類白血球組織 抗原為人類白血球組織抗原-A2，與 (c) (a)或（b)之該經分離的胜肽，其包括一胺基酸序 列，擇自由序列辨識號：2至19所組成之群組， (d) (a)或（b)之該經分離的胜肽，其中該胜肽包括— 胺基酸序列，擇自由序列辨識號：2至1 9所組成之群組， 其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入或加入，提供 維持該原始胜肽的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的該經修 飾之胜肽。 [5] [4]之經分離的胜肽，其由一胺基酸序列所組 成，該胺基酸序列擇自由序列辨識號：2至19所組成之群 組，其中該胜肽具有下列特徵之一或兩者： (a)來自N端之第二個胺基酸為擇自由白胺酸或甲 14 201138806 ♦ 硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) c端胺基酸為擇自由纈氨酸或白胺酸所組成之群 組。 [6] [1]至[5]之任一項所述之經分離的胜肽，其中該 胜肽為九胜肽或十胜肽。 [Ή 一種經分離之多核苷酸，其編碼出[丨]至[6]之任 一項所述的胜肽。 [8 ] 一種誘發細胞毒殺性T淋巴球之組合物，其中該 組合物包括[1]至[6]之任一項所述之一或多個該胜肽，或 [7]所述之一或多個該多核苷酸。 [9] 一種藥學組合物’用於癌症之治療及/或預防， 及/或其手術後復發的避免，其中該組合物包括[1]至[6] 之任一項所述之一或多個該胜肽，或[7]所述之一或多個該 多核苷酸。 [10] [9]所述之藥學組合物，其中該組合物被配製來 用於投予一個體，其人類白血球組織抗原為人類白血球組 織抗原-A2。 [11] [9 ]或[10 ]之藥學組合物，其中該組合物被配製 來用於癌症之治療。 [12] 一種誘導具有細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之 抗原呈現細胞的方法，包括擇自由下列所組成之群組的一 步驟： (a) h ^广π、a h叩或。>〇將一抗原呈現細 胞與[1]至[6]之任一項所述之胜肽接觸；以及 15 201138806 (b) 將編碼出[1]至[6]之任一項所述之胜肽的一多 核苷酸引入一抗原呈現細胞。 [13] —種誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法，包括擇 自由下列所組成之群組的一步驟： (a) 將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原 呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與[丨]至[6 ]之任—項 所述之胜肽的複合物於其表面上； (b) 將CD8陽性T細胞與外吐小體共培養，外吐小體 表現一人類白血球組織抗原與[丨]至[6 ]之任一項所述之胜 肽的複合物於其表面上；以及 (c) 將一包括編瑪出一 T細胞受體次單元多胜狀之 多核苷酸的基因引入一 T細胞，該T細胞受體次單元多胜 肽與[1 ]至[6 ]之任一項所述的胜肽結合。 [14] 一種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白 血球組織抗原與[丨]至[6 ]之任一項所述之胜肽的複合物於 其表面上。 [15] [ 14 ]之抗原呈現細胞，其藉由[12 ]之方法來誘 導。 [16] —種經分離之細胞毒殺性T淋巴球，其以[1 ] 至[6]之任一項所述之胜肽為標的。 [17] [ 16 ]之細胞毒殺性T淋巴球，其中該細胞毒殺 性T淋巴球藉由[丨3 ]之方法來誘導。 [18] —種於一需要個體中誘導一抗癌症之免疫反應 的方法，該方法包括投予該個體一組合物的一步驟，該組 16 201138806 ▼ 合物包括[1 ]至[6 ]之胜肽、一其免疫活性片段，或編碼出 該胜狀或該片段之一多核皆酸。 [19] 一種抗體或其免疫活性片段’其抗[1 ]至[6 ]之 任何胜肽。 [20] 一種載體，包括編碼出[1]至[6]之任何胜肽的 一核苷酸序列。 [21] 一種宿主細胞，其被以[20]之一表現載體所轉 形或轉染。 [22] 一種診斷套組，包括[1]至[6]之任何胜肽、[7] 之核苷酸或[1 9 ]之抗體。 [23] [1 ]至[6]之任一項所述之經分離的胜肽，其包 括一胺基酸序列，擇自由序列辨識號：6、9與丨6所組成 之群組。在另一實施例中，[4 ]為一經分離的胜肽，其係擇 自由下列所組成之群組： (a) 一經分離之胜肽，其與一人類白血球組織抗原結 合且誘發細胞毒殺性T淋巴球且包括或係由胜肽之一其免 疫活性片段的一胺基酸序列所組成，而該胜肽由序列辨識 號·· 21之胺基酸序列所組成， (b) (a)之該經分離的胜肽，其包括一胺基酸序列， 擇自由序列辨識號：2至1 9所组成之群組， 與 (c) 一經分離的胜肽，其包括在（a)或（b)之胜肽之胺 基酸序列中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入及/或 加入的一胺基酸序列，提供維持該原始胜肽的細胞毒殺性 17 201138806 τ淋巴球誘發能力的該經修飾之胜肽 (d) (a)、（b)或（c)之該經分離的胜肽，其中該人類 白血球組織抗原為人類白血球組織抗原_A2。 除了上述’當以下詳細說明被閱讀並結合伴隨之圖式 與實施例’本發明之其他目的與特徵會變的更完全地明 白。然而’可瞭解的是，上面之本發明内容與以下之詳細 說明兩者為不範之實施例，並不限制本發明或本發明其他 替代實施例。特別是，當關於一些特定實施例於此敘述之 本發明，可以瞭解的是，敘述為本發明之說明，且並不建 構為本發明之限制。各種修飾與應用可被熟悉此技藝人士 想到’而無背離本發明精神與範目，如所附t請專利範圍 所述。同樣地’本發明之其他目#、特徵、好處與優點自 此内容與下述之特定實施例，為清楚的，且對於熟悉此技 藝人士而言可立即明白。此種㈣、特徵、好處與優點自 上述結合伴隨實施例、資料、圖式與所有要被自其單獨或 隨著考慮引人於此之參考文獻而描述的所有合理推論為清 楚的。 【實施方式】 雖然於本發明實施例之實施或測試中可使用相似或等 同於在此敘述之那些的任何方法與材料，但是現在敛述較 佳之方法、元件與材料。㈣在敘述本發明材料與方法之 前，需瞭解的《，說明書僅為說明，且不意指為限制。需 瞭解的是’本發明並不限於敘述於此之特定大小、形狀、 18 201138806 尺寸、材料、方法學、 或最佳化可將发㈣ 例如按照慣例實驗法及/ 、/、變更。此外，於此敘述中使用之專門用語 僅疋為了敘述特別之變化 — 形式或貫施例，且不傾向限制僅 於所附上之申請專利範圍的本發明範圍。 於本說明書中提及之各刊物、專利或專利申請的揭露 於此以其内容被具體引人為參考文獻。“，於此並沒有 被解釋為承認本發明由於先前發明之效力不被給予先於這 些揭露之權力。 除非特別定義，於此使用屬與本發明之所有技術或科 學用語為與熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。若發 生抵觸，本發明說明書，包括定義將會控制”匕外，材料 方法與實施例為僅為說明性，且不意味為限制。 I.定義 於此使用之單字“一”與“該，，意指“至少一，，除非 以別的方式明確指出。 於此可替換使用之用語“多胜肽”、“胜肽，，與‘‘蛋 白質意指胺基酸殘基之一聚合物。此用語適用於胺基酸 聚合物’於其中一或多個胺基酸殘基為經修飾之殘基或非 自然發生之殘基，例如對應自然發生胺基酸之人工化學模 仿物’與自然發生胺基酸聚合物。 於本說明書中有時使用之用語“寡胜肽，，被用來意指 本發明之胜肽，其為20個殘基或更少，一般為15個殘基 或更少’且一般為由介於約8與約11個之間的殘基，通常 為9或10個的殘基所組成 19 201138806 於此使用之用語“胺基酸”意指自然發生與合成之胺 基酸，及胺基酸類似物與胺基酸模仿物，其與自然發生之 胺基酸起相似作用。胺基酸可為L-胺基酸或D-胺基酸。自 然發生胺基酸為基因密碼所編碼的那些與於細胞中在轉譯 後被修飾的那些（例如經脯胺酸（hydroxyprol ine)、γ -叛基谷胺酸（gamma-carboxyglutamate)與 0-碟絲胺酸 (0-phosphoserine))。措辭“胺基酸類似物”意指具有與 自然發生胺基酸相同之基礎化學結構（一 α碳鍵結至一 氫、一叛基、一胺基與一 R基）的化合物，但具有一或多 個經修飾之R基或經修飾之骨架（例如，同絲胺酸 (homoserine)、降亮胺酸（norleucine)、曱硫胺酸 (methionine)、亞颯（sulfoxide)、曱基硫氨磺（methionine methyl sulfonium))。措辭“胺基酸模仿物”意指化學化 合物其與一般胺基酸具有不同結構，但有相似的功能。 可藉由由 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature

Comm ission所建議之其一般所知的三字母符號或一字母符 號來指出於此處之胺基酸。 於此可替換使用用語“基因”、“多核苷酸核 苷酸”與“核酸”，且除非以別的特別方式指出，相似於 胺基酸其以它們一般被接受的單一字母編碼來指出。 於此可替換使用用語“試劑”與“組合物，，與意指一 產物，其包括於特定量中特定成分，與任何產物其直接或 間接來自於特定量之特定成分的組合。此用語當被使用與 修飾詞語“藥學”（如“藥學試劑”與“藥學組合物，，） 20 201138806 相關時，意指包括—太 產物，其包括-活性成分與形成载體 :成刀，及任何產物其直接或間接來自任兩個或多個 合'複合或聚集，或來自一或多個成分之解離， ^ 或多個成分之反應或相互作用的其他形式。因 =在本發明内容中，用語“藥學試劑，，與“藥學組 意㈣由混合本發明分子或化合物與藥學上或生理 受之載體所製成的任何產物。 接 2處所使用之措辭“藥學上可接受之_ ”：接㈣體，’意指藥學上或生理上可接受之材料、 :5物、物質或載劑，包括’但不限於-液體或固體填充 身稀釋劑、賦形劑、溶劑或套膜材料，其與自一器官或 身體之-料攜帶或運輸受^ , - 又朱樂效團 e P〇 ypharmacoph〇res)至另一器 一部分相關。 X豸媸之 本發明之藥學試劑或組合物提供特別 本發明内容中，措辭“疫苗（也意指唯：二： 物），，意指一物質，其藉由接種 文性、、且σ 免疫力的㈣。 ^進入動物具有誘導抗腫瘤 於此使用之用語“活性成分，，意指在 物中的物質’其為生物或生理活躍 1或- 試劑或組合物的内容中，用語“活性八，，疋，在一藥學 βε _ 取刀 意指一物質其 .,、τ目‘的之樂子作用。例如’若藥學試劑或电么物用 於癌症之治療或避免中，在試劑或組合物、σ 直接或間接引起對癌細胞及/或組織 1性成分可 生物或生理作用。較 21 201138806 佳為’此作用可包括減低或抑制癌細胞生長、損傷或殺死 癌細胞及/或組織等。一般而言，有效成分的間接作用為誘 導細胞毒殺性τ細胞辨認或殺死癌細胞。在被配製前，“活 性成分”也可意指為“主體（bulk)，’ 、 “藥物物質（drug substance)” 或“技術產物（technical product)，，。 除非以別的方式定義，用語“癌症”意指過度表現 CDCA5基因之癌症，其例子包括，但不限於急性骨髓性白 血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓 性白血病、大腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌 '肺癌、 淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。 除非以別的方式定義，於此可替換使用且以別的方式 特別指出用語“細胞毒殺性T淋巴球”、“細胞毒殺性T 細胞與‘‘ CTL”以意指T淋巴球之次族群，且除非以別的 方式指出’意指T淋巴球之次群組（sub-group)可辨認非自 身細胞（例如’腫瘤/癌症細胞、被病毒感染之細胞），且 誘導這些細胞死亡。 除非特別定義，用語“ HLA-A2”如此處所使用，代表 性意指次型，次型之例子包括，但不限於HLA-A*020 1、 HLA-A*0202 、 HLA-A*0203 、 HLA-A*0204 、 HLA-A*0205 、 HLA-A*0206 、 HLA-A*0207 、 HLA-A*0210 、 HLA-A*0211 、 HLA-A*0213 、 HLA-A*0216 、 HLA-A*0218 、 HLA-A*0219 、 HLA-A*0228 與 HLA-A*0250 。 除非特別定義，於此使用之用語“套組”被使用於關 於試劑與其他材料之組合。與此考慮之套組包括微陣列、 22 201138806 晶片、標誌等。並無打算使用語“套組”限制於試劑及/ 或材料之特定組合。 如於此使用，在一個體或病患的背景中，措辭“個體 之（或病患之）HLA抗原為HLA-A2”意指此個體或病患同 型結合地（homozygously)或異質結合地（heterozygously) 具有HLA-A2抗原基因’且HLA-A2抗原被表現於此個體或 病患的細胞中為一 HLA抗原。 本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之“治 療”之内容中，一治療被視為“有效”，若其導致臨床優 點，例如於CDCA5基因之表現中的減少、或於個體中癌症 之大小、普遍程度（prevalence)或轉移潛力的減少。當治 療為預防性（prophylactically)提供時，“有效”意指減 緩或避免癌症形成，或避免或減輕癌症之臨床症狀。有效 性被確認於相關之診斷或治療特定腫瘤形式的任何已知方 法0 本發明之方法與組合物之範圍提供用途於癌症之‘‘避 免與“預防”之内容中’此類用詞為與此交替使用意指 任何活性’其減少死亡率之負載或來自疾病之死亡率。避 免與預防可發生於“初期、第二期與第三期避免層級，，。 初期避免與預防避免了疾病之發展，@第二期與第三期層 級之避免與預防包括藉由恢復功能與減少疾病相關併發 症’以疾病之發展與症狀之浮現及減少已建立之疾病之負 :!展的避免與預防為目的。或者，治療或避免可包括二 ⑽圍之預防疾病治療’其以減緩特別疾病之嚴重度為目 23 201138806 標，例如減少腫瘤之增殖與轉移。 在本發明内容中，癌症之治療及/或預防，或，及/或 其手術後復發的避免包括任何下列步驟，例如癌細胞之手 術移除、似癌細胞之生長抑制、腫瘤之衰退或退化、癌發 生之減緩與抑制的料、腫瘤退化與轉移之減少與抑制。 癌症之有效治療及/或預防減少致死率與改善具有癌症之 個體的預後、減低癌症標記於血液中的程度與減緩伴隨著 癌症之可㈣症狀。例如’症狀之減輕或改善構成有效治 療及/或預防，其包括10%、20%、30%或更加減輕，或穩定 疾病。 在本發明内容中，用語“抗體”意、指免疫球蛋白與其 片段’其專-與選定蛋白質或其胜肽反應。一抗體可包括 人類抗體、靈長類抗體、嵌合抗體（chimeric antibmiy)、 雙專一抗體（bispecific antibody)、人源化抗體、與其他 蛋白質或放射標誌融合之抗體’與抗體片段。此外，此處 之抗體被使用於最大效用且特別包含完整單株抗體、多株 抗體、形成自至少兩個完整抗體之多專一抗體 (multi specific antibody)(例如雙專—抗體）與抗體片 段，只要其存在所需生物活性。-“抗體，，意指所有之種 類（例如，IgA' IgD、IgE、IgG 與 igM)。 除非特別定義’於此使用之所有技術與科學用語為與 熟悉此技藝人士所通常瞭解之意義相同。 II.胜肽 為了證明來自CDCA5之胜狀作用如一被細胞毒殺性 24 201138806 淋巴球（CTLs)所辨認之抗原，分析來自CDCA5之胜肽（序 冒 列辨識號：21)以確定是否其為由一般遇到HLA對偶基因 (allele)之HLA (人類白血球組織抗原）-A2所限制之抗 原決定位（Date Y ei a 厶，Tissue Antigens 47: 93-1 01， 1996; Kondo A et al., j Immunol 155: 4307-12, 1995; Kubo RT 以 a/.， J Immunol 152: 3913-24， 1994)。 確認來自CDCA5之HLA-A2結合胜肽的候選物，根據其 對HLA-A2之結合親和力。確認下列候選胜肽： CDCA5-A2-9-622 (序列辨識號：2 )、 CDCA5-A2-9-166 (序列辨識號：3)、 CDCA5-A2-9-235 (序列辨識號：4)、 CDCA5-A2-9-40 (序列辨識號：5 )、 CDCA5-A2-9-183 (序列辨識號：6)、 CDCA5-A2-9-151 (序列辨識號：7)、 CDCA5-A2-9-172 (序列辨識號：8)、 CDCA5-A2-9-241 (序列辨識號：9)、 CDCA5-A2-10-171 (序列辨識號：10)、 CDCA5-A2-10-221 (序列辨識號：11)、 CDCA5-A2-10-187 (序列辨識號：12)、 CDCA5-A2-10-59 (序列辨識號：13)、 CDCA5-A2-l〇-235 (序列辨識號：14)、 CDCA5-A2-1 0-225 (序列辨識號：15 )、 CDCA5-A2-10-35 (序列辨識號：16)、 CDCA5-A2-10-96 (序列辨識號：17)、 25 201138806 CDCA5-A2-10-170 (序列辨識號：18)與 CDCA5-A2-10-85 (序列辨識號：19) 此外，藉由載有這些胜肽之樹突細胞 (dendr i t i c ce 11，DCO刺激Τ細胞後，使用各下列胜肽成 功建立細胞毒殺性T淋巴球： CDCA5-A2-9-183 (序列辨識號：6)、 CDCA5-A2-9-241 (序列辨識號：9)與 CDCA5-A2-10-35C 序列辨識號：16)。、 這些被建立的細胞毒殺性T淋巴球顯示強而專一之抗 經分別之胜肽脈衝之目標細胞的細胞毒殺性τ淋巴球活 性。這些結果證明CDCA5為一由細胞毒殺性τ淋巴球所辨 認之抗原，且測試之胜肽為由HLA-A2限制之CDCA5的抗原 決定位胜肽。 由於CDCA5基因於癌症細胞與組織，包括，但不限於 例如急性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管 細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、胃癌、瀰 漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺癌與軟組 織腫瘤的那些之中被過度表現，且不在大部分正常器官 中’所以其為一良好之癌症免疫治療標的。因此，本發明 提供來自CDCA5之細胞毒殺性T淋巴球辨認抗原決定位的 九胜肽（胜肽由九個胺基酸殘基所組成）與十胜肽（胜肽 由十個胺基酸殘基所組成）。或者，本發明提供經分離之 胜肽’其與HLA抗原結合且誘導細胞毒殺性τ淋巴球，其 中胜肽係由序列辨識號：21所組成或為一其免疫活性片 26 201138806 段。此外’在一些實施例中，本發明提供胜肽，其由擇自 序列辨識號：2至19中之胺基酸序列所組成。在較佳實施 例中’本發明胜肽為包括擇自序列辨識號：6、9與16中 之胺基酸序列的胜肽。 通常可使用現今於例如網路可得之軟體程式，例如於 Parker KC et al. , J Immunol 1 994 Jan 1, 152(1)： 163-75 and Nielsen M et al., Protein Sci 2003; 12: 1007-17 中所敘述的那些’來計算介於各種胜肽與Hla 抗原間之結合親和力。例如，於概述於例如Laf uen t e em e ί a1. ， Current Pharmaceutical Design, 2009, 15， 3209-3220 中 parker KC M a/.，J I_un〇l 1994 Jan l 1 52( 1 ): 1 63-75，KuzushimaKeia/.，Blood 2001，98(6): 1 872-81, Larsen MV et a7. BMC Bioinformatics. 2007 Oct 31; 8: 424，Buus Set al. Tissue Antigens., 62:378-84, 2003， Nielsen Metal.， Protein Sci 2003; 12: 1007-17, 與 Nielsen M ei PLoS ONE 2007; 2: e796 中所述可 測量與HLA抗原之結合親和力。測量親和力之方法敘述， 例如於 Journal of Immunological Methods, 1 995, 1 85· 181-190 與 Protein Science, 2000， 9: 1838-1846 中。 所以可使用此種軟體程式來選擇來自CDCA5的那些片段， 其具有與HLA抗原之高結合親和力。因此本發明包括由來 自CDCA5之任何片段所組成之胜肽，其藉由此類已知程式 可確認與HLA結合。此外，此類胜肽可包括由CDCA5之全 長胜肽所組成之胜肽。 27 201138806 本發明胜肽，特別是本發明之九胜肽與十胜肽可於側 面具有額外之胺基酸殘基，只要胜肽維持其細胞毒殺性τ 淋巴球誘發能力。位於特定之額外胺基酸殘基可由任何種 類之胺基酸所組成，只它們不減少原始胜肽之細胞毒殺性 T淋巴球誘發能力。因此，本發明包括具有對HLA抗原之 結合親和力之胜肽，其包括來自CDCA5之胜肽。此種胜肽， 例如小於約4 0個胺基酸，時常小於約2 〇個胺基酸，通常 小於約15個胺基酸。 一般而言’已知於一胜肽中一、二、數個或多個胺基 酸之修飾，不影響胜肽的功能，或在一些例子中，甚至增 強原始蛋白質所需之功能。事實上，已知經修飾之胜肽 (即’胜肽由藉由取代、插入、刪除及/或加入一二或數個 胺基酸殘基至一原始胺基酸序列來修飾之胺基酸序列所組 成）維持原始胜肽的生物活性（Mark ef a/.，Proc Natl Acad Sci USA 1 984, 81: 5662-6; Zoller and Smith,

Nucleic Acids Res 1982, 10: 6487-500； Dalbadie-

McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 1982, 79： 6409-13)。因此，根據本發明一實施例’本發明具有細胞 毒殺性T淋巴球誘發能力之胜肽可由具有擇自序列辨識 號：2至1 9中之胺基酸序列之胜肽所組成，其中加入、刪 除、插入及/或取代一、二甚至更多個胺基酸。在另一實施 例中，本發明胜肽可為包括在擇自序列辨識號：2至19中 之胺基酸序列中一、二或數個胺基酸被取代刪除插入及/ 或加入之胺基酸序列的胜肽，提供維持原始胜肽之細胞毒 28 201138806 殺性τ淋巴球誘發能力的經修飾胜肽。在較佳實施例中， ν 外 本發明胜肽可為包括在擇自序列辨識號：6、9與16中之 胺基酸序列中一、二或數個胺基酸被取代刪除插入及/或加 入之胺基酸序列的胜肽，提供維持原始胜肽之細胞毒殺性 Τ淋巴球誘發能力的經修飾胜肽。 熟悉此技藝人士會認定改變一單一胺基酸或一小百分 比之胺基酸的個別加入、插入、刪除及/或取代至一胺基酸 序列產生保存原始胺基酸支鏈的特性；其因此被意指為 “保守取代（conservative substitutions)” 或“保守修 飾（conservative modifications)” ，其中一蛋白質之改 變導致一具有相似功能的蛋白質。提供功能相似胺基酸之 保守取代表已為本技術領域所熟知。胺基酸支鏈的特徵的 例子為疏水胺基酸（A，I，L，M，F，P，W，Y，V)、親水胺 基酸（R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)與具有下列共同 官能基或特徵之支鏈：一脂肪族支鏈（G，A，V，L, I p) · 一含羥基支鏈（S, T，Y);含硫原子支鏈（c，M);含羧酸與 胺基支鏈（D，N，E，Q);含鹼支鏈（r，k，H);以及含芳香 族支鏈（H，F，Y，W)。此外，下列八個族群各包含為彼此 保守取代之胺基酸： 1) 丙胺酸（A)、甘胺酸（G); 2) 天門冬胺酸（D)、麩胺酸（E); 3) 天門冬醯胺（N)、麩胺醯胺（Q); 4) 精胺酸（R)、離胺酸（K); 5) 異白胺酸（I)、白胺酸（L)、甲硫丁胺酸（M)、纈胺酸 29 201138806 (V)； 6) 苯丙胺酸（F)、酪胺酸（Y)、色胺酸（w); 7) 絲胺酸（S)、蘇胺酸（T);以及 8) 半胱胺酸（C)、曱硫丁胺酸（Μ)(參見，例如Creight〇n， Proteins 1984)。 此種經保守修飾胜肽也被視為本發明之胜肽。然而， 本發明之胜肽並不限於此，且可包括非保守修飾，只要經 修飾之胜肽維持原始胜肽之必不可少的細胞毒殺性T淋巴 球誘發能力。更進一步而言，經修飾之胜肽不排除多形變 體（polymorphic variant)、種間同質體（interspecies homologues)與CDCA5對偶基因（alleles)之細胞毒殺性τ 淋巴球誘發的胜肽。 胺基酸殘基可被插入、取代 '刪除/及或加入至本發明 之胜肽，或者胺基酸殘基可被從其刪除以達到一較高之結 合親和力。為了維持必須之細胞毒殺性T淋巴球誘發能 力，較佳為只修飾（插入、刪除、加入/或取代）一小數目 (例如一、二或數個）或小百分比之胺基酸。此處用語“數 個”指5或更少個胺基酸，例如4個或3個或更少。被修 飾之胺基酸之百分比可為，例如2〇%或更少，較佳為，丨5% 或更少，更佳為，10%或更少，甚至更佳為或i至5%。 當使用於文中之癌症免疫治療時，本發明胜肽可被表 現於一細胞或外吐小體之表面上如一伴隨HU抗原之複合 物。因此，其較佳為選擇不只誘導細胞毒殺性τ淋巴球且 也具有對於HLA抗體之高度親和力的胜肽。為此目的，藉 30 201138806 由胺基酸殘基之取代、插入、刪除及/或加入可修飾胜肽已 產生具有經改善之結合親和力之經修飾的胜狀。除了自然 表現之胜肽外，由於已知藉由結合至Hla抗原來表現之胜 肽序列的規則（J Immunol 1994, 152: 3913；

Immunogenetics 1995, 41： 178； J Immunol 1994, 155: 4 3 0 7) ’可將基於此規則之修飾引入本發明之致免疫性胜 肽。 例如，具有高HLA-A2結合親和力之胜肽傾向具有以白 胺酸或曱硫丁胺酸取代之來自N端的第二個胺基酸。同樣 地，於其中C端胺基酸被以纈胺酸或白胺酸取代的胜肽也 可較喜愛地被使用《因此，具有擇自序列辨識號：2至19 之胺基酸序列的胜肽’其中序列辨識號之胺基酸序列之來 自N端的第二個胺基酸被以白胺酸或曱硫丁胺酸取代，及/ 或其中序列辨識號之胺基酸序列之C端胺基酸被以纈胺酸 或白胺酸取代，為被本發明所考慮。在另一實施例中，本 發明包括胜肽’其具有擇自序列辨識號：2至19中之胺基 酸序列之來自N端的第二個胺基酸被以白胺酸或甲硫丁胺 酸取代及/或序列辨識號之胺基酸序列之C端胺基酸被以 纈胺酸或白胺酸取代的胺基酸序列。在較佳實施例中，本 發明胜肽可為胜肽，其具有擇自序列辨識號：6、9至16 中之胺基酸序列之來自N端的第二個胺基酸被以白胺酸或 曱硫丁胺酸取代及/或序列辨識號之胺基酸序列之C端胺 基酸被以纈胺酸或白胺酸取代的胺基酸序列。 可將取代引入不止於末端胺基酸，也可於胜肽之潛在 31 201138806 TCR位的辨認位置。一些研究已證實一具有胺基酸取代之 胜肽可具有等於或比原來更好的功能，例如CAP 1、P53 ( 264 - 2 72 ). Her-2/neu (369-377) 或 gplOO ( 20 9-2 1 7 ) (Zaremba ei a/.

Cancer Res. 57, 4570-4577, 1997, T. K. Hoffmann et dl. J Immunol. (2002 ) Feb 1 ;168(3):1338-47., S. 0. Dionne etaJ. Cancer Immunol immunother. (2003) 52: 199-206 and S. 0. Dionne et al. Cancer Immunology, Immunotherapy (2004) 53， 307-314)。 本發明也考慮一、二個或數個胺基酸的加入也可被加 至本發明胜肽之N及/或C端。本發明也包括具有高HLA抗 原結合親和力且維持細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之此種 經修飾的胜肽。 然而’當胜肽序列與一具有不同功能之内生或外生蛋 白質之胺基酸序列的一部份相同時，可能誘導副作用，例 如自體免疫疾病及/或抗特定物質之過敏症候群。因此，可 使用可得之資料庫首先執行同源搜尋以避免胜肽之序列符 合其他蛋白質之胺基酸序列的情況。當不只存在與目標胜 肽具有一或兩個胺基酸不同之胜肽的同源搜尋變得清楚 時’為了增加其與HLA抗原之結合親和力，及/或增加其細 胞毒殺性T淋巴球誘發能力而不具副作用之任何危險，可 修飾目標胺基酸。 雖然如上述之具有對HLA抗原高結合親和力的胜肽被 預期為高效能，但根據作為指示之高親和表現而被選擇之 候選胜肽，更進一步被測試細胞毒殺性T淋巴球誘發能力 32 201138806 的表現。此處措辭“細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力”意指 當表現於抗原呈現細胞上時，胜肽誘導細胞毒殺性τ淋巴 球的能力。此外，“細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力”包括 胜肽誘導細胞毒殺性Τ淋巴球活化、細胞毒殺性τ淋巴球 增殖、促進細胞毒殺性τ淋巴球分解目標細胞與增加細胞 毒殺性Τ淋巴球IFN-7"產生的能力。 藉由誘導攜帶人類MHC抗原之抗原呈現細胞（例如Β-淋巴球、巨嗤細胞與樹突細胞）或更專一地來自人類周邊 血液單核細胞之樹突細胞，並在以胜肽刺激之後與CD8陽 性細胞混合’且之後測量由抗目標細胞之細胞毒殺性Τ淋 巴球產生並釋放之IFN- 了來達成細胞毒殺性Τ淋巴球誘發 能力的確定。如此反應系統，可使用已被產生來表現人類 HLA之基因轉殖動物（例如，於BenMohamed L, Krishnan R， Longmate J, Auge C, Low L, Primus J, Diamond DJ, Hum Immunol 2000 Aug, 61(8): 764-79, Related Articles, Books, Linkout Induction of CTL response by a minimal epitope vaccine in HLA A*0201/DR1 transgenic mice: dependence on MHC (HLA) class II restricted T(H) response中的描述）。例如可以5ICr放射標示目標細胞， 且可從自目標細胞釋放出的放射活性計算細胞毒殺活性。 或者，其可在攜帶經固定之胜肽之抗原呈現細胞存在下， 藉由測量由細胞毒殺性T淋巴球產生並釋放的IFN_ r ’並 使用抗IFN-r單株抗體來使於培養基上之抑制區可見來 檢驗》 33 201138806 淋巴球誘發能 1 9所指出的胺基酸 示特別高之細胞毒 由於如上述測試胜肽之細胞毒殺性 力，發現擇自具有由序列辨識號：2至ig 序列之那些胜肽中的九胜肽與十胜肽顯示 殺性τ淋巴球誘發能力與對HLA抗原之高結合親和力。因 此這些胜肽被示例為本發明之較佳實施例。 此外，同源分析之結果證明此種胜肽不與來自任何其 他已知人類基因產物之胜肽共有顯著之同源性。當用於免 疫治療時，此降低了未知或不需要之免疫反應的可能性。 因此，也來自此態樣，這些胜肽對於在癌症病患中引起抗 CDCA5免疫力為有效的。因此較佳為具有擇自序列辨識號： 2至1 9中之胺基酸序列的胜肽之本發明之胜肽也被本發明 所考慮。 除了以上所討論之本發明胜肽的修飾之外，本發明胜 狀可連接其他胜肽’只要所產生之經連接的胜肽維持原始 胜肽之必不可少之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力，且更佳 為以維持其必不可少之HLA結合。示例之“其他，，胜肽的 包括：本發明胜肽或來自其他腫瘤相關抗原之細胞毒殺性 T淋巴球誘導胜肽。胜肽間之連結器為被本技術領域所熟 知’例如 AAY (P. M· Daf tar ian ei ，J Trans Med 2007， 5:26)' AAA' NKRK(R. P. M. Sutmullereiai., J Immunol 2000，1 65: 7308-731 5)或 K (S. Ota ei a/.，Can Res. 62， 1471-1476, K. S. Kawamura etal., J Immunol. 2002, 1 68: 5709-5715)。 例如，也可實質同時使用非CDCA5腫瘤相關抗原胜肽 34 201138806 以增加經由HLA class I及/或class II之免疫反應。其 已相當綠認，癌症細胞可表現多於一個腫瘤相關基因。因 此’其為在對於熟悉此技藝人士例行實驗之範圍中以確認 是否一特定個體表現額外腫瘤相關基因，且之後包括來自 此類基因之表現產物的HLA class I及/或ciass j j結合 胜肽於本發明之CDCA5組合物或疫苗中。 HLA class I與HLA class 11結合胜肽之例子對於熟 悉此技藝人士而言是已知的（例如，參見Coul ie，Stem Cells 13:393-403，1995)，且可以一如此處所揭露之那 些的類似方式被使用來與本發明連結。使用一般分子生物 程序’熟悉此技藝人士可製備包括一或多個CDCA5胜肽與 一或多個非CDCA5胜肽的多胜肽，或編碼出此類多胜肽的 核酸。 上述此類連結胜肽於此處意指為 “多面體 (polytope)”即’兩個或多個潛在免疫原性（immunogenic) 或免疫反應刺激胜肽的群組，胜肽可互相連接以多種排列 (例如’連成一串或部分重疊）。多面體（或編碼出多面 體的核酸）可以符合標準免疫步驟被投予，例如至動物， 以測試多面體於刺激、增強及/或誘導一免疫反應之功效。 胜狀可被直接連接或經由使用位於側面之序列以形成 多面體，且多面體為疫苗之用途為本技術領域所熟知（參 見 ’ Thomson M ，Proc. Natl. Acad. Sci USA 92(13): 5845-5849, 1995; Gilbert et al. , Nature Biotechnol. 15(12):1280-1284, 1997； Thomson et al., J Immunol. 35 201138806 1 57(2):822-826, 1 996; Tarn et a 1. , J Exp. Med. 171(1): 299-306，1 990 )。製備並含有抗原決定位之不同數目與組 合的多面體並為了藉由細胞毒殺性T淋巴球的辨認與為了 於增加免疫反應中之功效將其進行測試。 本發明胜肽可被進一步被連接至其他物質，只要它們 維持必不可少之細胞毒殺性T淋巴球誘發能力。此種“其 他物質之說明例子包括’但不限於胜肽、脂質、糖與糖 鏈、乙醯基’天然與合成之聚合物等。胜肽可包含修飾， 例如膽基化、支鏈氧化或磷酸化，只要修飾不損壞如於此 所述胜肽之生物活性。這些種類之修飾可被執行以授予額 外之功能（例如，目標功能與傳送功能）或穩定多胜肽。 例如，為了 Κ/叩增加多胜肽之穩定度，本技術領 域已知引入D-胺基酸、胺基酸模仿物或非天然胺基酸；此 内容也適合本發明之多胜肽。可以一#方法分析一多胜肽 的穩定度〇例如’可使用肽酶與多種生物培養基，例如人 類血漿與血清，來測試穩定度（參見，例如Verh〇ef & ，

Eur J Drug Metab Pharmacokin 1986， 11: 29卜302)。 田本發明胜肽包括一半胱胺酸殘基時，胜肽傾向經由 在胱胺酸之SH基之間的雙硫鍵結形成二聚體。因此，本發 明胜肽之二聚體也可被包含於本發明胜肽中。 此外’如上所提到，在藉由一、二或數個胺基酸殘基 取代、刪除或加人之經修飾的胜肽中，可筛選或選擇與原 始胜肽相較具有相同或較高之活性的那些。因此本發明也 提供-篩選或選擇與原始相較具有相同或較高之活性的經 36 201138806 修飾胜肽的方法。例如’方法可包括步驟： a:將至少—個本發明胜肽之胺基酸殘基取代、刪除或 加入， b :確定胜肽的活性，與 C:選擇與原始相較具有相同或較高之活性的胜肽。 此處’活性可包括MHC結合活性、抗原呈現細胞或細 胞毒殺性T淋巴球誘發能力與細胞毒性活性。 此處，本發明之胜肽也可被描述為“CDCA5胜肽，，或 “ CDCA5多胜肽”。 III· CDCA5胜狀之製備 使用熟知之技術可製備本發明之胜肽。例如，藉由重 組_技術或化學合成可以合成方法地製備胜狀。本發明 胜肽可單獨合成或為包括兩或多個胜肽之較長多胜肽。可 分離此胜肽，即實質上無其他自然發生之宿主細胞蛋白質 與其片段或任何其他化學物質地純化或分離。 本發明胜肽可包含修飾，例如醣基化'支鏈氧化或磷 酸化，其提供修飾不損冑原始胜肽之生物活性。其他修飾 包括可用I ’例如增加胜狀之血清半衰期之D_胺基酸或其 他胺基酸模仿物的合併。 精由根據經選擇之胺基酸序列的化學合成可獲得本發 明之胜肽。例如’可被用來合成之一般胜肽合成方法包括： (1)胜肽合成（Peptide Synthesis) Interscience， New York, 1966; (ii)蛋白質（The pr0teins)，Vol. 2，Academic 37 201138806

Press, New York, 1976; (iii) 胜肽合成（Peptide Synthesis)(in Japanese)， Maruzen Co., 1975; (iv) 胜肽合成之基礎與實驗（Basics and Experiment of Peptide Synthesis) (in Japanese), Maruzen Co.， 1985; (v) 藥學的發展（Development of Pharmaceuticals) (second volume) (in Japanese), Vol. 14 (peptide synthesis), Hi rokawa, 1991; (vi) W099/67288 ;以及 (vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2， Sol id Phase Peptide Synthesis" , Academic Press, New York, 1980， 100-118 〇 或者’藉由適應任何已知產生胜肽之基因工程方法可 獲得本發明之胜肽（例如，M〇rrison j，j Bacteriology 1977, 132: 349-51； C1ark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzym〇l〇gy (eds. Wu et al ) 1983， 1〇1: 34762)。 ，其懷有一多核苷酸其編碼

k/ iro產生胜肽。 例如，首先製備一適合之載體， 出目標胜肽於一可矣洁沾似a IV.多核苷酸 38 201138806 本發明提供多核苷酸，其編碼出任何本發明上述之胜 狀。^些包括來自自然發生之基因（GenBank Accession Νο· Νι〇8〇6688 (例如，序列辨識號：2〇)) 的夕核苷酸與具有其之保守修飾之核苷酸序列的那些。此 處措辭保寸修飾之核苷酸序列”指序列其編碼出相同或 實質上相同之胺基酸序列。由於基因密碼的退化，一大份 之功月t相同之核酸編碼出任何已知蛋白質。例如，密碼 GCA、GCC、GCG與GCU皆編碼出胺基酸丙胺酸。因此，於 藉由岔碼具體指定丙胺酸之每個位置，可改變密碼成為 任何上述不會改變編碼出之胜肽的對應密碼。此核酸變化 為於本技術領域意指為“沈默變化（silent variation)’’ ，表示保守修飾變體的一種。此處敘述為編 碼出一胜肽之每個核酸序列也描述核酸之每種可能的沈默 變化。熟悉此技藝人士會立即明白於一核酸中各密碼（除 了 AUG ’其原本為甲硫胺酸之唯一密碼、與tgg其原本為 色胺酸之唯一密碼）可被修飾以產生一功能相同分子。因 此各所揭露之胜肽編碼核苷酸序列表示與其相關之沈默變 化的暗示性揭露。 本發明之多核苷酸可由DNA、RNA與其衍生物所組成。 如本技術領域所熟知，DNA適合地由鹼基所組成，例如自 然發生鹼基A、T、C與G，而τ於RNA中為u所取代。熟 悉此技藝人士可瞭解非自然發生鹼基也被包含於多核苷酸 中。 本發明之多核苷酸可編碼出本發明之多個胜肽，具有 39 201138806 或不具有介於中間之胺基酸序列。例如，介於中間之胺基 酸序列可提供多核苷酸或經轉譯之胜肽一裂解位（例如酵 素辨認序列）。更進一步而言，多核苦酸可包括任何額外 之序列至編碼出本發明胜肽之編碼序列。例如，多核苷酸 可為一重組多核苷酸，其包括胜肽表現所需之調控序列， 或τ為具有標諸基因與此類之表現載體（質體）。一般 而言，可製備此重組多核苷酸’藉由經由使用例如聚合酶 與内切酶之一般重組技術的多核苷酸操作。 可使用重組與化學合成技術兩者以產生本發明之多核 苷酸。例如，藉由插進入一適合之載體可產生一多核苷酸， 當轉染進入一勝任細胞時，其可被表現◊或者，使用pcR 技術或表現於適合的宿主可將一多核苷酸放大（參見，例 如 Sambrook a人，Molecular Cloning: A Ub〇rat〇ry

Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)。或者，使用固態技術如於BeaucageSL& iyerRp，

Tetrahedron 1992, 48: 2223-311； Matthes etal., EMBO J 1 984，3: 801-5中所敘述，可合成多核苷酸。 V.外吐小體（exosomes) 本發明進一步地提供稱為外吐小體的胞間囊泡 (intraceliuiar vesicles)，其呈現形成於本發明之胜肽 與人類白血球抗原表面之間的複合物。例如，藉由使用於 Japanese Patent Application Kohyo Publications Nos. Hei 1 1-51 0507與W099/03499所詳述的方法以及使用從接 受治療和/或避免之病人所得的抗原表現細胞可製備外吐 201138806 小體。本發明之外吐小辦π ,— 相似於本發 r j體可如疫苗般地接種 明的胜肽。 包括在複合物中的人類 么机原形式必須盥需尊a 療及/或預防之個體的人類白. /、 ° 认士 ^ 類白血球抗原形式相符。例如，對 ;日本人而&，HLA-A2，特別是HLA_A* 〇2 也士也 * Λ Α Α 0201 與 HLA-A*0206 為時常適合的。高度表現於日 一问加緊人之中的A2型 之使用有助於獲得有效的結果，

* 术見-人型，例如A* 0201與A 020Θ提供用途。一般在臨床 床上而接文治療之病患的人 類：血球抗㈣式係進行預先的研究’這可適當地選擇對 此抗原具有高度結合親合力的胜肽或經由抗原表現具有細 胞毒性T淋巴細胞誘發性的胜肽。此外，$ 了獲得顯示高 度結合親合力與細胞毒性T淋巴細胞誘發性兩者的胜肽门 可以天然產生之CDCA5部分胜肽的胺基酸序列為基礎執 行1、2或數個胺基酸的取代、刪除或添加。 當對本發明外吐小體使用Α2型HLA抗原時，具有序列 辨識號：2至19之任一個之序列的胜肽具有特別的效用。 VI.抗原呈現細胞 本發明也提供抗經分離之原呈現細胞，其表現以 抗原與本發明胜肽形成的複合物於其表面上。抗原呈現細 胞可來自受到治療及/或避免之病患，且藉由其本身或與包 括本發明之胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球之其他 藥物結合可被投予如一疫苗。 抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans cell)、巨嗜細胞、b細胞 41 201138806 與活化之T細胞’已知其表現蛋白質（pr〇teinaceous)抗原 於其細胞表面以被淋巴球所辨認。由於樹突細胞為一典型 抗原呈現細胞’其於抗原呈現細胞中具最強之細胞毒殺性 T淋巴球誘導活性，樹突細胞供給使用如本發明之抗原呈 現細胞。 例如，藉由誘導來自周邊血液單核細胞之樹突細胞與 之後i77 H iro、ex KO或W ΓΟ以本發明胜肽接觸（刺 激）其可獲得一抗原呈現細胞。當本發明之胜狀投予至一 個體’於個體身體内誘導表現本發明胜肽之抗原呈現細 胞。因此，藉由在將本發明胜肽投予至一個體後，自此個 體收集抗原呈現細胞可獲得本發明之抗原呈現細胞。或 者’藉由將自個體收集之抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸 可獲得本發明之抗原呈現細胞。 可將本發明之抗原呈現細胞以其本身或結合包括本發 明胜肽、外吐小體或細胞毒殺性T淋巴球的其他藥物投予 至一個體以誘導於個體中之抗癌免疫反應。例如，W 投予可包括步驟： a :自一第一個體收集抗原呈現細胞， b :以胜肽接觸步驟a之抗原呈現細胞，以及 c :將步驟b之抗原呈現細胞投予一第二個體。 第一個體與第二個體可為相同個體或可為不同個體。 自步驟b獲得之抗原呈現細胞可被投予一為疫苗，用以治 療及/或預防癌症，癌症的例子，包括但不限於急性骨髓性 白血病 '膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨 42 201138806 髓性白血病、大腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、 淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。 本發明也提供製造包括抗原呈現細胞之藥學組合物的 一方法或製程，其中方法包括將本發明胜肽與藥學上可接 受之載體一起混合或配製的步驟。 根據本發明一方面，本發明之抗原呈現細胞具高程度 細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力。在用語“高程度細胞毒殺 性τ淋巴球誘發能力”中，高程度相對於藉由抗原呈現細 胞沒有與胜肽接觸或與無法誘導細胞毒殺性τ淋巴球之胜 肽接觸的程度。藉由包括“ h iro將編碼出本發明胜肽之 多核苷酸轉移至抗原呈現細胞的步驟的方法與上述之方 法，可製備此種具高程度細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之 抗原呈現細胞。此經引入之基因可為DNA或RNA形式。引 入方法的例子包括，並無特別限制，各種於此領域一般被 執行的方法，可使用例如脂質體轉染（lip0fection)、電穿 孔法（electroporation)或磷酸鈣方法。更特別地，可執行 其如 Cancer Res 1996，56: 5672-7; J Immunol 1 998, 1 6 1. 5607-13; J Exp Med 1996, 184: 465-72； Published

Japanese Translation of International Publication No 2000-509281中所述。藉由轉移基因進入抗原呈現細胞， 基因遭遇轉錄、轉譯與此類於細胞中，且之後所獲得之蛋 白質藉由MHC Class I或Class II處理，並經由—呈現途 徑進行以與呈現部分胜肽。 V Η.細胞毒殺性T淋巴球 43 201138806 抗任何本發明胜肽誘導之細胞毒殺性τ淋巴球增強π _以癌症細胞為標的之免疫反應，且因此可使用為疫 苗相似於胜肽。因此本發明提供經分離之細胞毒殺性Τ 淋巴球其藉由任何本發明之胜肽專—地被誘導或活化。 可獲得此種細胞毒殺性Τ淋巴球，藉由⑴將本發明 胜肽投予至一個體；或⑵冑來自個體之抗原呈現細胞與 CD8陽性細胞或周邊血液單核淋巴球與本發明之胜肽“ 接觸（刺激）；或（3)將⑽陽性細胞或周邊血液 單核淋巴球“κ/ίπ與表現HU抗原與胜肽之複合物於其 表面上之抗原呈現細胞或外吐小體接觸；或（4)引入包括 編碼出與與本發明胜狀結合之τ細胞受體次單元多胜狀的 多核苷酸的基因。#由上述方法可製備此種抗原呈現細胞 或外吐小體，且（4)之方法之詳細被敘述於下方“ νπι. τ 細胞受體（TCR)”的段落中β · 本發明細胞毒殺性Τ淋巴球可來自一受到治療及/或 避免之病患、’且藉由其身或與包括本發明之胜肽或為了調 節作用之外吐小體的其他藥物結合可被投予。所獲得之細 胞毒殺性Τ淋巴球起專一抗目標細胞的作用，而目標細胞 其表現本發明胜肽，例如用於誘導之相同胜肽。目標細胞 可為細胞其内生性表現CDCA5，例如癌細胞，或被以cdca5 基因轉殖之細胞；且由於藉由胜肽刺激表現本發明胜肽於 細胞表面之細胞，也可做為經活化之細胞毒殺性了淋巴球 攻擊的目標。 VIII. τ細胞受體（TCR) 44 201138806 本發明也提供一組合物其包括由編碼出可形成τ細胞 文體之次單位之多胜肽的核酸’與其使用方法。τ細胞受 體之-人單位具有能力形成Τ細胞受體，其授與專一性至抗 腫瘤細胞的Τ細胞，腫瘤細胞表現CDCA5。藉由使用本技 術領域所知的方法可確認作為細胞毒殺性τ淋巴球之τ細 胞党體次單70之^ _與3 _支鏈的核酸，而細胞毒殺性了淋 巴球以一或多個本發明之胜肽所誘導w〇2〇〇7/〇32255與

Morgan et al.，J lmmun〇i，171，3288 (2〇〇3)。例如， 喜好以聚合酶鏈鎖反應方法來分析τ細胞受體次單元。用 於刀析之聚合酶鏈鎖反應引子可為，例如5，—R引子 (5，-gtctaccaggcattcgcttcat-3’）為 5’ 端引子（序 列辨識號：22 )與3-TRa-C引子（5，_ tcagctggaccacagCCgCagcgt_3，）專一於 τ 細胞受體 alpha鏈C區（序列辨識號：23) 、3-TRb-Cl引子（5，- tcagaaatcctttctcttgac-3’ ）專一於 τ 細胞受體 beta 鏈 C1區（序列辨識號.24)或3-TRbeta-C2引子（5，_ ctagcctctggaatcctttctctt-3，）專一於 T 細胞受體以“ 鏈C2區（序列辨識號：25)為3’端引子，但不限於其。 引出之τ細胞受體可以高親合力結合表現CDCA5胜肽之目 標細胞，且視需要Wfo與J’77 t/j· 居中有效殺死表現 CDCA5之目標細胞。 編碼出T細胞受體次單位的核酸序列可合併進入適合 之載體，例如反轉錄病毒載體。這些載體為本技術領域所 熟知。通常包含其之核酸或載體可被轉移至一 T細胞，例 45 201138806 如一來自一病患之τ細胞。有用地，本發明提供一現成 (of f-the-shelf)的組合物允許快速修飾病人所擁有之τ 細胞（或其他哺乳動物之那些）以快速簡單產生具有優秀 之癌症細胞殺死特性的經修飾T細胞。 特定之T細胞受體可專一地辨認本發明之一胜肽與 HLA分子之複合物，當τ細胞受體於呈現於τ細胞表面時， 給予T細胞抗目標細胞之專一活性。藉由任何已知方法可 確認上述複合物之專一辨認，而較佳方法包括，例如使用 HLA分子與本發明胜肽之HLA多聚體（multimer)分析，與 ELISP0T分析。藉由執行ELISP〇T分析。藉由執行Eusp〇T 分析，其可確認表現T細胞受體於細胞表面上之τ細胞藉 由Τ細胞受體辨認一細胞，且訊息傳送於細胞内。當複合 物存在於τ細胞表面時藉由已知方法也可執行上述複合物 可給予一 Τ細胞細胞毒性活性的確認。較佳方法包括，例 如，抗HLA陽性目標細胞之細胞毒性活性測定，例如鉻 (chromium)釋放分析。 本發明也提供細胞毒殺性τ淋巴球，其藉由以編碼出 在HLA-2存在下與例如序列辨識號：2至19之cdcas胜肽 結合的T細胞受體次單位多胜肽的核酸轉導來製備。 經轉導之細胞毒殺性T淋巴球可/yj以>〇自引導至癌 症細胞，且可藉由熟知的培養方法y/? 擴張（例如

Kawakami eia人，J lmmunol ， 142， 3452_3461 (1989))〇 本發明細胞毒殺性T淋巴球也可用來形成一致免疫組合 物，其於一需要治療或保護之病患中治療或避免癌症為有 46 201138806 效（W02006/031221 )。 IX.藥學組合物 由於與正常組織相較，CDCA5表現於癌症中特別被提 冋，癌症例如急性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸 癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、 胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺 癌與軟組織腫瘤，本發明之胜肽或多核苷酸可用於癌症之 治療及/或預防，及/或避免其手術後之復發。因此，本發 月提供#學物質、^劑或組合物用來癌症之治療及/或預 防，及/或此類癌症之手術後復發的避免，此類試劑、物質 或组合物包括為活性成分之一或多個本發明胜狀或多核苦 酸作為活性成分。或者，本發明之胜狀可表現於任何前述 外吐小體或細胞表面，例如抗原呈現細胞，以用來作為藥 子物質、試劑或組合物。此外’上述以本發明任何胜肽為 『的之、胞t权性T淋巴球也可用來作為本發明藥學物 貝、試劑或組合物之活性成分。 ^本發明之藥學物質、試劑與組合物提供使用如一疫 二在本發明中，措辭“疫苗”（也指-致免疫組合物） '扣物貝，其藉由接種至動物具有誘導抗腫瘤免疫力的 功能。 本發明之藥學試劑、物質或組合物可用於治療及/或避 免癌症，及/或其手術後復發的避免於一個體或病患中，個 體或病患包括人類與任何其他哺乳動物，其包括，但不限 ;J乳、大乳、天竺鼠、兔子、描、狗、綿羊、山羊、豬、 47 201138806 特別是一商業上重要動物 牛、馬、猴子、狒狒與黑猩猩 或被馴養了的動物。 在另-實施例中，本發明也提供一活性成分在配製來 用於治療或避免癌症之治療及/或避免與其手術後之復發 的藥學試劑、物質或組合物的製造中的用4，此活性成分 擇自： (a) 本發明胜肽； (b) 於可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供一用於治療或避免癌症或脸瘤的 活性成分，活性成分擇自： (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 或者，本發明更提供一製造用以治療或避免癌症或腫 瘤之藥學組合物或物質的方法或製程，其中方法或製程包 括將-藥學上或生理上可接受之載體與一活性成分一起配 製的步驟，活性成分擇自： 48 201138806 (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 在另-實施例中，本發明也提供_製造用以治療或避 免癌症或腫瘤之藥學組合物或物質的方法或製程，其中方 法或製程包括將一藥學上或生理上可接受之載體與一活性 成分一起混合的步驟，其中活性成分擇自： (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；以及 (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 根據本發明，已發現具有擇自序列辨識號：2至19中 之胺基酸序列的胜肽為HLA_A2限制之抗原決定位胜肽或 候選物，其可誘導強而專一之免疫反應。因此包括任一具 有序列辨識號2至1 9之胺基酸序列之胜肽的本發明藥學物 質或組合物特別適合投予HLA抗原為HLA_A2之個體。相同 的東西提供至包含編碼出任何這些胜肽之多核苷酸（即， 本發明之多核苷酸）的藥學物質或組合物。 由本發明藥學物、質試劑或組合物治療之癌症不限於 49 201138806 且包括其中關力CDCA5 (例如，為過度表現）之任何之癌 症包括，但不限於急性骨腾性白血病、膀耽癌、乳癌、 子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食 道癌、月、癌、彌漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌”:、 細胞肺癌與軟組織腫瘤。 本發明藥學物質、試劑或組合物可包括除了上述活性 成分外，具有誘導細胞毒殺性τ淋巴球抗似癌細胞之能力 的其他胜肽、編碼出此其他胜肽之其他多核苦酸、其他表 現此其他胜肽之細胞或此類。於此’具有誘導細胞毒殺性 τ淋巴球抗似癌細胞之能力的其他胜肽由癌症專一抗原所 例示（例如，、經定義之腫瘤相關抗原），但不限於此。 若需要，本發明之藥學試劑、物質或組合物可視需要 包括其他治療物質為一活性成分，只要此物質不抑制活性 成分之抗腫瘤功效’活性成分例如任何本發明胜肽。例如 配方可包括抗發炎㈣、止痛劑、化學治__似^ 了其他治療物質於藥劑其本身中，也可將本發明之藥劑盘 :或多個其他藥學物質或組合物相繼或同時投予。藥劑班 藥學物質或組合物的量依照，例如使用 、 7種樂學物質或組 =物、要治療之疾病與投藥的計晝與方式。 應瞭解的是，除了此處特別提及之成分外， ^ m ® 本發明之 樂學物質、試劑或組合物可包括本技術領域 質或組合物，其具有關於討論中之配方形式。 、他物 在本發明一實施例中，本發明之藥學物質 合物可被包含於製造之商品與套組，纟 二劑或組 匕3對於要被治療 50 201138806 之疾病，例如癌症的病理情況有用之材料。製造之商品可 ，括具有-標籤之任何本發明藥學物質、試劑或組合物的 今器。適合的容器包括瓶、小瓶（vial)與試管。容器可形 成自各種材料’例如玻璃或塑膠。於容器上之標籤需指出 物質、試劑或組合物為用來治療或避免疾病之一； 況。標藏也可指出投藥指示等。 — 月 除了上述容器外，套組包括本發明藥學試劑'物質或 組合物可視需要更進一步包括一第二容器，其儲藏一藥學 上可接受之稀釋液。其可更包括商業或使用者觀點需要之 其他材料，包括其他緩衝溶液、稀釋液、濾器、針、注射 器與具有使用說明之包裝插入物。 藥學組合物若需要可被呈現於一包（p a c k)或一分配 器，其可包含含有活性成分之一或多單位劑量形式。包裝 可例如包括金屬或塑膠箱，例如一泡棉箱（Mist二 pack)。包或分配器可伴隨著投藥指示。 (1)藥學組合物包含胜肽作為活性成分 可直接投予本發明胜肽為一藥學物質、試劑或組合 物，若需要的話，其已被一般配方方法所配製。在之後的 例子，除了本發明胜肽外、若適合可包括載體、賦形劑與 原始做為藥物使用之此類而無特別限制。上述載體的例子 為滅菌水生理食鹽水、磷酸緩衝溶液與培養液體（culture fluid)與此類。更進一步而言，若必須，藥學物質、試劑 或組合物可含安定劑、懸液劑、防腐劑、界面活性劑與此 類。本發明之藥學物質、S式劑或組合物可用來抗癌目的。 51 201138806 可將本發明之胜肽可以組合來製備，其包括兩或更多 個本發明之胜肽’以//2 叩誘導細胞毒殺性T淋巴球。 胜肽組合可為雞尾酒形式或可使用標準技術彼此結合。例 如，胜肽可被化學連接或表現如一單一融合多胜肽序列， 其可具有一或數個胺基酸為一連結器（例如，Lysine linker: K. S. Kawamura et al. J. Immunol. 2002, 1 68： 5709-571 5 )。結合之胜肽可為相同或不同。藉由投予本發 明之胜肽，藉由HLA抗原，高密度呈現胜肽於抗原呈現細 胞上’之後對形成於呈現胜肽與HLA抗原之間的複合物專 一反應的細胞毒殺性T淋巴球被誘導。或者，抗原呈現細 胞（例如’樹突細胞）被從個體移出且之後以本發明胜肽 刺激以獲得呈現本發明任何胜肽於其表面上之抗原呈現細 胞。將這些抗原呈現細胞再投予至個體以誘導在個體中之 細胞毒殺性Τ淋巴球，且因此可增加了朝向腫瘤相關之内 皮細胞的侵犯。 包含一本發明任何胜肽為活性成分之治療及/或避免 癌症之藥學物質、試劑或組合物也可包含一佐劑以有效建 立細胞免疫力。或者藥學物質、試劑或組合物可與其他活 性成分一起被投予，或以配製成細粒被投予。佐劑指任何 化合物，當與具有免疫活性之蛋白質一起投予（或依次） 時，其增強抗蛋白質之免疫反應。可被應用之佐劑，包括 於文獻（Clin Microbiol Rev 1 994，7: 277-89)中所描述 的那些。示例之佐劑包括磷酸鋁、氫氧化鋁、明馨、霍亂 毒素、沙門氏菌毒素、佛氏不完全佐劑（Inc〇mplete 52 201138806

Freund-s adjuvant, IFA)、佛氏完全佐劑（Complete

Freund’s adjuvant，CFA)、IscOMatrix、GM-CSF、CpG、 0/W乳劑與此類，但不限於其。 此外，於微脂體（lipOS〇me)配方與細粒配方中，胜肽 連結至幾個微米直徑之小珠，且於配方中，可便利地使用 連結至胜肽之脂質。 在本發明另一實施例中，本發明胜肽也可以一藥學上 可接受之鹽類被投予。鹽類之較佳例子包括具有鹼金屬之 鹽、具金屬之鹽、具有機鹼之鹽、具有機酸之鹽與具無機 酸之鹽。 在一些實施例中’本發明之藥學物質、試劑或組合物 包括一成分其啟動細胞毒殺性T淋巴球。已定義脂質為可 M W FO啟動抗病毒抗原之細胞毒殺性τ淋巴球的物質。 例如，可將棕橺酸殘基黏附至離胺酸殘基之e-與^^_胺 基，且之後連結至本發明之一胜肽。之後脂質胜肽可被直 接投予於微胞或顆粒中、併入微脂體或乳化於一佐劑中。 如脂質啟動細胞毒殺性τ淋巴球反應之另一例子，兄 脂蛋白，例如三軟脂酸-S甘油半胱氨酰_絲氨酰基絲氨酸 (tripalmitoyl-S-glyCerylcysternyl_seryl_serine)可 使用來啟動細胞毒殺性T淋巴球，當共價附加至一合適之 胜肽（參見，例如 Deres et al.，Nature 1 989，342: 561-4)。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類，以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域。 53 201138806 可執仃單_人扠藥或藉由多次投藥追加。本發明之胜肽劑量 可適口地调整根據要治療之疾病、病患年紀、體重、投藥 方法與此類，且本發明之胜肽劑量一般為001 mg至 l，〇〇〇mg’ 例如 0.01mg 至 l〇〇mg，例如 〇 1心至 i〇mg， 且可於數天至數個月投藥一次。熟悉此技藝人士可適合地 選擇一合適的劑量。 (2)藥學組合物包含多核苷酸為活性成分 本發明之藥學物質、試劑或組合物也可包含編碼出此 處揭露之胜肽的核酸於一可表達之形式中。此處措辭“於 一可表達之形式中”意指多核苷酸，當引入一細胞，h η叩會被表現成一誘導抗腫瘤免疫力之多胜肽。在一代表 實施例中’感興趣之多核苷酸的核酸序列包括對於表現多 核苦酸而言必須之調控要素。可裝配多核苷酸以達到穩定 插入目標細胞之基因體（參見，例如敘述Thomas KR & Capecchi MR, Cell 1987, 51: 503-1 2 for a description of homologous recombination cassette vectors。也參 見’例如 Wolff a/·，Science 1990，247: 1465-8; U.S· Patent Nos. 5, 580,859; 5, 589,466; 5, 804, 566; 5,739，118; 5, 736,524; 5,679,647;與 WO 98/04720 )。 DNA輸送技術的例子包括“裸 DNA” 、經促進 (bupivacaine、聚合物、胜肽居中之）之輸送、陽離子脂 質複合物與顆粒居中之（“基因搶”）或壓力居中之傳送 (參見，例如 U. S. Patent No. 5, 922, 687 )。 本發明之胜肽也可藉由病毒或細菌載體來表現。表現 54 201138806 . 載體的例子包括減弱病毒宿主，例如牛疫或禽痘。此方法 包括使用牛痘病毒，例如為一載體以表現編碼胜肽之核苷 酸序列。藉由引入-宿主，此重組之牛疫病毒表現致免疫 胜肽且因此引起一免疫反應。於免疫步驟中為有效之牛痘 載體與方法敘述於，例如u s PatentN〇 4,722 848。 另一載體包括 BCG (Baci lle Calmette Guerin)。BCG 載體 敘述於 Stover et al.，Nature 1991，35 1: 456-60 中。 對於治療投藥或免疫有用之其他多種載體，例如腺與腺病 毒相關之載體、反轉錄病毒載體、傷寒沙門氏菌 (Salmonella typhi)載體、經解毒之炭疽毒素載體與其類 似為明顯的。參見，例如 Shata ei a/. , Mol Med Today 2000, 6: 66-71; Shedlock et al., J Leukoc Biol 2000, 68: 793-806; Hipp em In Vivo 2000，14: 571-85。 輸送多核苷酸進入一病患可為直接，於其例子中，個 體直接暴露於一攜帶多核苷酸之載體，或為間接，於其例 子中，細胞首先/·/? Fi fro以感興趣之多核苷酸轉形，之後 將細胞轉殖進入病患。此兩方法分別為已知，為Fi•叩 與ez 叩基因治療。 基因治療之方法之大體回顧，參見Goldspiel ei a人， Clinical Pharmacy 1993, 12: 488-505; Wu and Wu,

Biotherapy 1991, 3: 87-95; Tolstoshev, Ann Rev

Pharmacol Toxicol 1993, 33: 573-96; Mulligan, Science 1 993, 260: 926-32; Morgan & Anderson, Ann Rev Biochem 1993， 62: 191-217; Trends in Biotechnology 1993, 55 201138806 11(5): 155-215)。應用於本發明之於重組dna技術中一般 熟知的方法被於編者Ausubel ei a/.， in Current

Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY, 1993;與 Krieger， in Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990 所述。 投藥之方法可為口服、皮膚内、皮下、靜脈内注射或 此類’以及全身投藥或局部投藥至標的位置的鄰近區域提 供使用。可執行單次投藥或藉由多次投藥追加。於適合載 體中或於以編碼出本發明之胜肽的多核苦酸轉形之細胞中 的多核苷酸的劑量可適合地調整，根據要治療之疾病、病 患年紀、體重、投藥方法、與此類，且本發明之胜肽劑量 一般為 0. 001 mg 至 1 0〇0 mg，例如 〇. 〇 1 mg 至 1 〇〇 mg，例 如〇. 1 mg至10 mg，且可於每數天一次至每數個月一次 投藥。熟悉此技藝人士可適合地選擇一合適的劑量。 X.使用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與細胞毒殺性τ 淋巴球的方法 可使用本發明之胜肽與多核苷酸來製備或誘導抗原呈 現細胞與細胞毒殺性T淋巴球。也可使用本發明之外吐小 體與抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性τ淋巴球。胜狀、多 核苦酸、外吐小體與抗原呈現細胞可與任何其他化合物結 合使用’只要額外之化合物不抑制細胞毒殺性T淋巴球誘 發能力。因此，任何上述之本發明藥學物質或組合物可用 來誘導細胞毒殺性τ淋巴球。除此之外，包括胜狀與多核 苦酸的那些也可用來誘導抗原呈現細胞，如於下所說明。 56 201138806 (1)誘導抗原呈現細胞的方法 本發明提供使用本發明之胜肽或多核苦酸來誘導具有 高細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞的方法。 本發明之方法包括“ α ⑺或將 抗原呈現細胞與本發明胜肽接觸的步驟。例如，W叩 將抗原呈現細胞與胜肽接觸的方法可包括步驟： a :自一個體收集抗原呈現細胞；以及 b .將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸。 抗原呈現細胞並不限於特定種類之細胞，且包括樹突 細胞、蘭格罕細胞（Langerhans cel丨）、巨嗜細胞、B細胞 與活化之τ細胞，已知其表現蛋白質（pr〇teinace〇us)抗原 於其細胞表面以被淋巴球所辨認。較佳為，可使用樹突細 胞，由於它們於抗原呈現細胞中最強的細胞毒殺性τ淋巴 球誘發能力。本發明任何胜狀可以它們本身或與本發明其 他胜肽一起被使用。 另方面，s投予本發明胜肽至一個體時，抗原呈現 細胞與胜肽接觸，因此於個體之體内誘導具有高 細胞毒殺性T淋巴球誘發能力之抗原呈現細胞。因此，本 發明包括投予本發明胜肽至一個體的方法。相似地，當以 可表達之形式投予本發多核苷酸至一個體時，本發明胜肽 被表現且/刀與抗原呈現細胞接觸，因此於個體之體 内誘導具有高細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗原呈現細 I因此，本發明也包括投予本發明多核苷酸至一個體的 方法。措辭可表達之形式，，被描述於上述段落“丨X. 57 201138806 藥學組合物⑺藥學組合物包含多核苦酸為活性成分，，中。 此外’本發明可包括將本發明一多核苦酸引入一抗原 呈現細胞以便誘導具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗 原呈現細胞的步驟。例如，方法可包括步驟：· a :自一個體收集抗原呈現細胞；以及 b .將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入。 可如前述段落“VI.抗原呈現細胞，，中所述來執行步 驟b 〇 或者本發明提供一製備一專一誘導抗CDCA5之細胞毒 殺性T淋巴球活性的抗原呈現細胞的方法，其中該方法可 包括下列步驟之一： (a) 將抗原呈現細胞與本發明一胜肽wq W κο或κ/ κο接觸；以及 (b) 將編碼出本發明胜肽之一多核苷酸引入抗原呈現 細胞。 (2)誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法 本發明也提供使用本發明胜肽、多核苷酸、外吐小體 或抗原呈現細胞來誘導細胞毒殺性τ淋巴球的方法。 本發明也提供使用編碼出一多胜肽之多核苷酸來誘導 細胞毒殺性Τ淋巴球的方法，此多胜肽具形成一 τ細胞受 體次單位的能力，而此τ細胞受體次單位辨認一本發明胜 狀與HLA抗原之複合物。較佳為，誘導細胞毒殺性τ淋巴 球的方法可包括至少一步驟擇自由下列之中： a)將一 CD8陽性Τ細胞與一抗原呈現細胞及/或一外 58 201138806 吐小體接觸，該抗原呈現細胞及/或該外吐小體表現一 Hla 抗原與本發明胜肽之複合物於其表面，以及 b)將一多核苷酸引入一 CD8陽性τ細胞，其中該多 核苷酸編碼出一多胜肽，該多胜肽具形成一 T細胞受體次 單位的能力，而該T細胞受體次單位辨認一本發明胜肽與 HLA抗原之複合物。 當本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細胞或外吐小 體被投予至一個體時，於個體體内誘導細胞毒殺性τ淋巴 球’且以癌細胞為目標之免疫反應的強度增強。因此，本 發明之方法包括將本發明之胜肽、多核苷酸、抗原呈現細 胞或外吐小體投予至一個體的步驟。 或者’藉由ex f/叩使用它們，也可誘導細胞毒殺性 T淋巴球’且在誘導細胞毒殺性τ淋巴球後，經活化之細 胞毒殺性T淋巴球可返回至個體。例如，方法可包括步驟： a:自一個體收集抗原呈現細胞； b :將步驟a之抗原呈現細胞與胜肽接觸；以及 c :將步驟b之抗原呈現細胞與CD8陽性細胞共培養。 於上述步驟c中要與CD8陽性細胞共培養之抗原呈現 細胞也可藉由將一包括本發明多核苷酸之基因轉移進入抗 原里現細胞，如於前述段落“VI.抗原呈現細胞，，中所述 來製備，然而，本發明並不限於此，且因此包括任何有效 表現一 HLA抗原與本發明胜肽之複合物於表面的抗原呈現 細胞。 代替此種抗原呈現細胞’也可使用呈現一 HLA抗原與 59 201138806 本發明胜肽之複合物於盆ι 、具表面上的外吐小體。換句話說’ 本發明可包括將呈現一 HLA抗原與本發明胜肽之複合物於 其表面的外吐小體盥士 .兴本發明胜肽共培養之步驟。此種外吐 小體可藉由前述於段茇 各 v.外吐小體，，中之方法來製備。 此外，藉由將—& i括編碼出與本發明一胜肽結合之τ 細胞受體次單元的吝姑 妁夕核苷酸的基因引入CD8陽性細胞也可 誘導細胞毒殺性T漱p , 一 淋巴球°如於前述段落“ V111. T細胞 文體(TCK)”中所述可執行此轉導。 匕卜本發明也提供製造一誘導細胞毒殺性τ淋巴球 之藥學物質或組合物的 物的方法或製程’其中該方法包括將本 發明之胜肽與藥學t垃典 接又之载體一起混合或配製的步驟。 (3)誘導免疫反應的方法 本發明提供誘導抗CDCA5相關疾病之免疫反應的 方法。適合的疾病可包括癌纟’其例子包括，但不限於急 性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、 又!生月髓II白血病、大腸癌' 食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、 肺癌淋巴瘤、前列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。 本發明方法包括投予含任何本發明胜肽或編碼出其之 多核苷酸的物質或組合物的步驟。本發明方法也考慮投予 表現任何本發明胜肽之外吐小體或抗原呈現細胞。細節參 見Ix.藥學組合物”之項目，特別是敘述本發明物質、 試劑或組合物為疫苗之用途的部分。&外，可被使用於本 發明誘導免疫反應之方法的本發明外吐小體與抗原呈現細 胞被詳細描述在前之於“ V ·外吐小體”、‘‘ v I ·抗原 60 201138806 .1現細月包肖“x.冑用胜肽、外吐小體、抗原呈現細胞與 細胞毒殺性τ淋巴球的方法，，之（1)與（2)的項目。 本發明也提供製造一誘導免疫反應之藥學物質、試劑 或以物的方法或製程，其中該方法可包括將本發明之胜 肽與藥學上接受之載體—起混合或配製的步驟。 或者，本發明方法可包括投予本發明一疫苗或藥學組 合物的步驟，本發明疫苗或藥學組合物包含： (a) 本發明胜肽； (b) 於一可表現之形式，編碼出如此處揭露之此種胜 肽的核酸； (c) 表現本發明一胜肽於其表面上之抗原呈現細胞或 外吐小體；或 / (d) 本發明之細胞毒殺性τ淋巴球。 在本發明内容中，以這些活性成份可治療過度表現 CDCA5之癌症。此類癌症的例子包括，但不限於急性骨髓 性白血病、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性 骨髓性白血病、大腸癌、食道癌、胃-癌、瀰漫型胃癌、肺 癌淋巴瘤則列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。因此， 在包括活性成分之疫苗或藥學組合物的投予前，其較佳為 確〜與相同器吕之正常組織相較，CDCA 5之表現程度於要 被治療之細胞或組織中是否被提高。因此，在一實施例中， 本發明提供治療（過度）表現CDCA5之癌症的方法’其方 法可包括步驟： ' 1)測疋獲得自具有癌症要治療之個體的細胞或組織 61 201138806 中的CDCA5表現程度； i i )與正常控制組比較CDCA5表現程度；以及 iii)投予擇自由上述步驟（a)至（d)所組成之群組的 至少一成份至與正常控制組相較具有過度表現CDCA5之癌 症的個體。 或者，本發明也可提供包含擇自上述（a)至（d)中之群 、、且的至少一成份的疫苗或藥學組合物，其用於投予至具有 過度表現CDCA5之癌症的個體中。換句話說，本發明更提 供鑑定要被以本發明CDCA5多胜肽治療之個體的方法，此 類方法包括測定來自個體之細胞或組織中的CDCA5表現程 度的步驟，其中與基因之正常控制程度相較，此程度增加 指出個體可具有可以本發明CDCA5多胜肽治療之癌症。本 發月之鑑疋出要被治療癌症之個體的方法於以下更詳細敘 述。 可將任何源自個體之細胞或組織用於CDCA5表現之測 定，只要其包括CDCA5之目標轉錄或轉譯產物。適合樣本 的例子包括，但不限於身體組織或液體 '例如血液、唾液 >、尿液較佳為，生物樣本包含一細胞族群，其包括一上 皮、·田胞，更佳為源自個體之細胞或組織包含一細胞族群， 、匕括_L皮細胞，更佳為一癌症上皮細胞或一來自被懷 ^化之_的上皮細胞。此外’若需要’細胞可自所獲 之身體組織或液體被純化，且之後使用為源自個體之樣 本。 要藉由本發明治療之個體較佳為-哺乳類動物。示範 62 201138806 之哺乳類動物包括，但不限於，例如，人類 類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬與牛。、非人類靈長 根據本發明’可測定獲得自—個體 CDCA5表現程度。使用本技術領域已知方法織中的 酸）產物程度測定表現程度。例如，藉由轉錄（核 北方雜合）使用探針可將CDCA5的顧定量。可於㈧如， 陣列或如此類上執行们則。陣列之使用較、-晶片' CDCA5表現程度。利用CDa5的序列資吨:< 測 士可製備此種探針。例如，CDCA5的ΜΑ^此技藝人

灼如LDCA5的cDNA可被使用A 若需要，可以適合之標，士來"用為探針。 探針，例如染劑、螢光物 /、 ’、，且基因的表現程度可被偵測為雜合標誌的強 度0 此外’藉由擴大制方法（amplifieatiQn_base _心咖0(1)(例如，RT—pcR)使用引子可將aw (例如’序列辨識號：21 )的轉錄產物進行量。根據基 因之可獲得序列資訊可製備此種引子。 特別是’用於本方法之探針或引子於嚴厲 (stringent)、適度嚴厲、低嚴厲條件下雜合至CDCA5的 。>此處使用’措辭“嚴厲（雜合）條件”意指在此 在條件下探針或引子會雜合至其目標序列，而不是其他序 J嚴厲條件為序列依賴（sequence-dependent)，且在不 同％境下會不同。比起較短之序列，於較高溫度下觀察到 車乂長序列之特定雜合。一般而言，在一定義之離子強度與 pH下所選擇之嚴格條件的溫度為低於一特定序列之熔點 63 201138806 (Tm)約5C °Tm為溫度（在一定義之離子強度與pH與核酸 /辰度下）’於其下在平衡下5〇%之與目標序列互補的探針 雜合至目標序列。由於目標序列通常存在過量，所以於Tm， 在平衡下50%之探針被佔據。一般而言，嚴苛條件為於其 中鹽濃度低於I.0 Μ鈉離子，一般約〇.01至1.0 M鈉離 子（或其他鹽）於pH 7. 〇至8. 3，且對於短探針或引子（例 如’ 1 〇至5〇個核苷酸）而言溫度為至少約3〇<t ,對於較 長探針或引子而言溫度為至少約6〇〇c。也可以添加去穩定 试劑（destabilizing agents)，例如甲醯胺（f〇rmamide) 來達到嚴苛條件。 或者，為了本發明之診斷可偵測轉譯產物。例如，可 偵測CDCA5蛋白質（序列辨識號：21 )或其免疫活性片段 之量。測定作為轉錄產物之蛋白質的量的方法包括免疫分 析方法，其使用一抗體專一辨認此蛋白質。抗體可為單株 或^株此外，抗體之任何片段或修飾（例如嵌合型抗體 (chimeric antibody) 、 scFv 、 Fab 、 F(ab’ ）2 、 Fv 等）可 被用來偵測，只要片段或經修飾之抗體維持對CDCA5蛋白 質的結合能力。本發明也提供抗本發明胜肽與其片段的這 類抗體》這些用於蛋白質偵測之這些種類的抗體的製備方 法為本技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中 以製備此種抗體與其等同物（叫11“&16111：)。 如根據CDCA5基因轉譯產物偵測CDCA5基因之表現程 度的另一方法，使用抗CDCA5蛋白質之抗體經由免疫組織 化學（lmmunohistochemical)分析可測量到染色強度。即， 64 201138806 . 於此測量中，強的染色指出經增加之蛋白質的存在/程度， 且同時CDCA5基因之高表現程度。 可確認於癌症細胞中’目標基因’例如cdca5基因的 表現程度之為被提升，若從目標基因之控制组程度（例如， 於正常細胞中的程度）增加，例如i 〇%、25%、或5⑽，或 增加大於U倍、大於丨.5倍、大於2〇倍、大於5〇°倍\ 大於10. 0倍或更多。 使用先前自一個體其疾病階段（癌的或非癌的）為已 知的個體收集並儲存的樣本控制組之程度可與癌細胞同時 測定。此外，獲得自具有癌症要被治療之—器官的非癌區 域的正常細胞被使用為正常控制組。或者，根據獲得自分 析先前測定之來自其疾病程度已知之個體之樣本中之 CDCA5基因的表現程度的結果，藉由統計方法，可測定控 制組之程度。此外，控制組程度可為來自自先前測試細胞 之表現輪廓的資料庫。並且，根據本發明一方面於一生物 樣本中之CDCA5基因的表現程度，可與多個控制組程度比 較，其控制組程度被測定自多個參考樣本。較佳為使用一 控制組程度測定自-參考樣本，其來自一組織形式相似於 源自個體生物樣本之組織形式。此外，較佳為使用具有已 知疾病階段之群組中的CDCA5基因的表現程度的標準值 (standard value) ^標準值可獲得自本技術領域任何已知 勺方法例如，平均值+/-2標準差或平均值+/_3標準差， 可被使用為標準值。 本發明之内容中，測定自已知為非癌症之生物樣本的 65 201138806 控制組程度被意指為一 “正常控制組程度”。另一方面， 控制組程度測定自一癌的生物組織，其意指為一“癌的控 制組程度”。可將介於樣本表現程度與控制組程度間的= 同標準化至控制核酸的表現程度，例如管家基因 (housekeeping gene)，根據細胞之癌症與非癌程度已知其 表現程度並無不同。示範之控制基因包括，但不限於点肌 動蛋白（beta actin)、甘油醛磷酸去氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydr〇genase)與核糖蛋 白P1。 當與正常控制組程度相車交CDCA5基因的表現程度被增 加或相似/等同於癌控制組程度’可診斷個體為具有癌症要 被治療。 不發月也提供⑴診斷是否一個體懷疑具有要被治 癌症及/或（1 1 )冑擇要癌症治療之個體的方法其 法可包括步驟： ” a) 測定在細胞或組織中，CDCA5的表現程度，細胞 、’哉獲侍自破懷疑具有要被治療之癌症的個體； b) 與正常控制組比較CDCA5之表現程度； 加 〇若CDCA5之表現程度與正常控制組程度相較被 則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及 症 d)若個體於步驟〇中被診斷為具有要被治療之〉 選擇要癌症治療之個體。 或者，此種方法可包括步驟： C測定在細胞或組織中，的表現程度，細… 66 201138806 織獲得自被懷疑具有要被治療之癌症的個體； b) 與癌症控制組比較CDCA5之表現程度； 度 c) 若CDCA5之表現程度相似或等於癌症控制組程 ，則診斷個體為具有要被治療之癌症；以及 症 d) 若個體於步驟〇中被診斷為具有要被治療之癌 ’則選擇要癌症治療之個體。 .本發明也提供一診斷套組以診斷或測定一個體其為或 被懷疑為遭受可被以本發明CDCA5多胜肽治療之癌症，其 在平估及/或I控癌症免疫治療的功效或應用性中提供 用途。較佳為’癌症包括，但不限於急性骨髓性白血病、 膀耽癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血 :大腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、 ::列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。更特別的是，套組 :佳可包括至少-用以偵測來自個體細胞中之CDCA5基因 表現程度的試劑，其試劑可被擇自下列群組： (a) I試劑用以偵測CDCA5基因的mRNA; ,η.. 式劑用以偵測CDCA5蛋白質或其免疫活性片 +又，以及 試齊】用以偵測CDCA5蛋白質的生物活性。 過 & 用炉^ L r A C Ή· ΓΓ1 括核酸其專1 土因之m r n a之偵測的試劑的例子可包 認⑽5趣，例如，具有對於 寡核苷酸以蛊。P分互補的序列的募核苷酸。這些種類之 本技術領域所：：ΓΑ5_Α之引子與探針為例子。根據 ’、’、α、方法可製備這些種類之募核苷酸。若 67 201138806 需要’用以偵測CDCA5 mRNA之試劑可被固定於固體基質 (matrix)上。此外，大於一個之用以偵測CDCA5 mRNA的試 劑可被包含於套組中。 本發明之探針或引子一般包括一實質上經純化之寡核 苷酸。募核苷酸一般包括核苷酸序列之一區域，其在嚴苛 條件下雜合至至少約2000、1 000、500、400、350、300 ' 250、200、150、1〇〇、50 或 25 包括一 CDCA5 序列之一核 酸之連續意義股（consecutive sense strand)核苷酸序 列，或包括一 CDCA5序列之一核酸之反意義股（anti sense strand)核苷酸序列，或這些序列之自然發生突變體。特 別是，例如，在一較佳實施例中，一於長度具有5_5〇之寡 核苷酸可被使用為用來擴大要被偵測之基因的一引子。更 佳為，可以於長度具有15-3〇b之寡核苷酸探針或引子來偵 測CDCA5基因之mRNA或cDNA。在較佳實施例中，寡核苦 酸探針或引子的長度可被擇自15_25〇藉由使用此種募核 苷酸探針或引子之用於基因偵測的分析程序、裝置或試劑 為本技術領域所熟知（例如，寡核苷酸陣列或pCR )。在 這些分析中，探針或引子也可包括標籤（tag)或連結器 (linker)序列。此外，可以可偵測之標誌或要被捕捉之親 合配體來修飾探針或引子。或者在雜合偵測程序中，於長 度具有少數百的鹼基（例如，約100-200)至少數千（kil〇) (例如，約1 〇 〇 〇 - 2 〇 0 0 )之驗基的多核苷酸可被用於一探 針（例如’北方墨點分析或cDNa微陣列分析）。 另一方面，用以偵測CDCA5蛋白質或其免疫活性片段 68 201138806 之適合喊劑的例子可包括對於CDCA5蛋白質或其免疫活性 片段的抗體。抗體可為單株或多株。此外，抗體之任何片 段或t飾（例如嵌合型抗體ic ant ib〇dy)、sCFv、

Fab F(ab )2、Fv等）可被用來作為試劑，只要片段或經 I飾之抗體維持對CDCA5蛋白質或其免疫活性片段的結合 能力。製備用於蛋白質偵測之這些種類之抗體的方法為本 技術領域所熟知，且任何方法可被使用於本發明中以製備 ^種抗體與其等同物（―輪⑷。另外，可以訊號產生 刀子由直接連接或_間接標誌技術來將抗體進行標誌。 標鍵、與標諸抗體之方法與偵測抗料其目標的結合為本技 術項域所熟知’且任何標諸與方法可被使用於本發明。另 外，大於一個之用於偵測CDCA5蛋白質的試劑可被包括於 套組中。 可包3夕於一個之前述試劑。套組可更包括用以 結合對於CDCA5基因之探料七料# p 之探針或對於CDCA5胜肽之抗體的固 體基質與試劑、用以 一 °養細胞之培養基與容器、正與負控 制組6式劑與用以伯測對於rnr A κ y, , ; CDCA5胜肽之抗體的二次抗體。 例如，獲得自沒有癌 ^ 症或化又癌症或否之個體的組織樣本 可作為有用的控制組試劑。 明之套組可更包括商業或 便用者角度所需之其 哭、 ’斗，匕括緩衝溶液、稀釋液、濾 :例如4十、注射器與具有使用之操作指南的包裝插入物 持於2面、磁帶或CD-_等）。這些試劑或此類可保 得於一具有標誌之容器。 (viaH^^ ^ 0之各器包括瓶子、小玻璃瓶 )/、έ式驗試管。容琴 ° ^成自夕樣化之材料，例如玻 69 201138806 璃或塑膠。 本發明一實施例中’當式劑為抗CDCA5 mRNA之探針 時’試劑可被固定於_固體基質上，例如—多孔條（—us stnp)以形成至少一偵測位。多孔條之測量或制區可包 括複數個位置’各含有一核冑（探針）。一測試條也可含 有負及/或正控制組的位置。或者，控制組之位置可位於與 測試條分離之_條。視需要而^，不同之摘測位可包含不 同量之經固定之㈣，即一較高量於第一债測位中且一較 低含量於隨後之位置中。藉由測試樣本的加入，顯示可偵 ㈣號之-些位置提供—於樣本中⑽5_Α存在之量的 定量指示。偵測位可被設置於任何適合之可偵測形狀且一 般為在橫跨-測試條之寬度的條狀物或點的形狀中。 本發明之套組可更包括一正控制组樣本或鳴標準 樣本。藉由收集CDCA5正之樣本可製備本發明之正控制組 樣本且之後分析它們的CDCA5程度。或者，可將經純化之 CDCA5蛋白質或多核普酸加至不表現CDca5之細胞以形成 正樣本（positive sample)4 CDCA5標準樣本。於本發明 中，經純化之CDCA5可為重組蛋白質。正控制組樣本之 CDCA5程度為，例如，大於臨界值（cut 〇ff π。幻。 在一實施例中，本發明更提供一診斷套組，包括一蛋 白質或其一部份蛋白質，且裘一挑州太益 貞”导辨⑽本發明抗體或其片段 之能力。 本發明之部分胜肽的例子包括多胜肽，其係由在本發 明蛋白質之胺基酸序列中之至少8個，較佳^個更佳 70 201138806 蛋白質或一胜肽 血液、組織）中 與胜肽的方法如 20個連續胺基酸所組成。使用本發明之一 (多胜肽），藉由偵測於一樣本（例如， 之一抗體可診斷癌症。製備本發明蛋白質 上所述。 如上所述，藉由測定介於抗CDCA5抗體與其在對應控 制組中之的量的差異可執行本發明診斷癌症之方法。若個 體之細胞或組織含有抗基因之表現產物（c D c A 5)抗體且抗 CDCA5抗體的量被測定大於在相較於其在正常控制組之^ 度中的截斷值時，被體被懷疑遭受癌症。 在另-實施例中，本發明之診斷套組可包括本發明之 胜肽與結合至其之HLA分子。使用抗原胜肽與Hu分子偵 測抗原專-細胞毒殺性T淋巴球的方法已被建纟（例如，

Altman JDei a/.， Science. 1996， 274(5284): 94_6)。 因此，本發明之胜肽與HLA分子的複合物可應用至偵測腫 瘤抗原專一細胞毒殺性T淋巴球的偵測方法，藉此使早期 偵測癌症之復發及/或轉移為可能。此外，其可被用於適合 包含本發明胜肽為一活性成分之藥物的個體的篩選，或藥 物治療功效的評估。 特別是，根據已知方法（參見，例如Altman JD ，

Science· 1996’ 274(5284): 94-6)，可製備放射標誌之 HLA分子與本發明胜肽之寡聚複合物，例如四聚體。伴隨 使用複s物可執行#斷’例如藉由將來自被懷疑遭受癌 症之個體的周邊血液淋巴球（peripheral blood lymphocytes)中之抗原—胜肽專一細胞毒殺性τ淋巴球進 71 201138806 行定量。 本發明更提供藉由使用此處敘述之胜肽抗原決定位， 用以評估免疫反應之診斷試劑。在本發明一實施例中，如 上述之HLA-A2限制胜肽被使用為評估或預測一個體之免 疫反應的s式劑。藉由將免疫抗原（i mmun〇gen)與免疫活性細 胞（immunocompetent)//? Wπ 或；·/? 接觸可誘導要 被評估之免疫反應。在特定實施例中，可導致抗原專一細 胞毒殺性Τ淋巴球的產生的任何物質或組合物可使用為試 劑，而細胞毒殺性Τ淋巴球辨認與結合至胜肽抗原決定 位。胜肽試劑可必須不被使用為免疫抗原。用於此類分析 之分析系統包括相當新近之技術發展，例如四聚體，對細 胞内淋巴激素（lymph〇kines)之染色與干擾素釋放分析或 EL I SPOT分析。在較佳實施例中，用以評估一免疫反應的 免疫活性細胞可選擇自周邊血液、周邊血液淋巴球（PBL)、 與周邊血液單核細胞（PBMC)中。收集或分離此類免疫活性 細胞的方法為本技術領域所熟知。在替換實施例中，要與 胜狀試劑接觸之免疫活性細胞包括抗原呈現細胞，例如樹 突細胞。 例如’本發明胜肽可使用於四聚體染色分析以評估為 了抗原專一細胞毒殺性T淋巴球存在之周邊血液單核細 月已在暴露至腫瘤抗原或一免疫抗原後。HLA四聚體複合 物可被使用來直接顯現抗原專一細胞毒殺性T淋巴球（參 見’例如 〇gg Μ a人，Science 279 : 2103-2106，1 998; and Altman ei a/，Science 1 74 : 94-96，1 996 )，並測定於 72 201138806 周邊血液單核細胞之樣本中的抗原專一細胞毒殺性τ淋巴 球族群的頻率。使用本發明胜肽之四聚體試劑可如下被產 生。 在對應之HLA重鏈與泠2-微球蛋白存在下重新折疊結 合至HLA之胜肽’以產生三分子複合物。在複合物中，重 鏈之羧端為經生物素化於一預先設計進入蛋白質之位置。 之後將卵白素加至複合物以形成由三分子複合物與卵白素 (streptavidin)所組成之四聚體。藉由以螢光標誌卵白素 的方式’可使用四聚體來對抗原呈現細胞染色。之後可鑑 定細胞，例如藉由流式細胞技術。此類分析可被用於診斷 與預後（prognostic)目的。藉由此程序鑑定之細胞也可被 用於治療目的。

本發明也提供評估免疫收回反應（immune recaU responses)之试劑（參見，例如 Bert〇ni cih

Invest. 100: 5〇3-513，1997 與 penna 习入，〗 Π4. 1 565-1 570，1991)，其包括本發明之胜肽。例如， 為了抗原—專—細胞毒殺性T淋巴球的存在，使㈣定專一 胜肽’可分析來自具有要被治療之癌症之個體的病患㈣c 樣本。藉由培養PBMC與以本發明胜肽刺激細胞可評估含單 核細胞之血液樣本。在適合之培養期間後，例如為了細胞 毒殺性Τ淋巴球活性，分析經擴張之細胞族群。 胜肽也可使用為評估-疫苗功效之試劑。使用例如上 述方法可分析獲自H疫抗原接種之病患的⑽ 患為經HUA型’且選擇辨認表現於病患中之對偶基因 73 201138806 (a 11 e 1 e)專一分子的胜肽抗原試劑以分析。藉由於pbmc樣 本中之抗原決定位-專一細胞毒殺性T淋巴球的存在，可指 出疫苗之免疫抗原性（immunogenici ty)。本發明之胜肽也 可用來製造抗體，使用本技術領域已熟知的技術（參見， 例如，CURRENTPR0T0C0LSINIMMUN0L0GY，Wiley/Greene，NY 與 Antibodies A Laboratory Manual, Harlow and Lane， Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989 )，其可有 效作為診斷、偵測或監測癌症之試劑。此類抗體可包括辨 認於HLA分子内容中之胜肽的那些，即，結合至胜肽_MHC 複合物的抗體。 本發明胜肽或組合物具有一些額外之用途，其之一些 為此處所述。例如’本發明提供診斷或偵測以CDCA5免疫 活性胜狀之表現為特徵的一疾病。這些方法包含測定於一 生物樣本中之CDCA5 HLA結合胜肽的表現或CDCA5HLA結合 胜狀之一複合物與HL A class I分子。藉由以對於胜肽或 複合物之結合伙伴（binding partner)分析可測定或偵測 一胜肽之表現或胜肽與HLA class I分子之複合物。在一 較佳實施例中，對於胜肽或複合物之結合伙伴可為一抗體 其辨認且專一結合至胜肽。藉由使用CDCA5引子之標準PCR 放大步驟也可測試於一生物樣本，例如一腫瘤切片中之 CDCA5的表現。腫瘤表現之例子於此被呈現且示範之用於 CDCA5放大的條件與引子的更進一步揭露可被發現於 W02003/27322中，其内容藉由於此引用而被併入。 較佳為’診斷方法包含將分離自一個體的生物樣本與 74 201138806 專一於CDCA5 HLA結合胜肽之一試劑接觸以偵測於生物樣 本中之CDCA5 HLA結合胜肽的存在。如此處所使用“接觸” 意指以有效接近試劑方式放置生物樣本且在適合之例如， 濃度、溫度、時間、離子強度條件下，以允許介於試劑與 存在生物樣本中之CDCA5 HLA結合胜肽的專一互相作用。 一般而言，將試劑接觸生物樣本之條件為熟悉此技藝人士 所知之條件以促進介於分子及於生物樣本中之其同類物 (cognate)(例如，一蛋白質與其受體同類物、一抗體與其 蛋白質抗原同類物、一核酸與其互補序列同類物）之間的 專一互相作用。促進介於分子與其同類物之間的專一互相 作用的示範條件敘述於LQwetal所提出之u. s. pab No· 5，1 08,92卜其内容藉由於此引用而被併入。 可在π κ/叩或“ 之一或兩者執行本發明之診 斷方法因此’在本發明中生物樣本可位於仏心〇或“ 心0中。例如，生物樣本可為- /…組織且專一於 CDCA5免疫活性多胜肽的試劑可被用來偵測於組織中此類 分子的存在。或去，·5Γ . . 了 7/7 Η叩收集或分離生物樣本（例 如血液樣本、腫瘤切片、組織萃取物）。在-特別較佳實 施例中’生物樣本可為—含細胞樣本，更佳為-樣本含有 收集自要被診斷或測試之個體的腫瘤細胞。 或者，藉由一方法可執行診斷，此方法藉由以螢光素 ⑴窗escein)標諸Hu多聚複合物染色允許抗原—專一 Τ 細胞的直接定量（你丨‘ .m 里（例如，Alt隨，J· D.以3人，1 996,

Science 274 · 04 · λι + 94, Altman， D ， 1993, ρ改 75 201138806

Natl. Acad. Sci. USA 90 : 10330 ) » 也已提供細胞内淋 巴激素（lymphokines)之染色與干擾素釋放分析或ELISPOT 分析。多聚體染色、細胞内淋巴激素染色與ELI SPOT分析 皆顯露比一般分析靈敏至少多10倍（Murali-Krishna，K. et a 1. , 1998, Immunity 8: 177;Lalvani, A. et al. , 1997, J. Exp. Med. 186: 859; Dunbar, P. R. etaJ., 1 998, Curr. Biol· 8: 413)。也可使用五聚體（例如，US 2004-209295A)、右聚體（dextramer)(例如，W0 02/072631 )、 鏈聚體（streptamer)(例如，Nature medicine 6. 631-637 (2002))。 因此，在一些實施例中，本發明提供診斷或評估被投 予本發明至少一 CDCA5胜肽之個體的免疫反應的方法，方 法包括步驟： (a) 在適合誘導專一於免疫原之細胞毒殺性τ淋巴球 的條件下’將免疫原與免疫活性細胞接觸； (b) 偵測或測定於步驟（a)中所誘導之細胞毒殺性τ 淋巴球的誘導程度；以及 (c) 使個體之免疫反應與細胞毒殺性τ淋巴球的誘導 程度互相關連。 在本發明内容中，免疫原為擇自序列辨識號：2至19 之胺基酸序列中的CDCA5胜肽、（b)具有此種胺基酸序列的 胜肽與具有此種胺基酸序列於其中已被以丨、2或更多胺基 酸取代所修飾的胜肽的至少一個。於期間，適合誘導免疫 原專一之細胞毒殺性T淋巴球的條件為本技術領域所熟 76 201138806 知。例如’可i n v i t r 〇培養免疫活性細胞在免疫存在下以 誘導免疫原專一之細胞毒殺性Τ淋巴球。為了誘導免疫原 專一之細胞毒殺性Τ淋巴球’可加入任何刺激因子於細胞 培養物中。例如’ IL-2為細胞毒殺性Τ淋巴球誘導之較佳 刺激因子。 在一些實施例中’可在治療前、期間及/或後執行監測 或評估要被以胜肽癌症治療之個體的免疫反應的步驟。一 般而言，在癌症治療的程序中，一再地將免疫原性胜肽投 予至要被治療的個體。例如，可每週投予免疫原性胜肽達 3-10週。因此，在癌症治療程序期間，可評估或監測個體 之免疫反應。或者，對於癌症治療之評估或監測的步驟可 在治療程序完成時。 根據本發明，當與控制組相較時，經增強之免疫原專 一之細胞毒殺性Τ淋巴球的誘導指出要被評估或診斷之個 體免疫性地對已被投予之免疫原反應。用以評估免疫反應 之適合的控制組包括，例如當免疫活性細胞未與胜肽接觸 或與具有除了任何CDCA5胜肽之胺基酸序列的控制組胜肽 (例如，隨機胺基酸序列）接觸時的細胞毒殺性τ淋巴球 的誘導程度。在-較佳實施例中，藉由將介於投予至個體 之各個免疫原間的免疫反應進行比較，以序列專—方式來 -平估個體之免疫反應。特別是’纟至當將⑶⑴胜肽之一 二種類的混合物投予至個體時’依據胜肽免疫反應可成多 樣化。在此例子中’藉由將介於各個胜肽間的免疫反應進 行比較’可確認出對於其㈣顯示較高反應之胜狀。 77 201138806 x i.抗體 本發明提供抗體其結合至本發明胜肽。較佳抗體專一 結合至本發明胜肽且不會結合（或微弱結合）至非本發明 胜肽。或者抗體結合本發明胜肽與其同源物。 柷本發明胜肽之抗體可提供用途於癌症診斷與預後分析及 成像方法（imaging methodologies)。相似地，對於在癌症 病患中也表現或過度表現CDCA5程度而言，此類抗體可提 供使用於其他癌症之治療、診斷，及/或預後。此外，細胞 内表現之抗體（例如，單鏈抗體）可在治療於其中與cdca5 之表現相關的癌症中治療上地提供用途，與CDCA5之表現 相關的癌症例子包括，但不限於，急性骨髓性白血病、膀 胱癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、 大腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前 列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。 本發明也提供CDC A 5蛋白質（序列辨識號：21)或其 片段之偵測及/或定量的各種免疫活性分析，CDCA5蛋白質 (序列辨識號：21 )或其片段包括由擇自序列辨識號：2 至19中之胺基酸序列所組成的多胜肽。此類分析可包括一 或多個具辨認及結合CDC A 5蛋白質或其片段之能力之抗 CDCA5抗體為適當的。在本發明内容中，與CDCA5多胜肽 結合之抗CDCA5抗體，較佳為辨認一多胜肽，此多胜肽為 具有擇自序列辨識號：2至19中的胺基酸序列。以抑制測 試（inhibition test)可確認抗體之結合專一性。其為，在 具有擇自序列辨識號：2至19中之胺基酸序列之任何片段 78 201138806 多胜肽存在下’當介於要被分析之抗體與全長之CDCA5胜 肽之間的結合被抑制時，其顯示此抗體專一結合至片段。 在本發明内容中’在包括，但不限於放射免疫分析 (radioimmunoassays)、免疫色層分析技術（immun〇_ chromatgraph technique)、酵素連結免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)、酵素連 結免疫螢光分析（enzyme- linked immunofluorescent assays，ELIFA)等之多種本技術領域熟知之免疫分析形式 中執行此類免疫分析。 本發明之關於免疫，但非抗體分析也可包括T細胞致 免疫性分析（immunogenicity assay)(抑制或刺激）與主 要組織相谷性複合物（maj〇r hist〇compatibi 1 ity complex) 結合分析。此外’本發明也包括具偵測表現CDCA5之癌症 之能力的免疫成像分析，其包括，但不限於使用本發明之 經標該的抗體的放射顯像成像（radi〇 scintigraphic imaging)方法。此類分析在CDCA5表現之癌症偵測、監控 與預後中可臨床上提供用途，CDCA5表現之癌症，其例子 包括，但不限於，急性骨髓性白血病、膀胱癌、乳癌、子 宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、大腸癌、食道 癌、月癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌、小細 胞肺癌與軟組織腫瘤。 本發明也提供結合至本發明胜肽的抗體。本發明抗體 可使用於任何形式中，例如單株或多株抗體，且包括獲得 自將動物’例如兔子，以本發明胜肽進行免疫之抗血清、 79 201138806 所有類型之多株或單株抗體、人類抗體與由基因重組產生 之人源化抗體。 使用為一抗原以獲得一抗體之本發明胜肽可來自任何 動物種類，但較佳為來自哺乳動物，例如，人類、老鼠或 大鼠，更佳為一人類。人類來源胜肽可獲得自此處揭露之 核苷酸或胺基酸序列。 根據本發明，使用為免疫抗原之胜肽可為一完整之蛋 白質或部分胜肽之蛋白質。部分胜肽可包括，例如，本發 明之一胜肽之胺基（N)端或羧基（c)端片段。 此處，一抗體被定義為一蛋白質其與CDCA5胜肽之全 長或片段反應。在一較佳實施例中，本發明之抗體辨認 CDCA5片段胜肽，其具有擇自序列辨識號：2至19中的胺 基酸序列。合成寡胜肽的方法為本技術領域所熟知。在合 成後，在使用為免疫抗原（immun〇gen)前，胜肽可視需要被 純化。在本發明中，寡胜肽（例如9或1〇員）可與載體結 合或連結以增強致免疫性。鑰孔血藍蛋白（Keyh〇丨e_丨丨七 hemocyanin，KLH)被熟知為載體.結合鑰孔血藍蛋白與胜 肽的方法為本技術領域所熟知。 或者，可將編碼出本發明一胜肽或其片段的一基因插 入一已知的表現載體，其之後被轉形至一宿主細胞，如於 此所敘述。藉由任何標準方法，所需之胜肽或其片段可自 宿主細胞之外部或内部被重新獲得，且之後可被使用為一 杬原。或者，可將表現胜肽之整個細胞或其細胞萃出物或 一化學合成胜肽使用為抗原。 80 201138806 可以抗原將任何哺乳動物進行免疫，但較佳為考處與 用來細胞融合之親代細胞的相容性。一般而言，使用權齒 目Uodentia：)、兔形目cugomorphw或靈長目 (Primates)。嚅齒目的動物包括，例如小鼠、大鼠與倉鼠·。 兔形目的動物包括，例如兔子。靈長目的動物包括，例如 狹鼻類（舊世界猴）猴子，例如馬來猴（Macaca fascicularis)、獼猴（rhesus monkey)、聖狒狒（sacred baboon)與黑獲獲（chimpanzees)。 以抗原免疫動物之方法為本技術領域所熟知。抗原之 腹腔内注射（intraperitoneal injection)或皮下注射 (subcutaneous injection)為免疫哺乳動物之一標準方 法。更特別地，可將抗原稀釋或懸浮於一適合量的磷酸鹽 緩衝洛液、生理食鹽水等。若需要，可將抗原懸浮液與適 合量之標準佐劑，例如佛氏完全佐劑（Freund，s c〇mplete ad j uvant)混合，製成乳狀液（emu丨s丨〇n)並且之後投予至哺 乳動物。較佳為其之後投予與適合量之佛氏不完全佐劑 (Freund s incomplete adjuvant)混合的抗原，每 4 至 21 天也可使用一適合之載體來免疫。於上述免疫後，藉由 為了增加所需之抗體量，以標準方法可檢驗血清。 藉由自被檢驗以增加於血清中之所需抗體的經免疫動 物收集血液且藉由以任何一般方法自血液分離血清，可製 備抗本發明胜肽之多株抗體。多株抗體包括含多株抗體的 月’、3自血清分離之多株抗體的部分（fraction) 〇例 如使用與本發明胜肽結合之親合管柱且更進一步使用蛋白 81 201138806 質A或蛋白質G管柱純化此部分’可自僅辨認本發明胜肽 之部分純化免疫球蛋白G或Μ。 為了製備單株抗體，如上所述自經以抗原免疫並確認 於血清中所需抗體之增加程度的哺乳動物收集免疫細胞且 使免疫細胞遭遇細胞融合。用來細胞融合之免疫細胞，較 佳為獲自脾臟。其他要被與上述免疫細胞融合之親代細胞 包括’例如，哺乳動物之骨髓瘤（my e 1 oma)，且較佳為具有 以藥物篩選之融合細胞之獲得特性的骨髓瘤細胞。 根據已知方法’例如Milstein et al. (Galfre and Milstein，Methods Enzymol 73: 3-46 (1981 ))的方法， 可將上述免疫細胞與骨髓瘤細胞融合。 獲自細胞融合之產生的融合瘤，藉由將它們培養於標 準篩選培養基’例如HAT培養基（含亞黃嗓吟 (hypoxanthine)、氨蝶呤（amin〇pterin)和胸腺嘧啶 (thymidine)之培養基），可被篩選。通常持續細胞培養於 HAT培養基數天至數週，時間為允許除了所需融合瘤外之 其他細胞（非融合細胞）死亡。之後，可執行標準限制稀 釋以篩選並複製產生所需抗體之融合瘤。 除了於其中為了製備融合瘤、以一抗原免疫一非人類 動物的上述方法，可以胜肽、表現胜肽之細胞或其細胞萃 取物/77 F/ίΓΟ免疫人類淋巴細胞，例如被EB病毒感染的 那些。之後，將經免疫之淋巴細胞與具不明確分裂能力之 來自人類之骨髓瘤，例如U266融合，以產生一產生所需人 類抗體之融合瘤，所需之人類抗體可與可被獲得之胜肽結 82 201138806 , 合（Unexamined Published Japanese Patent Applicati〇n No. Sho 63-17688)。 將所獲得之融合瘤之後轉植進入小鼠之腹腔且萃取腹 水。可純化所獲得之單株抗體，藉由例如硫酸銨沉澱、一 蛋白質A或蛋白質G管柱、DEAE離子交換色層分析或一與 本發明胜肽結合之親和管柱。本發明抗體不只可被使用來 純化與偵測本發明胜肽，也可作為本發明胜肽之促進劑與 拮抗劑的候選物。 或者 產生抗體之免疫細胞，例如一經免疫之淋巴 細胞可藉由一致癌基因以永生且被使用來製備單株抗體。 也可使用基因工程技術來重組製備因此獲得之單株抗 體（參見，例如 Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United

Kingdom by MacMillan Publishers LTD ( 1 990))。例如， 編碼出抗體的dna可自一免疫細胞，例如產生抗體之一 融合瘤或一經免疫的淋巴細胞被複製，插入一適合之載 體，且引入一宿主細胞以製備重組抗體。本發明也提供如 上述製備之重組抗體。 此外，本發明抗體可為一抗體之片段或經修飾之抗 體，只要其結合一或多個本發明之胜肽。例如，抗體片段 可為Fab、F(ab’）2、Fv或單鏈Fv (scFv)，於其中來自重 與輕鏈的Fv片段藉由合適的連結器來連接（Hust〇n 占人，

Proc Natl Acad Sci USA 85: 5879-83 ( 1 988))。更特別 是，藉由以酵素例如木瓜酵素或胃蛋白酶處理抗體可產生 83 201138806 抗體片段。或者，編碼出抗體之基因可被構築、插入一表 現載體且表現於一適合的宿主細胞中（參見，例如Co efa人， J Immunol 152; 2968-76 (1994); Better snd Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989); Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 (1989)； Lamoyi, Methods Enzymol 121： 652-63 (1986); Rousseaux et al., Methods Enzymol 121: 663-9 (1986)； Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 132-7 (1991)) 〇 藉由與各種分子’例如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)結合可修飾抗體。本發明提供此類經修飾之 抗體。藉由化學修飾一抗體可獲得經修飾之抗體。這些修 飾方法為本技術領域中所常見。 或者，本發明之抗體可被獲得為嵌合抗體，介於來自 非人抗體之可變區與來自人類抗體之固定區之間，或為人 源化抗體’包括來自非人抗體之互補決定區、架構作用區 (frame work region，FR)與來自人類抗體之固定區。根據 已知方法可製備此類抗體。藉由齧齒類互補決定區之序列 取代人類抗體對應之互補序列可執行人源化（參見，例如

Verhoeyen ei a/.， Science 239:1534-1536 (1988))。 因此，此類人源化抗體為嵌合抗體，其中實質上少於完整 之人類可變區已被以來自非人種類之對應序列取代。 也可使用包括除了架構作用區與固定區尚有人類可變 區的全人類抗體。使用各種本技術領域所知的技術可產生 此類抗體。例如，in vitro方法包括呈現於噬菌體上之人 84 201138806 • 類抗體片丰又的重組資料庫的使用（例如，Hoogenboom &

Winter，J. Mol. Biol. 227:381 (1 99 1 ))。相似地，藉 由將人類免疫球蛋白基因座（1 〇c i )引入轉殖動物，例如於 其中内生免疫球蛋白基因已被部分或完全去活化的小鼠， 可製造人類抗體。此方法被敘述，例如於U. s. patent N〇s. 6’150’584， 5, 545, 807; 5, 545, 806; 5, 569, 825； 5, 625,126; 5, 633, 425; 5, 661，016。 獲自上述之抗體可被純化至同質（h〇m〇gene i ty )。例 如’根據用於一般蛋白質的分離與純化方法可執行抗體之 分離與純化。例如，藉由合適地選擇與結合管柱色層分析， 例如親合管住、過濾、超過濾、鹽析、透析、對鈉十二烷 基的硫酸鹽聚丙稀醜胺凝勝電泳（SDS po 1 yaery 1 amide ge 1 e 1 ectrophores i s)、等電焦集法（i soe i ectr i c f ocus i ng) 的使用可分開與分離抗體（Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory ( 1 988))，但不限於此。蛋白質a管柱與蛋白 質G管柱A可被使用為親合管柱。要被使用之示範的蛋白 質 A 管柱包括，例如 Hyper D、P0R0S 與 Sepharose F. F. (Pharmacia) 〇 除了親合’示範之色層分析包括，例如離子交換色層 分析、疏水色層分析、膠體過遽、逆向色層分析、吸附色 層分析等（Strategies for Protein Purification and

Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. , Cold Spring Harbor 85 201138806

Laboratory Press ( 1 996))。藉由液相色層分析，例如HpLC 與FPLC可執行色層分析步驟。 例如，可使用吸收之測量、酵素連結免疫吸附分析 (ELISA)、酵素免疫分析（EIA)、放射免疫分析及/或免疫螢 光以測量本發明抗體之抗原結合活性。在酵素連結免疫吸 附分析中’本發明抗體為固定於一培養盤上，提供本發明 胜肽至一培養盤，且之後提供含所需抗體之樣本，如，產 生抗體之細胞的培養懸浮液或經純化的抗體。之後，提供 辨β忍第一抗體且被標誌、酵素，例如驗性碟酸酶之第二抗 體，且之後培養培養盤。接著在清洗後，將酵素受質，例 如對硝基笨磷酸（p-nitrophenyl phosphate)，加至培養 盤，並測量吸收以評估樣本之抗原結合活性。胜肽之片段， 例如C端或N端之片段可被使用為抗原以評估抗體結合活 性。根據本發明，可使用BIAc〇re 評估抗 體的活性。 上述方法允許本發明胜肽之偵測或測量，藉由露出本 發明抗體至假定含本發明胜肽之樣本並偵測或測量由抗體 與胜肽所形成之免疫複合物。 由於根據本發明之胜肽偵測或測量方法可專一偵測或 測量胜肽’方法在使用胜肽之各種實驗中為有用的。 X11.載體與宿主細胞 本發明也提供載體與宿主細胞，於其中將編碼出本發 明胜肽之核苷酸引入。本發明之載體可提供效用來維持本 發明核苷酸，特別是DNA於宿主細胞中以表現本發明胜 86 201138806 . 狀’或為基因治療以投予本發明本發明核苷酸。 當’ co//為宿主細胞且載體被放大且大量製造於^ 例如，JM109、DH5 alpha、HB101 或 XLlBlue)中時， 載體應具有要被放大於五.co/j.中之“ori”與篩選轉形 E. co 1 i之標誌、基因（例如’藉由例如安比西林 (ampicillin)、四環黴素（tetracycHne)、卡那黴素 (kanamycin)、氣黴素（chloramphenicol)或類似物之藥物 篩選之一抗藥基因）。例如，可使用M1 3_系列載體、pUc_ 系列載體、pBR322、pBluescript、pCR-Script 等。此外， pGEM-T、pDIRECT與pT7也可被用來次複製與萃取cDNA與 上述載體。當載體被用來產生本發明蛋白質時，一表現載 體可提供使用。 例如’要被表現於及中之一表現載體應具有上 述特徵以被放大於兄中。當使用E. c〇ii，例如 JM109、DH5 alpha、HB101 或 XLlBlue 為宿主細胞時，載 體應具有啟動子（promoter)，例如lacZ啟動子（Ward ei al., Nature 341： 544-6 (1989); FASEB J 6: 2422-7 (1992)), araB promoter (Better et al. , Science 240: 1041-3 (1 988))、T7啟動子或類似物，其可有效表現所需 基因於E· col i.中。基於那方面，可使用，例如 (Pharmacia), "QIAexpress system" (Qiagen)、pEGFP 與 pET(於此例子’宿主較佳為此21，其表現T7 RNA聚合酶）， 取代上述載體。另外，載體也可含用於胜肽分泌之訊號序 列。一引導要被分泌之胜肽至兄•的胞膜間區 87 201138806 (periplasm)的示範之訊號序列為pelB訊號序列（Lei et al.，J Bacter iol 169: 4379 (1987))。將載體引入目標 宿主細胞的方式包括，例如，氯化鈣方法，與電穿孔 (e 1 ectroporat ion)方法 〇 除了五· co/i·，例如來自哺乳動物之表現載體（例如 pcDNA3 (Invitrogen)與 pEGF-B〇S (Nucleic Acids Res 18(17): 5322 ( 1 990))，pEF，pCDM8)、來自昆蟲細胞之表 現載體（例如、"Bac-to-BAC桿狀病毒表現系統 (baculovirus expression system)" (GIBCO BRL)、 pBacPAK8 )、來自植物之表現載體（例如，pMHl、pMH2 )、 來自動物病毒之表現載體（例如、pHSV、pMV、pAdexLcw)、 來自反轉錄病毒之表現載體（例如，pZipneo)、來自酵母 卤之表現載體（例如’ "Pichia Expression Kit11 (Invitrogen)、pNVll、SP-Q01 )與來自枯草桿菌（Bacillus subtilis)之表現載體（例如’ pPL6〇8，pKTH50)可被用 來產生本發明之多胜肽。 為了在於動物細胞，例如CH0、C0S或NIH3T3細胞中 表現載體’載體應攜帶表現於此類細胞中所必須的啟動 子’例如 SV40 啟動子（Mulligan et a 1.，Nature 277: 108 ( 1 979))、MMLV-LTR 啟動子、EF1 alpha 啟動子（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)) 、 CMV 啟 動子等，與篩選轉形物的標誌基因（例如藉由藥物筛選（例 如，新黴素（neomycin)、G418之抗藥基因）較佳。具有這 些載體特徵之已知載體的例子包括，例如pMAM、pDR2、 88 201138806 pBK-RSV 、 pBK-CMV 、 pOPRsv 與 p〇pi3 。 呈現下列實施例以說明本發明與以協助熟悉此技藝人 士製U與使用本發明。實施例並不意味於在其他方面限制 本發明範圍任何方式中。 【實施例】 材料與方法 細胞株 Τ2、HLA-A 0201陽性人類β淋巴母細胞株與c〇S7、非 洲綠猴腎細胞株為自ATCC所購得。 來自CDCA5之胜肽的候選物選擇 使用結合預測軟體” NetMHC 3. 0”（www. cbs. dtu. dk/ services/NetMHC/) (Buus et al. (Tissue Antigens., 62:378-84, 2003), Nielsen et al. (Protein Sci., 12:1007-17, 2003, Bioinformatics, 20(9)：1388-97, 2004))預測來自〇0€45之9員與1〇員胜肽，其結合至111^-八 *0201分子。這些胜肽係根據一標準固相合成方法由 Biosynthesis (Lewisville，TX)來合成且藉由逆相高效能 液體層析（reversed phase high performance liquid chromatography，HPLC)來純化。分別藉由分析型HLpc與 質譜分析確認這些胜狀之純度（>90%)與身份 (identity)。 將胜肽溶解於二甲基亞颯 (dimethylsulfoxide，DMS0)中於 20 mg/ml 且儲存於-80 〇C。 //? h iro細胞毒殺性T淋巴球誘導 89 201138806 使用來自單核白血球之樹突細胞做為抗原呈現細胞以 誘導抗表現於人類白血球組織抗原（HLA)上之胜肽的細胞 毒殺性τ淋巴球反應。//? Pi· iro產生樹突細胞如別處所述 (Nakahara S et al., Cancer Res 2003 Jul 15, 63(14)： 4112-8)。特別地’由 Fic〇l hPiaque (Pharmacia)溶液分 離自一正常自願者（HLA_A*〇2(n陽性）之周邊血液單核細 胞’藉由貼附至一塑膠組織培養盤（Bect〇n Dickinson)來 分離以豐富其如一單核白血球部分。將經豐富單核白血球 之族群培養在1 〇〇〇 U/m 1之人類顆粒-巨噬細胞群落刺激因 子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) (R&D System)與 1000 U/ml 之白細胞介素 (interleukin, IL)-4 (R&D System)存在下於含 2%之熱去 活性自身取得血清（aut〇1〇g〇us serum, as)之AIM-V培養 基（Invitrogen)中。培養7天後，於AIM-V培養基中，於 3 /z g /ml 之石-2 微球蛋白（beta 2-microglobulin)存在 下以2G /zg/ml之各合成胜肽脈衝（puised)細胞激素誘導 之樹突細胞3小時於37。(：。所產生之細胞顯示表現樹突細 胞相關分子，例如CD80、CD83、CD86與HU CUss π於 其細胞表面（資料未顯示）。之後以χ_射線（2〇 Gy)將這 些胜肽脈衝之樹突細胞去活性且將其以1 : 2 〇之比例與自 身取得CD8陽性τ細胞混合’ CD8陽性τ細胞藉由以C])8

Positive Isolation Kit (Dynal)正選擇獲得。這些培養 物設置於48孔盤（Corning);各孔含15 χ 1〇4胜肽脈衝 之樹突細胞、3 X 1〇5 CD8陽性Τ細胞與1〇 ng/mi之il-7 90 201138806 (R&D System)於0.5 ml之AIM-V/2%自身取得血清培養基 中。三天之後，以iLdCCHIRON)添加至培養物至終濃度為 20 IU/ml。第7天與第14天更以自身取得胜肽脈衝之樹突 細胞進一步刺激T細胞。以與上述相同之方法每次製備樹 突細胞。於第21天，第三輪之胜肽刺激後，將細胞毒殺性 T淋巴球進行抗胜肽脈衝之T2細胞測試（Tanaka H ei a/.， Br J Cancer 2001 Jan 5, 84(1 ): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7; Uchida N et aL, Clin Cancer Res 2004 Dec 1 5, 1 0(24): 8577-86; Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506; Suda T ei a7· , Cancer Sci 2006 May, 97(5): 41卜9)。 細胞毒殺性T淋巴球擴張步驟 使用與由 Riddell et al. (Walter EA et al., N Engl J Med 1 995 Oct 1 9, 333( 1 6)： 1038-44; Riddell SR et al., Nat Med 1 996 Feb, 2(2): 216-23)所敘述之相似方法於培 養中擴張細胞毒殺性T淋巴球。全部 5 X 1 04細胞毒殺性 Τ淋巴球懸浮於2 5 m 1之含有兩種人類Β類淋巴母細胞株 之AIM-V/5%自身取得血清培養基，由MMC去活化，在40 ng/ml之抗-CD3單株抗體（Pharmingen)存在下。在開始培 養1天後，120IU/ml之IL-2加入培養中。於第5、8、11 天以新鮮之含30 IU/ml之IL-2的AIM-V/5%自身取得血清 培養基提供給培養物（Tanaka H Br J Cancer 2001

Jan 5, 84( 1 ): 94-9; Umano Y et al., Br J Cancer 2001 Apr 20, 84(8): 1052-7； Uchida N et al., Clin Cancer 91 201138806

Res 2004 Dec^l 5, 1 0(24): 8577-86; Watanabe T et al., Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506； Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 4U-9)。 細胞毒殺性T淋巴球複製（c 1 one)的建立 執行稀釋以具有〇. 3、1與3細胞毒殺性T淋巴球/孔 於 96 圆底（round-bottomed)微效價盤（Nalge Nunc

11^61'1131^〇11&1)中。細胞毒殺性1'淋巴球與15^1〇4細胞/ 孔之2種兩種人類b類淋巴母細胞株、30 ng/ml之抗-CD 抗體與125 U/ml之IL-2於全部150 μ 1 /孔之含5%自身 取得之血清的AIM-V培養基中一起培養。1〇天後將50 "1/孔之IL-2加入培養基中以達到125 U/ml IL-2之終 浪度。於第14天測試細胞毒殺性τ淋巴球之活性，且使用 上述相同方法擴張細胞毒殺性T淋巴球複製（uchida N ei aL, Clin Cancer Res 2004 Dec 15, 10(24): 8577-86;

Suda T et al., Cancer Sci 2006 May, 97(5): 411-9;

Watanabe T et al. , Cancer Sci 2005 Aug, 96(8): 498-506) 〇 專一之細胞毒殺性τ淋巴球活性 為了測試專一之細胞毒殺性T淋巴球活性，執行 IFN-7酵素結合免疫斑點（ELISp〇T)分析與IFN_r酵素結 合免疫吸附（ELISA)分析。特別地，製備胜肽脈衝之T2 (1 X 1 〇4細胞/we 11)為刺激細胞。培養之細胞於48孔中做為 應答細胞。在製造商步驟下執行IFN_ 7酵素結合免疫斑點 刀析與IFN- γ酵素結合免疫吸附分析。 92 201138806 ， 強有力地表現目標基因與HLA-A02任一或兩者的細胞的建 立 藉由PCR將編碼出目標基因之開放讀框或jjla-a*0201 * 之cDNA放大。將PCR放大產物複製進一表現載體。使用 lipofectamine 2000 (Invitrogen)，根據製造商建議步驟 將質體轉染進C0S7，其為一目標基因與HLA-A02陰性細胞 株。於自轉染後2天，以versene (Invitrogen)收集經轉 染的細胞且使用為細胞毒殺性T淋巴球活性分析之目標細 胞（5 X 104/well)。 結果 於癌症中增強之CDCA5表現 使用c-DNA微陣列獲得自各種癌症之廣泛基因表現概 況（profile)顯示 CDCA5 ( GenBank Accession N〇 NM一050668 ;序列辨識號：2〇)被提升。當與正常對應組織 比較時’急性骨髓性白血病中28個有1 〇個、膀胱癌7個 有6個、乳癌4個有2個、子宮頸癌9個有9個、膽管細 胞癌1個有1個、慢性骨髓性白血病28個有23個、大腸 癌14個有13個、食道癌丨丨個有7個、胃癌1〇個有8個、 瀰漫型胃癌1個有1個、肺癌丨6個有丨5個、淋巴瘤i 4個 有14個、前列腺癌6個有5個、小細胞肺癌15個有15個 與軟組織腫瘤39個有31個，有根據地提升CDCA5表現（表 1) ° 93 201138806 表1、與正常對應組織比較，於癌症組織中觀察到CDCA5之向上調控之例子 的比例 癌症/腫瘤 比 急性骨髓性白血病 10/28 膀胱癌 6/7 乳癌 2/4 子宮頸癌 9/9 膽管細胞癌 1/1 慢性骨髓性白血病 23/28 大腸癌 13/14 食道癌 7/11 胃癌 8/10 瀰漫型胃癌 1/1 肺癌 15/16 淋巴瘤 14/14 前列腺癌 5/6 小細胞肺癌 15/15 軟組織腫瘤 31/39 結果 來自CDCA5之HLA-A02結合胜肽的預測 表2a與2b以高結合親和力之順序顯示CDCA5之 HLA-A02結合9員與10員胜肽。總共19個具有潛在HLA-A02 結合能力之胜肽被選擇且將其試驗以確定抗原決定位胜 肽。 表2a、來自CDCA5之HLA-A02結合9員胜肽 序列辨識號 起始位置 胺基酸序列 Kd (nM) 1 236 AMNAEFEAA 191 2 62 RIVAHAVEV 201 3 166 FGFEGLLGA 529 4 235 AAMNAEFEA 586 5 40 ILPEIWPKT 910 6 183 VVCSKLTEV 1133 7 151 TLGSASTST 2503 8 172 LGAEDLSGV 7630 9 241 FEAAEQFDL 15780 94 201138806 表2b、來自CDCA5之HLA-A02結合10員胜肽 序列辨識號 起始位置 胺基酸序列 Kd (nM) 10 171 LLGAEDLSGV 49 11 221 KMPEILKTEL 83 12 187 KLTEVPRVCA 860 13 59 VLKRIVAHAV 973 14 235 AAMNAEFEAA 2044 15 225 ILKTELDEWA 3049 16 35 SELPSILPEI 8773 17 96 ELTKEDLFKT 13432 18 170 GLLGAEDLSG 14912 19 85 FLEKENEPPG 15200 起始位置指自CDCA5之N端的胺基酸殘基數目。 結合分數為來自“NetMHC3. 0”。 以HLA- A* 0201限制之來自CDCA5之預測胜肽誘導細胞毒 殺性T淋巴球 根據敘述於“材料與方法”之步驟產生對於那些來自 C D C A 5之胜肽的細胞毒殺性T淋巴球。藉由IF N - 7酵素結 合免疫斑點分析測定胜肽專一細胞毒殺性T淋巴球活性 (第la-c圖）。與控制組孔洞相較，以CDCA5-A02-9-183 (序列辨識號：6 )刺激之孔洞編號#3與#5 (a)、以 CDCA5-A0 2-9-241 (序列辨識號：9)刺激之孔洞編號#2 (b) 與以CDCA5-A02-1 0-35 (序列辨識號：16)刺激之孔洞編 號#8 (c)顯示強而有力的IFN- r產生。另一方面，藉由以 顯示於表2a與2b中之其他胜肽刺激，沒有測定到強的IFN-T產生，儘管那些胜肽具有與HLA-A+ 020 1之可能結合活 性。例如，抗胜肽脈衝之目標細胞之以CDCA5-A02-9-236 (序列辨識號：1 )刺激的細胞毒殺性T淋巴球反應的典型 負資料（d)。結果，其指出篩選出來自CDCA5之3個胜肽為 95 201138806 可誘導強而有力之細胞毒殺性τ淋巴球的胜肽。 抗CDCA5衍生胜肽之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株與複製的 建立 藉由IFN- τ*酵素結合免疫斑點分析偵測，於以 CDCA5_A02_9-183 (序列辨識號：6 )刺激之孔洞編號#3與 #5 (a)與以CDCA5-A02-1 0-35 (序列辨識號：16 )刺激之 孔洞編號# 8 (b)中顯示胜肽專一細胞毒殺性τ淋巴球活性 的細胞被擴張’並藉由上述限制稀釋步驟來建立細胞毒殺 性T淋巴球細胞株。藉由I fn- r酵素結合免疫吸附分析來 測定那些細胞毒殺性T淋巴球細胞株的細胞毒殺性τ淋巴 球活性（第2a-b圖）。與無胜肽脈衝之目標細胞相較，細 胞毒知·性T淋巴球細胞株顯示強的抗以對應胜狀脈衝之目 標細胞的IF N - 7產生。此外’藉由來自細胞毒殺性τ淋巴 球細胞株的限制稀釋建立細胞毒殺性T淋巴球複製，且藉 由IFN-T酵素結合免疫吸附分析測定來自抗經胜肽脈衝 之目標細胞之細胞毒殺性τ淋巴球複製的IFN- r產生。從 以 CDCA5-A02-9-1 83 (序列辨識號：6) (a)與〇!)0人5-八02- 1 0 - 3 5 (序列辨識號：16 )(b)刺激之細胞毒殺性τ淋巴球 複製測定出強的IFN- r產生（第3a-b圖）。 抗外生表現CDCA5與HLA-A* 0201之目標細胞的專一細胞毒 殺性T淋巴球活性 檢驗經提升抗這些胜肽之所建立的細胞毒殺性τ淋巴 球細胞株其對於辨認外生表現與HLA-A* 0201基因之 目標細胞的能力。使用由對應之胜肽提升的細胞毒殺性τ 96 201138806 淋巴球細胞株為應答細胞（effector cell)來測試抗c〇s7 細胞的專一細胞毒殺性T淋巴球活性，而C0S7細胞經全長 之與HLA-A* 0201基因轉染（對於外生表現 與HLA-A* 0201基因之目標細胞的特定模式）：c〇S7細胞 以全長0?以5或HLA-A* 0201基因轉染製備為控制組。於第 4圖中，以CDCA5-A02-9-1 83 (序列辨識號：6)刺激之細 胞毒殺性T淋巴球顯示強的抗表現與HLA-A* 0201 兩者之C0S7細胞的細胞毒殺性τ淋巴球活性。另一方面， ’又有彳貞測到抗控制組之顯著專一之細胞毒殺性T淋巴球活 性。因此’此資料清楚證明CDCA5_A02-9-183 (序列辨識 號：6)被内生地處理且表現於具有HLA-A* 020 1分子之目 標細胞上且由細胞毒殺性T淋巴球所辨認。這些結果更進 一步顯示此來自CDCA5之胜肽為可適合作為具CDCA-表現 之腫瘤病患之治療的癌症疫苗。 抗原胜肽之同源分析 以 CDCA5-A02-9-1 83 C 序列辨識號：6)、CDCA5-A0 2-9-241 (序列辨識號：9)與CDCA5-A02-1 0-35 (序列辨識號： 1 6 )刺激之細胞毒殺性T淋巴球顯示顯著且專一之細胞毒 殺性T淋巴球活性。此結果可能起因於CDCA5-A02-9-183 (序列辨識號：6) 、CDCA5-A02-9-241 (序列辨識號：9) 與CDCA5-A02-1 0-35 (序列辨識號：16 )之序列為與源自 已知使人類免疫系統敏感之其他分子的胜肽同源的事實。 為了排除此可能性，對於使用為關鍵字向BLAST演算法 (www. ncbi. nlm. nih. gov/blRst/hla^t. cgi)查詢之這些胜 97 201138806 肽序列執行同源性分析’而BLAST演算法顯示沒有序列顯 不顯著之同源性。同源性分析之結果指出CDCA5-A02-9-183 (序列辨識號：6) 、CDCA5-A02-9-241 (序列辨識號：9) 與CDCA5-A02-10-35 C序列辨識號：16)之序列為獨特的， 且因此只有很小可能性，對於我們最佳知識而言，這些分 子會對於一些非相關分子提高非計畫中之免疫反應。 因此，確認新穎之來自CDCA5之HU —A〇2抗原決定位 胜肽。此外此處結果證明CDCA5之抗原決定位胜肽對使用 於癌症免疫治療中而言可為適合的。 產業利用性 本發明提供新的腫瘤相關抗原，特別是來自CDCA5的 那些’其可誘導強且專一的抗腫瘤免疫反應，且對於癌症 形式之廣泛多樣化而言具有應用‘I·生。此腫瘤相關抗原可提 供用途為抗與CDCA5相關之疾病的胜肽疫苗，與咖相 關之疾病’例如癌,症’更特別是急性骨髓性白血病、膀胱 癌、乳癌、子宮頸癌、膽管細胞癌、慢性骨髓性白血病、 大腸癌、食道癌、胃癌、瀰漫型胃癌、肺癌、淋巴瘤、前 列腺癌、小細胞肺癌與軟組織腫瘤。 g 2於此詳述本發明與提及其特定實施例時，需瞭解的 月J述敘述本質為不範與解釋且意為說明本發明與其較 佳實施例°於例行實驗之中’熟悉此技藝人士可立即瞭解 :::離本發明之精神下其可實行各種改變與修飾，其邊 界與範圍被所附申請專利範圍所定義。 98 201138806 【圖式簡單說明】 第1圖由一系列照片（a)至（c)所組成，其顯示在以來 自CDCA5之胜肽誘導之細胞毒殺性T淋巴球上之丨FN_ r酵 素結合免疫斑點分析（E LIS P 0 T)的結果。分別與控制組相 較，以CDCA5-A02-9-183 (序列辨識號：6)刺激之於孔洞 編说#3與#5中（a)、以CDCA5_A02_9-241(序列辨唯號 . g ) 刺激之於孔洞編號#2中（b)與以CDCA5-A02-10-35 (序列 辨識號：1 6 )刺激之於孔洞編號#8中（c)的細胞毒殺性τ 淋巴球顯示強的IFN- 7產生。於這些照片之孔洞上的正方 形指出來自對應之孔洞的細胞被擴張來建立細胞毒殺性τ 淋巴球細胞株。相對的，如負資料的典型例子，其並未顯 示從抗胜肽脈衝目標細胞之以CDCA5-A02-9-236 (序列辨 識號：1)刺激的細胞毒殺性Τ淋巴球之專一的產 生（d)。於圖中，“ +”指出抗以適合之胜肽脈衝的目標細 胞的IFN-τ產生，而指出抗未以任何胜肽脈衝的目 標細胞的IF N - y產生。 第2圖由一系列線圖（a)至（b)所組成，其顯示ΙρΝ_γ 酵素結合免疫吸附分析之結果，IFN_ r酵素結合免疫吸附 分析之結果顯示（a) CDCA5-A02-9-183 (序列辨識號：6 ) 與（1))00[六5^02-10-35 (序列辨識號：16)刺激之細胞毒 殺性T淋巴球細胞株的IFN- 7產生。結果顯示與控制組相 較，藉由以各胜肽刺激建立之細胞毒殺性T淋巴球細胞株 顯示強而有力之IFN- r產生。於圖中，‘‘ +，，指屮始 99 201138806 合之胜肽脈衝的目標細胞的IFN- 7產生，而“ 指出抗 未以任何胜肽脈衝的目標細胞的IF N - 7產生。 第3圖由一對線圖（a)與（b)所組成，其示藉由來自以 (a) CDCA5-A02-9-1 83 (序列辨識號：6)與（b) CDCA5-A02- 10-35 (序列辨識號：丨6 )刺激之細胞毒殺性τ淋巴球細胞 株的限制稀釋所建立之細胞毒殺性T淋巴球複製的I ρ n - γ 產生。結果顯示與控制組相較’藉由以各胜肽刺激所建立 之細胞毒殺性Τ淋巴球複製顯示強而有力之丨FN_ r產生。 於圖中，指出抗以各胜肽脈衝的目標細胞的丨^^一^ 產生，而“指出抗未以任何胜肽脈衝的目標細胞的 IFN- τ產生。 第4圖由線圖所組成，其顯示抗外生表現cdca5與 HLA-A 0201之目標細胞的專一細胞毒殺性τ淋巴球活性。 將以HLA-A* 0201或全長之CDCA5基因轉染之c〇S7細胞製 備為控制組。以CDCA5-A02-9-183 (序列辨識號：6 )建立 之細胞毒殺性τ淋巴球細胞株顯示抗以CDCA5與hla一a* 020 1兩者轉染之⑽7細胞的專-細胞毒殺性T淋巴球活 眭（黑色圓形）。$ 一方面’沒有偵測到顯著專_之細胞 毒殺性τ淋巴球活性，其抗表現hla a*_ (三角形 cdCA5(白色圓形）任—的目標細胞。 【主要元件符號說明】 fe 〇 100 201138806 序列 〈110〉 腫瘤療法·科學股份有限公司 <120〉 GDCA5胜肽及含此胜肽之疫苗 <130〉 0NC-A1012-TW <150〉 US 61/322,676 <151> 2010-04-09 〈160〉 25 <170〉 Patent In version 3. 5 <210〉 1 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉 人工序列 〈220〉 〈223〉 人工合成胜肽序列 <400〉 1

Ala Met Asn Ala Glu Phe Glu Ala Ala 1 5 〈210> 2 <211〉 9 <212〉 PRT <213> 人工序列 <220> <223> 人工合成胜狀序列 〈400> 2 Arg lie Val Ala His Ala 1 5 〈210〉 3 〈211〉 9 <212〉 PRT <213> 人工序列 〈220〉 〈223〉 人工合成胜狀序列 201138806 <400> 3

Phe Gly Phe Glu Gly Leu Leu Gly Ala 1 5 <210〉 4 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 4

Ala Ala Met Asn Ala Glu Phe Glu Ala <210〉 5 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 5 lie Leu Pro Glu lie Trp Pro Lys Thr <210〉 6 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400> 6

Val Val Cys Ser Lys Leu Thr Glu Val 〈210〉 7 <211> 9 2 201138806

J <212> PRT 〈213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 7

Thr Leu Gly Ser Ala Ser Thr Ser Thr 〈210〉 8 <211> 9 <212> PRT 〈213〉人工序列 〈220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 8

Leu Gly Ala Glu Asp Leu Ser Gly Val 1 5 <210〉 9 <211〉 9 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 9

Phe Glu Ala Ala Glu Gin Phe Asp Leu 1 5 <210〉 10 〈211〉 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 〈220> <223〉人工合成胜肽序列 <400> 10

Leu Leu Gly Ala Glu Asp Leu Ser Gly Val 3 201138806 1 5 10 <210〉 11 <211〉 <212> . <213〉 10 PRT 人工序列 <220〉 〈223〉 人工合成胜肽序列 〈400〉 11

Lys Met Pro Glu lie Leu Lys Thr Glu Leu 1 5 10 <210〉 12 <211〉 <212〉 <213> 10 PRT 人工序列 〈220> <223> 人工合成胜肽序列 <400> 12

Lys Leu Thr Glu Val Pro Arg Val Cys Ala 1 5 10 <210〉 13 <211〉 <212〉 <213〉 10 PRT 人工序列 <220〉 〈223> 人工合成胜肽序列 <400> 13

Val Leu Lys Arg lie Val Ala His Ala Val 1 5 10 <210> 14 <211> <212> <213〉 10 PRT 人工序列 <220〉 201138806 • <223〉人工合成胜肽序列 - <400> 14

Ala Ala Met Asn Ala Glu Phe Glu Ala Ala 1 5 10 <210〉 15 <211〉 10 <212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220> <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 15 lie Leu Lys Thr Glu Leu Asp Glu Trp Ala 1 5 10 <210> 16 〈211〉 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 16

Ser Glu Leu Pro Ser lie Leu Pro Glu lie 1 5 10 〈210〉 17 〈211〉 10 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人工合成胜肽序列 <400> 17

Glu Leu Thr Lys Glu Asp Leu Phe Lys Thr 1 5 10 <210> 18 201138806 <211〉 10 <212> PRT <213〉人工序列 <220〉 <223〉人工合成胜肽序列 <400〉 18

Gly Leu Leu Gly Ala Glu Asp Leu Ser Gly 1 5 10 <210〉 19 〈211〉 10 <212〉 PRT <213〉人工序列 <220〉 〈223>人工合成胜肽序列 <400〉 19

Phe Leu Glu Lys Glu Asn Glu Pro Pro Gly 1 5 10 <210〉 20 <211〉 2599 <212> DNA 〈213〉人類 <400〉 20 gaaaagactc ggggttccga gggccgcaga ccgctagccc tacgtcactt ccgcttcctt 60 tcccgcaggg cgggtaattc gaacgttttt tgcagcgagt ggccttcccg gttggcgcgc 120 gcccggggcg gcggcgctgg aggagctcga gacggagcct aagttatgtc tgggaggcga 180 acgcggtccg gaggagccgc tcagcgctcc gggccaaggg ccccatctcc tactaagcct 240 ctgcggaggt cccagcggaa atcaggctct gaactcccga gcatcctccc tgaaatctgg 300 ccgaagacac ccagtgcggc tgcagtcaga aagcccatcg tcttaaagag gatcgtggcc 360 catgctgtag aggtcccagc tgtccaatca cctcgcagga gccctaggat ttcctttttc 420 ttggagaaag aaaacgagcc ccctggcagg gagcttacta aggaggacct tttcaagaca 480 cacagcgtcc ctgccacccc caccagcact cctgtgccga accctgaggc cgagtccagc 540 6 201138806 • tccaaggaag gagagctgga cgccagagac < tacagccggc tggagaccct gggctctgcc tttggcttcg aggggctgct gggggcagaa tccaaactca ccgaggtccc cagggtttgt cctggaatct ccccaccacc cgagaaacag ttgaaaacgg agctggatga gtgggctgcg cagtttgatc tcctggttga atgagatgca cctgtcctgt acatagccac ctccctgtgg ttgttacctg tgtgtgtgct ggtgctgcgc cagcagcggc agccatcttg gttttaggaa tgtcctgtct cttgtcgtcc tgtccttcct gatgggccac agactgggga ggagaatcag ttgaggtgag aggcacctct gctcttgttg gggctctgcc agcctcggcc tctccctcct gaacccacct gtgtaaagag gttttcagtt gtcccagaga gaattcgtgg gctgagggca cagcctgtgg agtctgagtt ttgaaggatg agtgtgtact acacagaagc tgtgttttct aatgccaggt tgatagggcg ctggctgctt accaggtgct gtgagtttct gtggctcatg acgctggagt cttaccactc tgctgcaggg ccatttctta caaaataagt tacaccgagt gtcccagacc tactagcatt ttgcaactat gtaccagaca gcggcggggg ctgatagcaa atgagaacac tgcctggatg catctcatga tttccatcgt gtggattcaa tagtgtggat ttggaaatgt ctaagaaagt caggcgttcc 600 tctacctcca ccccaggccg ccggtcctgc 660 gacttgtccg gagtctcgcc agtggtgtgc 720 gcaaagccct gggccccaga catgactctc 780 aaacgtaaga agaagaaaat gccagagatc 840 gccatgaatg ccgagtttga agctgctgag 900 gtggggggtg cacctggcca gactctccct 960 agaggacact tagggtcccc tcccctggtc 1020 atgaggactg tctgcctttg agggcttggg 1080 atggggccgc ctggcccagG cactcactgg 1140 atctccccaa agtaccatag ccagtttcca 1200 tggcccagcc agaagttaaa gggctgaggg 1260 ggaggggtgg ctgcttggaa ataggcccag 1320 gagttgcctt ctgttggtgg ctttcttctt 1380 ccgtgggttt cccctttgat tctgtaaata 1440 attctgtctt ggaggaagaa gctggacatt 1500 tagggagcct tagttgggtc tcagaccata 1560 agttctggtc tgctgttgag atgtttggta 1620 ggagcaaagg gtgcatttca gggtgtggcc 1680 gcctctgggc tggtcccttg cacagggccc 1740 gtggaaggtg gcccctcttg tcacccatac 1800 ctacttggcc ctagaagaga aagttgaaga 1860 gcttgtaaag tcctcggaaa gtttcctcgc 1920 ttttagtttt tggcctccct atcctctcac 1980 tctctggaga atttccccat ctttctcttc 2040 ttgaaggctg ccctgccccc gactctcctg 2100 201138806 ccgcacccct ggccattgta ccttttgatg tttagaagtt cgtggaagta gacgctgagg 2160 tgtgcagagg agctggtgga taacagagaa tgccagggaa gatgagtgct gggtcagggt 2220 acttggatga aacggtgcag gccaggcggg ccctaataaa accctctgcc aggtctggga 2280 gtcccaggcc atctgctcaa cgctctgtgg tttgtcagac ctgcaagcaa gccccctgct 2340 ggggaagcct aggtgtcctt gagctgaacc gcactgaaga actcttgtcc tcactggctg 2400 atgcagcaga actcttggga aatgtcttag tcctgcagaa tcaggagtca ccagatgatg 2460 cagagttgag atcatcattg caaagttctc tgttcctgag gaactaaatt taaggaaaaa 2520 atgggatttt gttttagagt tggaaaaaaa gcctgattaa agagtttctg cctgttaaaa 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2599 <210〉 <211〉 <212〉 <213〉 <400〉

Met Ser Gly Arg Arg Thr Arg Ser Gly Gly Ala Ala Gin Arg Ser Gly 15 10 15

Pro Arg Ala Pro Ser Pro Thr Lys Pro Leu Arg Arg Ser Gin Arg Lys 20 25 30

Ser Gly Ser Glu Leu Pro Ser lie Leu Pro Glu lie Trp Pro Lys Thr 35 40 45

Pro Ser Ala Ala Ala Val Arg Lys Pro lie Val Leu Lys Arg lie Val 50 55 60

Ala His Ala Val Glu Val Pro Ala Val Gin Ser Pro Arg Arg Ser Pro 65 70 75 80

Arg lie Ser Phe Phe Leu Glu Lys Glu Asn Glu Pro Pro Gly Arg Glu 85 90 95 8 201138806

Leu Thr Lys Glu Asp Leu Phe Lys Thr His Ser Val Pro Ala Thr Pro 100 105 110

Thr Ser Thr Pro Val Pro Asn Pro Glu Ala Glu Ser Ser Ser Lys Glu 115 120 125

Gly Glu Leu Asp Ala Arg Asp Leu Glu Met Ser Lys Lys Val Arg Arg 130 135 140

Ser Tyr Ser Arg Leu Glu Thr Leu Gly Ser Ala Ser Thr Ser Thr Pro 145 150 155 160

Gly Arg Arg Ser Cys Phe Gly Phe Glu Gly Leu Leu Gly Ala Glu Asp 165 170 175

Leu Ser Gly Val Ser Pro Val Val Cys Ser Lys Leu Thr Glu Val Pro 180 185 190

Arg Val Cys Ala Lys Pro Trp Ala Pro Asp Met Thr Leu Pro Gly Ile 195 200 205

Ser Pro Pro Pro Glu Lys Gin Lys Arg Lys Lys Lys Lys Met Pro Glu 210 215 220

Ile Leu Lys Thr Glu Leu Asp Glu Trp Ala Ala Ala Met Asn Ala Glu 225 230 235 240

Phe Glu Ala Ala Glu Gin Phe Asp Leu Leu Val Glu 245 250 <210〉 22 <211〉 22 〈212〉 DNA <213〉人工 <220〉 〈223>人工序列 <400> 22 gtctaccagg cattcgcttc at 22 9 201138806 <210〉 23 <211〉 <212> <213> 24 DNA 人工 <220〉 <223〉 人工序列 〈400〉 23 tcagctggac cacagccgca gcgt 24 <210〉 24 <211〉 〈212〉 <213> 21 DNA 人工 <220> <223〉 人工序列 <400〉 24 tcagaaatcc tttctcttga c 21 <210〉 25 <211> <212〉 <213> 24 DNA 人工 <220〉 <223> 人工序列 <400〉 25 ctagcctctg gaatcctttc tctt 24 10

Claims (1)

1. 201138806 七、申請專利範圍： 1 · 一種經分離的胜肽，係由序列辨識號：2丨之胺基酸 序列或一其免疫活性片段所組成，其中該胜肽與一人類白 血球組織抗原結合且誘發細胞毒殺性τ淋巴球。 2.如申請專利範圍第丨項所述之經分離的胜肽，其中 該人類白血球組織抗原為人類白血球組織抗原_A2。 3 ·如申請專利範圍第1或2項所述之經分離的胜肽， 其中該胜肽包括一胺基酸序列，係擇自由序列辨識號：2 至1 9所組成之群組。 4_ 一種經分離的胜肽’係擇自由下列所組成之群組： (a) 一種經分離的胜肽’其與一人類白血球組織抗原 結合且誘發細胞毒殺性T淋巴球且係由序列辨識號：21之 胺基酸序列或一其免疫活性片段所組成， (b) (a)之該經分離的胜肽’其中該人類白血球組織 抗原為人類白血球組織抗原-A2，與 (c) (a)或（b)之該經分離的胜肽，其包括一胺基酸序 列，擇自由序列辨識號：2至19所組成之群組， (d) (a)或（b)之該經分離的胜肽，其中該胜肽包括一 胺基酸序列，擇自由序列辨識號：2至19所組成之群組， 其中1、2或數個胺基酸被取代、刪除、插入或加入，提供 維持該原始胜狀的細胞毒殺性T淋巴球誘發能力的該經修 飾之胜肽。 5.如申請專利範圍第4項所述之經分離的胜肽，其由 一胺基酸序列所組成，該胺基酸序列擇自由序列辨識號：2 201138806 至1 9所組成之群組，其中該胜肽具有 者. Γ幻特徵之一或兩 (a) 來自N端之第二個胺基酸為擇 伟目由白胺酸或曱 硫丁胺酸所組成之群組；以及 (b) C端胺基酸為擇自由㈣酸或白胺酸所組成之群 組。 6·如申請專利範圍第丨至5項之 項所述之經分離 的胜狀，其中該胜肽為九胜肽或十胜肽。 7. —種經分離之多核苷酸，其編确ψ ^ ^ ，、、兩碼出如申請專利範圍 第1至6項之任一項所述的胜肽。 8. —種誘發細胞毒殺性τ淋巴球之組合物其中該組 合物包括如申請專利範圍第丨至6項之任一項所述之一或 多個該胜肽，或如申請專利範圍第7項所述之一或多個該 多核苷酸。 9. 一種藥學組合物，用於癌症之治療及/或預防，及/ 或其手術後復發的避免，其中該組合物包括如申請專利範 圍第1至6項之任一項所述之一或多個該胜肽，或如申請 專利祀圍第7項所述之一或多個該多核芽酸。 10. 如申請專利範圍第9項所述之藥學組合物，其中該 組合物被配製來用於投予一個體，其人類白血球組織抗原 為人類白血球組織抗原—A2。 11. 如申請專利範圍第9或10項所述之藥學組合物， 其中該組合物被配製來用於癌症之治療。 12. —種誘導具有細胞毒殺性τ淋巴球誘發能力之抗 2 201138806 原呈現細胞的方法，包括擇自由下列所組成之群組的—步 驟： (a) ^以’斤〇、a Wfo或“ 叩將一抗原呈現細 胞與如申請專利範圍第丨至6項之任一項所述之胜肽接 觸；以及 (b) 將編碼出如申請專利範圍第1至6項之任一項所 述之胜肽的一多核苷酸引入一抗原呈現細胞。 13. —種誘導細胞毒殺性T淋巴球的方法’包括擇自由 下列所組成之群組的一步驟： (a) 將CD8陽性T細胞與抗原呈現細胞共培養，抗原 呈現細胞表現一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第 1至6項之任一項所述之胜肽的複合物於其表面上； (b) 將CD8陽性T細胞與外吐小體共培養，外吐小體 表現一人類白血球組織抗原與如申請專利範圍第1至6項 之任一項所述之胜肽的複合物於其表面上；以及 (c) 將一包括編碼出一 T細胞受體次單元多胜肽之 多核普酸的基因引入一 T細胞，該T細胞受體次單元多胜 月大與如申請專利範圍第1至6項之任一項所述的胜肽結合。 14·—種經分離之抗原呈現細胞，其表現一人類白血球 組織抗原與如申請專利範圍第1至6項之任一項所述之胜 狀的複合物於其表面上。 15, 如申請專利範圍第14項所述之抗原呈現細胞，其 藉由如申請專利範圍第12項所述之方法來誘導。 16. —種經分離之細胞毒殺性τ淋巴球，其以如申請專 201138806 矛J跑圍第1至6項之任一項所述之胜狀為標的。 1 7 ·如申請專利範圍第16項所述之細胞毒殺性τ淋巴 球’其t該細胞毒殺性τ淋巴球藉由如申請專利範圍第！ 3 項所述之方法來誘導。 ’ 18. —種於一需要個體中誘導一抗癌症之免疫反應的 方法’該方法包括投予該個體一組合物的一步驟，該組合 物包括如申請專利範圍第1至6項所述之胜肽、一其免疫 活性片段’或編碼出該胜肽或該片段之一多核苷酸。 19. 一種抗體或其免疫活性片段，其抗如申請專利範圍 第1至6項所述之任何胜肽。 20. —種載體，包括編碼出如申請專利範圍第1至6項 所述之任何胜肽的一核苷酸序列。 21. —種宿主細胞，其被以如申請專利範圍第2〇項所 述之一表現載體所轉形或轉染。 2 2. —種診斷套組’包括如申請專利範圍第1至6項所 述之任何胜肽、如申請專利範圍第7項所述之核苷酸或如 申請專利範圍第1 9項所述之抗體。 23.如申請專利範圍第1至6項之任一項所述之經分離 的胜肽’其包括一胺基酸序列，擇自由序列辨識號：6、9 與16所組成之群組。 4