TW201132353A - WISE binding agents and epitopes - Google Patents

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Michelle Hortter
Kevin Graham
Mei-Mei Tsai
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Description

201132353 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明一般係關於WISE蛋白（包括人類WISE蛋白）之抗 原決定基，及能夠結合於WISE或其中之抗原決定基的結 合劑（諸如抗體）。 本申明案主張2009年12月18曰申請之美國臨時申請案第 6 1/288,171號的權益，該臨時申請案以引用的方式併入本 文中。 本申請案與電子格式之序列表一起歸檔。序列表以2〇1〇 年12月1日創建之喊為a_i 532-WO-PCT一 SeqList.txt的文標 提供，大小為86.5 KB。電子格式之序列表的資訊以全文 引用的方式併入本文中。 【先前技術】 纖維化一般定義為作為癒合過程之部分產生額外結缔組 織且包括各種症狀。過度纖維化為幾乎無治療選擇的嚴重 問題。 含有胱胺酸結之蛋白質通常為具有關鍵功能之重要調控 劑且影響各種細胞類型。Wise(USAG_i，s〇STDCl)為分 泌之含有胱胺酸結之蛋白質且主要表現於腎臟、肺、皮膚 及上皮細胞中。WISE KO小鼠具有生殖能力且其腎臟具有 正常功能。然而，當藉由單側輸尿管阻塞（uu〇)或注射化 學毒性劑順鉑（Cisplatin)攻毒產生腎臟損傷時，WISE κ〇 小鼠受到保護（Yanagita等人，j. Clin Invest 2〇〇6年i月4 曰；116(1): 70-79)。在UUO模型中，WISE κο小鼠之受影 152973.doc 201132353 響腎臟中的纖維化少得多，且表現少得多的aSMA(成肌纖 維細胞活化之標誌物），且保持上皮細胞標誌物E_鈣黏素 之表現。在腎臟損傷之順鉑模型中，WISE缺失保護動物 以免腎小管損傷（tubular injury)且降低死亡率（Tanaka等 人 ’ Kidney International advance online publication 2007 年10月17日）。此外’當WISE KO小鼠（aka USAG-1 KO小 鼠）與Col4a3 KO小鼠繁殖時，雙重基因剔除小鼠相對於具 有WT WISE基因之C〇14a3 ΚΟ小鼠具有顯著較少之蛋白尿 且產生較少末期腎病。在4週大時，USAG-1+/+、3(IV)-/-小鼠已顯示嚴重蛋白尿且腎小球基底膜（GBM)大規模分 裂’而雙重KO小鼠顯示正常結構之GBM »在10週大時， USAG-1+/+、3(IV)-/-小鼠產生末期腎病，而雙重κ〇小鼠 顯示顯著保持之腎功能且具有較少腎臟組織學改變。 (Tanaka 等人，J c/ζ” /«ναί· 2010;120(3):768-777 及 Abstract TH-FC059 2008 ASN meeting)。 此等資料表明WISE可能為成年人腎功能之調控劑。然 而’此等研究限於在整個發育週期中缺乏WISE之基因剔 除小鼠，因此不可預測使用諸如抗體之抑制劑短期抑制 WISE活性是否提供在與各種纖維變性疾病相關之病理狀 況下保持腎功能的治療益處。 本發明者證明可能使用靶向WISE之結合劑治療與損壞 及修復有關之肺病症及腎臟病症，包括纖維化及器官功能 障礙。 【發明内容】 152973.doc 201132353 本文揭示可用於預防或治療疾病及病症之組合物及方 月另外係關於由本文揭示之結合劑辨識之人類 WISE的區，&用此等區之方法及製造該等區之方法。本 心月亦係關於對識別為胱胺酸結結構域之WIS£區具特異 性之抗原決定基，及特異性結合於彼區之結合劑。 本發明係關於特異性結合於WISE之結合劑（諸如抗體卜 結合劑特徵為其交叉阻斷至少一種本文揭示之抗體與 WISE之結合及/或由至少一種該等抗體交叉阻斷與之 結合的能力。本發明之抗體及其他結合劑的特徵亦為在如 本文所揭示之人類WISE肽抗原決定基競爭結合檢驗中與 人類WISE肽之結合模式。 在某些實施例中’本發明係關於抑制Wise活性且可降 低諸如腎臟、肺、皮膚、眼睛、肝臟及心臟之組織中的組 織損傷及相關纖維化之結合劑（諸如抗體）。此外，本發明 係關於抑制蛋白尿或蛋白尿誘發之損傷（例如纖維化）之結 合劑’該等病症與諸如患有糖尿病性腎病變、腎小球腎 炎、膜性腎病變、狼瘡、移植及涉及表現提高之蛋白尿之 其他腎病之患者中的各種免疫學及非免疫介導之腎病有 關。此外，本發明係關於改善器官功能或延遲上文所述之 器官的功能損失之結合劑，該等功能損失由纖維化及/或 蛋白尿影響’包括（但不限於）諸如慢性腎臟疾病、慢性同 種異體移植腎病變、特發性肺纖維化、心肌症、青光眼 (透鏡狀細胞纖維化）及硬皮病（皮膚纖維化）之疾病。此 外’因為腫瘤轉移亦使用與組織纖維化中所用機制類似之 152973.doc 201132353 機制，所以WISE結合劑亦可具有延遲腫瘤轉移及/或癌症 進展之效用。 在其他實施例中，本發明係關於可在基於細胞之檢驗中 阻斷WISE之抑制作用之結合劑（諸如抗體）。本發明亦係關 於可在基於細胞之檢驗中改變WISE之作用的結合劑（諸如 抗體）。本發明亦係關於可在基於細胞之檢驗中活化WISE 之作用的結合劑（諸如抗體）。 本發明另外係部分關於包含由至少一個二硫鍵連接之兩 個、三個或四個多肽片段且表示WISE之胱胺酸結的核心 區之多肽構築體，及能夠與其特異性結合之抗體。 在一實施例中，本發明係關於獲得適用作在哺乳動物中 產生結合劑（諸如能夠特異性結合於WISE之抗體）之免疫原 的抗原決定基之方法；在某些實施例中，產生之結合劑能 夠活體外及/或活體内中和WISE活性。 在另一實施例中，本發明係關於投與動物時引發對 WISE具特異性之抗體的組合物，該組合物包含具有選自 (但不限於）下表中之一種序列之序列的多肽： 表1
SeqldNo.·· 1
ATGCTTCCTCCTG CCATTCATTT CTATCTCCTT CCCCTTGCAT GCATCCTAAT GAAAAGCTGT TTGGCTTTTA AAAATGATGC CACAGAAATC CTTTATTCAC ATGTGGTTAA ACCTGTTCCA GCACACCCCA GCAGCAACAG CACGTTGAAT CAAGCCAGAA ATGGAGGCAG GCATTTCAGT AACACTGGAC TGGATCGGAA CACTCGGGTT CAAGTGGGTT GCCGGGAACT GCGTTCCACC AAATACATCT CTGATGGCCA GTGCACCAGC ATCAGCCCTC TGAAGGAGCT GGTGTGTGCT GGCGAGTGCT TGCCCCTGCC AGTGCTCCCT AACTGGATTG GAGGAGGCTA TGGAACAAAG TACTGGAGCA GGAGGAGCTC CCAGGAGTGG CGGTGTGTCA 152973.doc 201132353 ATGACAAAAC CCGTACCCAG AGAATCCAGC TGCAGTGCCA AGATGGCAGC ACACGCACCT ACAAAATCAC AGTAGTCACT GCCTGCAAGT GCAAGAGGTA CACCCGGCAG CACAACGAGT CCAGTCACAA CTTTGAGAGC ATGTCACCTG CCAAGCCAGT CCAGCATCAC AGAGAGCGGA AAAGAGCCAG CAAATCCAGC AAGCACAGCA TGAGTTAGCT CGAGGGGCGG ATCCCCCGGG CTGCAGGAAT TCGATATCAA GCTTGCTAGC Seq Id No.: 2 MLPPAIHFYL LPLACILMKS CLAFKNDATE ILYSHVVKPV PAHPSSNSTL NQARNGGRHF SNTGLDRNTR VQVGCRELRS TKYISDGOCT SISPLKELVC AGECLPLPVL PNWIGGGYGT KYWSRRSSOE WRCVNDKTRT ORIOLOCODG STRTYKITVV TACKCKRYTR QHNESSHNFE SMSPAKPVQH HRERKRASKS SKHSMS (人類） Seq Id No.: 3 ATGC TTCCTCCTGC CATTCATCTC TCTCTCATTCCCCTGCTCTG CATCCTGATG AGAAACTGTT TGGCTTTTAA AAATGATGCC ACAGAAATCCTTTATTCACA TGTGGTTAAA CCTGTCCCGG CACACCCCAG CAGCAACAGC ACCCTGAATCAAGCCAGGAA TGGAGGCAGG CATTTCAGTA GCACTGGACT GGATCGAAAC AGTCGAGTTCAAGTGGGCTG CAGGGAACTG CGGTCCACCA AATACATTTC GGACGGCCAG TGCACCAGCATCAGCCCTCT GAAGGAGCTG GTGTGCGCGG GCGAGTGCTT GCCCCTGCCG GTGCTTCCCAACTGGATCGG AGGAGGCTAT GGAACAAAGT ACTGGAGCCG GAGGAGCTCT CAGGAGTGGCGGTGTGTCAA CGACAAGACG CGCACCCAGA GGATCCAGCT GCAGTGTCAG GACGGCAGCACGCGCACCTA CAAAATCACC GTGGTCACGG CGTGCAAGTG CAAGAGGTAC ACCCGTCAGCACAACGAGTC CAGCCACAAC TTTGAAAGCG TGTCGCCCGC CAAGCCCGCC CAGCACCACAGAGAGCGGAA GAGAGCCAGC AAATCCAGCA AGCACAGTCT GAGCTAGCTC GAG Seq Id No.: 4 MLPPAIHLSL IPLLCILMRN CLAFKNDATE ILYSHVVKPV PAHPSSNSTL NQARNGGRHF SSTGLDRNSR VQVGCRELRS TKYISDGQCT SISPLKELVC AGECLPLPVL PNWIGGGYGT KYWSRRSSQE WRCVNDKTRT QRIQLQCQDG STRTYKITVV TACKCKRYTR QHNESSHNFE SVSPAKPAQH HRERKRASKS SKHSLS (小鼠） Seq Id No.: 5 ATGCT TCCTCCTGCC ATTCATCTCT CTCTCATTCC CCTGCTCTGCATCCTGATGA AAAACTGTTT GGCTTTTAAA AATGATGCCA CAGAAATCCT TTATTCACATGTGGTTAAAC CTGTTTCAGC ACACCCCAGC AGCAACAGCA CCTTGAATCA AGCCAGGAATGGAGGCAGGC ACTTCAGTAG CACGGGACTG GATCGAAATA GTCGAGTTCA AGTGGGCTGCAGGGAACTGC 152973.doc 201132353
GGTCCACCAA ATACATCTCG GATGGCCAGT GCACCAGCAT CAGCCCTCTGAAGGAGCTGG TGTGCGCGGG TGAGTGCTTG CCCTTGCCAG TGCTTCCCAA CTGGATCGGAGGAGGCTACG GAACAAAGTA CTGGAGCCGG AGGAGCTCCC AGGAGTGGCG GTGTGTCAACGACAAGACGC GCACCCAGAG AATCCAGCTG CAGTGTCAGG ACGGCAGCAC ACGCACCTACAAAATCACCG TGGTCACAGC GTGCAAGTGC AAGAGGTACA CCCGGCAGCA CAACGAGTCCAGCCACAACT TTGAAAGCGT GTCTCCCGCC AAGCCCGCCC AGCACCACAG AGAGCGGAAGAGAGCCAGCA AATCCAGCAA GCACAGTCTG AGCTAGGCGG CCGC Seq Id No.: 6 MLPPAIHFYL LPLACILMKS CLAFKNDATEILYSHVVKPV PAHPSSNSTM NQARNGGRHF SNTGLDRNTR VQVGCRELRS TKYISDGQCT SISPLKELVC AGECLPLPVL PNWIGGGYGT KYWSRRSSQE WRCVNDKTRT QRIQLQCQDG STRTYKITVV TACKCKRYTR QHNESSHNFE SMSPAKPVQH HRERKRASKS SKHSMS (大鼠） Seq Id No.: 7 ATGCT TCCTCCTGCC ATTCATCTCT CTCTCATTCC CCTGCTCTGCATCCTGATGA AAAACTGTTT GGCTTTTAAA AATGATGCCA CAGAAATCCT TTATTCACATGTGGTTAAAC CTGTTTCAGC ACACCCCAGC AGCAACAGCA CCTTGAATCA AGCCAGGAATGGAGGCAGGC ACTTCAGTAG CACGGGACTG GATCGAAATA GTCGAGTTCA AGTGGGCTGCAGGGAACTGC GGTCCACCAA ATACATCTCG GATGGCCAGT GCACCAGCAT CAGCCCTCTGAAGGAGCTGG TGTGCGCGGG TGAGTGCTTG CCCTTGCCAG TGCTTCCCAA CTGGATCGGAGGAGGCTACG GAACAAAGTA CTGGAGCCGG AGGAGCTCCC AGGAGTGGCG GTGTGTCAACGACAAGACGC GCACCCAGAG AATCCAGCTG CAGTGTCAGG ACGGCAGCAC ACGCACCTACAAAATCACCG TGGTCACAGC GTGCAAGTGC AAGAGGTACA CCCGGCAGCA CAACGAGTCCAGCCACAACT TTGAAAGCGT GTCTCCCGCC AAGCCCGCCC AGCACCACAG AGAGCGGAAGAGAGCCAGCA AATCCAGCAA GCACAGTCTG AGCTAGGCGG CCGC Seq Id No.: 8 MLPPAIHLSLIPLLCILMKN CLAFKNDATE ILYSHVVKPV SAHPSSNSTL NQARNGGRHF SSTGLDRNSR VQVGCRELRS TKYISDGQCT SISPLKELVC AGECLPLPVL PNWIGGGYGT KYWSRRSSQE WRCVNDKTRT QRIQLQCQDG STRTYKITVV TACKCKRYTR QHNESSHNFE 181 SVSPAKPAQH HRERKRASKS SKHSLS* (石蟹獮猴） Seq Id No.: 9 LPLPVLPNWIGGGYGTK 在其他實施例中，本發明亦係關於投與動物時引發對 152973.doc 201132353 WISE具特異性之抗體的組合物，該組合物包含至少一種 基本上由人類、小鼠 '大鼠或石蟹獼猴WISE之胺基酸序 列組成的多肽。 熟習此項技術者應理解，表丨十所列iWlSE蛋白為各別 物種之全長蛋白質序列且進行進一步處理以供分泌。在特 定實施例中，信號肽為前23個胺基酸（Seq Id N〇 : 2、4、6 及8)且移除信號肽會產生成熟多肽。在特定實施例中，本 發明亦係關於基本上由上文表丨所示之成熟贾13£之胺基酸 82至109(亦例如在Seq Id N〇: 9中描繪）組成的多肽；此多 肽在本文中稱為WISE環2多肽，可藉由蛋白質片段之重組 表現、人類WISE之胰蛋白酶消化、或化學合成獲得，且 蛋白質可藉由尤其HPLC部分分離來分離。合成之肽可為 線性或環化形式。若肽藉由重組表現產生，則其可融合至 其他載體蛋白，諸如Fc片段或人類血清白蛋白或將增加之 其他蛋白質。 在一實施例中’本發明係關於產生能夠特異性結合於 WISE之抗體的方法，其包含：（a)以包含WISE多肽之組a 物使動物免疫；（b)自動物收集血清；及（c)自企清分離能 夠特異性結合於WISE且抑制WISE之生物活性的抗體，其 中該抗體特異性結合於WISE之環2。 在另一實施例中’本發明進一步涵蓋使用噬菌體呈現選 擇結合於WISE環2之抗體，及/或使用噬菌體呈現提高已知 抗體對WISE之親和力的方法。 在額外實施例中，本發明亦係關於產生能夠特異性、纟士人 152973.doc 201132353 於WISE之抗體的方法，該方法包含：（a)以包含含有胱胺 酸結之WISE片段（例如Seq Id No. 9)或其衍生物之組合物 使動物免疫；（b)自動物收集血清；及（c)自血清分離能夠 特異性結合於WISE且抑制WISE之生物活性的抗體。 在其他實施例中，本發明另外係關於偵測生物樣品中之 抗WISE抗體之方法，其包含以下步驟：（a)在允許抗體與 多肽之間形成複合物之條件下使生物樣品與基本上由具有 SEQ ID NO: 2之胺基酸24至206的多肽、具有SEQ ID NO: 4之胺基酸24至206的多肽、具有SEQ ID NO: 6之胺基酸24 至206的多肽、具有SEQ ID NO: 8之胺基酸24至206的多 肽、及諸如SEQ ID NO: 9之肽組成之多肽接觸；及（b)偵測 複合物是否存在，其中存在複合物指示生物樣品含有抗 WISE抗體。 在其他實施例中，本發明包含偵測生物樣品中之抗 WISE抗體之方法，其包含以下步驟：（a)在允許抗體與多 肽之間形成複合物的條件下使生物樣品與包含含有胱胺酸 結之WISE片段的組合物接觸；及（b)偵測是否存在複合 物，其中存在複合物指示生物樣品含有抗WISE抗體。 在某些實施例中，本發明係關於交叉阻斷至少一種本發 明抗體之結合的WISE結合劑（諸如抗體）。本發明抗體包括 結合於WISE多肽之環2的抗體。表2中包括環2結合抗體之 實例，其中描繪結合於WISE蛋白之環2之抗體的可變區。 在其他實施例中，本發明係關於交叉阻斷表2中至少一種 抗體與WISE蛋白之結合的WISE結合劑（諸如抗體）。 152973.doc -10- 201132353 表2 :
SEQUENCE ID NO.: 10 Ab-AA 輕鏈 GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAG CAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTC TGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCA GCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCA TCCACTAGGCAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTG GATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGC TGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTC CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA SEQUENCE ID NO·: 11 Ab-AA 輕鏈 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQ KPGQSPKLLIYWASTRQSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLA VYYCKQSYNLLTFGAGTKLELK SEQUENCE ID NO.: 12 Ab-AA 重鏈 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCA GGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACA TTAAAGACTACTATATACACTGGATGAAGCAGAGGCCTGAAC AGGGCCTCGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTG ATACTGAATCTGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGAC TGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCACCTCAGCAGC CTGACATTTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTAATGCAGAAG GTTACGGTAGTAGGCACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGG GACCACGGTCACCGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO.: 13 Ab-AA 重鏈 EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWMKQRPEQG LEWIGWIDPENGDTESAPKFQGKATMTADTSSNTAYLHLSSLTFE DTAVYYCNAEGYGSRHWYFDVWGAGTTVTVSS SEQUENCE ID NO.: 14 Ab-AB 輕键 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTG TGGGAGAAACCATCACCATCACATGTCAAGCAAGTGAGAACA TTTACTTCAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCAAGGGAAATC TCCTCAGCTCCTGATCTATAATGCAAACAACTTGGAAGATGGT GTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTATT CTATGAAGATCAACAACATGCAGCCTGAAGATACTGCAACTTA TTTCTGTAAAGAGGCTTATGACTCTCCATTCACGTTCGGCACG GGGACAAAATTGGAAATAAAA 152973.doc -11 - 201132353
SEQUENCE ID NO.: 15 Ab-AB 輕鏈 DIQMTQSPASLAASVGETITITCQASENIYFSLAWYQQKQGKSPQL LIYNANNLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINNMQPEDTATYFCKE AYDSPFTFGTGTKLEIK SEQUENCE ID NO.: 16 Ab-AB 重鏈 GAAATTCAACTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGACAAGGCCTG GGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTT TACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACA GGGTCTGGAATGGATTGGCGCTCTTTATCCTGGAAATAGTGTT ACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACT GCAGTCACATCCACCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCC TGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTACAAGAGGATT TCTTACTGCGCCCTACTTTGACTCCTGGGGCCAAGGCACCACT CTCACAGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO.: 17 Ab-AB 重鍵 EIQLQQSGTVLTRPGASVKMSCKTSGYTFTSYWMHWVKQRPGQ GLEWIGALYPGNSVTNYNQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELSSLT NEDSAVYYCTRGFLTAPYFDSWGQGTTLTVSS SEQUENCE ID NO.: 18 Ab-AC 輕鏈 GACATTGTGGTGTCACAGGCTCCATCCTCCCTTGCTGTGTCAGT TGGAGAGAAGATTATTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTT TTACACAGCAGCAATCGAAGGAACTACTTGGCCTGGTACCAAC AGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAATTGCTGATTTCCTGGGCATC CATTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGA TCCGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCGTGAAGACTG AAGACCTGGCAATTTATTACTGTCACCAATATTATACTTATTCC ACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAG SEQUENCE ID NO.: 19 Ab-AC 輕鏈 DIVVSQAPSSLAVSVGEKIIMSCKSSQSLLHSSNRRNYLAWYQQK PGQSPKLLISWASIRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAIY YCHQYYTYSTFGAGTKLELK SEQUENCE ID NO.: 20 Ab-AC 重鏈 CAGGTTACTCTAAAAGAGTCTGGCCCTGAGATACTGCAGCCCT CCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCGTTCTCTGGGTTTTCACTG ACCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAG GAGGGAGTCTGGAATGGCTGGCTCACATTTTCTGGGATGATGA CAAGCGGTATAATCCATCCCTGACGAGTCGACTCACAATCTCC AAGGATGCCCCCAGAAACCAGGTTTTCCTCAAAATCACCAGTG TGGACACTGCAGATGCTGCCACATATTACTGTGCTCGAGGAGG AGATTATTACAGTACTGGATTTGGCTTTGATTACTGGGGCCAA GGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA 152973.doc -12- 201132353
SEQUENCE ID NO.: 21 Ab-AC 重鏈 QVTLKESGPEILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTSGMGVSWIRQPSGGSL EWLAHIFWDDDKRYNPSLTSRLTISKDAPRNQVFLKITSVDTADA ATYYCARGGDYYSTGFGFDYWGQGTLVTVSA SEQUENCE ID NO.: 22 Ab-AD 輕鏈 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCCTCCCTGGCTGCATCTG TGGGAGAATCCATCACCATCACATGTCAGGCAAGTGAGAACA TTTACTTCAGTTTAGCATGGTATCAGCAGAAGCAAGGGAGGTC TCCTCAGCTCCTGATCTATCATGCAAAAAGTTTGGAAGATGGT GTCCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGGACACAGTATT CTATGAAGATCAACAGCATGCAGCCTGAAGATACTGCAACTTA TTTCTGTAAACAGGCTTATGACCATCCATTCACGTTCGGCACG GGGACAAAATTGGAAATGAAA SEQUENCE ID NO·: 23 Ab-AD 輕鏈 DIQMTQSPASLAASVGESITITCQASENIYFSLAWYQQKQGRSPQL LIYHAKSLEDGVPSRFSGSGSGTQYSMKINSMQPEDTATYFCKQA YDHPFTFGTGTKLEMK SEQUENCE ID NO·: 24 Ab-AD 重鏈 GAGGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGACTGTGCTGGCAAGGCCTG GGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGTAAGGCTTCTGGCTACACCTT TACCAGCTACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACA GGGTCTGGAATGGATTGTCGCTATTTATCCTGGAAATAGTGAT ACTAACTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACT GCAGTCACATCCACCAGCACTGCCTACATGGAACTCAACAGCC TGACAAATGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGTAAGAGGATT TATTACTGCGCCCTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACT CTCACAGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO.: 25 Ab-AD 重鍵 EVQLQQSGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPG QGLEWIVAIYPGNSDTNYNQKFKGKAKLTAVTSTSTAYMELNSL TNEDSAVYYCVRGFITAPYFDYWGQGTTLTVSS SEQUENCE ID NO.: 26 Ab-AE 輕鏈 GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAG CAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTC TGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCA GCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCA TCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTG GATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGC TGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTT CCGACGTTCGGTGGAGGCACCAGGCTGGAAATCAAA 152973.doc -13- 201132353
SEQUENCE ID NO. :27 Ab-AE 輕鍵 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQ KPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLA VYYCKQSYNLPTFGGGTRLEIK SEQUENCE ID NO.:28 Ab-AE 重鏈 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCA GGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACA TTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAAC AGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAAAATGGTG ATACTGAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGAC TGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGC CTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTTTTACTGTAATTTCTATGA TGTTTACTCCGAGGGGACTATGGCCTACTGGGGTCAAGGAACC TCAGTCACCGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO. :29 Ab-AE 重鍵 EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQ GLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLT SEDTAVFYCNFYDVYSEGTMAYWGQGTSVTVSS SEQUENCE ID NO.: 30 Ab-AF 輕鏈 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTG TGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTGGAGCAAGTGAGAATA TTTACGGTGCTTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATC TCCTCAGGTCCTGATCTATGGTGCAACCAACTTGGCAGATGGC ATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATT CTCTCAAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAATGTA TTACTGTCAAAATGTGTTCAGTAGTCCGCTCACGTTCGGTGCT GGGACCAAGCTGGAGCTGAAA SEQUENCE ID NO.: 31 Ab-AF 輕鏈 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGALNWYQRKQGKSPQ VLIYGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLKISSLHPDDVAMYYCQ NVFS SPLTFGAGTKLELK SEQUENCE ID NO. :32 Ab-AF 重鏈 CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTG GAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTT CACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAA GGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGA GCCAACATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCT TTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTGTTTGGAGATCAACAACC TCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTTCTTTAACTGG GTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA 152973.doc -14- 201132353
SEQUENCE ID NO.: 33 Ab-AF 重鏈 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKG LKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTACLEINNLKNE DTATYFCSLTGYWGQGTSVTVSS SEQUENCE ID NO.: 70 Ab-AG 輕鏈 GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTG TGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTGGAGCCAGTGAGAATA TTTACGGTGCTTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATC TCCTCAGCTCCTGATCTTTGGTGCAACCAACTTGGCAGATGGC ATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATT CTCTCGAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAACGTA TTACTGTCAAAATTTATTTAATTCTCCGCTCACATTCGGTGCTG GGACCAAGCTGGACCTGAAA SEQUENCE ID NO.: 71 Ab-AG 輕鏈 DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGALNWYQRKQGKSPQ LLIFGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYSLEISSLHPDDVATYYCQN LFNSPLTFGAGTKLDLK SEQUENCE ID NO. :72 Ab-AG 重鏈 CAGATCCAGTTGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTG GAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTT CACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAA GGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGA GCCAACATATGCAGCTGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCT TTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACC TCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTACTTTAACTGG GTACTGGGGTCAGGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO.: 73 Ab-AG 重鏈 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWYKQAPGKG LKWMGWINTETGEPTYAADFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKN EDTATYFCTLTGYWGQGTSVTVSS SEQUENCE ID NO·: 74 Ab-AH 輕鏈 GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAG CAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTC TGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCA GCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCA TCCACTAGGAAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCATAGGCAGTG GATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTAGCAGTGTGCAGGC TGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCAAGCAATCTTATAATCTC GTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA 152973.doc 15- 201132353
SEQUENCE IDNO_: 75 Ab-AH 輕鏈 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQ KPGQSPKLLIYWASTRKSGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLA VYYCKQSYNLVTFGAGTKLELK SEQUENCE ID NO.: 76 Ab-AH 重鏈 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCA GGGGCCTCAGTCAGGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACA TTAAAGACTTCTATATGCACTGGTTGAAGCAGAGGCCTGAACA GGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTGAT ACTGAGTCTGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGACTG CAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCT GACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTGCTGTAATGCAGAAGGC TACGATAATAGCCACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCAGGGA CCACGGTCACCGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO.: 77 Ab-AH 重鏈 EVQLQQSGAELVRSGASVRLSCTASGFNIKDFYMHWLKQRPEQG LEWIGWIDPENGDTESAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSE DTAVYCCNAEGYDNSHWYFDVWGAGTTVTVSS SEQUENCE ID NO. :78 Ab-AI 輕鏈 GACATTGTGGTGTCACAGGCTCCATCCTCCCTTGCTGTGTCAGT TGGAGAGAAGATTATTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGCCTT TTACACAGCAGCAATCAAAGGAACTACTTGGCCTGGTACCAAC AGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATTTCCTGGGCATC CATTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGA TCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCGTGAAGACTG AAGACCTGGCAGTTTATTATTGTCACCAATATTATAGTTATTCC ACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAG SEQUENCE ID NO.: 79 Ab-AI 輕鍵 DIVVSQAPSSLAVSVGEKIIMSCKSSQSLLHSSNQRNYLAWYQQK PGQSPKLLISWASIRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKTEDLAVY YCHQYYSYSTFGAGTKLELK SEQUENCE ID NO.:80 Ab-AI 重鏈 CAGGTTACTCTAAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCT CCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTG ACCACTTCTGGTATGGGTGTGAGCTGGATTCGTCAGCCTTCAG GAGGGAGTCTGGAATGGCTGGCACACATTTTCTGGGATGATGA CAAGCGCTATAATCCATCCCTGACGAGCCGACTCACAATCTCC AAGGATGCCTCCAGAAACCAGGTTTTCCTCAAGATCAGCAGTG TGGACACTGCAGACGCTGCCACATACTACTGTGCTCGAGGAGG AGATTACTACAGTACTGGATTTGGCTTTGATTACTGGGGCCAA GGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA 152973.doc 16- 201132353
SEQUENCE ID NO·: 81 Ab-AI 重鏈 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTSGMGVSWIRQPSGGS LEWLAHIFWDDDKRYNPSLTSRLTISKDASRNQVFLKISSVDTAD AATYYCARGGDYYSTGFGFDYWGQGTLVTVSA SEQUENCE ID NO.: 82 Ab-AJ 輕鏈 GACATTGTGATGTCACAGTCTCCATCCTCCCTGGCTGTGTCAG CAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAATCCAGTCAGAGTC TGCTCAACAGTAGAACCCGAAAGAACTACTTGGCTTGGTACCA GCAGAAACCAGGGCAGTCTCCTAAACTGCTGATCTACTGGGCA tccactagggaatctggggtccCtgatcgcttcacaggcagtg GATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGC TGAAGACCTGGCAGTTTATTATTGCAAGCAATCTTATAATCTT CCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA SEQUENCE ID NO.: 83 Ab-AJ 輕鏈 DIVMSQSPSSLAVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQQ KPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLA VYYCKQSYNLPTFGGGTKLEIK SEQUENCE ID NO·: 84 Ab-AJ 重鏈 GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCAGAGCTTGTGAGGTCA GGGGCCTCAGTCAAGTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACA TTAAAGACTACTATATGCATTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAAC AGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTG ATACTGAATATGCCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATGAC TGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGC CTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTAATTTCTATG ATGTTTACTCCGAGGGGGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAAC CTCAGTCACCGTCTCCTCA SEQUENCE ID NO.: 85 Ab-AJ 重鏈 EVQLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQ GLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLT SEDTAVYYCNFYDVYSEGALDYWGQGTSVTVSS 在本發明之某些實施例中，預期Seq Id No.: 11及13、 Seq Id No·: 15及 17、Seq Id No.: 19及 21、Seq Id No.: 23及 25、Seq Id No. 27及 29、Seq Id No. 31 及 33、Seq Id No. 71 及 73、Seq Id No. 75及 77、Seq Id No. 79及 81、以及 Seq Id No. 83及85中所描繪之多肽的可變域對為能夠結合人類 WISE之環2(Seq Id No·: 9)之結合域。如本文所用，如下特 I52973.doc -17- 201132353 定序列識別號中描繪之可變域包含能夠結合於WISE(Seq Id No.: 9)之重鏈及輕鏈，亦即Seq Id No.: 11及13稱為八1)-AA，Seq Id No.: 15及 17稱為 Ab-AB，Seq Id No·: 19及 21 稱為 Ab-AC，Seq Id No.: 23 及 25 稱為 Ab-AD，Seq Id No·: 27及 29稱為 Ab-AE，Seq Id No.: 31 及 33 稱為 Ab-AF，Seq Id No·: 71 及 73 稱為 Ab-AG，Seq Id No.: 75 及 77 稱為八!?-AH，Seq Id No.: 79 及 81 稱為 Ab-AI 以及 Seq Id No·: 83 及 85 稱為Ab-AJ。另外預期此等可變域之互補決定區可選殖至 抗體（例如IgG2)之人類構架區中，以保留Seq Id No. 9之結 合活性。 下表3中呈現表2中描繪之抗體可變域的CDR。 表3 :
Seq Id No. 34 KSSQSLLNSRTRKNYLA Seq Id No. 35 WASTRQS Seq Id No. 36 KQSYNLLT Seq Id No. 37 DYYIH Seq Id No. 38 WIDPENGDTESAPKFQG Seq Id No. 39 EGYGSRHWYFDV Seq Id No. 40 QASENIYFSLA Seq Id No. 41 NANNLED Seq Id No. 42 KEAYDSPFT Seq Id No. 43 SYWMH Seq Id No. 44 ALYPGNSVTNYNQKFKG Seq Id No. 45 GFLTAPYFDS Seq Id No. 46 KSSQSLLHSSNRRNYLA Seq Id No. 47 WASIRES Seq Id No. 48 HQYYTYST Seq Id No. 49 TSGMGVS 152973.doc -18- 201132353
Seq Id No. 50 HIFWDDDKRYNPSLTS Seq Id No. 51 GGDYYSTGFGFDY Seq Id No. 52 QASENIYFSLA Seq Id No. 53 HAKSLED Seq Id No. 54 KQAYDHPFT Seq Id No. 55 SYWMH Seq Id No. 56 AIYPGNSDTNYNQKFKG Seq Id No. 57 GFITAPYFDY Seq Id No. 58 KSSQSLLNSRTRKNYLA Seq Id No. 59 WASTRES Seq Id No. 60 KQSYNLPT Seq Id No. 61 DYYMH Seq Id No. 62 WIDPENGDTEYAPKFQG Seq Id No. 63 YDVYSEGTMAY Seq Id No. 64 GASENIYGALN Seq Id No. 65 GATNLAD Seq Id No. 66 QNVFSSPLT Seq Id No. 67 DYSMH Seq Id No. 68 WINTETGEPTYADDFKG Seq Id No. 69 TGY Seq Id No. 86 GASENIYGALN Seq Id No. 87 GATNLAD Seq Id No. 88 QNLFNSPLT Seq Id No. 89 DYSMH Seq Id No. 90 WINTETGEPTYAADFKG Seq Id No. 91 KSSQSLLNSRTRKNYLA Seq Id No. 92 WASTRKS Seq Id No. 93 KQSYNLVT Seq Id No. 94 DFYMH Seq Id No. 95 WIDPENGDTESAPKFQG Seq Id No. 96 EGYDNSHWYFDV Seq Id No. 97 KSSQSLLHSSNQRNYLA Seq Id No. 98 WASIRES Seq Id No. 99 HQYYSYST 152973.doc -19- 201132353
Seq Id No. 100 TSGMGVS Seq Id No. 101 HIFWDDDKRYNPSLTS Seq Id No. 102 GGDYYSTGFGFDY Seq Id No. 103 KSSQSLLNSRTRKNYLA Seq Id No. 104 WASTRES Seq Id No. 105 KQSYNLPT Seq Id No. 106 DYYMH Seq Id No. 107 WIDPENGDTEYAPKFQG Seq Id No. 108 YDVYSEGALDY 在某些實施例中，本發明抗體包括包含Seq Id No.: 34、 35及36以及Seq Id No.: 37、38及39中所示之互補決定區的 抗體。在某些實施例中，本發明抗體包括包含Seq Id No.: 40、41及42以及Seq Id No.: 43、44及45中所示之互補決定 區的抗體。在某些實施例中，本發明抗體包括包含Seq Id No·: 46、47及48以及Seq Id No_: 49、50及51中所示之互補 決定區的抗體。在某些實施例中，本發明抗體包括包含 Seq Id No·: 52、53 及 54以及 Seq Id No·: 55、56及 57 中所示 之互補決定區的抗體。在某些實施例中，本發明抗體包括 包含 Seq Id No.: 58、59及 60以及 Seq Id No.: 61、62及 63 中 所示之互補決定區的抗體。在某些實施例中，本發明抗體 包括包含 Seq Id No.: 64、65 及 66 以及 Seq Id No_: 67、68 及 69中所示之互補決定區的抗體。在某些實施例中，本發明 抗體包括包含 Seq Id No·: 86 ' 87及 88 以及 Seq Id No.: 89、 90及69中所示之互補決定區的抗體。在某些實施例中，本 發明抗體包括包含Seq Id No.: 91、92及93以及Seq Id No.: 94、95及96中所示之互補決定區的抗體。在某些實施例 中，本發明抗體包括包含Seq Id No.: 97、98及99以及Seq 152973.doc -20- 201132353
Id No··’ 100、101及102中所示之互補決定區的抗體。在某 些實施例中，本發明抗體包括包含Seq Id N〇 : 1〇3、1〇4及 105以及Seq IdNo.: 106、107及108中所示之互補決定區的 抗體。 本發明之WISE結合劑亦可由至少一種包含表2中所描繪 之可變域的抗體交叉阻斷與WISE之結合。本發明之WISE 結合劑亦可由表2中所描繪之至少一種抗體及/或包含由以 下例示之互補決定區的抗體交叉阻斷與WISE之結合：Seq
Id No·: 34、35 及 36 以及 Seq Id No.: 37、38 及 39 ; Seq Id No·: 40、41 及 42 以及 Seq Id No·: 43、44 及 45 ; Seq Id No·: 46、47及 48 以及 Seq Id No·: 49、50 及 51 ; Seq Id No.: 52、 53及 54以及 Seq Id No·: 55、56及 57 ; Seq Id No.: 58、59及 60以及 Seq Id No·: 61、62及 63 ; Seq Id No_: 64、65及 66以 及 Seq Id No.: 67、68 及 69 ; Seq Id No.: 86、87 及 88 以及 Seq Id No.: 89、90以及 69 ; Seq Id No.: 91、92及 93 以及 Seq Id No.: 94、95 及 96 ; Seq Id No·: 97、98 及 99 以及 Seq Id No.: 100、101 及 102 ;以及 Seq Id No·: 103、104及 105 以及 Seq Id No.: 106、107 及 108。 包含本文例示之抗體之互補決定區（CDR)的抗體包括編 碼 Seq Id No.: 34、35及 36以及 Seq Id No·: 37、38及 39 ; Seq Id No.: 40、41 及 42 以及 Seq Id No.: 43、44 及 45 ; Seq Id No.: 46、47及 48以及 Seq Id No.: 49、50及 51 ; Seq Id No·: 52、53 及 54 以及 Seq Id No·: 55、56 及 57 ; Seq Id No·: 58、59及 60以及 Seq Id No.: 61、62及 63 ; Seq Id No.: 64、 21 - 152973.doc 201132353 65及 66 以及 Seq Id No.: 67、68及 69 ; Seq Id No.: 86、87及 88 以及 Seq Id No.: 89、90及 69 ; Seq Id No.: 91、92及 93 以 及 Seq Id No.: 94、95 及 96 ; Seq Id No.: 97、98 及 99 以及 Seq Id No·: 100、101 及 102 ;或 Seq Id No·: 103、104及 105 以及Seq Id No.: 106、107及108中所示之CDR的核酸使用 習知分子生物學技術選殖至人類構架區中的人類化抗體。 此等序列之選殖中可對構架區進行或不進行額外修飾及/ 或對CDR進行額外改變。此等人類化抗體使用本文部分描 述之習知方法表現。本發明人類化抗體之實例包括描繪為 重鏈及輕鏈對之相應核酸序列如下表4中Seq Id No·: 110及 112、Seq Id No·: 114及 116、Seq Id No.: 118及 116、Seq Id No·: 114及 120、Seq Id No.: 118及 120、Seq Id No.: 122及 124、Seq Id No.: 126及 124、Seq Id No.: 122及 128、以及 Seq Id No.: 126及128所示的抗體。 表4 :
Seq Id No. 109 GATATCGTAATGACCCAGTCGCCTGACTCACTTGCGGTGTCC CTCGGGGAAAGAGCTACAATCAATTGCAAGTCAAGCCAGTC CTTGCTCAACAGCAGGACGCGAAAGAACTACTTGGCGTGGT ACCAGCAAAAGCCGGGACAACCGCCCAAGTTGCTGATCTAT TGGGCCTCAACGCGCGAGTCGGGGGTCCCAGACCGGTTCTCG GGTTCGGGATCCGGGACTGACTTCACGCTGACTATTTCGTCG TTGCAGGCAGAGGATGTCGCGGTGTATTACTGTAAACAGAG CTATAACCTTCCCACCTTTGGTGGCGGAACAAAAGTGGAAAT CAAA Seq Id No. 110 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSRTRKNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED VAVYYCKQSYNLPTFGGGTKVEIK Seq Id No. Ill CAGGTACAACTCGTGCAGAGCGGAGCCGAAGTCAAAAAGCC 152973.doc • 22- 201132353
CGGTGCGTCAGTGAAGGTATCGTGTAAGGCATCAGGGTTTAA CATCAAAGATTACTACATGCACTGGGTGAGGCAAGCTCCGG GCCAGGGGCTGGAGTGGATGGGGTGGATTGATCCAGAAAAT GGAGACACTGAGTATGCACCTAAGTTCCAGGGGAGAGTGAC GATGACAGCGGACACCTCGACGTCCACAGTGTACATGGAGC TGTCGTCCTTGCGCAGCGAGGACACGGCCGTCTATTACTGCA ACTTCTATGATGTCTACTCGGAAGGTGCGTTGGACTATTGGG GACAGGGAACCCTTGTGACCGTCTCTAGT SeqldNo. 112 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMHWVRQAP GQGLEWMGWIDPENGDTEYAPKFQGRVTMTADTSTSTVYMEL SSLRSEDTAVYYCNFYDVYSEGALDYWGQGTLVTVSS Seq Id No. 113 GACATTCAGATGACTCAATCACCCTCGTCCCTCTCAGCTTCC GTCGGTGATAGGGTAACAATCACATGTCAAGCGAGCGAGAA CATCTATTTCTCGCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGGAA AGCGCCCAAGTTGCTGATCTACAATGCCAACAATTTGGAGGA TGGGGTGCCATCGAGATTTTCGGGATCCGGCAGCGGAACTG ACTTCACGTTCACCATTAGCTCGCTTCAGCCGGAGGACATTG CCACCTACTATTGCAAAGAAGCATACGATTCACCGTTTACGT TTGGACAGGGGACAAAGCTCGAAATCAAA SeqldNo. 114 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIYFSLAWYQQKPGKAP KLLIYNANNLEDGVPSRF SGSGSGTDFTFTI S SLQPEDIATYYCK EAYDSPFTFGQGTKLEIK SeqldNo. 115 CAAGTACAATTGGTGCAGTCAGGAGCAGAAGTCAAGAAGCC GGGTGCTAGCGTGAAAGTCAGCTGTAAGACTTCGGGATATA CTTTCACGAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCAG GCCAGGGGCTTGAGTGGATGGGTGCGCTGTACCCCGGAAAT TCGGTCACAAACTATAACCAGAAGTTCAAAGGGAGGGTGAC AATGACCGCGGACACGTCAACGTCCACTGTATACATGGAGCT GTCCTCGCTCAGATCAGAGGATACGGCGGTGTACTATTGCAC ACGGGGGTTTTTGACAGCCCCTTACTTTGACTCGTGGGGACA GGGGACCACCGTGACCGTCTCTAGT SeqldNo. 116 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTSYWMHWYRQAP GQGLEWMGALYPGNSVTNYNQKFKGRVTMTADTSTSTVYME LSSLRSEDTAVYYCTRGFLTAPYFDSWGQGTTVTVSS SeqldNo. 117 GACATTCAGATGACTCAATCACCCTCGTCCCTCTCAGCTTCC GTCGGTGATAGGGTAACAATCACATGTCAAGCGAGCGAGAA CATCTATTTCTCGCTTGCGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGGAA 152973.doc ·23· 201132353
AGCGCCCAAGTTGCTGATCTACAATGCCAACAATTTGGAGGA TGGGGTGCCATCGAGATTTTCGGGATCCGGCAGCGGAACTG ACTACACGTTCACCATTAGCTCGCTTCAGCCGGAGGACATTG CCACCTACTTCTGCAAAGAAGCATACGATTCACCGTTTACGT TTGGACAGGGGACAAAGCTCGAAATCAAA Seq Id No. 118 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASENIYFSLAWYQQKPGKAP KLLIYNANNLEDGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYFCK EAYDSPFTFGQGTKLEIK Seq Id No. 119 CAAATCCAATTGGTGCAGTCAGGAGCAGAAGTCAAGAAGCC GGTGCTAGCGTGAAAGTCAGCTGTAAGACTTCGGGATATA CTTTCACGAGCTACTGGATGCACTGGGTCCGCCAGGCCCCAG GCCAGGGGCTTGAGTGGATGGGTGCGCTGTACCCCGGAAAT TCGGTCACAAACTATAACCAGAAGTTCAAAGGGAGGGCCAA GCTGACCGCGGACACGTCAACGTCCACTGCCTACATGGAGCT GTCCTCGCTCAGATCAGAGGATACGGCGGTGTACTATTGCAC ACGGGGGTTTTTGACAGCCCCTTACTTTGACTCGTGGGGACA GGGGACCACCGTGACCGTCTCTAGT Seq Id No. 120 QIQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKTSGYTFTSYWMHWVRQAPG QGLEWMGALYPGNSVTNYNQKFKGRAKLTADTSTSTAYMELS SLRSEDTAVYYCTRGFLTAPYFDSWGQGTTVTVSS Seq Id No. 121 GATATCGTAATGACGCAATCCCCGGACTCACTTGCCGTGTCG CTTGGCGAAAGAGCTACCATTAACTGCAAGTCATCCCAGTCA TTGTTGCATTCGTCGAACCAGAGGAATTACCTGGCGTGGTAC CAACAAAAGCCTGGACAGCCACCCAAATTGTTGATCTATTGG GCGTCAATTCGCGAAAGCGGGGTCCCCGACCGGTTCTCGGG AAGCGGTTCCGGTACTGACTTTACACTCACGATCAGCTCGCT CCAGGCAGAGGATGTGGCGGTATACTATTGTCACCAGTATTA CTCATACTCGACATTCGGGCAGGGAACCAAACTGGAGATCA AA Seq Id No. 122 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLHSSNQRNYLAWYQ QKPGQPPKLLIYWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED VAVYYCHQYYSYSTFGQGTKLEIK Seq Id No. 123 CAGGTCACACTTAAGGAGTCGGGTCCAGCGCTCGTGAAGCC CACACAGACCTTGACCCTCACGTGTACGTTCTCGGGATTTTC ACTTACGACTAGCGGGATGGGCGTAAGCTGGATTCGGCAAC CTCCGGGGAAAGCGCTGGAATGGTTGGCACACATCTTCTGGG ATGATGACAAAAGGTATAACCCCTCGCTCACGTCGCGCCTGA 152973.doc -24- 201132353
CAATCTCAAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTAGTGCTTACG ATGACGAATATGGATCCCGTGGACACAGCAACTTACTACTGC GCCAGAGGAGGAGATTACTATTCCACAGGGTTTGGTTTTGAC TACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACCGTCTCTAGT SeqldNo. 124 QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLTTSGMGVSWIRQPPG KALEWLAHIFWDDDKRYNPSLTSRLTISKDTSKNQVVLTMTNM DPVDTATYYCARGGDYYSTGFGFDYWGQGTLVTVSS SeqldNo. 125 GATATCGTAATGACGCAATCCCCGGACTCACTTGCCGTGTCG CTTGGCGAAAGAGCTACCATTAACTGCAAGTCATCCCAGTCA TTGTTGCATTCGTCGAACCAGAGGAATTACCTGGCGTGGTAC CAACAAAAGCCTGGACAGCCACCCAAATTGTTGATCAGCTG GGCGTCAATTCGCGAAAGCGGGGTCCCCGACCGGTTCTCGG GAAGCGGTTCCGGTACTGACTTTACACTCACGATCAGCTCGC TCCAGGCAGAGGATGTGGCGGTATACTATTGTCACCAGTATT ACTCATACTCGACATTCGGGCAGGGAACCAAACTGGAGATC AAA Seq Id No. 126 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLHSSNQRNYLAWYQ QKPGQPPKLLISWASIRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAED VAVYYCHQYYSYSTFGQGTKLEIK Seq Id No. 127 CAGGTCACACTTAAGGAGTCGGGTCCAGCGCTCGTGAAGCC CACACAGACCTTGACCCTCACGTGTACGTTCTCGGGATTTTC ACTTAGCACTAGCGGGATGGGCGTAAGCTGGATTCGGCAAC CTCCGGGGAAAGCGCTGGAATGGTTGGCACACATCTTCTGGG ATGATGACAAAAGGTATAACCCCTCGCTCACGTCGCGCCTGA CAATCTCAAAGGACACCTCCAAAAACCAGGTAGTGCTTACG ATGACGAATATGGATCCCGTGGACACAGCAACTTACTACTGC GCCAGAGGAGGAGATTACTATTCCACAGGGTTTGGTTTTGAC TACTGGGGGCAGGGAACTCTGGTCACCGTCTCTAGT SeqldNo. 128 QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPG KALEWLAHIFWDDDKRYNPSLTSRLTISKDTSKNQVVLTMTNM DPVDTATYYCARGGDYYSTGFGFDYWGQGTLVTVSS 在其他實施例中，本發明係關於在「人類WISE肽抗原 決定基競爭結合檢驗」中對人類WISE肽展示與抗體八1)-AA ' Ab-AB、Ab-AC、Ab-AD、Ab-AE、Ab-AF、Ab- 152973.doc •25- 201132353 AG、Ab-AH、Ab-AI、Ab-AJ及D14或其衍生物中至少一者 所展示類似之結合模式的結合劑（諸如經分離抗體）；經分 離抗體或其抗原結合片段可為多株抗體、單株抗體、人類 化抗體、人類抗體或嵌合抗體。 對WISE具特異性之人類抗體的實例顯示於下表5中。 表5 :
Seq Id No. 129 CAGTACGAATTGACTCAGCCACCCTCAGTGGCCGTGTCCCC TGGAAAGACAGCCAGCATCACCTGCGCTGGAGATGAATTGG GTAATAAATATGCTGCGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAG GCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTC AGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACA CGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGA GGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGAAGTAGTTATC ATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT CAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCC TCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCT GATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGA AGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCAC CAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAG AAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTG GAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA Seq Id No. 130 QYELTQPPSVAVSPGKTASITCAGDELGNKYAAWYQQKPGQA PVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYY CQVWDRS SYHWFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPS SEELQA NKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Seq Id No. 131 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTT TCTCTCTTTACACTATGCAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTA AAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCGGTTCTTCTGGTGGCG GTACTTCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCT CTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAAC AGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGGGGTCAGCAGTTGGTTTTTCGAGTACTGGGGCCAGGGAA CCCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG 152973.doc •26- 201132353
CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTC GGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAG CAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTG TCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCG TCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGT GAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGG ACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGA GGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAG TGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAA AACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAA CCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCA GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGA GAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCA TGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA SeqldNo. 132 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLYTMQWVRQAPG KGLEWVSGIGSSGGGTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARGVSSWFFEYWGQGTLVTVSSASTKGPSVF PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVD KTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFR VVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK SeqldNo. 133 AGDELGNKYAA SeqldNo. 134 DDSDRPS SeqldNo. 135 QVWDRSSYHVV SeqldNo. 136 LYTMQ Seq Id No. 137 GIGSSGGGTSYADSVKG 152973.doc -27- 201132353
SeqldNo. 138 I GVSSWFFEY 表5中之人類抗體的CDR可進一步突變以例如藉由增加 對人類WISE之親和力提高抗體功能，其中突變如下表6中 所述。基於抗體之重鏈或輕鍵（Seq Id No. 132或Seq Id No. 13 0)中之胺基酸殘基位置進行編號。 表6
突變 DNW-D14 親本 D14-DM03 H35(HC CDR2-5D)+L33(LC CDR1-7E) D14-DM05 H35(HC CDR2-5D)+L36(LC CDR1-7S) D14-DM09 H35(HC CDR2-5D)+L98(LC CDR3-5W) D14-DM13 H66(HC CDR2-8P)+L33(LC CDR1-7E) D14-DM15 H66(HC CDR2-8P)+L36(LC CDR1-7S) D14-DM16 H66(HC CDR2-8P)+L37(LC CDR1-7T) D14-DM19 H66(HC CDR2-8P)+L98(LC CDR3-5W) D14-DM25 H118(HC CDR2-17H)+L36(LC CDR1-7S) D14-DM44 H95(HC CDR2-14H)+L36(LC CDR1-7S) D14-DM46 H41(HC CDR2-5Q)+L36(LC CDR1-7S) D14-TM1 H66(HC CDR2-8P)+H127(HC CDR3-4G)+L34(LC CDR1-7G) D14-TM2 H66(HC CDR2-8P)+H127(HC CDR3-4G)+L36(LC CDR1-7S) D14-L36 LC-CDR1-7 N->S 本發明進一步係關於治療哺乳動物個體中之腎臟及/或 肺纖維變性疾病或病症之方法，其包含向需要該治療之個 體提供足以減輕與該病症相關之症狀之量的抗WISE結合 劑，其中抗WISE結合劑包含抗體或其WISE結合片段。 本文提供特異性結合於人類WISE之抗體。本發明抗體 特徵為其交叉阻斷至少一種本文揭示之抗體與人類WISE 之結合及/或由至少一種本文揭示之抗體交叉阻斷與人類 152973.doc -28- 201132353 WISE之結合的能力。本發明亦提供在基於細胞之檢驗中 可阻斷WISE之作用的經分離抗體或其抗原結合片段。本 發明亦提供在基於細胞之檢驗中可活化WISE之作用的單 株抗體或其片段。 本發明之此等及其他態樣參考以下詳細描述及隨附圖式 將顯而易見。本文揭示之所有參考文獻均以全文引用的方 式併入本文中’如同其個別併入一般。 【實施方式】 本發明部分係關於含有由抗體辨識之抗原決定基的 WISE蛋白之區，其中此等抗體在全長WISE多肽情形中亦 能夠結合於抗原決定基，且係關於製備及使用此等抗原決 疋基之方法。本發明亦提供特異性結合於WISE或WISE之 部分的結合劑（諸如抗體），及該等結合劑之使用方法。結 合劑適於阻斷或賦予人類WISE與一或多種配位體之結合 及其生物活性。 如本文所用，術語人類WISE欲包括Seq Id N〇 2、4、6 及8中所描繪之蛋白質及其對偶基因變異體。亦描述以肌 之直系同源物且包括小鼠、大鼠及石蟹獼猴㈣ld n〇 2、 4、6及8。可藉由溶離宿主細胞培養液之經過濾上清液自 已由編碼WISE之基因轉染的宿主細胞純化簡£。實例中 描述製備及進一步純化。人類WISE核酸描述於美國專利 第 5,780,263號中。 熟習此項技術者應理解，廳£之直系同源物之間存在 冋度序列致性。因此，在結合劑之辨識位點（例如抗體 152973.doc -29- 201132353 結合位點， 諸如抗原決定基）高度保守且詳言之與人類序
鼠或石蟹獼猴WISE。因此，當使用術語 ，當使用術語
34、35及 36 以及 Seq Id
No·: 37、38 及 39 ; Seq Id No·: 40、41 及 42 以及 Seq Id No.: 43、44及 45 ; Seq Id No·: 46、47及 48以及 Seq Id No·: 49、 50 及 51 ; Seq Id No.: 52、53 及 54 以及 Seq Id No·: 55、56 及 57 ; Seq Id No.: 58、59及 60以及 Seq Id No.: 61、62及 63 ; Seq Id No.: 64、65及 66以及 Seq Id No·: 67、68及 69 ; Seq Id No.: 86、87及 88 以及 Seq Id No.: 89、90 及 69 ; Seq Id No.: 91、92及 93 以及 Seq Id No.: 94、95及 96 ; Seq Id No.: 97、98及 99以及 Seq Id No.: 100、101 及 102 ; Seq Id No·: 103、104及 105 以及 Seq Id No.: 106、107及 108;以及 Seq Id No·: 133、134 及 135 以及 Seq Id No·: 136、137及 138 之 抗體。此外，本發明CDR-L1多肽之實例包括Seq Id No.: 34、40、46、52、58、64、86、91、97、103及 133 中所示 之多肽。CDR-L2 之實例包括 Seq Id No.: 35、41、47、 53、59、65、87、92、98、104及 134 中所示者。CDR-L3 之實例包括 Seq Id No.: 36、42、48、54、60、66、88、 93、99、105及135中所示者。CDR-H1之實例包括Seq Id 152973.doc .30- 201132353
No.: 37、43、49、55、61、67、89、94、100、106及 136 中所示者。CDR-H2之實例包括Seq Id No.: 38、44、50、 56、62、68、90、95、101、107及 137 中所示者。CDR-H3 之實例包括 Seq Id No.: 39、45、51、57、63、69、96、 102、108及138中所示者。 如本文所用，Ab-AA包含由Seq Id No. 1 〇及12中所示之 核苷酸表現之多肽；Ab-AB包含由Seq Id No. 14及1 6中所 示之核苷酸表現之多肽；Ab-AC包含由Seq Id No· 18及20 中所示之核苷酸表現之多肽；Ab-AD包含由Seq Id No. 22 及24中所示之核苷酸表現之多肽；Ab-AE包含由Seq Id No. 26及28中所示之核苷酸表現之多肽；Ab_AF包含由seq Id No. 30及32中所示之核苷酸表現之多肽；Ab-AG包含由 Seq Id No· 70及72中所示之核苷酸表現之多肽；Ab-AH包 含由Seq Id No. 74及76中所示之核苷酸表現之多肽；Ab_ AI包含由Seq Id No. 78及80中所示之核苷酸表現之多肽； Ab-AJ包含由Seq Id Νο· 82及84中所示之核苷酸表現之多 肽；且D14包含由Seq Id No·: 129及131中所示之核苷酸表 現之多肽。亦應理解，本文中Ab_AA、Ab_AB、Ab_AC、
Ab-AD ' Ab-AE ' Ab-AF ' Ab-AG ' Ab-AH > Ab-AI ' Ab- AJ及D14各顯示缺乏信號肽，且熟習此項技術者可使用習 知技術（包括使用此項技術中已知之信號肽）表現此等多肽 中之每一者。亦應理解，本文所述之AbAA、Ab_AB、
Ab-AC、Ab-AD、Ab_AE、Ab_AF、Ab_AG、Ab_AH、抓 AI及Ab-AJ各僅包括可變輕鏈及重鏈且不包括恆定區。 152973.doc -31 - 201132353 此外，本文所述之非人類抗體可藉由多種不同策略人類 化，包括簡單『剪切及黏貼』CDR，或亦可包括回復突變 以保持人類化分子中之關鍵鼠類序列。人類化之特定實例 包括下文實例中之Ab-AB、Ab-AI及 Ab-AE(Seq Id N。.： 114 &116、SeqIdNo.:ll8&120、SeqIdNo.:122&l24、Seq
Id No.: 126及 128、以及 Seq Id No. 110及 112)。 額外抗體資料參考美國專利申請案第12/275,85〇號（us
2009/0130114)中先前揭示之分子（例如Ab-C、Ab-T、Ab_S 及Ab-P)呈現於本文中，該申請案以全文引用的方式併入 本文中。 本發明之結合劑通常為如本文所定義之抗體或其片段。 術§吾「抗體」係指完整抗體或其結合片段。抗體可包含完 全抗體分子（包括具有全長重鏈及/或輕鏈之多株、單株、 嵌合、人類化或人類型式）或包含其抗原結合片段。抗體 片段包括F(ab') 2、Fab、Fab'、Fv、Fc及Fd片段，且可併 入至單結構域抗體、單鏈抗體、最大抗體、微型抗體、細 胞内抗體、微型雙功能抗體、三功能抗體（triab〇cjy)、四功 能抗體（tetrabody)、v-NAR及雙-scFv 中（參看例如 Hollinger 及 Hudson, 2005，Nature Biotechnology, 23，9，1126- u36)。抗體多肽亦揭示於美國專利第6,703^99號中，包 括纖維結合蛋白多肽單功能抗體（m〇n〇b〇dy)。其他抗體多 肽揭示於美國專利公開案2005/0238646中，其為單鏈多 狀。如本文所用’經分離抗體或其抗原結合片段可為多株 抗體、單株抗體、人類化抗體、人類抗體、嵌合抗體或其 152973.doc •32· 201132353 類似抗體。 根據習知方法，可例如藉由蛋白水解抗體（例如用胃蛋 白酶或木瓜蛋白酶消化全抗體）獲得源自抗體之抗原結合 片段。舉例而言，可藉由使用胃蛋白酶酶促裂解抗體獲得 稱為F(ab')2之5S片段，從而製造抗體片段。此片段可使用 . 硫醇還原劑進一步裂解產生3.5S Fab'單價片段。視情況， 可使用二硫鍵裂解產生之硫氫基的阻隔基進行裂解反應。 或者，使用木瓜蛋白酶之酶促裂解直接產生兩個單價Fab 片段及一個Fc片段。此等方法由例如Goldenberg，美國專 利第 4,331，647號；Nisonoff等人，Arch· Biochem. Biophys. 89:230, 1960 ； Porter, Biochem. J. 73:119, 1959 ； Edelman 4 人，Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967);及 Andrews，S. M·及 Titus，J· A.，Current Protocols in Immunology (Coligan J. E.等人編），John Wiley & Sons， New York (2003)。第 2.8.1 頁·第 2.8.10頁及第 2.10A.1 頁-第 2.10A.5頁描述。亦可使用裂解抗體之其他方法，諸如分 離重鏈形成單價輕鏈-重鏈片段（Fd)、進一步裂解片段、或 其他酶促、化學或遺傳技術，只要片段結合於由完整抗體 辨識之抗原即可。 抗體片段亦可為任何合成或經遺傳工程改造之蛋白質。 舉例而言，抗體片段包括由輕鏈可變區組成之分離片段； 由重鏈及輕鏈之可變區組成之rFv」片段；重組單鏈多肽 分子’其中輕鏈及重鏈可變區由肽連接子連接（scFv蛋 白）0 152973.doc -33- 201132353 抗體片段之另一形式為包含抗體之一或多個互補決定區 (CDR)的多肽。CDR(亦稱為「最小辨識單位」或「高變 區」）可由建構編碼所關注CDR之聚核苷酸獲得。該等聚 核苷酸例如藉由使用聚合酶鏈反應製備，使用產生抗體之 細胞的mRNA作為模板合成可變區（參看例如Larrick等人， Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991 ； Courtenay-Luck, 「第 Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies」第 Monoclonal Antibodies.
Production，Engineering and Clinical Application，Ritter等 人’（編）’第 166頁（Cambridge University Press 1995);及 Ward 專人’「Genetic Manipulation and Expression of Antibodies」Monoclonal Antibodies: Principles and
Applications，Birch 等人，（編），第 137 頁（Wiley-Liss，Inc. 1995))。
因此’在一個實施例中，結合劑包含至少一個如本文所 述之CDR。結合劑可包含至少兩個、三個、四個、五個咬 >·、個如本文所述之CDR。結合劑另外可包含本文所述抗體 之至少一個可變區結構域。可變區結構域可具有任何大小 或胺基酸組成，一般包含至少一個負責結合於人類WISE 之 CDR序列，例如 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，及 / 咬本 文特定描述之輕鏈CDRs，且與一或多個構架序列相鄰戍 同框。一般而言，可變（V)區結構域可為免疫球蛋白重鍵 (VH)及/或輕鏈（Vl)可變域的任何適合排列。因此，舉例 而言，V區結構域可為單體的且為VH或VL結構域，其能 152973.doc • 34- 201132353 夠如下文所述以至少等於或小於WO·7 Μ之親和力獨立結 合人類WISE。或|，ν區結構域可為二聚的且含有 VH VH-VL或VL-VL二聚體。v區二聚體包含可非共價締 合之至少一個VH鏈及至少一個¥；1鏈（下文稱為FV)。需要 時，該等鏈可例如經由兩個可變域之間的二硫鍵直接共價 偶聯或經例如肽連接子之連接子共價偶聯，形成單鏈 Fv(scFV)。 可變區結構域可為任何天然存在之可變域或其經工程改 造之型式。經工程改造之型式意謂可變區結構域使用重組 DNA工程改造技術形成。該等經工程改造之型式包括例如 藉由特異性抗體之胺基酸序列的插入、缺失或改變而自特 異性抗體可變區形成之型式。特定實例包括經工程改造之 可變區結構域，其含有至少一個CDR及視情況存在之一或 多個來自第一抗體之構架胺基酸，且該可變區結構域之其 餘部分來自第二抗體。 可變區結構域可在C端胺基酸處共價連接至至少一個其 他抗體結構域或其片段。因此，舉例而言，可變區結構域 中存在之VH結構域可連接至免疫球蛋白chi結構域或其片 段。同樣，VL結構域可連接至CK結構域或其片段《以此 方式’抗體可例如為如下Fab片段，其中抗原結合域含有 分別在C端共價連接於CHI及CK結構域之締合VH及VL結 構域。CH1結構域可以其他胺基酸擴展以例如提供如Fab' 片段令所發現之鉸鏈區或鉸鏈區結構域之一部分，或提供 其他結構域，諸如抗體CH2及CH3結構域。 152973.doc •35- 201132353 如本文所述，結合劑包含此等CDR中之至少一者。舉例 而言’一或多個CDR可併入至已知抗體構架區（igGl、 IgG2等）中或結合於適合媒劑以提高其半衰期。適合媒劑 包括（但不限於）Fc、聚乙二醇（PEG)、白蛋白、運鐵蛋白 及其類似物。此項技術中已知此等及其他適合媒劑。該等 結合之CDR肽可為單體、二聚、四聚或其他形式。在一實 施例中，一或多種水溶性聚合物鍵結於結合劑之一或多個 特定位置處（例如胺基端）。 在某些實施例中’結合劑包含一或多個水溶性聚合物連 接’包括（但不限於）聚乙二醇、聚氧乙二醇或聚丙二醇。 參看例如美國專利第4,640,835號、第4,496,689號、第 4’301’144 號、帛 4’670,417 號、第 4,791，192 號及第 4’179,337號。在某些實施例中，衍生物結合劑包含以下一 或多者.單甲氧基-聚乙二醇、聚葡萄糖、纖維素或其他
醇、丙一醇均聚物、聚氧化丙稀/氧化乙稀共聚物、聚 氧乙基化多元醇（例如甘油）及聚乙烯醇 以及該等聚合物
式併入本文中。 即可。因此，對 熟習此項㈣者應瞭解’本發明結合劑可具有至少一個 胺基酸取代，只要結合劑保留結合特異性 152973.doc -36 - 201132353 結合劑結構之修飾涵蓋於本發明料内^此等㈣可包括 胺基酸取代，其可為保守或非保守的且不會破壞結合=之 WISE結合能力。保守胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺 基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非生物系統中之合成 併入。此等殘基包括肽模擬物，及胺基酸部分之其他反相 或反向形式。保守胺基酸取代亦可涉及以標準殘基 (normative residue)取代原生胺基酸殘基，使得對彼位置處 胺基酸殘基的極性或電荷幾乎無影響。 非保守取代可涉及將一類胺基酸或胺基酸模擬物的一員 換為具有不同物理特性（例如大小、極性、疏水性、電荷） 的另一類別之一員。該等經取代殘基可引入至與非人類抗 體同源之人類抗體之區域中或引入至分子之非同源區中。 此外，熟習此項技術者可產生在各所要胺基酸殘基處含 有單個胺基酸取代之測試變異體。該測試可對如下文實例 中所述之結合劑的標靶或對本發明之治療性結合劑進行。 接著可使用熟習此項技術者已知的活性檢驗篩選變異體。 該等變異體可用於收集關於適合變異體之資訊。舉例而 s ’若發現特定胺基酸殘基之改變導致受損、不必要減少 或不適當的活性，則可避免具有該改變之變異體。換言 之’基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可 容易地判定胺基酸何處應避免單獨或與其他突變組合的進 一步取代。 熟練技術人員將能夠使用熟知技術判定如本文所述多肽 之適合變異體。在某些實施例中，熟習此項技術者可藉由 I52973.doc -37- 201132353 靶向咸信對活性不重要之區域來識別可能發生改變但不會 破壞活性的適合分子區域。在某些實施例中，可識別在類 似多肽中保守之殘基及分子部分。在某些實施例中，甚至 對生物活性或對結構重要之區域亦可進行保守胺基酸取 代，而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。 此外’熟習此項技術者可回顧識別類似多肽中對活性或 結構重要之殘基的結構-功能研究。鑒於該比較，可預測 在蛋白質中對應於類似蛋白質中對活性或結構重要之胺基 酸殘基之胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可選擇化 學上類似之胺基酸取代用於該等預測之重要胺基酸殘基。 許多科學出版物已致力於二級結構之預測。參看M〇uit J.，Curr. Op. in Biotech·，7(4):422-427 (1996); Chou 等 人，Biochemistry，13(2):222-245 (1974) ; Chou 等人， Biochemistry，113(2):211-222 (1974) ; Chou 等人，Adv.
Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978) ； Chou 等人 ’ Ann. Rev. Biochem·，47:251-276 及 Chou 等人， Biophys· J·，26:367-3 84 (1979)。此外，目前可利用電腦程 式輔助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係基於同 源建模。舉例而言’具有大於30%序列一致性或大於4〇〇/0 相似性之兩個多肽或蛋白質通常具有類似的結構佈局。蛋 白質結構資料庫（PDB)之近期發展提高了二級結構（包括多 肽結構或蛋白質結構内潛在的摺疊數）之可預測性。參看
Holm等人，Nucl. Acid. Res·，27(1):244-247 (1999)。已提 出（Brenner 等人 ’ Curr. Op. Struct. Biol.，7(3):369-376 152973.doc -38 - 201132353 (1997)) ’在既定多肽或蛋白質中存在有限數目之摺疊且一 旦解析關鍵數目之結構，則結構預測將變得顯著更精確。 其他預測一級結構之方法包括「穿線（threading)」 (Jones, D·，Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997);
Sippl等人，Structure，4(1):15-19 (1996))、「概況分析」 (Bowie 等人，Science，253:164-170 (1991) ; Gribskov 等 人，Meth. Enzym·，183:146-159 (1990) ; Gribskov等人， Proc. Nat. Acad· Sci·，84(13):4355-4358 (1987))及「進化聯 繫（evolutionary linkage)」（參看 Holm，上文（1999)及
Brenner，上文（1997))。 在某些實施例中，結合劑變異體包括糖基化變異體，其 中糖基化位點之數目及/或類型相較於親本多肽之胺基酸 序列有所改變。在某些實施例中，變異體包含與原生蛋白 質相比更多或更少數目之N-連接糖基化位點β N_連接糖基 化位點之特徵為以下序列：Asn-X-Ser或Asn-X-Thr，其中 表示為X之胺基酸殘基可為除脯胺酸之外的任何胺基酸殘 基。形成此序列之胺基酸殘基之取代提供潛在新位點以供 添加N-連接碳水化合物鏈。或者，消除此序列之取代將移 除現有N-連接碳水化合物鏈。亦提供小連接碳水化合物鏈 之重排，其中消除一或多個义連接糖基化位點（通常為天 然存在之位點）且形成一或多個新Ν·連接位點。額外較佳 抗體變異體包括半胱胺酸變異體，其中與親本胺基酸序列 相比，一或多個半胱胺酸殘基缺失或由另一胺基酸（例如 絲胺酸)取代。當抗體諸如在分離不可溶包涵體之後須再 152973.doc -39- 201132353 ’半胱胺酸變異體可能有用。
用降至最低。 摺疊成生物活性構形時， 胺酸變異體一般相射於,
文所述WISE之親和力。 所要胺基酸取代（保守或非保守）可在需要該等取代時由 熟習此項技術者硇宕。a甘从.总L . 根據某些實施例，較佳胺基酸取代為以下取代：（。降 低對蛋白水解之易感性，（2)降低對氧化之易感性，改 變形成蛋白質複合物之結合親和力，（句改變結合親和力， 及/或（5)賦予該等多肽其他生理化學或功能特性或修飾該 等特性。根據某些實施例，單個或多個胺基酸取代（在某 些貫施例中’保守胺基酸取代）可於天然存在之序列中進 行（在某些實施例中’在形成分子間接觸之結構域之外的 多肽部分中）。在某些實施例中，保守胺基酸取代通常無 法實質上改變親本序列之結構特徵（例如置換胺基酸不應 傾向於中斷親本序列中存在之螺旋，或破壞表徵親本序列 之其他類型的二級結構）^此項技術辨識之多肽二級結構 及二級結構之實例描述於Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton 編，W.H. Freeman and Company, New York (1984)) ； Introduction to Protein Structure (C. Branden及 J. Tooze 編，Garland Publishing, New York，N.Y. (1991));及 Thornton等人，Nature 354:105 152973.doc • 40 · 201132353 〇中，該等文獻各以引用的方式併入本文中。 在某些實施例中，本發明結合劑可與聚合 他部分化學鍵結。 曰貧或其
結合劑可包含至少一個彳杜λ s L 至生物相容性構架結構中 本文所述之CDR。在一管你丨由 . 貫例中，生物相容性構架結構 足以形成構形穩定結構切之多肽或其部分，或能夠呈^ -或多個結合於局部表面區域中之抗原（例如咖、 區等）的胺基酸序列之構架或骨架。該等結構可為天，缺存 在之多狀或纽「摺疊」（結構基元），或相對於天然存在 之多肽或摺疊可具有一或多種修飾，諸如胺基酸之添加、 缺失或取代。此等骨架可源自任何物種(或一種以上物 種)(諸如人類、其他哺乳動物、其他脊椎動物、無脊椎動 物、植物、細菌或病毒）之多肽。 生物相容性構架結構通常基於除免疫球蛋白結構域以外 的蛋白質骨架或基幹。舉例而言，可使用基於纖維結合蛋 白、4田蛋白、脂質運載蛋白、新抑癌素（ne〇carzin〇stain)、 細胞色素b(cytochrome b)、CP1鋅指、PST1、捲曲螺旋、 LAC1_D1 ' Z結構域及澱粉酶抑肽（tendramisat)結構域之構 架結構（參看例如 Nygren及 Uhlen，1997，Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469) ° 在較佳實施例中，應瞭解本發明結合劑包括本文所述之 人類化抗體。可使用熟習此項技術者已知之技術產生人類 化抗體（諸如本文所述之人類化抗體）（Zhang，W.等人，
Molecular Immunology. 42(12): 1445-1451, 2005 ； Hwang 152973.doc 201132353 W.等人，Methods. 36(1):35·42，2005 ; Dall'Acqua W F等 人，Methods 36(1):43-60, 2005 ;及 Clark，M·，Immunology Today. 21(8):397-402, 2000) ° 此外，熟習此項技術者將瞭解，適合結合劑包括此等抗 體之部分，諸如本文特定揭示之CDR-H1、CDR-H2、 CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3 中之一或多者。 CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2 及 CDR-L3區中至少一者可具有至少一個胺基酸取代，只要結合劑 保留未經取代CDR之結合特異性即可。結合劑之非CDR部 分可為非蛋白質分子，其中結合劑交叉阻斷本文揭示之抗 體與WISE的結合及/或中和WISE。結合劑之非CDR部分可 為非蛋白質分子，其中結合劑在「人類WISE肽抗原決定 基競爭結合檢驗」中對人類WISE肽展現與至少一種本文 所述抗體所展現類似之結合模式及/或中和WISE。結合劑 之非CDR部分可由胺基酸構成，其中結合劑為重組結合蛋 白或合成肽，且重組結合蛋白交叉阻斷本文揭示之抗體與 WISE之結合及/或中和WISE。結合劑之非CDR部分可由胺 基酸構成，其中結合劑為重組結合蛋白，且重組結合蛋白 在人類WISE肽抗原決定基競爭結合檢驗（下文所述）中對人 類WISE肽展現與至少一種本文所述抗體Ab-AA、Ab-AB、 Ab-AC、Ab-AD、Ab-AE、Ab-AF、Ab-AG、Ab-AH、Ab-AI、Ab-AJ D14 及以 Ab-AA、Ab-AB、Ab-AC、Ab-AD、 Ab-AE、Ab-AF、Ab-AG、Ab-AH、Ab-AI、Ab-AJ 之 CDR 人類化之抗體所展現類似的結合模式及/或中和WISE。 152973.doc -42- 201132353 若抗體包含如上文所述CDR-Hl、CDR-H2、CDR-H3、 CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3中之一或多者，貝，J其可藉由自 含有編碼此等序列之DNA的宿主細胞表現而獲得》編碼各 CDR序列之DNA可基於CDR之胺基酸序列測定且根據需要 - 使用寡核苷酸合成技術、定點突變誘發及聚合酶鏈反應 (PCR)技術與任何所要抗體可變區構架及恆定區DNA序列 一起合成。熟習此項技術者可自諸如GenBank®之基因序 列資料庫大量獲得編碼可變區構架及恆定區之DNA。上述 各CDR通常將位於根據Kabat編號系統在重鏈的位置31-35(CDR-H1)、50-65(CDR-H2)及 95-102(CDR-H3)及輕鏈的 位置 24-34(CDR-Ll)、50-56(CDR-L2)及 89-97(CDR-L3)之 可變區構架中（Kabat等人，1987 in Sequences of proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services，NIH，USA)。 術語「CDR」可指抗體可變序列内之互補決定區。各重 鏈及輕鏈可變區中通常存在三個CDR，其針對各可變區命 名為CDR1、CDR2及CDR3。此等CDR之邊界已根據不同 系統以不同方式加以定義。Kabat(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes • of Health，Bethesda, Md. (1987) and (1991))所述之系統提 供適用於任何抗體可變區之殘基編號系統，且提供界定該 三個CDR之殘基邊界。Chothia及同事（Chothia及Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及 Chothia 等人，Nature 342:877-883 (1989))發現Kabat CDR内之某些子部分即使在 152973.doc 43· 201132353 胺基酸序列層面上具有巨大多樣性，亦採用幾乎相同的肽 主鏈構形。此等子部分命名為Ll、L2及L3或HI、H2及 H3，其中「L」與「H」分別表示輕鏈區及重鏈區。此等 區可具有與使用Kabat界定之CDR重疊之邊界。Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995))及 MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996))已描述界定與Kabat之CDR重疊之 CDR的其他邊界。其他CDR邊界定義可能未嚴格遵循上述 系統之一，但仍將與Kabat編號重疊，不過根據特定殘基 或殘基群或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合之預測或實 驗研究結果，其可能縮短或延長。本文使用之方法可利用 根據此等系統中任一者界定之CDR。 如本文所用，術語「構架」或「構架序列」係指CDR周 圍但不包括CDR之其餘可變區序列。因為CDR序列之確切 定義可由不同系統確定，所以可相應地對構架序列之含義 進行不同解釋。CDR(輕鏈之CDR-L1、-L2及-L3及重鏈之 CDR-H1、-H2及-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架區在各鏈上 分成四個子區（FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於 FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於 FR3與FR4之間。在不將特定子區指定為FR1、FR2、FR3 或FR4之情形下，構架區當以其他名稱提及時代表天然存 在之單個免疫球蛋白鏈之可變區中之組合FR。如本文所 用，FR代表四個子區中之一者，且FRs代表構成構架區之 四個子區中之兩者或兩者以上。 合成後，編碼本發明抗體或其片段之DNA可根據用於核 152973.doc • 44· 201132353 酸切除、接合、轉型及轉染之多種熟知程序中之任一者使 用多種已知表現載體增殖及表現。因此，在某些實施例 中，抗體片段較佳可在原核生物宿主（諸如大腸桿菌）中表 現（參看例如 Pluckthun 等人，1989 Methods Enzymol. 178:497-515)。在某些其他實施例中，抗體或其片段較佳 可在真核生物宿主細胞，包括酵母（例如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)及畢赤酵母（Pichia pastoris))、動物細胞（包括哺乳 動物細胞）或植物細胞中表現。適合動物細胞之實例包括 (但不限於）骨髓瘤（諸如小鼠NSO細胞系）、COS、CHO或融 合瘤細胞。植物細胞之實例包括终草、玉米、大豆及稻細 胞。 可製備一或多個含有編碼抗體可變區及/或恆定區之 DNA的可複製表現載體且用於轉型將產生抗體之適當細胞 系（例如非生產性骨髓瘤細胞系，諸如小鼠NSO細胞系）或 細菌（諸如大腸桿菌）。為了獲得有效轉錄及轉譯，各載體 中之DNA序列應包括適當調節序列，特定言之可操作地連 接至可變域序列之啟動子及前導序列。一般熟知且常規使 用以此方式製造抗體之特定方法。舉例而言，基本分子生 物學程序由 Maniatis等人（Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York，1989 ;亦參看 Maniatis 等人，第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory, New York，（2001))描述。DNA定序可如 Sanger等人（PNAS 74:5463，（1977))及Amersham International 152973.doc -45- 201132353 pic sequencing handbook所述進行，且定點突變誘發可根 據此項技術中已知之方法進行（Kramer等人，Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984) ； Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985) ; Kunkel 等人，Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987) ; Anglian Biotechnology Ltd handbook)。 此外，大量公開案描述適於藉由操縱DNA、形成表現載體 以及轉型及培養適當細胞製備抗體之技術（Mountain A及 Adair, J R, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (Tombs，Μ P編，10，第 1章，1992，Intercept, Andover， UK) ;「Current Protocols in Molecular Biology」，1999，F. M. Ausubel (編），Wiley Interscience，New York)。 當需要改良本發明含有一或多個上述CDR之抗體之親和 力時，可藉由多種親和力成熟方案獲得，該等方案包括保 留 CDR(Yang等人，J_ Mol· Biol·，254，392-403，1995)、鏈 改組（Marks 等人，Bio/Technology，10, 779-783，1992)、使 用大腸桿菌之突變菌株（Low等人，厂]^〇1.8丨〇1.,250,350-368，1996)、DNA改組（Patten等人，Curr· Opin. Biotechnol·, 8，724-733，1997)、噬菌體呈現（Thompson等人，J. Mol_ Biol·, 256，7-88，1996)及有性PCR(Crameri等人，Nature, 391，288-291，1998)。所有此等親和力成熟法均由Vaughan 等人（Nature Biotechnology，16，535-539, 1998)論述。 可藉由如本文所述及此項技術中已知的習知免疫及細胞 融合程序獲得本發明之其他抗體。可使用多種已知技術產 生本發明之單株抗體。一般而言，可藉由熟習此項技術者 152973.doc -46- 201132353 已知之方法獲得結合於特異性抗原之單株抗體（參看例如 Kohler 等人，Nature 256:495, 1975 ； Coligan 等人（編）， Current Protocols in Immunology, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991);美國專利第 RE 32,011號、第 4,902,614號、 第 4,543,439 號及第 4,411，993 號；Monoclonal Antibodies，
Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses,
Plenum Press, Kennett, McKearn及 Bechtol(編）（1980);及 Antibodies: A Laboratory Manual，Harlow及 Lane(編），Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988) ; Picksley 等人， Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli」DNA Cloning 2: Expression Systems，第 2 版，Glover 等人（編），第 93 頁（〇xf〇rd University press 1995))。可使用諸如蛋白水解消化之任何 適合標準技術，或視情況藉由蛋白水解消化（例如使用木 瓜蛋白酶或胃蛋白酶）、隨後適度還原二硫鍵及烧基化， 自其產生抗體片段。或者，亦可藉由如本文所述之重組遺 傳工程改造技術產生該等片段。 可根據此項技術中已知及本文所述之方法以包含wise 之免疫原（例如包括SEQ ID N0: 2、4、6或8中描繪之全長 或成熟多肽或其片段，例如Seq Id N〇 9)注射動物（例如大 鼠、倉鼠、兔或較佳小鼠，包括例如此項技術中已知之轉 殖基因或基因剔除之動物），藉此獲得單株抗體。可在初 始注射後及/或在加強注射後，藉由獲得血清樣品且使用 此項技術中已知及本文所述之若干免疫偵測法中的任一者 152973.doc -47- 201132353 偵測結合於人類WISE或肽之抗體的存在，監測特異性抗 體產生之存在。自產生所要抗體之動物移除淋巴樣細胞 (脾臟或淋巴結中最常見之細胞）以獲得B_淋巴細胞β B淋 巴細胞接著與對藥物敏感之骨髓瘤細胞融合搭配物（較佳 為與經免疫動物同系且視情況具有其他所要特性（例如不 能表現内源Ig基因產物，例如P3X63-Ag 8_653(ATCC編號 CRL 1580); NSO、SP20)的搭配物）融合，產生融合瘤，其 為永生真核細胞系。淋巴樣（例如脾臟）細胞及骨髓瘤細胞 可與膜融合促進劑（諸如聚乙二醇或非離子清潔劑）組合數 刀鐘’接者以低也、度塗於支持融合瘤細胞生長但不支持未 融合之骨髓瘤細胞生長的選擇性培養基上。較佳選擇培養 基為HAT(次黃嘌呤、胺基蝶呤、胸苷）。在足夠時間之 後’一般為約1至2週後，觀測到細胞群落◊分離單個群 落’且可使用此項技術中已知且本文所述之多種免疫檢驗 中的任一者測試細胞產生之抗體對人類WISE之結合活 性。選殖融合瘤（例如藉由有限稀釋選殖或藉由軟瓊脂空 斑分離），且選擇及培養產生對WISE具特異性之抗體的陽 性純系。可自融合瘤培養物之上清液分離來自融合瘤培養 物之單株抗體。產生鼠類單株抗體之替代方法為將融合瘤 細胞注射至同系小鼠（例如已經處理（例如異十八烷預致敏） 之小鼠）之腹腔中，以促進形成含有單株抗體之腹水。可 藉由多種公認技術分離及純化單株抗體。該等分離技術包 括使用蛋白質-A瓊脂糖凝膠之親和力層析、尺寸排阻層析 及離子交換層析（參看例如Coligan，第2.7.1頁-第2.7.12頁 152973.doc -48- 201132353 及第 2.9.1 頁-第 2.9.3 頁；Baines 等人，「Purification 〇f Immunoglobulin G (IgG)J Methods in Molecular Biology , 第 10卷，第 79-104頁（The Humana Press, Inc. 1992))。單株 抗體可藉由親和力層析使用基於特定抗體特性（例如重鏈 或輕鏈同型、結合特異性等）選擇之適當配位體純化。固 定於固體支撐物上之適合配位體之實例包括蛋白質A、蛋 白質G、抗恆定區（輕鏈或重鏈）抗體、抗個體基因型抗 體、及TGF-β結合蛋白、或其片段或變異體。 本發明抗體亦可為人類單株抗體。可藉由一般技術人員 熟悉之多種技術產生人類單株抗體。該等方法包括（但不 限於）人類周邊血細胞（例如含有B淋巴細胞）之eb病毒 (Epstein Barr Virus，EBV)轉型、活體外免疫人類B細胞、 融合攜▼有插入的人類免疫球蛋白基因之經免疫轉瘦基因 小鼠的脾細胞、自人類免疫球蛋白V區噬菌體文庫分離、 或如此項技術中已知且基於本文揭示内容之其他程序。舉 例而言，可自經工程改造以回應於抗原攻毒產生特異性人 類抗體之轉殖基因小鼠獲得人類單株抗體。自轉殖基因小 鼠獲得人類抗體之方法由例如Green等人，Nature Genet. 7:13，1994 ; Lonberg等人，Nature 368:856，1994 ; Taylor 等人，Int. Immun. 6:579, 1994 ;美國專利第 5,877,397號； Bruggemann等人，1997 Cun·. Opin. Biotechnol. 8:455-58 ; Jakobovits等人，1995 Ann· N. Y Acad. Sci. 764:525-35描 述。在此技術中，將人類重鏈及輕鏈基因座之元件引入至 源自含有内源重鏈及輕鏈基因座之定向敲除的胚胎幹細胞 152973.doc •49· 201132353 系之小鼠品系中（亦參看Bruggemann等人，Curr 〇pin Biotechnol. 8:455-58 (1997))。舉例而言，人類免疫球蛋白 轉殖基因可為袖珍基因構築體、或酵母人工毕色體上之轉 殖基因座，其經歷小鼠淋巴組織中之Β細胞特異性Dna重 排及超突變。可藉由經免疫轉殖基因小鼠獲得人類單株抗 體，此接著可產生對WISE具特異性之人類抗體。可使用 經免疫轉殖基因小鼠之淋巴樣細胞根據本文所述之方法製 造分泌人類抗體之融合瘤。亦可自經免疫動物之血液獲得 含有人類抗體之多株血清。 用於產生本發明人類抗體之另一方法包括藉由EbV轉型 使人類周邊血細胞永生化》參看例如美國專利第4,464,456 號。可藉由如本文所提供之免疫偵測法（例如elisa)識別 5亥產生特異性結合於Wise之單株抗體的永生化β細胞系 (或類淋巴母細胞細胞系），接著藉由標準選殖技術分離。 可藉由根據此項技術中已知之方法融合經轉型細胞系與鼠 類骨髓瘤產生小鼠-人類雜交細胞系來提高產生抗WISE抗 體之類淋巴母細胞細胞系的穩定性（參看例如Qlasky等人， Hybridoma 8:3 77-89 (1989))。產生人類單株抗體之另一方 法為活體外免疫，其包括以人類WISE預致敏人類脾臟B細 胞’隨後融合預致敏之B細胞與異種雜交融合搭配物。參 看例如 Boerner等人，1991 J. Immunol. 147:86-95。 在某些實施例中，選擇產生抗人類WISE抗體之B細胞且 根據此項技術中已知（WO 92/02551 ;美國專利第5,627,052 號；Babcook等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-48 152973.doc •50- 201132353 (1996))且本文所述之分子生物學技術自8細胞選殖輕鏈及 重鏈可變區。可藉由選擇產生特異性結合於WISE之抗體 的細胞自脾臟、淋巴結或周邊血液樣品分離來自經免疫動 物之B細胞。B細胞亦可自人類’例如自周邊血液樣品分 離。此項技術中熟知偵測產生具有所要特異性之抗體的單 個B細胞之方法，例如斑塊形成、螢光活化細胞分選、活 體外刺激繼之以偵測特異性抗體、及其類似方法。用於選 擇產生特異性抗體之B細胞的方法包括例如在含有人類 WISE之軟瓊脂中製備B細胞之單細胞懸浮液。b細胞產生 之特異性抗體結合於抗原會形成複合物，該複合物可以免 疫沈殿物之形式可見。在選擇產生所要抗體之B細胞之 後’可藉由根據此項技術中已知且本文所述之方法分離及 擴增DNA或mRNA選殖特異性抗體基因。 獲得本發明抗體之其他方法為嗤菌體呈現。參看例如
Winter等人，1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55 ; Burton 等人 ’ 1994 Adv. Immunol. 57:191-280。在噬菌體載體中 可形成人類或鼠類免疫球蛋白可變區基因組合文庫，該等 載體可經篩選以選擇特異性結合於TGF-β結合蛋白或其變 異體或片段之Ig片段（Fab、Fv、sFv或其多聚體）。參看例 如美國專利第5,223,409號；Huse等人，1989 Science 246:1275-81 ; Sastry 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989) ; Alting-Mees等人，Strategies in Molecular Biology 3:1-9 (1990) ; Kang等人，1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4363-66 ; Hoogenboom等人，1992 J. Molec. 152973.doc 201132353 B i ο 1 · 2 2 7:3 81 - 3 8 8，S c h 1 e b u s c h 專人，19 9 7 jj y b r i d ο m 16:47-52及其中引用之參考文獻。舉例而言，含有複數個 編碼Ig可變區片段之聚核苷酸序列的文庫可與編碼„重菌體 鞘蛋白之序列同框插入至絲狀噬菌體（諸如Ml3或其變異 體）之基因組中。融合蛋白可為鞘蛋白與輕鏈可變區結構 域及/或重鏈可變區結構域的融合體。根據某些實施例， 免疫球蛋白Fab片段亦可呈現於噬菌體粒子上（參看例如美 國專利第5,698,426號）。 重鏈及輕鏈免疫球蛋白cDNA表現文庫亦可例如使用λ
ImmunoZap ΤΜ (Η)及 λ ImmunoZap TM (L)載體（stratagene，
La Jolla，Calif.)在λ噬菌體中製備。簡言之，自b細胞群體 分離mRNA ’且將其用於在λ immun〇zap(H)及λ ImmunoZap(L)載體中形成重鏈及輕鏈免疫球蛋白cDna表 現文庫。此等載體可個別地經篩選或共表現以形成Fab片 段或抗體（參看Huse等人，上文；亦參看sastry等人，上 文）。陽性斑塊可隨後轉化成允許由大腸桿菌高水準表現 單株抗體片段的非溶胞質體。 在一實施例令，在融合瘤中，使用核苷酸引子擴增表現 所關注單株抗體之基因的可變區。此等引子可由一般技術 人員合成’或可購自商業來源。（參看例如Stratagene (La Jolla，Calif.)，其出售小鼠及人類可變區之引子，尤其包 括 VHa、VHb、VHc、VHd、CHI、VL及 CL· 區之引子。）此 等引子可用於擴增重鏈或輕鏈可變區，其接著可分別插入 至諸如 ImmunoZAP TM Η或 ImmunoZAP TM(Stratagene)之 152973.doc •52. 201132353 載體中。此等載體接著可引入至基於大腸桿菌、酵母或哺 乳動物之表現系統中。可使用此專方法製造大量含有VH 與VL結構域之融合體的單鏈蛋白質（參看Bird等人， Science 242:423-426, 1988) ° 使用任何上述免疫及其他技術獲得產生本發明抗體之細 胞後’可藉由根據如本文所述之標準程序自其分離及擴增 DN A或mRN A選殖特異性抗體基因。可定序自其產生之抗 體，且識別之CDR及編碼該等CDR之DNA可如先前所述經 操縱以產生本發明之其他抗體。 結合劑較佳地特異性結合於WISE。與所有結合劑及結 合檢驗一樣’熟習此項技術者認識到，不可能詳盡且不切 實際地列出應可偵測地結合於結合劑以在治療上有效及適 合之各種部分。因此’對於本文揭示之結合劑，術語「特 異性結合」係指結合劑以比結合於不相關對照蛋白質時大 的親和力結合於WISE(較佳為人類WISE)之能力。對照蛋 白質較佳為母雞卵白溶菌酶。結合剞結合於WISE之親和 力較佳為對對照蛋白質之親和力的至少5〇、1〇〇、250、 500、1000或1〇,〇〇〇倍。結合劑對人類WISE之結合親和力 可小於或等於1 X 1 〇·7 Μ ’小於或等於1 X 1 〇·8 Μ，小於或等 於lxlO-9 Μ，小於或等於Ιχίο·1。μ，小於或等於lxlO·11 Μ，或小於或等於ΐχΐ〇·12Μ。 可藉由親和力ELISA檢驗測定親和力。在某些實施例 中’可藉由BIAcore檢驗測定親和力。在某些實施例中， 可藉由動力學方法測定親和力◎在某些實施例中，可藉由 152973.doc •53· 201132353 平衡/溶液法測定親和力。該等方法在本文中進一步詳細 描述或為此項技術中已知。 本發明之WISE結合劑較佳在本文所述之基於細胞之檢 驗及/或本文所述之活體内檢驗中調節WISE功能，及/或結 合於一或多種本文所述之抗原決定基及/或交叉阻斷本申 請案中所述抗體中之一者的結合及/或由本申請案中所述 抗體中之一者交又阻斷與WISE之結合。因此，該等結合 劑可使用本文所述之檢驗識別。 在某些實施例中，結合劑藉由首先識別結合於一或多種 本文提供之抗原決定基的抗體產生，及/或在本文所述之 基於細胞之檢驗及/或活體内檢驗中具有中和作用，及/或 交叉阻斷本申請案中所述之抗體及/或由本申請案中所述 抗體中之一者交叉阻斷與WISE之結合。此等抗體之CDR 區接著用於插入至適當生物相容構架中，以產生Wise結 合劑。結合劑之非CDR部分可由胺基酸構成，或可為非蛋 白質分子。本文所述之檢驗允許表徵結合劑。本發明結合 劑較佳為如本文所定義之抗體。 熟習此項技術者應理解，一些蛋白質（諸如抗體）在由宿 主細胞表現及分泌期間可經歷多種轉譯後修飾。此等修飾 之類型及程度通常視用於表現蛋白質之宿主細胞系以及培 養條件而定。該等修飾可包括糖基化之變化、甲硫胺酸或 色胺酸氧化、二酮基哌嗪形成、天冬胺酸異構化及天冬醯 胺脫醯胺化。常見修飾為由於羧基肽酶之作用失去羧基端 驗性殘基（諸如離胺酸或精胺酸）（如Harris，RJ. Journal of 152973.doc • 54 · 201132353
Chromatography 705:129-134，1995 中所述）。在蛋白質經 表現及處理後，其為『成熟』形式。因此，應理解本發明 包括由於表現本發明DNA而產生之成熟抗體。 本文揭示之抗體結合於對蛋白質之活體内活性重要的人 類WISE區，藉此抑制WISE活性。抗體與WISE之結合可與 腎功能相關之生物標誌物有關，該等生物標誌物為例如白 蛋白之尿液含量或24小時總尿液蛋白質排泄、血清肌酸酐 或肌酸酐清除率。熟習此項技術者已知建構及表現包含本 發明CDR之抗體及其片段的方法。 若寡肽或多肽之胺基酸序列與以下各物至少75%、 76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98% 或 99%— 致：表 1 中所描繪之 至少一種CDR ;及/或交叉阻斷至少一種本文所述抗體與 WISE之環2之結合及/或由至少一種本文所述之抗體交又阻 斷與WISE之結合的WISE結合劑之CDR ;及/或結合劑在基 於細胞之檢驗中可阻斷WISE之抑制作用或在基於細胞之 檢驗（亦即WISE中和結合劑）中活化WISE之作用的WISE結 合劑之CDR ;及/或結合於胱胺酸結結構域抗原決定基之 WISE結合劑的CDR，則該寡肽或多肽在本發明範疇内。 若WISE結合劑多肽及抗體之胺基酸序列與至少一種結 合於WISE之環2(例如Seq Id No. 9)的抗體之可變區至少 85%、86%、87%、88%、89%、90% ' 91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%—致，且交叉阻斷至 152973.doc -55- 201132353 少一種結合於WISE之環2的抗體之結合，及/或由至少一種 本文所述抗體交叉阻斷與WISE環2之結合；及/或在基於細 胞之檢驗中可阻斷WISE之抑制作用（亦即WISE中和結合 劑）；及/或結合於胱胺酸結結構域抗原決定基，則該等 WISE結合劑多肽及抗體在本發明範疇内。本發明亦涵蓋 經分離抗體或其片段，其中該WISE抗體或其片段可降低 至少一種以下參數：組織損傷及其標誌物、天狼星紅染色 或膠原蛋白產量、諸如aSMA或FSP-1之成肌纖維細胞標誌 物的表現、骨橋蛋白表現、蛋白尿，及/或在基於細胞之 檢驗中可改變WISE之活性。如本文所用，熟習此項技術 者將瞭解活性之改變包括活化或抑制。 若編碼WISE結合劑之聚核苷酸的聚核苷酸序列與編碼 抗體Ab-AA、Ab-AB及Ab-AC中至少一者的可變區之聚核 苷酸至少 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%—致，且 其中所編碼之WISE結合劑交又阻斷至少一種本文所述抗 體之結合；及/或在基於細胞之檢驗中可阻斷WISE之抑制 作用（亦即WISE中和結合劑）；及/或結合於胱胺酸結結構 域抗原決定基，則該等編碼WISE結合劑之聚核苷酸在本 發明範疇内。 一般技術人員可使用習知技術測定諸如抗體或結合搭配 物之結合劑的親和力以及結合劑（諸如抗體）抑制結合之程 度，該等習知技術為例如Scatchard等人（Ann. Ν·Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))所述之技術或表面電漿子共振 I52973.doc • 56 · 201132353 (SPR; BIAcore，Biosensor，Piscataway，N.J.)。對於表面電 衆子共振’將標粗分子固定於固相上且暴露於沿流槽流動 之移動相中的配位體。若配位體結合於經固定之標乾，則 局部折射率改變，導致SPR角改變，此可藉由偵測反射光 的強度改變即時監測。可分析SPR信號之變化速率，產生 結合反應之締合及解離相的表觀速率常數。此等值之比率 給出表觀平衡常數（親和力）（參看例如Wolff等人，Cancer Res. 53:2560-65 (1993))。 本發明抗體可屬於任何免疫球蛋白類別，例如IgG、 IgE、IgM、IgD或IgA。其可獲自或源自動物，例如家禽 (例如雞）及哺乳動物，包括（但不限於）小鼠、大鼠、倉 鼠、兔或其他齧齒動物、牛、馬、綿羊、山羊、路轮、人 類或其他靈長類動物。抗體可為内化抗體。抗體之製造一 般揭示於美國專利公開案第2〇〇4/〇146888 A1中。 特徵化檢驗
在本文所述之產生本發明抗體且包括將特異性環2 WISE 抗體CDR操縱至新構架及/或‘丨亙定區中之方法中，使用適 當檢驗選擇所要抗體或結合劑（亦即測定對WiSE之結合親 和力的檢驗’父又阻斷檢驗；基於Biacore之「人類WISE 肽抗原決定基競爭結合檢驗」；基於MC3T3-E1細胞之檢 驗；活體内檢驗）。 抗原決定基結合檢驗 未處理之人類WISE為具有信號肽之2〇6個胺基酸，且人 類WISE之成熟形式為含有胱胺酸結基元之丨83個胺基酸的 152973.doc -57· 201132353 醋蛋白。由於關鍵胺基酸殘基（特定言之半胱胺酸）保守， 因此咸k WISE之結構類似於先前所述之胱胺酸結蛋白 質。除胱胺酸結基元以外，此結構亦包括三個環，命名為 環1、環2及環3。如本文所用，環的位置定義為環丨大致處 於SEQ ID NO: 2之胺基酸75至1〇4處；環2大致處於胺基酸 105至132處；且環3大致處於SEQ ID NO:2之胺基酸134至 1 70處。應理解’大致位置意謂相對位置可能在所述位置 之羧基端或胺基端加或減3個胺基酸處。 人類WISE可經受蛋白水解消化，產生片段。簡言之， 使用不同蛋白酶（包括胰蛋白酶、Asp-N及Lys-C)產生具有 不同裂解位點及大小之片段。測定各種人類WISE肽之序 列及質量。評估抗體保護以測定對蛋白水解可接近性之作 用，包括切斷位點遮罩及肽移位，最後，進行基於 BIAcore之「人類WISE肽抗原決定基競爭檢驗」。 如基於Biacore之「人類WISE肽抗原決定基競爭結合檢 驗」所證明，一組抗體展現結合於特定抗原決定基之特定 模式。簡言之，抗體與待測試之抗原決定基在將使抗體上 之抗原決定基結合位點飽和的濃度下預培育。抗體接著暴 露於結合於晶片表面之WISE。在適當培育及洗務程序 後，建立競爭結合模式。 交叉阻斷檢驗 術語「交叉阻斷」（「cross_bl〇ck」、「cross_bl〇cked」及 「cross-blocking」）在本文中可互換使用，意謂抗體或其 他結合劑干擾其他抗體或結合劑結合WISE之能力。 152973.doc • 58 · 201132353 可使用競爭結合檢驗測定抗體或其他結合劑能夠干擾另 一抗體或結合劑結合WISE之程度，且因此判定其能否稱 為本發明之交又阻斷。一種尤其適合之定量檢驗使用可使 用表面電漿子共振技術量測相互作用程度之8丨£^01^機。另 一種適合之定量交叉阻斷檢驗使用基於ELISA之方法來量 測抗體或其他結合劑之間就結合於WISE而言的競爭。 亦預期一種類型之交叉阻斷檢驗適用於識別抑制WISE 與其受體LRP-5及LRP-6之結合的狀。舉例而言，已顯示 環2肽或使用半胱胺酸二硫鍵環化之環2肽抑制wise與其 受體之結合。 熟習此項技術者應瞭解，與交又阻斷有關之術語不欲視 作絕對阻斷，而是此項技術中理解為意謂由於測試分子亦 結合之區域中的先前結合產生之空間干擾或其他干擾而降 低結合，藉此降低測試分子之結合量的術語。因此，應瞭 解S測试抗體與標把之結合存在可彳貞測降低時，可能存在 交叉阻斷。結合中之此可偵測降低可小至15%、1〇%或 10%以下’視檢驗敏感性而定。
Biacore交叉阻斷檢驗 下文大體描述判定抗體或其他結合劑是否根據本發明交 又阻斷或是否能夠根據本發明交又阻斷的適合Biac〇r^^ 驗。為方便起見提及兩種抗體，但應瞭解，該檢驗可使用 本文所述之任何WISE結合劑。根據製造商建議操作 Biacore機（例如 Biacore 3000)。 因此，在X叉阻斷檢驗中，使用標準胺偶聯化學品將 152973.doc -59- 201132353 WISE偶聯至CM5 Biacore晶片，產生經WISE塗覆之表面。 通常，200-800共振單位之WISE將偶聯至晶片（容易產生可 量測程度之結合但可由所用測試試劑濃度容易地實現飽和 之量）。 在適合緩衝液中以1:1莫耳比之結合位點混合待評定彼 此交又阻斷之能力的兩種抗體（稱為A*及B*)，形成測試混 合物。當基於結合位點計算濃度時，假定抗體之分子量為 抗體之總分子量除以彼抗體上之WISE結合位點數。 各抗體於測試混合物中之濃度應足夠高，以容易地使 Biacore晶片上捕捉之WISE分子對彼抗體之結合位點飽 和。混合物中之抗體處於相同莫耳濃度下（以結合計）且該 濃度通常介於1 .〇〇微莫耳濃度與1 5微莫耳濃度之間（以結 合位點計）》 亦製備含有單獨抗體A*及含有單獨抗體B*之各別溶 液°此等溶液中之抗體A*及抗體B*應與測試混合物在相 同緩衝液中且在相同濃度下。 使測試混合物通過經WISE塗覆之Biacore晶片且記錄總 結合置°接著以移除結合之抗體而不破壞晶片結合之 WISE的方式處理晶片。通常，此藉由以3〇 mM HQ處理晶 片持續60秒來進行。 接著使單獨抗體A*之溶液通過經WISE塗覆之表面且記 錄結合量。再次處理晶片以移除所有結合之抗體而不破壞 晶片結合之WISE。 接著使單獨抗體B*之溶液通過經WISE塗覆之表面且記 152973.doc 201132353 錄結合量。 接著計算抗體A*與抗體B*之混合物的最大理論結合， 且其為各抗體單獨通過WISE表面時之結合的和。若實際 記錄之混合物結合小於此理論最大值，則兩種抗體彼此交 叉阻斷。 因此，一般而言，本發明之交叉阻斷抗體或其他結合劑 為在上述Biacore交叉阻斷檢驗中將結合於WISE，使得檢 驗期間且在第二抗體或本發明之其他結合劑存在下，所記 錄之結合在兩種抗體或結合劑組合時最大理論結合（如上 文剛定義）之80%與0.1%之間（例如80%至4%)，特定言之最 大理論結合之75%與0.1%之間（例如75%至4%)，且更特定 言之最大理論結合之70%與0.1 %之間（例如70%至4%)的交 叉阻斷抗體或結合劑。 上文所述之Biacore檢驗為用於判定抗體或其他結合劑是 否根據本發明彼此交叉阻斷之檢驗。在個別情形下，特定 抗體或其他結合劑可能不結合於經由胺化學品偶聯於CM5 Biacore晶片之WISE(此一般發生於WISE上之相關結合位 點由於偶聯至晶片而受到遮罩或破壞時）。在該等情形 中，可使用經標記型式之WISE(例如N端His標記之WISE) 判定交叉阻斷。在此特定格式中，抗His抗體將偶聯於 Biacore晶片，接著經His標記之WISE將通過晶片表面且由 抗His抗體捕捉。交叉阻斷分析將基本上如上文所述進 行，但在各晶片再生循環後，新的經His標記之WISE將加 載回經抗His抗體塗覆之表面上。除使用N端His標記之 152973.doc -61 - 201132353 WISE的既定實例以外，亦可替代使用C端His標記之 WISE。此外，此項技術中已知之多種其他標記及標記結 合蛋白組合可用於該交叉阻斷分析（例如具有抗HA抗體之 HA標記；具有抗FLAG抗體之FLAG標記；具有抗生蛋白 鏈菌素之生物素標記）。 基於Elisa之交叉阻斷檢驗 下文大體描述判定抗WISE抗體或其他WISE結合劑是否 根據本發明交叉阻斷或是否能夠根據本發明交叉阻斷的 ELISA檢驗。為方便起見提及兩種抗體，但應瞭解，該檢 驗可使用本文所述之任何WISE結合劑。 檢驗之一般原理為將抗WISE抗體塗覆於ELISA板之孔 上。添加過量之含潛在交叉阻斷之第二抗WISE抗體的溶 液（亦即未結合於ELISA板）。接著向各孔中添加有限量之 WISE。塗覆之抗體及溶液中之抗體競爭結合有限數目之 WISE分子。洗滌板以移除未與塗覆之抗體結合的WISE， 且亦移除第二溶液相抗體以及第二溶液相抗體與WISE之 間形成的任何複合物。接著使用適當WISE偵測試劑量測 結合之WISE的量。溶液中之抗體能夠交叉阻斷塗覆之抗 體，將能夠使塗覆之抗體可結合之WISE分子數目相對於 在無第二溶液相抗體存在下塗覆之抗體可結合之WISE分 子數目降低。 下文針對Ab-AA、Ab-AC及Ab-AE更詳細描述此檢驗。 在選擇Ab-AA為經固定抗體之情形中，將其塗覆於ELIS A 板的孔上，此後以適合阻斷溶液阻斷板，使隨後添加之試 152973.doc -62- 201132353 劑的非特異性結合降至最低。接著將過量Ab-AC添加至 ELISA板中，使得每孔Ab-AC WISE結合位點之莫耳數至 少為塗覆ELISA板期間每孔所用Ab-AA WISE結合位點之 莫耳數的10倍。 隨後添加WISE，使得每孔添加之WISE的莫耳數至多為 用於塗覆各孔之Ab-AA WISE結合位點之莫耳數的1/25。 在適合培育時段之後，洗滌ELISA板且添加WISE偵測試劑 以量測由塗覆之抗WISE抗體（在此情形下為Ab-AA)特異性 結合之WISE的量。該檢驗之背景信號定義為在具有塗覆 之抗體（在此情形下為Ab-AA)、第二溶液相抗體（在此情形 下為Ab-AB)、僅WISE緩衝液（亦即無WISE)及WISE偵測試 劑之孔中獲得的信號。該檢驗之陽性對照信號定義為在具 有塗覆之抗體（在此情形下為Ab-AA)、僅第二溶液相抗體 緩衝液（亦即無第二溶液相抗體）、WISE及WISE偵測試劑 之孔中獲得的信號。ELISA檢驗需要以使陽性對照信號至 少為背景信號之3倍的方式進行。 為了避免選擇何種抗體用作塗覆之抗體及何種抗體用作 第二（競爭劑）抗體所產生的任何偽訊（例如Ab-AA與Ab-AB 對WISE的親和力顯著不同），交叉阻斷檢驗需要以兩種形 式進行：1)形式1，其中第一抗體為塗覆於ELISA板上之抗 體且第二抗體為在溶液中之競爭劑抗體，及2)形式2，其 中第一抗體及第二抗體為塗覆及溶液形式顛倒。 基於細胞之中和檢驗 使用MC3T3-E1 SuperTopFlash(STF)報導體細胞測定 152973.doc -63- 201132353 WISE蛋白是否可調節wnt信號傳導。可使用藉由將培養基 換為分化培養基或藉由添加外源Wnt(諸如Wnt3a)誘發之任 一内源Wnt信號傳導觸發MC3T3-E1 STF細胞中TCF依賴性 號傳導的活化。源自大腸桿菌或哺乳動物細胞之重組 WISE蛋白可以劑量依賴方式抑制MC3T3-E1 STF細胞中之 Wnt信號傳導。 螢光素酶檢驗：將一小瓶MC3T3-E1/STF細胞塗於培養 燒瓶中之擴增培養基中。當細胞匯合時，將其以胰蛋白酶 處理’且將擴增培養基中之細胞塗於96孔板之各孔中。第 二天’移除所有擴增培養基，且替換為1〇〇 μΐ新鮮製備之 分化培養基。 隨後四天，每天將一半分化培養基（5〇 μΐ)替換為新鮮製 備之分化培養基。在分化5天後，所有培養基均替換為體 積為1 00 μΐ之新鮮分化培養基中之測試樣品。接著培育板 24小時’隨後量測螢光素酶信號。在自測試板移除培養基 且添加已平衡至室溫的20 μΐ 1倍溶解緩衝液之後量測螢光 素酶信號。密封板，且在室溫下搖動30分鐘，且向各孔中 添加1 00 μΐ螢光素酶檢驗試劑，且根據製造商之說明書使 用光度計（LMAX，Molecular Device)捕捉信號。 活體内中和檢驗 可量測與腎臟保護或肺保護有關或由其產生之多種參數 的提咼作為WISE結合劑活體内測試之結果，以識別能夠 中和WISE且提供治療益之結合劑。該等參數包括各種腎 臟/肺標誌物，及腎臟/肺健康之組織形態標誌物。WISE中 152973.doc -64- 201132353 和結合劑定義為能夠引起與刺激腎臟/肺保護有關或由其 產生之任何參數相較於經媒劑處理之動物的統計學顯著增 加之結合劑。該活體内測試可在任何適合哺乳動物（例如 小鼠、大鼠、猴）中進行。 治療劑之調配及傳遞 提供醫藥組合物，其包含一種上述結合劑（諸如至少一 種本文所述之人類WISE之抗體）以及醫藥學或生理學上可 接受之載劑'賦形劑或稀釋劑。 此項技術中熟知將本文所述之特定組合物用於多種治療 方案（包括例如皮下、經口、非經腸、靜脈内、鼻内及肌 肉内投與及調配）之適合給藥及治療方案的開發其中一 些出於一般說明目的在下文中簡單論述。 在某些應用中，本文揭示之醫藥組合物可經口投與傳遞 至動物。因此，此等組合物可與惰性稀釋劑或與同化性可 食用載劑一起調配，或可封入硬殼或軟殼明膠膠囊中，或 可壓成錠劑，或可與膳食直接合併。 在某些情形令’需要經皮下、非經腸、靜脈内、肌肉内 或甚至腹膜内傳遞本文揭示之醫藥組合物。該等方法為熟 練技術人員所熟知，其中一些進一步描述於例如美國專利 第5’543，158號；美國專利第5,641，515號及美國專利第 5’399,363號中。在某些實施例中’可在與界面活性劑（諸 如羥丙基纖維素）適合混合的水中製備呈游離鹼或藥理學 上可接受鹽形式的活性化合物之溶液，亦可於甘油、液2 聚乙二醇及其混合物及油中製備分散液。在一般儲存及使 152973.doc -65· 201132353 用條件下’此等製劑一般含有防腐劑以防止微生物生長。 適於注射用途之說明性醫藥形式包括滅菌水溶液或分散 液及用於臨用製備滅菌注射溶液或分散液之滅菌粉末 (例如參看美國專利第5,466,468號）。在所有情形中，該形 式均須滅菌且流動程度均須易於注射。其在製造及儲存條 件下須穩定，且須防止微生物（諸如細菌及真菌）之污染作 用。載劑可為溶劑或分散介質，含有例如水、乙醇、多元 醇（例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇，及其類似物）、其 適合混合物、及/或植物油。可例如藉由使用諸如印麟脂 之包衣，藉由保持所要粒徑（在分散液情形中）及/或藉由使 用界面活性劑來保持適當流動性。可藉由各種抗細菌劑及 抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氣丁醇、苯酚 '山梨 酸、硫柳汞及其類似物）幫助預防微生物之作用。在許多 it形中’較佳包括等張劑，例如糖或氣化鈉。可藉由在組 合物中使用延遲吸收劑（例如單硬脂酸鋁及明膠）來實現注 射組合物之長期吸收。 在-實施例中，對於在水溶液中非經腸投與而言，溶液 在必要時應經適當緩衝，且首先使用足量生理食鹽水或葡 萄糖使液體稀釋劑具等張性。此等特定水溶液尤其適於靜 脈内、肌肉内、皮下及腹膜内投與”尤此而言，熟習此項 技術者根據本發明將獲知可採用之無菌水性介質。舉例而 言’可將-劑量溶解w ml NaC1等張溶液中，且添加至 1000 ml皮下灌注液中或在建議之輸注位置注射（參看例如 Remington’s Phar職eutical 以⑻⑽’第 15版第⑼^ 152973.doc • 66 - 201132353 1038頁及第1570-1580頁）。視所治療個體之病狀而定，將 必要地出現一些劑量變化。此外，對於人類投與，製劑當 然較佳將滿足FDA生物製品標準組辦公室（FDA 〇ffice 〇f Biologies standards)所要求的無菌、發熱性及一般安全性 及純度標準。 在本發明之另一實施例中，本文揭示之組合物可以中性 或鹽形式調配。說明性醫藥學上可接受之鹽包括酸加成鹽 (與蛋白質之游離胺基形成），且其係與諸如鹽酸或磷酸之 無機酸形成’或與諸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸及其 類似物之有機酸形成。與游離羧基形成之鹽亦可衍生自諸 如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵 之無機驗及諸如異丙胺、三曱胺、組胺酸、普魯卡因 (procaine)及其類似物之有機鹼。在經調配後，溶液將以 與劑量調配相容之方式且以諸如治療有效量投與。 載劑可進一步包含任何及所有溶劑、分散介質、媒劑、 包衣、稀釋劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張及吸收延遲 劑、緩衝劑、載劑溶液、懸浮液、膠體及其類似物。此項 技術中熟知該等介質及試劑用於醫藥活性物質之用途。除 非任何習知介質或試劑與活性成分不相容，否則預期將其 用於治療性組合物中。補充活性成分亦可併入組合物中。 il藥學上可接受」一詞係指向人類投與時不產生過敏性 或類似非所要反應之分子實體及組合物。 在某些貫施例中’使用脂質體、奈米膠囊（nan〇capSule)、 4’粒 '脂質粒子、微脂粒及其類似物將本發明組合物引入 152973.doc -67- 201132353 至適合宿主細胞/生物體中。詳言之，本發明組合物可經 調配以供囊封於脂質粒子、脂質體、微脂粒、奈米球體或 奈米粒子或其類似物中來傳遞。或者，本發明組合物可共 價或非共價結合於該等載劑媒劑之表面。 熟習此項技術者一般已知作為潛在藥物載劑之脂質體及 脂質體樣製劑之形成及用途（參看例如Lask，。⑶心
Biotechnol. 16(7):307-21, 1998 ； Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691-95, 1998 ； Chandranf A · Indian J. Exp. Biol. 35(8).801-09, 1997 ； Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug
Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995； ® # ^.J ^ 5,567,434 號；美國專利第5,552，157號；美國專利第5,565,2i3號；美 國專利第5,738,868號及美國專利第5,795,587號，其各自以 全文引用的方式特定併入本文中）。脂質體之使用看似與 全身傳遞後的自體免疫反應或不可接受之毒性無關。在某 些實施例中，脂質體由分散於水性介質中之填脂形成，且 自發开v成多層同心雙層微脂粒（亦稱為多層微脂粒 (MLV))。 或者’在其他實施例中，本發明提供本發明組合物的醫 藥學上可接受之奈米膠囊調配物。奈米膠囊一般可以穩定 且可再現方式裹入化合物（參看例如Quintanar Guerrer〇等 人，Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12):1113-28, 1998)。為了避 免胞内聚合物超載引起之副作用’可使用能夠活體内降解 之聚合物設計該等超細粒子（大小約為〇1㈣。該等粒子 可例如 Couvreur等人，Crit. Rev Ther Dnjg _ I52973.doc -68· 201132353 5(1):1-20, 1988 ; zur Muhlen 等人，Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2).149-55, 1998 ; Zambaux等人，J Controlled Release 50(l-3):31-40，1998 ;及美國專利第 ^45,684號中 所述製備。 此外，本發明之醫藥組合物可與提供關於該等醫藥組合 物之使用的說明書之封裝材料一起置於容器内。一般而 言，該等說明書將包括有形表述，其描述試劑濃度，以及 在某些貫施例中，復原醫藥緻合物必需之賦形劑成分或稀 釋劑（例如水、生理食鹽水或PBS)的相對量。 所投與之劑量可在每公斤體重〇.〇1 mg至每公斤體重2〇〇 mg範圍内。典型劑量在3〇 mg/kg與乃mg/kg之間。然而， 熟習此項技術者將顯而易見’投與之量及頻率當然將視以 下因素而定，諸如所治療適應症之性質及嚴重程度、所要 反應、患者病狀等。通常，組合物可藉由如上文所述之多 種技術投與。 使用WISE結合劑之治療方法 「治療」為出於防止病症發展或改變病症病理之目的而 進行之介人1此，「治療」係指治療性處理及防治性或 f措紅m要治療者包括已患有病症者以及待預防病 :於治療目的之「哺乳動物」係指歸類為 ::物’包括人類、家畜及農畜、及動物園動物、運動型 =勿、或寵物型動物，諸如犬、馬、猫、母牛 物較佳為人類。 肖扎動 152973.doc -69· 201132353 如治療腎臟病症或疾病之情形中所使用，「治療有效 量」一詞欲指使腎臟損壞或惡化減輕、或使與腎病有關之 症狀（諸如纖維化及/或蛋白尿）的嚴重程度或進展減輕（亦 即k供「治療功效」）或如使用血清肌酸酐或肌酸酐清除 率所量測保持或改善腎功能的治療性或防治性Wise抗體 之量。如治療纖維化之情形中所使用，「治療有效量」一 °司欲彳s使肌瘤元件或其前驅物減少，及/或使與纖維變性 疾病（例如蛋白尿性腎小球疾病）有關之症狀的嚴重程度或 進展減輕（亦即提供「治療功效」）的治療性或防治性WISE 抗體之量。 在一實施例中，預期本發明組合物適用於治療、減輕 及/或預防腎功能障礙，包括選自由以下組成之群者：蛋 白尿性腎小球疾病、末期腎病、慢性腎病（諸如糖尿病性 腎病變、移植相關之移植物功能障礙、IgA腎病變、巴特 氏症候群（Bartter’s syndrome)、吉特曼症候群（Giteiman syndrome)、腎結石、腎澱粉樣變性、高血壓、原發性多 酸銅症又迪森氏病（Addison’s disease));腎衰竭；腎小 球腎炎及慢性腎小球腎炎：腎小管間質性腎炎；腎臟之囊 性病症及發育不良畸形’諸如多囊性疾病、腎發育不良及 皮質或髓質囊性病；遺傳性多囊腎病(pRD)，諸如隱性及 自體顯性PRD ;髓質囊性疾病；趙質海綿腎及腎小管發育 不良，亞伯氏症候群（Ab〇rt，s syndr〇me);影響腎臟生理 學之非腎癌，諸如肺支氣f腫瘤或大腦基底區腫瘤；多發 性骨髓瘤；腎臟之腺癌；轉移性腎癌；此外，腎毒性病 152973.doc 201132353 症，包括由攝取、注射、吸入或吸收的任何醫藥劑、化學 藥劑或生物藥劑引起的任何腎功能或形態改變…些廣泛 類另J之吊見腎毋性劑包括(但不限於)免疫抑制劑，諸如鈣 調神經磷酸酶抑制劑、重金属、所有類別之抗生素、止痛 劑'谷劑、草酸鹽沉著症誘發劑、抗癌藥、除草劑及殺蟲 劑、植物製劑及生物製劑、及抗癲癇藥。 「降低纖維變性之活性」一詞欲指完全或部分抑制肌瘤 形成或移除或減輕現有纖維化之能力。因此，在一實施例 中，預期本發明組合物適用於治療纖維變性疾病，包括病 理性纖維化或結瘢（包括心内膜硬化症）、特發性間質纖維 化間質肺纖維化、肌肉周圍纖維化、幹線型肝纖維化 (Symmers’ fibrosis)、周心纖維化（peHcentral fibr〇sis)、肝 λ、皮膚纖維瘤、膽汁性肝硬化症、酒精性肝硬化症、急 性肺纖維化、特發性肺纖維化、急性呼吸窘迫症候群、腎 纖維化/腎小球腎炎、腎纖維化/糖尿病性腎病變、硬皮病/ 全身性、硬皮病/局部、瘢痕瘤、肥厚性瘢痕、嚴重關節 黏連/關節炎、骨髓纖維化、角膜瘋痕、囊腫性纖維化、 肌肉萎縮症（杜興氏（duchenne，s))、心臟纖維化、肌肉纖維 化/視網膜脫離、食管狹窄及佩隆樂氏疾病（payr〇nles disease)»其他纖維變性病症可由手術誘發或起始，包括 瘢痕修復/整形手術、青光眼、白内障纖維化、角膜瘢 痕、關節黏連、移植物抗宿主疾病（例如移植患者中）、肌 腱手術、神經壓迫、杜普宜特朗氏攣縮（dupuytren，s contracture)、0B/GYN黏連/纖維化、盆腔黏連、硬膜外纖 -71- 152973.doc 201132353 维化、再狭窄。亦預期，沈積多種胞外基質蛋白質（包括 (但不限於）膠原蛋白及/或纖維結合蛋白）之纖維變性病狀 為可根據本發明治療之病因因素。特發性肺纖維化、博萊 黴素（bleomycin)肺、囊腫性纖維化及腎小球腎病變（包括 特徵在於例如腎臟中之膠原$白及/或纖維結合蛋白沈積 物最終導致腎衰竭之疾病）為亦可根據本發明治療之病狀 的實例。 本發明亦涵蓋對WISE之親和力小於丨χ 1〇_7 M且抑制 WISE活性之抗體，其係用於治療與纖維化有關之醫學病 狀的方法中，纟中纖維化可能與上文所論述之疾病(包括 肺病或腎臟疾病）有關。此外，亦涵蓋對Wise之親和力小 於1Χ10·7Μ且抑制_£活性的抗體，其適用於治療與蛋白 尿有關之醫學病狀的方法中。 本發明亦提供組合療法，其中向有需要之患者投與本發 明組合物與治療潛在疾病或減輕與所治療疾病有社症狀 的其他治療劑。此等其他療法可在投與本發明組合物的同 時、之前或之後投與。與本發明組合物組合使用之其他療 法包括ACE抑制劑、血管收縮素受體阻斷劑'红血 球生成素（例如Aranesp®(達貝泊汀（扣作邛⑽⑷）、
Epogen®(紅血球生成素叫、約調神經碟酸酶抑制劑、類 固醇、β阻斷劑及其類似物。 本發明亦提供診斷套組，其包含至少一種本發明之抗 WISE結合劑。結合劑可為抗體e此外，該套組可視情: 包含以下-或多者：⑴關於將一或多種結合劑用於篩二： 152973.doc -72· 201132353 診斷、預後、治療監測或此等應用之任何組合的說明書； (2)抗WISE結合劑之經標記結合搭配物；（3)固定有抗WISE 結合劑之固相（諸如試劑條）；及（4)指示用於篩選、診斷、 預後或治療用途或其任何組合之管理許可的標籤或插頁。 若未提供結合劑之經標記結合搭配物，則結合劑本身可經 一或多個可偵測標誌物，例如化學發光部分、酶部分、螢 光部分或放射性部分標記。 以下實例係以說明而非限制的方式給出。 實例
Wise及Wise環2突變體之構築體製備 藉由PCR引子自含有hWise之cDNA的DNA純系（NM_ 015464)擴增hWise。以Xbal及Notl限制酶消化表現載體以 及約641個鹼基對之PCR產物。接合適當片段，產生hWise 表現載體。 下文描述以hSost環2置換人類WISE之環2。hWise-hSost 環2嵌合蛋白質之選殖：藉由組合引子延伸與重疊PCR產 生取代突變。環2嵌合突變體的75 bp hWise環2經63 bp hSost環2取代。特定言之，使用hWise作為模板，hWise之 N端以引子擴增且延伸。hWise之C端以引子擴增且延伸。 在重疊PCR反應中將N端及C端片段用作模板。PCR產物以 Xbal及Notl限制酶消化，且次選殖至哺乳動物表現載體 中〇
在哺乳動物細胞中表現及純化小鼠及人類WISE 將一小瓶儲備培養物接種至搖瓶（125 ml，Plastic)中之 152973.doc -73- 201132353 10 ml培養基中，繼續培養2_3天；接著將培養物自l〇 mL 擴充至100 mL搖瓶中，且再自10〇 mi擴充成5〇〇 ml體積之 培養物。對於轉染，將細胞接種至1 L培養基中且生長直 至達到適當細胞密度。 製備轉染混合物，使用標準技術轉染細胞，且轉染後24 小時’向細胞中添加饋料。接著繼續再培養48小時，且藉 由在4〇00 rpm下旋轉30分鐘，接著經02 μΜ過濾器過濾來 採集條件培養基。接著取小樣品（丨ml)用於西方墨點分 析，且其餘冷凍以供純化。離心宿主細胞培養液（CCF)以 移除細胞碎片。接著過濾CCF上清液。 使肝素管柱裝載蛋白質，接著以PBS洗滌，直至流經物 在280 nm下之吸光度返回基線。接著使用含15〇爪皿至之m 氣化鈉之PBS的線性梯度自管柱溶離WISE蛋白，且收集溶 離伤。接著藉由庫馬斯藍（C〇omassie)染色之sds-PAGE檢 驗溶離份以識別含有多肽之溶離份，其在預定大小之 WISE下會遷移。合併管柱之適當溶離份以製備肝素池。 藉由逆向層析法進一步純化自肝素管柱溶離之WISE蛋 白。以22%乙醇製備肝素池，且使用乙酸調整至pH 5 〇。 過濾該池。接著將經過濾之肝素池裝載至平衡管柱上。裝 載後，洗滌管柱直至流經物在28〇 nm下之吸光度返回基 線。接著自管柱溶離WISE蛋白。 純化後’藉由透析於PBS中調配WISE。調配後，使 WISE經0.2 μιη無菌過濾器過濾，且儲存於4t下或冷凍。 抗原修飾及免疫 152973.doc •74- 201132353 使用完全弗氏佐劑（Complete Freund，s Adjuvant，Pierce) 或RIBI(Sigma)以1 ]比率乳化來自哺乳動物來源之人類 WISE蛋白，接著皮下及腹膜内免疫至WISE基因剔除小鼠 中。免疫至少每兩週進行一次，且在第3次免疫後取小鼠 之抗血清用於抗WISE效價分析。 融合 在融合之前4天，各小鼠以含Hu WISE蛋白之PBS腹膜内 加強。在融合當天，在無菌條件下移除脾臟，且將器官處 理成單細胞懸浮液。溶解紅血球，且以RpMl(Gibc〇)洗滌 脾細胞。將對數期生長之活骨髓瘤細胞與鼠類脾細胞以骨 趙瘤：脾細胞1:2.5之比率混合。接著在細胞融合培養基 C(Cytopulse Sciences Inc)中洗滌細胞2次。洗滌後，將細 胞以每毫升1 e7個細胞之最終密度懸浮於33%細胞融合培養 基C及67%内部產生之低滲透性融合緩衝液中。將此混合 物裝載至2 ml BTX融合室（Harvard Apparatus)中，接著經 受來自 BTX ECM 2001(Harvard Apparatus)之電融合條件。 自該等至移除細胞懸浮液且將其懸浮於細胞生長培養基 中。將每孔20 μΐ此細胞懸浮液塗於384孔細胞培養板 (Greiner)中’且在pi潮濕1〇% c〇2培育箱中培育隔夜。 第二天，向板之各孔中添加20 μΐ含有2X HAT(Sigma)之上 述生長培養基^將培養物培育7天’接著自各孔吸出生長 培養基且換為新鮮生長培養基。在更換培養基2_3天後， 開始篩選融合瘤上清液。 篩選 I52973.doc • 75· 201132353 以每孔25 μΐ 1 pg/ml由PBS中之山羊抗-μ IgG，Fc特異性 pAb(Pierce)組成之溶液塗覆高結合性透明聚苯乙稀384孔 板（Corning)。板與塗覆溶液一起在4°C下培育隔夜，接著 在自動板洗滌器上使用PBS +.05% Tween 20(Sigma)洗滌一 次。向各孔中添加50 μΐ阻斷溶液，且在4°C下培育隔夜。 向ELISA板之各孔中轉移5 μΐ融合瘤上清液，且在室溫 下培育60分鐘。接著使用上述方法洗滌板兩次。接著向板 之各孔中添加每孔20 μΐ 10 ng/ml人類WISE蛋白稀釋於阻 斷溶液中之溶液。在添加WISE抗原之後，在室溫下培育 ELISA板60分鐘，接著洗滌。接著，向各孔中添加每孔20 μΐ兔抗WISE-HRP Pab(Amgen)稀釋於阻斷溶液中之溶液， 且培育60分鐘，且洗滌板4次。 最後，向各孔中添加每孔20 μΐ TMB(Pierce)，且在650 nM下在Spectramax板讀取器（Molecular Devices)上對板讀 數。隨後使來自ELISA陽性融合瘤孔之細胞在細胞培養物 中擴增以供進一步特徵研究。
IgG之高產量純化 使用自動液體轉移平台（Bravo)將初級篩選期間識別之 ELISA陽性融合瘤純系轉移至96孔板中，且在37°C潮濕5% C02培育箱中生長3-5天。一旦達到足夠細胞質量，則藉由 自原始板轉移20 μΐ上清液將各板複製成8個板（96孔）。各 板之最終體積為200 μΐ。在37°C潮濕5% C02培育箱中培育 板7天。接著將融合瘤上清液收集至聚丙烯檢驗阻斷液（2 ml，Costar 3961)中，且在3500G下離心30分鐘。將不含細 152973.doc -76- 201132353 胞碎片之澄清上清液轉移至新檢驗阻斷液中，且與每孔70 μΐ蛋白質G加瓊脂糖（Calbiochem，目錄號IP08)—起在室溫 下在震盪器上培育隔夜。接著使用利用慣用軟體及真空歧 管系統之自動液體處理機器人分離及澄清含有經結合IgG 之蛋白質G樹脂。接著使用標準低pH值溶離及中和條件溶 離經結合IgG。所得經純化IgG經由A280吸光度定量。 識別環2黏合劑（Binder)之結合分析 收集抗WISE融合瘤上清液且添加至以1 pg/ml山羊抗小 鼠IgG Fc(Pierce)預塗覆之高結合性ELISA板上。板在室溫 下培育1小時。接著將板以洗滌缓衝液洗滌4次。隨後，添 加最終濃度為2 ng/ml之huWISE或人類WISE-hSost-環2嵌 合蛋白且在室溫下培育1小時。洗滌4次後，將兔抗WISE Pab 生物素（50 ng/ml)+NeutrAvidin-HRP(Pierce)添加至板 上，且在室溫下培育1小時。將板再以洗滌緩衝液洗滌4 次。根據製造商之說明書使用1步Ultra TMB-ELIS A受質 (Pierce)分析結合。 在基於MC3T3-El/STF-Luc細胞之檢驗中識別中和抗體 使用MC3T3-E1 SuperTopFlash(STF)報導體細胞判定 WISE蛋白質是否可調節Wnt信號傳導。可使用藉由將培養 基換為分化培養基或藉由添加外源Wnt(諸如Wnt3a蛋白）誘 發之任一内源Wnt信號傳導觸發MC3T3-El/STF-luc細胞中 TCF依賴性信號傳導之活化。重組WISE蛋白可以劑量依賴 性方式抑制]^03丁3-£1/8丁？-111〇細胞中之'\\^信號傳導。 將一小瓶^^〇3丁3-£1/8丁？-丨11<:細胞塗於培養燒瓶中之擴增 152973.doc -77- 201132353 培養基中。當細胞達到9〇_95%匯合時，將其以騰蛋白酶處 理，且將㈣培養基巾之細胞以每孔塗於％孔測試板 中。第二天，移除所有擴增培養基，且替換為100 μι新鮮 製備之分化培養基。隨後四天’每天將5G%分化培養基替 換為新鮮製備之分化培養基。在分化5天後，所有培養基 均替換為體積為100 μΐ之新鮮分化培養基中之測試樣品。 將wISE蛋白及WISE mab在3rc下預培^小時，隨後添加 至測試孔中《接著培育板24小時，隨後量測螢光素酶信 號。使用Promega螢光素酶檢驗系統量測螢光素酶信號。 自測試板小心移除培養基，以PBS沖洗細胞，且添加2〇 W 已平衡至室溫之1 X溶解緩衝液。密封板，且在室溫下搖動 30分鐘，且向各孔中添加1〇0 μι螢光素酶檢驗受質，且根 據製造商之說明書使用光度計（LMAX)捕捉信號。
表現及純化環2融合瘤CM 使用FACS分選分離來自ELISA陽性融合瘤孔之單細胞， 且將其置於每孔具有80 μΐ BDR培養基[50 ml融合瘤選殖因 子（8丨〇¥61^)、1乂〇?1培養基補充液（5丨811^)、55 014 2-
ME(Gibco)、10%低IgG FBS(Gibco)、IX pSG(Gibco)、BD 量子產率培養基（BD Bioscience)]之96孔板中。使此等細胞 生長直至達到足夠細胞質量。接著將細胞進一步擴增至每 孔具有1 ml BDR培養基之24孔板中。在24孔板匯合後，將 細胞轉移至每孔具有5 ml BDR培養基之6孔板中。培育5天 後，將一半細胞於FBS(超低IgG)+10% DMSO混合物中冷 凍以供備份。將另一半轉移至具有40 ml BDR培養基之τ- 152973.doc -78· 201132353 175燒瓶中且使其擴增。在Τ-175燒瓶匯合後，收集上清 液，過濾（.45 μιη CΑ過濾器）且用於純化。 自融合瘤細胞培養物純化WISE mAb用於活體外研究 自如下融合瘤細胞培養物純化WISE單株抗體（mAb)。所 有純化處理均在室溫或4°C下進行。一種純化機制用於純 化多種mAb且使用親和力層析法。 蛋白質G層析法 在l〇°C下，將宿主細胞培養液（CCF)在Beckman Coulter Allegra X-12R離心機中在1500 rpm下離心5分鐘以移除細 胞碎片。接著經無菌0.45 μπι過濾器過濾CCF上清液。此 時，可冷凍儲存經無菌過濾之CCF直至純化。若冷凍，則 CCF在40°C下解凍。在解凍後，CCF經無菌0.45 μιη過濾器 過濾，接著裝載至在室溫下在PBS中平衡的呈管柱形式之 蛋白質G層析介質（蛋白質G高效（GE Healthcare,先前為 Amersham Biosciences))上。 裝載後，蛋白質G管柱以PBS洗滌，直至流經物在280 nm下之吸光度返回基線。接著使用0.1 Μ乙酸鹽（pH 3)自 管柱溶離WISE mAb，且立即藉由每毫升溶離體積添加65 μί 1 M Tris驗之儲備溶液中和。監測溶離液在280 nm下之 吸光度，且收集含有蛋白質之溶離份以製備蛋白質G池。 調配及濃縮
在4°C下進行調配及濃縮步驟。純化後，藉由使用10,000 MWCO膜（Pierce Slide-A-Lyzer)透析在 A5Su(10 mM 乙酸 鈉，9%蔗糖，pH 5)中調配WISE mAb。若必需濃縮WISE 152973.doc •79- 201132353 mAb，則使用具有l〇,〇〇〇 MWCO膜之離心裝置（Vivascience Vivaspin)。或者，蛋白質G池可用緩衝液交換至A5Su中， 且使用單獨離心裝置濃縮。調配後，經無菌〇.2 μιη過濾器 過濾WISE mAb且將其儲存於40。(：下或冷凍。 WISE結合於LRP6且該結合可藉由中和抗wise環2抗體阻斷 使用AlphaScreen技術表徵WISE與推定受體LRP6之結 合。下文描述詳細檢驗程序： 每天遵循與AlphaScreen組胺酸（Nickel Chelate)偵測套組 (PerkinElmer)—起提供之說明書新鮮製備以緩衝液。 以lx緩衝液稀釋生物素標記huWise、生物素標記 huWise-huSost-環 2、rmLRP6-His6(R&D Systems)、抗 Wise 環2抗體之工作溶液直至達到各蛋白質及抗體反應所需最 終濃度之3倍。 將各5 μΐ Wise或Wise-huSost-環2及LRP6工作溶液分配 至白色不透明OptiPlate-384微定量板（PerkinElmer)的適當 孔中。在室溫下在溫和震盪下使Wise與LRP6反應1小時 後’向彼等適當孔中添加5 μΐ各連續稀釋之抗體工作溶 液，使反應繼續。根據相同說明書製備生物素標記 His6(陽性對照，與套組一起提供）連續稀釋液及鎳螯合接 受體及抗生蛋白鏈菌素供體珠粒（與套組一起提供）工作溶 液。抗體與LRP6競爭結合Wise持續60分鐘後，將15 μΐ各 連續稀釋之生物素標記His6溶液分配於板之空孔中。最終 將5 μ丨各供體及接受體珠粒工作溶液分配至所有樣品及對 照孔中’在室溫下在暗處再培育1小時，且在Enyisi〇n微 152973.doc •80· 201132353 定量板分析器上分析。 建構hWise環2 Ala突變體 丙胺酸篩選突變誘發已成功用於系統地定位功能性結合 抗原決定基。全長形式之WISE為206個胺基酸，且成熟形 式之hWISE為含有胱胺酸結基元及命名為環1、環2及環3 之三個環的183個胺基酸之醣蛋白。環2大致處於全長人類 WISE之胺基酸1〇5至132處及成熟形式之人類WISE的胺基 酸82至109處。將自hWISE環2中之位置107至129識別的總 計23個胺基酸殘基換為丙胺酸。 藉由定點突變誘發使用長度為24-30個核苷酸之寡脫氧 核苷酸引子及野生型hWISE質體DNA作為模板產生丙胺酸 篩選hWISE環2基因。如QuikChange定點突變誘發套組 (Stragagene)中所述進行反應。各突變體直接形成於哺乳 動物表現載體中。對丙胺酸突變構築體進行序列確認且將 其轉染至哺乳動物宿主細胞中以供短暫產生突變蛋白質。 單個胺基酸突變對蛋白質表現無作用。 下文列出具有胺基酸改變之代表性丙胺酸取代：
Seq Id No.: 2之胺基酸107處白胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸108處脯胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸109處纈胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸110處白胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No·: 2之胺基酸111處脯胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸112處天冬醯胺換為丙胺酸0 152973.doc -81 - 201132353
Seq Id No.: 2之胺基酸113處色胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸114處異白胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸115處甘胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸116處甘胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸117處甘胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸118處酪胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸119處甘胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸120處蘇胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No·: 2之胺基酸121處離胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸122處酪胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸123處色胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸124處絲胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸125處精胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸126處精胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸127處絲胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No.: 2之胺基酸128處絲胺酸換為丙胺酸。
Seq Id No·: 2之胺基酸128處麩醯胺酸換為丙胺酸。 環2黏合劑之抗原決定基定位及對結合關鍵之殘基 對hWISE環2區進行丙胺酸篩選突變誘發，且總共產生 23個突變體，且活體外檢驗抗體結合及功能性特徵。 比較藉由中和抗體或非中和抗體相對捕捉之個別WISE 突變蛋白質或野生型蛋白質，評定任何此等單個胺基酸改 變是否影響抗體與WISE蛋白之結合。接著使用對抗WISE 之HRP結合之親和力純化多株抗體偵測經結合WISE蛋白。 I52973.doc * 82 - 201132353 將經純化抗WISE抗體（0.5 gg/ml)添加至以1 pg/ml山羊 抗小鼠IgGFc(Pierce)預塗覆之高結合性ELISA板上。板在 室溫下培育1小時。接著將板以洗滌緩衝液洗滌4次。隨後 添加來自短暫轉染培養物（100倍稀釋）之丙胺酸篩選之 WISE環2突變體上清液，且在室溫下培育1小時。洗滌4次 後，將兔抗 WISE Pab 生物素（50 ng/ml)+NeutrAvidin-HRP(Pierce，目錄號31001)添加至板上，且在室溫下培育1 小時。將板再以洗滌緩衝液洗滌4次。根據製造商之說明 書使用1步Ultra TMB-ELISA受質（Pierce，目錄號34028)分 析結合。 將一組環2結合抗體應用於丙胺酸突變體，且識別出對 此等抗體之結合重要之特定胺基酸。此等胺基酸包括一或 多種選自由以下組成之群的胺基酸：SEQ ID NO: 2之胺基 酸殘基112之天冬醯胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基114 之異白胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基11 5之甘胺酸、 SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基117之甘胺酸、SEQ ID NO: 2 之胺基酸殘基119之甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基 121之離胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基123之色胺酸、 SEQ ID NO: 2之胺基酸殘基126之精胺酸或SEQ ID NO: 2 之胺基酸殘基129之麩醯胺酸。 此等資料提供僅一個上述殘基突變的實例顯著降低 WISE抗體與WISE蛋白之結合。可設想，上述殘基之組合 對特定環2結合抗體之最佳結合而言可能重要。然而，單 個殘基可能足以賦予抗體與WISE之環2的結合。 152973.doc -83- 201132353 選殖鼠類抗huWISE抗體重鏈及輕鏈 藉由稱為5’ RACE(快速擴增cDNA末端）之聚合酶鏈反應 (PCR)擴增技術獲得鼠類抗人類WISE輕鏈及重鏈可變區之 序列。使用TRIzol試劑（Invitrogen)自六個表現人類WISE 結合單株抗體 Ab-AA、Ab-AB、Ab-AC、Ab-AD、Ab-AE 及Ab-AF之鼠類融合瘤分離總RNA，隨後使用RNeasy Mini 套組（Qiagen)進一步純化。使用 GeneRacer套組（Invitrogen) 製備寡dT預致敏之第一股RACE ready cDNA。使用 Phusion HF DNA 聚合酶（Finnzymes)進行 cDNA 之 PCR 擴 增。將RACE PCR產物選殖至pCR4-TOPO(Invitrogen)及其 使用ABI DNA定序設備（Perkin Elmer)測定之序列中。使用 Vector NTI Advance 10軟體（invitrogen)測定共同序列。 鼠類人類抗WISE抗體之人類化 使用直鏈CDR移植至VK1|018接受體構架中之輕鏈vl人 類化Ab-AB。使用A24T、R71A及A93T處具有鼠類殘基之 CDR移植至VH111-46接受體構架中的重鏈vl人類化Ab Ab-AB 。 亦使 用具有 F71Y及 Y87F 回 復突變 之輕鍵 v2 人類化 Ab-AB。使用具有額外V2I、VTM 67、68、69至AKL及 V78A的重鏈v2及vl(分別為seq Id No.: 114及116以及Seq
Id No.: 118及 120)人類化 Ab-AB。 使用直鏈CDR移植至VK4|B3接受體構架中之輕鍵vl人類 化Ab-AI。使用具有S30T回復突變之重鏈vl人類化Ab-AI。亦引入回復突變，因為Ab-AI亦使用具有Y49S回復突 變之輕鏈v2(Kabat)人類化。使用直鏈CDR移植至VH2|2-70 I52973.doc •84- 201132353 接受體構架中之重鏈v2(Seq Id No_: 122及124以及Seq Id No.: 126 及 128)人類化 Ab-AI。 使用直鏈CDR移植至VK4|B3接受體構架中之輕鏈人類化 Ab-AJ。使用重鏈CDR移植至VHl|l-46接受體構架中人類 化Ab-AJ，其中鼠類殘基固定於Kabat位置27、28、29、 30、71、93、94(Y27F、T28N、F29I、T30K、R71A、 A93N、R94F)(Seq Id No.: 110及 112) ° 上述抗體之人類化輕鏈及重鏈亦可互換，且描繪為重鏈 及輕鏈對之相應核酸序列如下表4中Seq Id No.: 11 0及 112(hz Ab-AJ)、Seq Id No.: 114及 116(hz Ab-AB vl ;分別 為 LC1 及HC1)、Seq Id No.: 118及 116(hz Ab-AB v2 ;分別 為 LC2及HC1)、Seq Id No.: 114及 120(hz Ab-AB v3 ;分別 為 LC1 及 HC2)、Seq Id No·: 118 及 120(hz Ab-AB v4 ;分別 為 LC2及 HC2)、Seq Id No.: 1 22及 1 24(hz Ab-AI v 1 ;分別 為 LC1 及 HC1)、Seq Id No.: 126 及 124(hz Ab-AI v2 ;分別 為 LC2 及 HC1)、Seq Id No.: 122 及 128(hz Ab-AI v3 ;分別 為 LC1 及 HC2)、以及 Seq Id No·: 126及 128(hz Ab-AI v4 ; 分別為LC2及HC2)所示。 圖29中顯示使用WISE之人類化抗體的MC3T3報導體檢 驗。Ab-R以引用國際專利申請案W02009/070243的方式併 入。人類化WISE環2 mab之MC3T3E1-STF表現：所有資料 均表示為相對於對照組校正之總螢光素酶信號％。Mab與 300 ng/ml huWISE—起培育。在培育後24小時，根據製造 商之說明書使用發光受質（Luciferase Assay System， 152973.doc -85 - 201132353
Promega E4530)分析報導體基因表現。 自Fab-3 10噬菌體文庫分離D14 在隨後幾輪中針對5 pg/ml、0.5 pg/ml及0.025 pg/ml生物 素標記之重組人類WISE淘選Fab-3 10嗤菌體文庫（Dyax Corp)。自第3輪分離D14，洗滌池隔夜。分離包括結合於 huWISE之D14的53個獨特Fab噬菌體且將其轉化成IgG2。 在MC3T3-E1功能性檢驗中測試此等IgG2分子。D14顯示對 huWISE的抑制活性最佳。 D14 IgG2之親和力成熟 對D14 IgG2進行親和力成熟以提高抑制活性。藉由隨機 突變誘發使重鏈（31個位置）及輕鏈（29個位置）之所有CDR 中之每個殘基發生突變。藉由0ctet QK(ForteBi〇)上之親 和力量測使用粗條件培養基樣品及以生物素標記之人類 WIES塗覆之抗生蛋白鏈菌素生物感測器識別出提高與人 類WISE之結合的5個位置中之7個重鏈突變及6個位置中之 10個輕鏈突變^ L34、L36、H66及H127為4個頂部單個殘 基突變。藉由在293 6E細胞中短暫轉染在基質中配對有益 重鏈犬變及輕鍵突變’產生進一步改良之雙重突變體 (DM ’ 一個突變在重鏈中且—個突變在輕鏈十）。選擇丨〇個 DM突變體。藉由重疊Pcr獲得2個最佳重鏈突變（H66及 H127)。所得具有雙重突變之重鏈與L34或L36配對產生兩 個三重突變體（TM1及TM2)。 與糖尿病性腎病變有關之腎功能障礙之進展的WISE抗體 治療 I52973.doc -86 - 201132353 藉由組合產生2型糖尿病但無進展性腎病之GK大鼠與產 生進展性腎病但無2型糖尿病之FHH大鼠的基因組產生 T2DN大鼠模型。在早期發作之糖尿病後約“固月大之 T2DN大鼠中產生明顯蛋白尿，且蛋白尿程度隨著大鼠年 齡逐漸變得更嚴重。伴有18個月大時腎小球肥大、腎小球 及腎小管基底膜增厚、腎小球膜基質擴增、及產生局部隨 後彌漫性整體腎小球硬化、及形成腎小球節結。 在形成嚴重腎小球損傷（包括腎小球肥大及局部區段性 腎小球硬化）且由於腎小球膜基質擴增及毛細管填充使得 腎小球叢局部黏連於腎球囊（B〇wman，s capsule)2 12個月 大的大鼠中測試此模型中WISE抗體對腎功能障礙進展之 作用。12個月大時，T2DN大鼠之腎小球亦展現腎小球膜 基質擴增及出現過碘酸·希夫（Schiff)陽性物質（參看
Diabetes 53: 73 5-742)。為了加速疾病進展，對大鼠進行單 側腎切除（左腎，用作組織學基線）。 手術之後兩週及即將開始處理之前量測各個別大鼠中之 蛋白尿程度’且用於將動物隨機分成4組：丨）原生組，無處 理’ π=1〇 ; 2)賴諾普利（Lisinopril)(每天每公斤飲用水中20 mg ’ π=12)且用作降低蛋白尿之陽性對照；3)同型匹配對 照IgGl(20 mg/kg，腹膜内注射’在抗體稀釋緩衝液中每 週3次，n=i2) ; 4)WISE抗體（20 mg/kg，IP注射，在抗體 稀釋緩衝液中每週3次，n=l2)。在基線時及在代謝籠中每 兩週收集尿液樣品，且在測試或冷凍之前等分。在基線 時 '處理後第8週、處理後第14週、及處理後第16週最終 152973.doc -87- 201132353 屍體剖檢時收集血清樣品。在屍體剖檢時，對右腎進行處 理以供組織學檢查（一半，H&E，Masson's Trichrome)及蛋 白質/RNA檢查（另一半）。評估對蛋白尿、腎小球及間質纖 維化以及腎功能之影響。 以WISE抗體處理相對於以IgG對照組處理顯著抑制腎小 球及間質損傷之進展；且接受WISE抗體之大鼠相對於基 線時觀測到之水準保持及增強腎功能（4%)，而原生組或對 照IgG處理組之大鼠的腎功能（估算之肌酸酐清除率）相對 於基線水準分別降低27%及23%。因此，預期WISE抗體對 降低腎臟損傷及保持或改善以下疾病之腎功能具有治療性 應用：如糖尿病性腎病變，其中腎功能障礙由糖尿病、高 血壓或兩者之組合引起；及腎臟損傷由嚴重蛋白尿引起之 疾病；以及重生纖維化或正在進行之纖維化導致進展性腎 臟或移植物功能障礙的疾病，包括（但不限於）高血壓性腎 臟疾病、及移植相關之同種異體移植纖維化。 WISE環2抗體之結合形態 圖20-28描繪結合於環2區之抗WISE抗體的結合形態。 圖20描繪針對WISE突變體之Ab-AB。圖21描繪針對WISE 突變體之Ab-AE。圖22描繪針對WISE突變體之Ab-AG。圖 23描繪Ab-AI。圖24描繪針對WISE突變體之Ab-AC。圖25 描繪針對WISE突變體之Ab-AA。圖26描繪針對WISE突變 體之Ab-AH。圖27描繪針對WISE突變體之Ab-AJ。圖28描 繪針對WISE突變體之Ab-AF。 圖20-28中之突變體表示為天然存在之胺基酸，隨後為 152973.doc -88 - 201132353 WISE蛋白中胺基酸位置之編號’及隨後為突變（例如A = 丙胺酉文）。因此，LI 10A應理解為表示SEq id NO: 2之位置 110之白胺酸突變成丙胺酸之突變。Nil 2A為SEQ ID NO: 2 之位置112之天冬醯胺酸突變為丙胺酸。1114人為SEq id NO: 2之位置114之異白胺酸突變為丙胺酸。
• ID N0: 2之位置115之甘胺酸突變為丙胺酸。G116A為SEQ ID NO: 2之位置116之甘胺酸突變為丙胺酸。G117A為SEQ ID NO: 2之位置in之甘胺酸突變為丙胺酸β K121A為SEQ ID NO: 2之位置121之離胺酸突變為丙胺酸^ δ128Α為SEQ ID NO: 2之位置128之絲胺酸突變為丙胺酸。wiSE-Scl L2 描繪環2區已經SOST環2置換的人類WISE蛋白。較高吸光 度表示結合，而較低吸光度表示減少之結合。 某些殘基之突變導致與突變WISE蛋白之結合減少，表 明抗體需要天然存在之殘基來結合。Ab-AB對G117A之結 合減少（圖20)。Ab-AE對I114A之結合減少（圖21)。Ab-AG 對I114A及K121A之結合減少（圖22)。Ab-AI對G115A及 G117A之結合減少（圖23) » Ab-AC對G115A及G117A之結合 減少（圖 24)。Ab-AA對 N112A、I114A、G115A及 K121A之 結合減少（圖25)。Ab-AH對N112A及I114A之結合減少（圖 26)。Ab-AJ對 L11A、N112A及 G117A之結合減少（圖 27)。 Ab-AF對 L11A、N112A 及 G117A之結合減少（圖 28)。 因此，本發明之經分離抗體包括經由以下一或多者結合 於WISE之抗體：SEQ ID NO: 2之胺基酸110之白胺酸、 SEQ ID NO: 2之胺基酸112之天冬醯胺酸、SEQ ID NO: 2 152973.doc -89- 201132353 之胺基酸114之異白胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸115之甘 胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸116之甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸117之甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸119之甘 胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸121之離胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸123之色胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸126之精 胺酸、SEQ ID NO·· 2之胺基酸128之絲胺酸、或SEQ ID NO: 2之胺基酸129之麩醯胺酸。熟習此項技術者應理解， 基於本文所述之方法，可藉由在指定位置處產生突變，接 著使結合降低來識別藉由或經由殘基結合之抗體。降低之 結合由例如Ab-AJ代表’其在約2之吸光度下結合原生 WISE。殘基L110A或N112A或G117A之突變導致吸光度降 至約1.5或1.5以下（圖27)。 •雖然已根據一些實施例描述本發明之組合物及方法，但 熟習此項技術者將顯而易見，變更可在不悖離本發明之概 念、精神及範疇的狀況下應用於本文所述之組合物及/或 方法及應用於本文所述之方法的步驟或步驟順序中。更特 定言之，將顯而易見某些化學上及生理學上相關之藥劑可 取代本文所述之藥劑，同時將實現相同或相似結果。熟習 此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改應視為 在如隨附申請專利範圍所定義之本發明之精神、範疇及概 念内。 本文全文以向本文所述内容提供例示性程序或其他細節 補充的程度引用之參考文獻均以引用的方式較併入本文 中。尤其提及國際申請案侧2〇〇9/〇7〇243中之抗體， 152973.doc •90· 201132353 該案以全文引用的方式併入本文中。 【圖式簡單說明】 圖1 :需要環2結合於WISE之抗體的識別； 圖2 :在基於細胞之檢驗中識別中和環2抗體。蛋白質濃 度為：0_3 pg/ml hWISE及 3 pg/ml Ab ; 圖3 :中和抗Wise環2抗體抑制Wise-Lrp6結合； 圖4 :用於量測Ab-AA與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab-AA結合於板。Ab-C、Ab-T、Ab-S及Ab-P為先前識別 之對照抗體且包括於此圖及隨後各圖中； 圖5 :用於量測Ab-AB與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab-AB結合於板； 圖6 :用於量測Ab-AC與hWISE之競爭性結合之檢驗。 A b - A C結合於板； 圖7 :用於量測Ab-AD與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab-AD結合於板； 圖8 :用於量測Ab-AE與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab-AE結合於板； 圖9 :用於量測Ab-AF與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab-AF結合於板； 圖10 :用於量測Ab-S與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab - S結合於板； 圖11 :用於量測Ab-與hWISE之競爭性結合之檢驗。Ab-S結合於板； 圖12 :用於量測Ab-S與hWISE之競爭性結合之檢驗。 152973.doc -91 - 201132353
Ab-S結合於板； 圖13 :用於量測Ab-S與hWISE之競爭性結合之檢驗。 Ab-S結合於板； 圖14 :顯示hWISE抗體與突變hWISE之相對結合的結合 檢驗，其中環2中之殘基個別地突變成丙胺酸。編號小於1 指示減少之結合。HuWISE-HuSost-環2為對照多肽，其為 hWISE之嵌合體且具有HuSost環2(參看實例）。『WT殘基』 指示胺基酸已轉化成丙胺酸。此等殘基分別對應於Seq Id No: 9中之胺基酸4至25 ; 圖15 :在T2DN模型中，WISE抗體治療保持腎功能； 圖16 :在T2DN模型中，WISE抗體治療保持腎功能； 圖1 7 :在T2DN模型中，WISE抗體治療抑制腎小管-間質 損傷； 圖18 :在T2DN模型中，WISE抗體治療抑制腎小球損 傷； 圖19 :在T2DN模型中，WISE抗體治療對已確立之蛋白 尿無影響； 圖20 : WISE環2 Mab(Ab-AB)對WISE突變體之結合形 態； 圖21 : WISE環2 Mab(Ab-AE)對WISE突變體之結合形 態； 圖22 : WISE環2 Mab(Ab-AG)對WISE突變體之結合形 態； 圖23 : WISE環2 Mab(Ab-AI)對WISE突變體之結合形 152973.doc •92· 201132353 態； 圖24 : 態； 圖2 5 · 態； 圖26 : 態； 圖27 : 態； 圖2 8 . 態；及 圖29 : MC3T3E1 WISE 環 2 Mab(Ab-AC)對 WISE突變體之 WISE 環 2 Mab(Ab-AA)對 WISE突變體之 WISE 環 2 Mab(Ab-AH)對 WISE突變體之 WISE 環 2 Mab(Ab-AJ)對 WISE突變體之 WISE 環 2 Mab(Ab-AF)對 WISE突變體之 顯示抗體活性之人類化WISE環2 -STF表現。 結合形 結合形 結合形 結合形 結合形 mab的 152973.doc -93- 201132353 序列表 <110〉美商安美基公司 <120〉WISE結合劑及抗原決定基
<130> A-1532-W0-PCT <140> 099144615 <141> 2010-12-17 <150> 61/288,171 <151> 2009-12-18 <160> 138 <170> Patentln version 3. 5 <210〉 1 <211〉 673 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 1 atgcttcctc ctgccattca tttctatctc cttccccttg catgcatcct aatgaaaagc 60 tgtttggctt ttaaaaatga tgccacagaa atcctttatt cacatgtggt taaacctgtt 120 ccagcacacc ccagcagcaa cagcacgttg aatcaagcca gaaatggagg caggcatttc 180 agtaacactg gactggatcg gaacactcgg gttcaagtgg gttgccggga actgcgttcc 240 accaaataca tctctgatgg ccagtgcacc agcatcagcc ctctgaagga gctggtgtgt 300 gctggcgagt gcttgcccct gccagtgctc cctaactgga ttggaggagg ctatggaaca 360 aagtactgga gcaggaggag ctcccaggag tggcggtgtg tcaatgacaa aacccgtacc 420 cagagaatcc agctgcagtg ccaagatggc agcacacgca cctacaaaat cacagtagtc 480 actgcctgca agtgcaagag gtacacccgg cagcacaacg agtccagtca caactttgag 540 agcatgtcac ctgccaagcc agtccagcat cacagagagc ggaaaagagc cagcaaatcc 600 agcaagcaca gcatgagtta gctcgagggg cggatccccc gggctgcagg aattcgatat 660 caagcttgct age 673 152973-序列表.doc 201132353 〈210> 2 <211〉 206 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 2
Met Leu Pro Pro Ala lie His Phe Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Cys lie 15 10 15
Leu Met Lys Ser Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu lie Leu 20 25 30
Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Pro Ala His Pro Ser Ser Asn Ser 35 40 45
Thr Leu Asn Gin Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Asn Thr Gly 50 55 60
Leu Asp Arg Asn Thr Arg Val Gin Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80
Thr Lys Tyr He Ser Asp Gly Gin Cys Thr Ser He Ser Pro Leu Lys 85 90 95
Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn 100 105 110
Trp He Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser 115 120 125
Gin Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gin Arg He Gin 130 135 140 152973-序列表.doc 201132353
Leu Gin Cys Gin Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys lie Thr Val Val 145 150 155 160
Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gin His Asn Glu Ser Ser 165 170 175
His Asa Phe Glu Ser Met Ser Pro Ala Lys Pro Val Gin His His Arg 180 185 190
Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser Met Ser 195 200 205 〈210〉 3 <211〉 627 <212〉 DNA <213〉小家鼠 〈400〉 3 atgcttcctc ctgccattca tctctctctc attcccctgc tctgcatcct gatgagaaac 60 tgtttggctt ttaaaaatga tgccacagaa atcctttatt cacatgtggt taaacctgtc 120 ccggcacacc ccagcagcaa cagcaccctg aatcaagcca ggaatggagg caggcatttc 180 agtagcactg gactggatcg aaacagtcga gttcaagtgg gctgcaggga actgcggtcc 240 accaaataca tttcggacgg ccagtgcacc agcatcagcc ctctgaagga gctggtgtgc 300 gcgggcgagt gcttgcccct gccggtgctt cccaactgga tcggaggagg ctatggaaca 360 aagtactgga gccggaggag ctctcaggag tggcggtgtg tcaacgacaa gacgcgcacc 420 cagaggatcc agctgcagtg tcaggacggc agcacgcgca cctacaaaat caccgtggtc 480 acggcgtgca agtgcaagag gtacacccgt cagcacaacg agtccagcca caactttgaa 540 agcgtgtcgc ccgccaagcc cgcccagcac cacagagagc ggaagagagc cagcaaatcc 600 agcaagcaca gtctgagcta gctcgag 627 152973·序列表.doc 201132353 <210〉 4 <211> 206 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 4
Met Leu Pro Pro Ala He His Leu Ser Leu He Pro Leu Leu Cys He 15 10 15
Leu Met Arg Asn Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu He Leu 20 25 30
Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Pro Ala His Pro Ser Ser Asn Ser 35 40 45
Thr Leu Asn Gin Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Ser Thr Gly 50 55 60
Leu Asp Arg Asn Ser Arg Val Gin Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80
Thr Lys Tyr lie Ser Asp Gly Gin Cys Thr Ser He Ser Pro Leu Lys 85 90 95
Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn 100 105 110
Trp He Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser 115 120 125
Gin Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gin Arg lie Gin 130 135 140 152973·序列表.doc 201132353
Leu Gin Cys Gin Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys lie Thr Val Val 145 150 155 160
Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gin His Asn Glu Ser Ser 165 170 175
His Asn Phe Glu Ser Val Ser Pro Ala Lys Pro Ala Gin His His Arg 180 185 190
Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser Leu Ser 195 200 205 <210〉 5 〈211〉 629 <212> DNA <213〉褐家鼠 <400> 5 atgcttcctc ctgccattca tctctctctc attcccctgc tctgcatcct gatgaaaaac 60 tgtttggctt ttaaaaatga tgccacagaa atcctttatt cacatgtggt taaacctgtt 120 tcagcacacc ccagcagcaa cagcaccttg aatcaagcca ggaatggagg caggcacttc 180 agtagcacgg gactggatcg aaatagtcga gttcaagtgg gctgcaggga actgcggtcc 240 accaaataca tctcggatgg ccagtgcacc agcatcagcc ctctgaagga gctggtgtgc 300 gcgggtgagt gcttgccctt gccagtgctt cccaactgga tcggaggagg ctacggaaca 360 aagtactgga gccggaggag ctcccaggag tggcggtgtg tcaacgacaa gacgcgcacc 420 cagagaatcc agctgcagtg tcaggacggc agcacacgca cctacaaaat caccgtggtc 480 acagcgtgca agtgcaagag gtacacccgg cagcacaacg agtccagcca caactttgaa 540 agcgtgtctc ccgccaagcc cgcccagcac cacagagagc ggaagagagc cagcaaatcc 600 agcaagcaca gtctgagcta ggcggccgc 629 152973-序列表.doc 201132353 <210〉 6 <211〉 206 <212> PRT <213〉褐家鼠 <400〉 6
Met Leu Pro Pro Ala He His Phe Tyr Leu Leu Pro Leu Ala Cys He 15 10 15
Leu Met Lys Ser Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu lie Leu 20 25 30
Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Pro Ala His Pro Ser Ser Asn Ser 35 40 45
Thr Met Asn Gin Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Asn Thr Gly 50 55 60
Leu Asp Arg Asn Thr Arg Val Gin Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80
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Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn 100 105 110
Trp He Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser 115 120 125
Gin Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gin Arg He Gin 130 135 140 6- 152973·序列表.doc 201132353
Leu Gin Cys Gin Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys He Thr Val Val 145 150 155 160
Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gin His Asn Glu Ser Ser 165 170 175
His Asn Phe Glu Ser Met Ser Pro Ala Lys Pro Val Gin His His Arg 180 185 190
Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser Met Ser 195 200 205 <210〉 7 <211〉 629 <212〉 DNA <213〉食蟹猴 <400〉 7 atgcttcctc ctgccattca tctctctctc attcccctgc tctgcatcct gatgaaaaac 60 tgtttggctt ttaaaaatga tgccacagaa atcctttatt cacatgtggt taaacctgtt 120 tcagcacacc ccagcagcaa cagcaccttg aatcaagcca ggaatggagg caggcacttc 180 agtagcacgg gactggatcg aaatagtcga gttcaagtgg gctgcaggga actgcggtcc 240 accaaataca tctcggatgg ccagtgcacc agcatcagcc ctctgaagga gctggtgtgc 300 gcgggtgagt gcttgccctt gccagtgctt cccaactgga tcggaggagg ctacggaaca 360 aagtactgga gccggaggag ctcccaggag tggcggtgtg tcaacgacaa gacgcgcacc 420 cagagaatcc agctgcagtg tcaggacggc agcacacgca cctacaaaat caccgtggtc 480 acagcgtgca agtgcaagag gtacacccgg cagcacaacg agtccagcca caactttgaa 540 agcgtgtctc ccgccaagcc cgcccagcac cacagagagc ggaagagagc cagcaaatcc 600 agcaagcaca gtctgagcta ggcggccgc 629 152973·序列表.doc 201132353 <210〉 8 <211> 206 <212〉 PRT <213〉食蟹猴 <400〉 8
Met Leu Pro Pro Ala lie His Leu Ser Leu lie Pro Leu Leu Cys lie 15 10 15
Leu Met Lys Asn Cys Leu Ala Phe Lys Asn Asp Ala Thr Glu lie Leu 20 25 30
Tyr Ser His Val Val Lys Pro Val Ser Ala His Pro Ser Ser Asn Ser 35 40 45
Thr Leu Asn Gin Ala Arg Asn Gly Gly Arg His Phe Ser Ser Thr Gly 50 55 60
Leu Asp Arg Asn Ser Arg Val Gin Val Gly Cys Arg Glu Leu Arg Ser 65 70 75 80
Thr Lys Tyr lie Ser Asp Gly Gin Cys Thr Ser lie Ser Pro Leu Lys 85 90 95
Glu Leu Val Cys Ala Gly Glu Cys Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn 100 105 110
Trp lie Gly Gly Gly Tyr Gly Thr Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser 115 120 125
Gin Glu Trp Arg Cys Val Asn Asp Lys Thr Arg Thr Gin Arg He Gin 130 135 140 152973·序列表.doc 201132353
Leu Gin Cys Gin Asp Gly Ser Thr Arg Thr Tyr Lys lie Thr Val Val 145 150 155 160
Thr Ala Cys Lys Cys Lys Arg Tyr Thr Arg Gin His Asn Glu Ser Ser 165 170 175
His Asn Phe Glu Ser Val Ser Pro Ala Lys Pro Ala Gin His His Arg 180 185 190
Glu Arg Lys Arg Ala Ser Lys Ser Ser Lys His Ser Leu Ser 195 200 205 <210〉 9 <211〉 28 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 9
Leu Pro Leu Pro Val Leu Pro Asn Trp He Gly Gly Gly Tyr Gly Thr 15 10 15
Lys Tyr Trp Ser Arg Arg Ser Ser Gin Glu Trp Arg 20 25 <210> 10 <211〉 336 <212> DNA <213〉小家鼠 <400> 10 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact atgagctgca aatccagtca gSLgtctgctc aacsLgteigaa cccgaaagaa ctacttggct tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg •9· 152973-序列表.doc 201132353 caatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctc ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa <210〉 11 <211〉 112 <212> PRT <213〉 小家鼠 <400〉 11
Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Gin Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 〈210〉 12 <211> 363 •10· 152973-序歹！1表.doc 201132353 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 12 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tacactggat gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctcgagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tactgaatct 180 gccccgaagt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcacctca gcagcctgac atttgaggac actgccgtct attactgtaa tgcagaaggt 300 tacggtagta ggcactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tea 363 <210〉 13 <211> 121 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 13
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Tyr 20 25 30
Tyr lie His Trp Met Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Ser Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 •Π- 152973·序列表-doc 201132353
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Phe Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Asn Ala Glu Gly Tyr Gly Ser Arg His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 14 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aaccatcacc 60 atcacatgtc aagcaagtga gaacatttac ttcagtttag catggtatca gcagaagcaa 120 gggaaatctc ctcagctcct gatctataat gcaaacaact tggaagatgg tgtcccatcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tattctatga agatcaacaa catgcagcct 240 gaagatactg caacttattt ctgtaaagag gcttatgact ctccattcac gttcggcacg 300 gggacaaaat tggaaataaa a 321 <210> 15 <211〉 107 <212> PRT <213〉小家鼠 <400〉 15
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 15 10 15 12 152973·序列表.doc 201132353
Glu Thr lie Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Glu Asn lie Tyr Phe Ser 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Met Lys He Asn Asn Met Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Glu Ala Tyr Asp Ser Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210〉 16 <211> 357 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 16 gaaattcaac tccagcagtc tgggactgtg ctgacaaggc ctggggcttc agtgaagatg 60 tcctgcaaga cttctggcta cacctttacc agctactgga tgcactgggt aaaacagagg 120 cctggacagg gtctggsiatg gattggcgct ctttatcctg gaaatagtgt tactaactac 180 aaccagaagt tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccaccag cactgcctac 240 atggagctca gcagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attactgtac aagaggattt 300 cttactgcgc cctactttga ctcctggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357 <210〉 17 -13· 152973-序列表.doc 201132353 <211〉 119 <212〉 PRT 〈213>小家鼠 <400〉 17
Glu lie Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Thr Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Gly Phe Leu Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210〉 18 <211〉 336 <212> DNA <213〉小家鼠 <400〉 18 •14- 152973·序歹!1 表.doc 201132353 gacattgtgg tgtcacaggc tccatcctcc cttgctgtgt cagttggaga gaagattatt 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta cacagcagca atcgaaggaa ctacttggcc 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagtctcct aaattgctga tttcctgggc atccattagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatccg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagcg tgaagactga agacctggca atttattact gtcaccaata ttatacttat 300 tccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaag 336 <210〉 19 〈211〉 112 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 19
Asp lie Val Val Ser Gin Ala Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15
Glu Lys lie lie Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Ser Asn Arg Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu He Ser Trp Ala Ser lie Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala lie Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95 -15- 152973·序列表.doc 201132353
Tyr Tyr Thr Tyr Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 20 <211> 369 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 20 caggttactc taaaagagtc tggccctgag atactgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttcgt tctctgggtt ttcactgacc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gagggagtct ggaatggctg gctcacattt tctgggatga tgacaagcgg 180 tataatccat ccctgacgag tcgactcaca atctccaagg atgcccccag aaaccaggtt 240 ttcctcaaaa tcaccagtgt ggacactgca gatgctgcca catattactg tgctcgagga 300 ggagattatt acagtactgg atttggcttt gattactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210〉 21 <211〉 123 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 21
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu lie Leu Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Gly Ser Leu Glu 35 40 45 •16· 152973·序列表.doc 201132353
Trp Leu Ala His He Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Thr Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Ala Pro Arg Asn Gin Val 65 70 75 80
Phe Leu Lys lie Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Ser Thr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210〉 22 <211> 321 <212> DNA <213〉小家鼠 〈400〉 22 gacatccaga tgactcagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga atccatcacc 60 atcacatgtc aggcaagtga gaacatttac ttcagtttag catggtatca gcagaagcaa 120 gggaggtctc ctcagctcct gatctatcat gcaaaaagtt tggaagatgg tgtcccatcg 180 aggttcagtg gcagtggctc tgggacacag tattctatga agatcaacag catgcagcct 240 gaagatactg caacttattt ctgtaaacag gcttatgacc atccattcac gttcggcacg 300 gggacaaaat tggaaatgaa a 321 <210> 23 〈211〉 107 <212> PRT <213〉小家鼠 •17· 152973-序列表.doc 201132353 <400〉 23
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Ser lie Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Glu Asn lie Tyr Phe Ser 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Arg Ser Pro Gin Leu Leu lie 35 40 45
Tyr His Ala Lys Ser Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Pile Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Met Lys He Asn Ser Met Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gin Ala Tyr Asp His Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 100 105 <210〉 24 <211〉 357 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 24 gaggttcagc tccagcagtc tgggactgtg ctggcaaggc ctggggcttc agtgaagatg tcctgtaagg cttctggcta cacctttacc agctactgga tgcactgggt aaeiacagagg cctggacagg gtctggaatg gattgtcgct atttatcctg gaaatagtga tactaactac aaccagaagi tcaagggcaa ggccaaactg actgcagtca catccaccag cactgcctac 18· 152973-序列表.doc 201132353 etggaactca acagcctgac aaatgaggac tctgcggtct attectgigt aagaggattt attactgcgc cctactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 300 357 <210〉 25 <211> 119 <212〉 PRT <213〉小家鼠 〈400〉 25
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Val Ala lie Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Val Arg Gly Phe lie Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 152973-序列表.doc · 19· 201132353 <210〉 26 <211〉 336 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 26 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaagccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctt 300 ccgacgttcg gtggaggcac caggctggaa atcaaa 336 〈210〉 27 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 27
Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 •20- 152973·序列表.doc 201132353 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 28 <211> 360 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 28 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa. gactactata tgcactgggt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg aaaatggtga tactgaatat 180 gccccgaagt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct tttactgtaa tttctatgat 300 gtttactccg aggggactat ggcctactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210〉 29 〈211〉 120 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 29
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Tyr 20 25 30 •21 · 152973·序列表.doc 201132353
Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys 85 90 95
Asn Phe Tyr Asp Val Tyr Ser Glu Gly Thr Met Ala Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 321 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400〉 30 gacatccaga tgactcagtc tccagcttca ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60 atcacatgtg gagcaagtga gaatatttac ggtgctttaa attggtatca gcggaaacag 120 ggaaaatctc ctcaggtcct gatctatggt gcaaccaact tggcagatgg catgtcatcg 180 aggttcagtg gcagtggatc tggtagacag tattctctca agatcagtag cctgcatcct 240 gacgatgttg caatgtatta ctgtcaaaat gtgttcagta gtccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa a 321 〈210〉 31 22- 152973·序列表.doc 201132353 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 31
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn lie Tyr Gly Ala 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Val Leu He 35 40 45
Tyr Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gin Tyr Ser Leu Lys lie Ser Ser Leu His Pro 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Met Tyr Tyr Cys Gin Asn Val Phe Ser Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 〈210〉 32 〈211〉 336 <212〉 DNA <213〉小家鼠 <400> 32 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 23- 60 120 152973·序列表.doc 201132353 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctgt ttggagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgttc tttaactggg tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc tcctca 180 240 300 336 <210〉 33 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 33
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys He Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Cys 65 70 75 80
Leu Glu lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Ser Leu Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 -24· 152973·序列表.doc 201132353 <210〉 34 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 34
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala 〈210〉 35 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 35
Trp Ala Ser Thr Arg Gin Ser 1 5 <210〉 36 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 36 Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Leu Thr 1 5 <210〉 37 <211〉 5 〈212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 37 •25· 152973-序列表.doc 201132353
Asp Tyr Tyr lie His 1 5 <210〉 38 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 38
Trp He Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Ser Ala Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210〉 39 <211〉 12 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400〉 39
Glu Gly Tyr Gly Ser Arg His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210〉 40 <211> 11 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 40
Gin Ala Ser Glu Asn He Tyr Phe Ser Leu Ala
1 <210〉 41 <211〉 7 <212〉 PRT •26· 152973-序列表.doc 201132353 <213〉小家鼠 <400> 41
Asn Ala Asn Asn Leu Glu Asp 1 <210〉 42 <211〉 9 <212> PRT <213〉 小家鼠 <400〉 42
Lys Glu Ala Tyr Asp Ser Pro Phe Thr 1 5 <210〉 43 <211> 5 〈212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 43 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210〉 44 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 44
Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly •27- 152973-序列表.doc 201132353 <210> 45 <211〉 10 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 45
Gly Phe Leu Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210〉 46 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 46
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Ser Asn Arg Arg Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210〉 47 <211〉 7 〈212〉 PRT <213〉 小家鼠 〈400〉 47
Trp Ala Ser He Arg Glu Ser 1 <210〉 48 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 48 28- 152973·序列表.doc 201132353
His Gin Tyr Tyr Thr Tyr Ser Thr 1 <210> 49 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 49
Thr Ser Gly Met Gly Val Ser 1 <210〉 50 <211〉 16 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 50
His lie Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Thr Ser 15 10 15 <210〉 51 <211〉 13 〈212〉 PRT <213> 小家鼠 <400〉 51
Gly Gly Asp Tyr Tyr Ser Thr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 〈210〉 52 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 〈400〉 52 •29· 152973·序列表.doc 201132353
Gin Ala Ser Glu Asn lie Tyr Phe Ser Leu Ala 1 5 10 <210〉 53 <211> 7 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 53 His Ala Lys Ser Leu Glu Asp 1 5 <210〉 54 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 54
Lys Gin Ala Tyr Asp His Pro Pile Thr 1 5 <210〉 55 <211> 5 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 55 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210〉 56 <211〉 17 <212〉 PRT <213> 小家鼠 <400〉 56 30· 152973-序列表.doc 201132353
Ala He Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 57 <211> 10 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 57
Gly Phe lie Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210〉 58 <211〉 17 <212> PRT <213〉小家鼠 〈400〉 58
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210> 59 〈211〉 7 <212> PRT <213〉小家鼠 <400> 59
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 •31 · 152973-序列表.doc 201132353 <210> 60 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 60
Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Pro Thr 1 5 <210〉 61 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400〉 61 Asp Tyr Tyr Met His 1 5 <210〉 62 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 小家鼠 <400> 62
Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gin 1 5 10 15 Gly <210〉 63 〈211〉 11 <212〉 PRT 〈213〉 小家鼠 •32- 152973-序列表.doc 201132353 <400〉 63
Tyr Asp Val Tyr Ser Glu Gly Thr Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 11 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400〉 64
Gly Ala Ser Glu Asn lie Tyr Gly Ala Leu Asn 1 5 <210〉 65 <211〉 7 <212> PRT <213〉 小家鼠 <400〉 65 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210〉 66 <211> 9 <212〉 PRT 〈213〉 小家鼠 <400〉 66
Gin Asn Val Phe Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210〉 67 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉小家鼠 •33· 152973-序列表 _doc 201132353 <400〉 67
Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210〉 68 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉小家鼠 〈400〉 68
Trp lie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 69 <211〉 3 <212〉 PRT <213〉小家鼠 <400> 69
Thr Gly Tyr 1 <210〉 70 <211〉 321 <212> DNA <213〉智人 <400〉 70 gacatccaga tgactcagtc tccagcttca ctgtctgcat ctgtgggaga aactgtcacc atcacatgtg gagccagtga gaatatttac ggtgctttaa attggtatca gcggaaacag ggaaaatctc ctcagctcct gatctttggt gcaaccaact tggcagatgg catgtcatcg •34· 152973·序列表.doc 201132353 aggttcagtg gcagtggatc tggtagacag tattctctcg agatcagtag cctgcatcct gacgatgttg caacgtatta ctgtcaaaat ttatttaatt ctccgctcac attcggtgct gggaccaagc tggacctgaa a <210> 71 <211〉 107 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 71
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Glu Thr Val Thr lie Thr Cys Gly Ala Ser Glu Asn lie Tyr Gly Ala 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Arg Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu He 35 40 45
Phe Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Gin Tyr Ser Leu Glu He Ser Ser Leu His Pro 65 70 75 80
Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Asn Leu Phe Asn Ser Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Asp Leu Lys 100 105 <210> 72 <211> 336 152973·序列表.doc -35- 201132353 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 72 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 gcagctgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa aaatgaggac acggctacat atttctgtac tttaactggg 300 tactggggtc agggaacctc agtcaccgtc tcctca 336 <210〉 73 <211〉 112 <212> PRT <213〉智人 <400〉 73
Gin He Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15
Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30
Ser Met His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 -36- 152973-序列表.doc 201132353
Leu Gin lie Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95
Thr Leu Thr Gly Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 〈210〉 74 <211〉 336 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 74 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 aaatctgggg tccctgatcg cttcataggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 attagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gcaagcaatc ttataatctc 300 gtcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336 <210〉 75 〈211〉 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 75
Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 15 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45 •37· 152973-序列表.doc 201132353
Ser Pro Lys Leu Leu He Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe lie Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210〉 76 <211> 363 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 76 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcaggttg 60 tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacttctata tgcactggtt gaagcagagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tactgagtct 180 gccccgaagt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcctccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attgctgtaa tgcagaaggc 300 tacgataata gccactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc 360 tea 363 <210〉 77 <211〉 121 <212〉 PRT <213〉智人 •38· 152973-序列表.doc 201132353 <400> 77
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 15 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn lie Lys Asp Phe 20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Ser Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Cys Cys 85 90 95
Asn Ala Glu Gly Tyr Asp Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110
Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 78 <211〉 336 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 78 gacattgtgg tgtcacaggc tccatcctcc cttgctgtgt cagttggaga gaagattatt 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta cacagcagca atcaaaggaa ctacttggcc 120 39· 152973-序列表.doc 201132353 tggtaccaac agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttcctgggc atccattagg gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc atcagcagcg tgaagactga agacctggca gtttattatt gtcaccaata ttatagttat tccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaag 180 240 300 336 〈210〉 79 <211〉 112 <212> PRT <213〉智人 <400〉 79
Asp He Val Val Ser Gin Ala Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 15 10 15
Glu Lys He lie Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Ser Asn Gin Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Ser Trp Ala Ser lie Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80
He Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Ser Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 -40· 152973-序列表.doc 201132353 <210〉 80 <211〉 369 <212> DNA <213〉智人 <400〉 80 caggttactc taaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgacc acttctggta tgggtgtgag ctggattcgt 120 cagccttcag gagggagtct ggaatggctg gcacacattt tctgggatga tgacaagcgc 180 tataatccat ccctgacgag ccgactcaca atctccaagg atgcctccag aaaccaggtt 240 ttcctcaaga tcagcagtgt ggacactgca gacgctgcca catactactg tgctcgagga 300 ggagattact acagtactgg atttggcttt gattactggg gccaagggac tctggtcact 360 gtctctgca 369 <210> 81 <211〉 123 <212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 81
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly lie Leu Gin Pro Ser Gin 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Gly Ser Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His lie Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 -41 · 152973-序列表.doc 201132353
Leu Thr Ser Arg Leu Thr He Ser Lys Asp Ala Ser Arg Asn Gin Val 65 70 75 80
Phe Leu Lys lie Ser Ser Val Asp Thr Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Ser Thr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 82 <211〉 336 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 82 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctggctgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca aatccagtca gagtctgctc aacagtagaa cccgaaagaa ctacttggct 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattatt gcaagcaatc ttataatctt 300 ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 83 <211> 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 83
Asp lie Val Met Ser Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly 15 10 15 • 42· 152973·序列表.doc 201132353
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110 <210> 84 <211〉 360 〈212〉 DNA <213〉智人 <400〉 84 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaggt caggggcctc agtcaagttg tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcattgggt gaagcagagg cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tactgaatat gccccgaagt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcctccaa cacagcctac ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtaa tttctatgat gtttactccg agggggcttt ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca -43- 152973·序列表.doc 201132353 <210〉 85 <211〉 120 <212〉 PRT 〈213> 智人 <400〉 85
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Gin Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Asn Phe Tyr Asp Val Tyr Ser Glu Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 86 〈211〉 11 <212〉 PRT 〈213〉智人 -44 - 152973·序列表.doc 201132353 <400〉 86
Gly Ala Ser Glu Asn lie Tyr Gly Ala Leu Asn 1 5 10 <210〉 87 <211〉 7 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400> 87 Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp 1 5 <210〉 88 <211〉 9 <212> PRT <213〉 智人 <400〉 88 Gin Asn Leu Phe Asn Ser Pro Leu Thr 1 5 <210〉 89 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 89 Asp Tyr Ser Met His 1 5 <210〉 90 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉 智人 45- 1529*73-序列表.doc 201132353 <400〉 90
Trp lie Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe Lys 15 10 15
Gly <210〉 91 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 91
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210〉 92 <211〉 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 92
Trp Ala Ser Thr Arg Lys Ser 1 5 <210〉 93 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 93 •46- 152973-序列表.doc 201132353
Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Val Thr 1 5 <210〉 94 <211> 5 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 94
Asp Phe Tyr Met His 1 5 <210〉 95 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 95
Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Ser Ala Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210〉 96 <211> 12 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 96
Glu Gly Tyr Asp Asn Ser His Trp Tyr Phe Asp Val 1 5 10 <210> 97 <211〉 17
<212〉 PRT •47- 152973-序列表.doc 201132353 <213〉智人 <400〉 97
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser Ser Asn Gin Arg Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210〉 98 <211〉 7 <212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 98
Trp Ala Ser lie Arg Glu Ser 1 5 <210〉 99 <211〉 8 <212> PRT <213〉智人 〈400〉 99
His Gin Tyr Tyr Ser Tyr Ser Thr 1 5 <210〉 100 <211〉 7 <212> PRT <213〉智人 <400〉 100
Thr Ser Gly Met Gly Val Ser 1 5 -48- 152973-序列表.doc 201132353 <210> 101 <211> 16 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 101
His lie Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Thr Ser 15 10 15 <210〉 102 <211〉 13 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 102
Gly Gly Asp Tyr Tyr Ser Thr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr 1 5 10 <210〉 103 <211〉 17 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 103
Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu 15 10 15
Ala <210〉 104 〈211〉 7 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 104 152973-序列表.doc -49- 201132353
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210〉 105 <211〉 8 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 105 Lys Gin Ser Tyr Asn Leu Pro Thr 1 5 <210〉 106 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉 智人 <400> 106
Asp Tyr Tyr Met His 1 <210> 107 <211> 17 <212〉 PRT 〈213〉 智人 <400〉 107
Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gin 15 10 15
Gly <210〉 108 <211〉 11 152973-序列表.doc -50- 201132353 <212> PRT <213〉智人 <400〉 108
Tyr Asp Val Tyr Ser Glu Gly Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210〉 109 <211〉 336 <212〉 DNA <213〉智人 〈400〉 109 gatatcgtaa tgacccagtc gcctgactca cttgcggtgt ccctcgggga aagagctaca 60 atcaattgca agtcaagcca gtccttgctc aacagcagga cgcgaaagaa ctacttggcg 120 tggtaccagc aaaagccggg acaaccgccc aagttgctga tctattgggc ctcaacgcgc 180 gagtcggggg tcccagaccg gttctcgggt tcgggatccg ggactgactt cacgctgact 240 atttcgtcgt tgcaggcaga ggatgtcgcg gtgtattact gtaaacagag ctataacctt 300 cccacctttg gtggcggaac aaaagtggaa atcaaa 336 〈210〉 110 <211〉 112 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 110
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin •51 · 1529*73·序列表.doc 201132353 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gin 85 90 95
Ser Tyr Asn Leu Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 111 <211> 360 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 111 caggtacaac tcgtgcagag cggagccgaa gtcaaaaagc ccggtgcgtc agtgaaggta tcgtgtaagg catcagggtt taacatcaaa gattactaca tgcactgggt gaggcaagct ccgggccagg ggctggagtg gatggggtgg attgatccag aaaatggaga cactgagtat gcacctaagt tccaggggag agtgacgatg acagcggaca cctcgacgtc cacagtgtac atggagctgt cgtccttgcg cagcgaggac acggccgtct attactgcaa cttctatgat gtctactcgg aaggtgcgtt ggactattgg ggacagggaa cccttgtgac cgtctctagt <210〉 112 <211> 120 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 112 •52- 60 120 180 240 300 360 152973·序列表.doc 201132353
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn He Lys Asp Tyr 20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60
Gla Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Asn Phe Tyr Asp Val Tyr Ser Glu Gly Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 113 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 113 gacattcaga tgactcaatc accctcgtcc ctctcagctt ccgtcggtga tagggtaaca atcacatgtc aagcgagcga gaacatctat ttctcgcttg cgtggtatca gcagaagcct gggaaagcgc ccaagttgct gatctacaat gccaacaatt tggaggatgg ggtgccatcg 53- 152973-序列表.doc 201132353 agattttcgg gatccggcag cggaactgac ttcacgttca ccattagctc gcttcagccg gaggacattg ccacctacta ttgcaaagaa gcatacgatt caccgtttac gtttggacag gggacaaagc tcgaaatcaa a <210〉 114 <211〉 107 <212> PRT <213〉智人 <400〉 114
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Glu Asn He Tyr Phe Ser 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Glu Ala Tyr Asp Ser Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210〉 115 • 54· 152973·序列表.doc 201132353 <211> 357 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 115 caagtacaat tggtgcagtc aggagcagaa gtcaagaagc cgggtgctag cgtgaaagtc 60 agctgtaaga cttcgggata tactttcacg agctactgga tgcactgggt ccgccaggcc 120 ccaggccagg ggcttgagtg gatgggtgcg ctgtaccccg gaaattcggt cacaaactat 180 aaccagaagt tcaaagggag ggtgacaatg accgcggaca cgtcaacgtc cactgtatac 240 atggagctgt cctcgctcag atcagaggat acggcggtgt actattgcac acgggggttt 300 ttgacagccc cttactttga ctcgtgggga caggggacca ccgtgaccgt ctctagt 357 <210> 116 <211〉 119 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 116
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 •55· 152973-序列表 _doc 201132353
Met GIu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Gly Phe Leu Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210〉 117 <211〉 321 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 117 gacattcaga tgactcaatc accctcgtcc ctctcagctt ccgtcggtga tagggtaaca 60 atcacatgtc aagcgagcga gaacatctat ttctcgcttg cgtggtatca gcagaagcct 120 gggaaagcgc ccaagttgct gatctacaat gccaacaatt tggaggatgg ggtgccatcg 180 agattttcgg gatccggcag cggaactgac tacacgttca ccattagctc gcttcagccg 240 gaggacattg ccacctactt ctgcaaagaa gcatacgatt caccgtttac gtttggacag 300 gggacaaagc tcgaaatcaa a 321 <210〉 118 <211〉 107 <212> PRT <213〉智人 <400〉 118
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Gin Ala Ser Glu Asn He Tyr Phe Ser •56· 152973-序列表.doc 201132353 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Glu Ala Tyr Asp Ser Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 <210〉 119 <211> 357 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 119 caaatccaat tggtgcagtc aggagcagaa gtcaageiagc cgggtgctag cgtgaaagtc 60 agctgtaaga cttcgggata tactttcacg agctactgga tgcactgggt ccgccaggcc 120 ccaggccagg ggcttgagtg gatgggtgcg ctgtaccccg gaaattcggt cacaaactat 180 aaccagaagt tcaaagggag ggccaagctg accgcggaca cgtcaacgtc cactgcctac 240 atggagctgt cctcgctcag atcagaggat acggcggtgt actattgcac acgggggttt 300 ttgacagccc cttactttga ctcgtgggga caggggacca ccgtgaccgt ctctagt 357 <210〉 120 <211〉 119 •57- 152973-序列表.doc 201132353 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 120
Gin lie Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Ala Leu Tyr Pro Gly Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Arg Ala Lys Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Thr Arg Gly Phe Leu Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 〈210〉 121 <211〉 336 〈212〉 DNA 〈213〉智人 <400> 121 gatatcgtaa tgacgcaatc cccggactca cttgccgtgt cgcttggcga aagagctacc • 58 · 152973-序列表.doc 120 201132353 attaactgca agtcatccca gtcattgttg cattcgtcga accagaggaa ttacctggcg tggtaccaac aaaagcctgg acagccaccc aeiattgttga tctattgggc gtcaattcgc gaeiagcgggg tccccgaccg gttctcggga agcggttccg gtactgactt tacactcacg atcagctcgc tccaggcaga ggatgtggcg gtatactatt gtcaccagta ttactcatac tcgacattcg ggcagggaac caaactggag atcaaa <210〉 122 <211〉 112 <212> PRT <213〉智人 <400> 122
Asp lie Val Met Thr Gin Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr lie Asn Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu His Ser 20 25 30
Ser Asn Gin Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser lie Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Ser Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 59- 180 240 300 336 152973-序歹丨J表·doc 201132353 100 105 110 <210〉 123 <211> 369 <212〉 DNA <213〉智人 <400〉 123 caggtcacac ttaaggagtc gggtccagcg ctcgtgaagc ccacacagac cttgaccctc 60 acgtgtacgt tctcgggatt ttcacttacg actagcggga tgggcgtaag ctggattcgg 120 caacctccgg ggaaagcgct ggaatggttg gcacacatct tctgggatga tgacaaaagg 180 tataacccct cgctcacgtc gcgcctgaca atctcaaagg acacctccaa aaaccaggta 240 gtgcttacga tgacggiatat ggatcccgtg gacacagcaa cttactactg cgccagagga 300 ggagattact attccacagg gtttggtttt gactactggg ggcagggaac tctggtcacc 360 gtctctagt 369 <210> 124 <211〉 123 <212〉 PRT 〈213〉智人 <400〉 124
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin 15 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Ser 20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45
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Ser Asn Gin Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu lie Ser Trp Ala Ser lie Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 lie Ser Ser Leu Gin Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gin 85 90 95
Tyr Tyr Ser Tyr Ser Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110 <210〉 127 <211> 369 <212> DNA <213〉智人 <400〉 127 caggtcacac ttaaggagtc gggtccagcg ctcgtgaagc ccacacagac cttgaccctc acgtgtacgt tctcgggatt ttcacttagc actagcggga tgggcgtaag ctggattcgg caacctccgg ggaaagcgct ggaatggttg gcacacatct tctgggatga tgacaaaagg tataacccct cgctcacgtc gcgcctgaca atctcaaagg acacctccaa asiaccaggta gtgcttacga tgacgaatat ggatcccgtg gacacagcaa cttactactg cgccagagga 62- 60 120 180 240 152973·序列表.doc 300 201132353 ggagattact attccacagg gtttggtttt gactactggg ggcagggaac tctggtcacc gtctctagt 360 369 <210〉 128 <211〉 123 〈212〉 PRT <213〉智人 〈400〉 128
Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin 15 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45
Trp Leu Ala His lie Phe Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser 50 55 60
Leu Thr Ser Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95
Cys Ala Arg Gly Gly Asp Tyr Tyr Ser Thr Gly Phe Gly Phe Asp Tyr 100 105 110
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 -63· 152973·序列表.doc 201132353 <210〉 129 <211〉 642 <212〉 DNA <213〉智人 <400> 129 cagtacgaat tgactcagcc accctcagtg gccgtgtccc ctggaaagac agccagcatc 60 acctgcgctg gagatgaatt gggtaataaa tatgctgcgt ggtaccagca gaagccaggc 120 caggcccctg tgctggtcgt ctatgatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180 ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240 gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagaagta gttatcatgt ggtattcggc 300 ggagggacca agctgaccgt cctaggtcag cccaaggcca accccactgt cactctgttc 360 ccgccctcct ctgaggagct ccaagccaac aaggccacac tagtgtgtct gatcagtgac 420 ttctacccgg gagctgtgac agtggcctgg aaggcagatg gcagccccgt caaggcggga 480 gtggagacca ccaaaccctc caaacagagc aacaacaagt acgcggccag cagctacctg 540 agcctgacgc ccgagcagtg gaagtcccac agaagctaca gctgccaggt cacgcatgaa 600 gggagcaccg tggagaagac agtggcccct acagaatgtt ca 642 <210〉 130 <211> 214 <212〉 PRT <213〉智人 <400> 130
Gin Tyr Glu Leu Thr Gin Pro Pro Ser Val Ala Val Ser Pro Gly Lys 15 10 15
Thr Ala Ser lie Thr Cys 20
Ala Gly Asp Glu Leu Gly Asn Lys Tyr Ala 25 30 -64· 152973·序列表.doc 201132353
Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45
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Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Val Trp Asp Arg Ser Ser Tyr His 85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gin Pro Lys 100 105 110
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Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe Tyr Pro Gly 130 135 140
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Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Ala 115 120 125 -66· 152973-序列表.doc 201132353
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Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Thr Cys Cys Ala Ala Ala Ala Cys Cys 995 1000 1005 152973-序列表.doc -71 - 201132353
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Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala 1015 1020
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Ala Ala 1160
Cys Thr Ala Cys Ala Ala Gly Ala Cys Cys Ala Cys Ala 1165 1170 152973-序列表.doc -72- 201132353
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Ala Gly 1235
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Gly Ala Ala Cys Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Ala 1255 1260
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Cys Ala 1295
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Gly Gly Gly Thr Ala Ala Ala 1330 152973-序列表.doc -73- 201132353 <210〉 132 <211〉 444 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 132
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Ala Arg Gly Val Ser Ser Trp Phe Phe Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn •74· 152973-序列表 _doc 201132353 145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin 165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190
Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser 195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys 210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe 260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285
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Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr -75- 152973-序列表.doc 201132353 325 330 335
Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro 370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin 405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 133 <211〉 11 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 133
Ala Gly Asp Glu Leu Gly Asn Lys Tyr Ala Ala 1 5 10 <210> 134 <211> 7 152973·序列表.doc -76- 201132353 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 134
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser 1 5 <210> 135 <211〉 11 <212> PRT <213〉智人 <400> 135
Gin Val Trp Asp Arg Ser Ser Tyr His Val Val 1 5 10 <210〉 136 <211〉 5 <212〉 PRT <213〉智人 <400〉 136
Leu Tyr Thr Met Gin 1 5 〈210〉 137 <211> 17 <212> PRT <213〉智人 <400> 137
Gly lie Gly Ser Ser Gly Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15
Gly •77- 152973-序列表.doc 201132353 <210> 138 <211〉 9 <212〉 PRT <213〉 智人 <400〉 138
Gly Val Ser Ser Trp Phe Phe Glu Tyr 1 5 -78 * 152973-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201132353 七、申請專利範圍： 1. 一種經分離之抗體或其月段，其交叉阻斷抗體Ab-AA、 Ab-AB、Ab-AC、Ab-AD、Ab-AE、Ab-AF、Ab-AG、 Ab-AH、Ab-AI、Ab-AJ及D14中至少一者與人類WISE之 . 結合，且特異性結合於人類WISE之環2結構域，及/或由 抗體 Ab-AA、Ab-AB、Ab-AC、Ab-AD、Ab-AE、Ab-AF 、 Ab-AG 、 Ab-AH 、 Ab-AI 、 Ab-AJ 及 D14 中至 少一者 交叉阻斷與人類WISE之結合，且特異性結合於人類 WISE之環2結構域。 2. 如請求項1之抗體或其片段，其中該WISE抗體或其片段 可降低至少一種以下參數：組織損傷及其標誌物、天狼 星紅（Sirius red)染色或膠原蛋白產量、諸如aSMA或FSP-1之成肌纖維細胞標諸物的表現、骨橋蛋白（osteopontin) 表現、蛋白尿，及/或在基於細胞之檢驗中可抑制WISE 之活性。 3. 如請求項1之抗體，其可提高或保留肌酸酐清除率所測 量之腎功能及/或降低血清或血漿肌酸酐的升高於有需要 之患者（相較於未經治療之患者）。 ' 4. 一種經分離之抗體或其片段，其結合於WISE之環2抗原 • 決定基》 5.如請求項4之經分離之抗體，其中該抗體結合於WISE在 以下一或多處：SEQ ID NO: 2之胺基酸110之白胺酸、 SEQ ID NO: 2之胺基酸112之天冬醯胺酸、SEQ ID NO: 2 之胺基酸114之異白胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸115之 I52973.doc 201132353 甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸116之甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸117之甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸119 之甘胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸121之離胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸123之色胺酸' SEQ ID NO: 2之胺基酸 126之精胺酸、SEQ ID NO: 2之胺基酸128之絲胺酸、或 SEQ ID NO: 2之胺基酸129之麩醯胺酸。 6. 如請求項1至3及5中任一項之抗體或其片段，其包含至 少一個序列與選自以下之序列具有至少90% —致性： SEQ ID NO: 34、35、36、37、38、39、40、41、42、 43 、 44 ' 45 、 46 、 47 、 48 、 49 、 50 、 51 、 52 、 53 、 54 、 55 、 56 、 57 、 58 、 59 、 60 、 61 、 62 、 63 、 64 、 65 、 66 、 67 、 68 、 69 、 86 、 87 、 88 、 89 、 90 、 91 、 92 、 93 、 94 、 95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、 105、1〇6、i〇7、i〇8、133、134、135、136、137 及 138 ’且結合於人類WISE。 7. 如請求項4及6中任一項之抗體或其片段，其包含六個該 專序列。 8. 如睛求項7之抗體或其片段，其中該一致性百分比為 95%。 9，如請求項8之抗體或其片段，其包含： a. SEQ id NO: 34、35及 36之序列； b· SEQ id NO: 37、38及 39之序列； c· SEQ Π) NO: 40、41及 42之序列； d· SEQ ID NO: 43、44及 45之序列； J52973.doc -2- 201132353 e. SEQ ID NO: 46、47及 48之序列； f. SEQ ID NO: 49、50及 51之序列； g. SEQ ID NO: 52、53及 54之序列； h. SEQ ID NO: 55、56及 57之序列； i. SEQ ID NO: 58、59及 60之序列； j. SEQ ID NO: 61、62及 63之序列； k. SEQ ID NO: 64、65及 66之序列； l. SEQ ID NO: 67、68及 69之序列； m. SEQ ID NO: 86、87及 88之序列； n. SEQ ID NO: 89、90及 69之序列； o. SEQ ID NO: 91、92及 93之序列； p. SEQ ID NO: 94、95及 96之序列； q. SEQ ID NO: 97、98及 99之序列； r. SEQ ID NO: 100、101 及 102之序列； s. SEQ ID NO: 103、104及 105之序歹ij ; t. SEQ ID NO: 106、107及 108之序列； u. SEQ ID NO: 133、134及 135之序列；及 v. SEQ ID NO: 136、137及 138之序列。 10.如請求項9之抗體或其片段，其包含： a. SEQ ID NO: 34、35及 36之序列及 SEQ ID NO: 37、 38及39之序列； b. SEQ ID NO: 40、41 及 42之序列及 SEQ ID NO: 43、 44及45之序列； c. SEQ ID NO·· 46、47及 48之序列及 SEQ ID NO: 49、 152973.doc 201132353 50及51之序列； d. SEQ ID NO: 52、53及 54之序列及 SEQ ID NO: 55、 56及57之序列； e. SEQ ID NO: 58、59 及 60 之序列及 SEQ ID NO: 61、 62及63之序列； f. SEQ ID NO: 64、65及 66之序列及 SEQ ID NO: 67、 68及69之序列； g. SEQ ID NO: 86、87 及 88 之序列及 SEQ ID NO: 89、 90及69之序列； h. SEQ ID NO: 91、92及 93之序列及 SEQ ID NO: 94、 95及96之序列； i. SEQ ID NO: 97、98 及 99 之序列及 SEQ ID NO: 100、101及102之序列； j. SEQ ID NO: 103、104及 105之序列及 SEQ ID NO: 106、107及108之序列；及 k. SEQ ID NO: 133、134及 135之序列及 SEQ ID NO: 136、137及138之序列。 11. 如請求項10之抗體或其片段，其包含至少一個序列與序 列a至k中任一者具有至少90% —致性。 12. 如請求項10之抗體，其包含SEQ ID NO: 110之輕鏈及 SEQ ID NO: 112 之重鏈、SEQ ID NO: 114 之輕鏈及 SEQ ID NO: 116 之重鏈、SEQ ID NO: 118 之輕鏈及 SEQ ID NO: 116 之重鏈、SEQ ID NO: 114 之輕鏈及 SEQ ID NO: 120之重鏈、SEQ ID NO: 118之輕鏈及 SEQ ID NO: 120之 152973.doc 201132353 重鏈、SEQ ID NO: 122之輕鏈及SEQ ID NO: 124之重 鏈、SEQ ID NO: 1126之輕鏈及 SEQ ID NO·· 124之重鍵、 SEQ ID NO: 122之輕鏈及SEQ ID NO: 128之重鏈，或 SEQ ID NO: 126之輕鏈及SEQ ID NO: 128之重鏈。 . 13. 一種抗體，其對WISE之親和力小於1 x 1 〇·7 μ，特異性結 合Seq Id No: 2之成熟多肽之環2，且抑制WISE活性，其 用於治療與腎臟疾病或病症有關之醫學病狀的方法。 14. 如請求項13之抗體，其中該腎臟病症為糖尿病性腎病 變’或高血壓性腎病’或移植相關之移植物功能障礙。 15. 如請求項13之抗體，其中該腎臟疾病與蛋白尿及/或纖維 化有關。 16. —種醫藥組合物，其包含如請求項13或16之抗體或片 段。 17. 如請求項16之抗體或其片段，其係與一或多種醫藥學上 可接受之賦形劑、稀釋劑或載劑組合。 18. 如請求項17之抗體或其片段，其接合於Fc、pEG、白蛋 白及運鐵蛋白中至少一者。 19. 一種WISEi免疫原性多肽，其適用於產生抑制性抗體， 其中該等抗體以小於lxlG.7 M之親和力結合於全長人類 WISE且可降低至少-種以下參數：組織損傷、天狼星紅 染色或膠原蛋白產量、諸如aSMA或FSP-1之成肌纖維細 胞標諸'物之表現、骨橋蛋白表現、及蛋白尿、腎功能下 降，及/或在基於細胞之檢驗中可阻斷WISE之抑制作 用0 152973.doc 201132353 20. —種使用如請求項1之抗體治療糖尿病性腎病變之方 法0 152973.doc
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