TW201113033A - Use of cathepsin H - Google Patents

Description

201113033 、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於組織蛋白酶Η之用途。本發明其他方面係 關於用於篩選醫藥、診斷疼痛感受性及治療疼痛之方法。 【先前技術】 在西方國家，慢性疼痛為一主要的未解決健康問題，削 弱數百萬人的健康和幸福。慢性疼痛嚴重地折磨經歷疼痛個 人的幸福且其通常伴隨或接續生理症狀(vegetative signs)，其 常常導致憂鬱症。慢性疼痛造成個人痛苦和巨大的社會經濟 成本。現存的藥理學疼痛治療普遍無法滿足效力和安全性二 方面。 有鑒於與最新式疼痛治療有關的嚴重缺點，因此對於治 療持續性疼痛之新選擇，且對於診斷和預測有關慢性疼痛的 潛在發展有迫切的需求。特言之，有鑒於在快速增加了解疼 痛之神經生物學與未滿足的臨床需求的巨大落差之間，提供 有效治療而無新式治療的缺點，需朝向開發新的目標作為新 種類的鎮痛劑來努力。 【發明内容】 因此，本發明之目的係提供一種開發和提供新種類疼 痛調節藥之新方法。 此目的係藉由使用組織蛋白酶Η或其功能片段或衍生 物用於辨識調節疼痛（且特別是神經病性疼痛）之化合物來解 決。 本發明係基於發明人等之意外的發現，其在小鼠的神經 201113033 病性疼痛之模型中首次證 受性密切相關。 明組織蛋白酶Η 的表現與疼痛感 知國際疼痛研究協會之定義， 在的組織傷害有關’或根據斤 m 七曰 情緒經驗。疼痛__般為痛害所描相不愉悦感受和 神經季一感神！糸統活化之結果，而痛感 疼痛為身體警告系統之部傷害。因此 害最小化之反應。疼痛可身體實際或潛在傷 為疾扃狀况之—級效應，常常無任何生物上之意義。 疼痛可為急性或慢性。条性 之生理m / 疼痛為指示潛在或急性損傷 = ; = 伴隨著組織傷害、感染、發炎或其他 耒1 _ 4雜障礙後改變㈣。若急性疼痛 未文適治療，其可能導致慢性疼痛。 慢性疼痛為一種帶有多錄 士 之疾病狀ϋ。 種㈣定徵候 严疼痛可能為痛感性、發炎性或神經病性。痛感性疼 痛係根據身體或臟器疼痛敏感神經纖維之持續活化所判 定。神城性疼痛為關或巾樞縣組織之任何種類的傷害 所造成之«:咸信’係在周圍神經系統、CNS或二者具持 續異常的體感過程。（疼痛機制之概觀，請參見例如Sch〇lz 和 Woolf，2002 ’ Julius 和 Basbaum，2001，Woolf 和 Mannion， 1999 ; Wood, J.D” 2000 ; Woolf 和 Salter，2000.) 慢性神經病性疼痛係隨病患之不同而變。最近的數據顯 示個別的疼痛感受性在個體的痛苦量扮演一個重要的角 4 201113033 色’亦即’對疼痛有一個重要的遺傳易感性’特別是對神經 病性疼痛之發生。本發明係基於發明人等在嚅齒動物之慢性 疼痛模型中針對辨識疼痛異感性基因之延伸性的研究（亦 即’在一特定的、固定程度之組織損傷存在下，測定所感受 的疼痛量）。發明人所使用的嚅齒動物模型和實驗設定，能 讓不同的個體間之實驗條件a)天生和相同的神經病變可準 確地控制及b)可將基因和環境的變數降至最小。 組織蛋白酶 H (CTSH ;根據 Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology 之替代性標題 (http://atlasgeneticsoncology.org) : ACC-4、ACC-5、CPSB、 DKFZp686B24257、EC 3.4.22.16、MGC1519、aleurain、 minichain)為一溶酶體蛋白酶。 人類組織蛋白酶H之基因位置係在染色體15q24-125上 (參見例如 Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology)。此基因含有12個跨越23 kb基因序列之外顯 子（exon)。人類組織蛋白酶前體(preprocathepsin)之核皆酸序 列，例如係由 Fuchs 和 Gassen，1989, Nucleic Acids Res. 17 : 9471-9471所公開。大鼠的組織蛋白酶H之基因構造，例如 係由 Ishidoh 等人，FEBS Letters，1989, Vol. 253,第 1,2 號, 103-107所公開。15號染色體上之人類（homo sapiens)CTSH 的基因序列，例如可於NCBI網頁以登錄號NG_009614.1 (SEQIDN0.1)來檢索。 組織蛋白酶Η之基因具有一 TATA-和CAAT-less啟動 子及exon 1 one GC bo之上游。在前列腺組織和癌症細胞株 201113033 中已偵測出二種不同的組織蛋白酶H cDNA形式：全長型 (CTSH)和在訊號胜肽區删除12個胺基酸之截斷型 (CTSHdelta 10-21)(參見 Atlas of Genetics and Cytogenetics in

Oncology and Haematology)。前酶原（preproenZyme)轉錄之 長度為1005 bp。組織蛋白酶h之編碼多核苷酸序列可在 NCBI核苷酸資料庫由數個登錄號，例如：BC006878 (CTSH ’完整編碼序列’小家鼠（mus muscuius)，id N0.4，NM—004390.3 [人類(Homo sapiens)CTSH 轉錄變體 1 mRNA (SEQ ID NO.2)，NM_148979.2 [人類（Homo 3&?丨61^)€：丁811’轉錄變體2 1111^八（8丑(3 10>10.3)]公開取 得。熟習技術者知道如何由NCBI資料庫中檢索另外的組織 蛋白酶Η之編碼或基因序列（其他物種的組織蛋白酶η ;若 存在，組織蛋白酶Η之突變物或不同的同型物）。若在下列 中’其係指組織蛋白酶Η編碼序列，則此可表示任何上述 mRNA或編碼序列；SEQ ID. NOs. 2、3和4之序列為較佳 的實例。 組織蛋白酶Η之蛋白質序列於NCBI蛋白質資料庫，例 如由下列登錄號公開取得：人(homo sapiens)(hs)組織蛋白酶 Η同型物’一種蛋白質前體：NP_004381(SEQ ID No.8) ; hs 同型物 b 前驅物：Np:68388〇(SEQ id N0.9);小鼠（mus musculus)組織蛋白酶h :蛋白質前體：NP—031827 ;小鼠同 型物 CRA__a : EDL20900，小鼠同型物 CRA_b : EDL20901 ’ 大鼠（溝鼠(Rattus n〇rvegjcus))組織蛋白酶 η: ΝΡ_037071 ;組織蛋白酶η同型物CRA-a (溝鼠）： 6 201113033

EDL77562，組織蛋白酶Η之同型物CRA_b(溝鼠）： EDL77563 ’組織蛋白酶Η。再者，蛋白質序列可於 UniProtKB 資料庫（www.beta.uniprot.org)，由登錄號： P09668 (HUMAN一CATH ’ 人類組織蛋白酶 η，SEQ ID N0.5)公開取得。若在下列中，其係指組織蛋白酶H或胺基 酸，則此可表示任何上列的編碼序列中之上述蛋白質序列 或轉譯的蛋白質序列’例如下列序列：SEQIDNO.s5、6、 7、8 或 9。 NCBI為國家的生物科技資訊中心（郵件地址：Nati〇nal Centre for Biotechnology Information, National Library of

Medicine, Building 38A，Bethesda，MD 20894, USA ;網頁地 址：www.ncbi.nhm.nih.gov)。更多的序列（例如帶有 SwissProt或EMBL登錄號之序列）可於UniPr〇tKB資料庫中 由 www.beta.uniprot.org.來檢索。 組織蛋白酶Η為一種帶有胺基肽酶和較弱的内肽酶功 月匕之/谷體蛋白S#。其係屬於C1(類木瓜酵素(papain_Hke)) 半胱胺酸蛋白酶之家族。組織蛋白酶Η蛋白質係合成為一 335個胺基酸之前酶原並經蛋白質分解處理成為内體或溶酶 體内部之活化單鏈。除了重鏈和輕鏈外（共同命名為長鏈）， 組織蛋白酶Η含有一衍生自前肽(pr〇peptide)之所謂的迷你 鏈「EPQNCSAT」。（組織蛋白酶η之結構，亦請參見Turk 等人，Biological Chemistry, 1997)。此迷你鏈似乎與組織蛋 白S# Η之胺肽轉活性有關並在基質識別上扮演著主要角 色。缺乏迷你鏈之人類組織蛋白酶Η重組型顯示為一内肽 201113033 酶(Valiljeva等人，2003)。組織蛋白酶η之内肽酶基質為例 如 ： Bz-Arg+NHNap 、 Bz-Arg+NH-Mec 、 Bz-Phe_Val-Arg+NHMec。其對於基質：Pr〇-Gly+phe 和 Pro-Arg+NHNap具有二肽基-肽酶之活性。其對於基質. H-Arg-NH-Mec > Bz-Arg-NH-Mec . Bz-Arg-NH-Mec H-Cit-NH-Mec具有胺肽酶之活性（參見例如R〇the和D〇dt 1992 ; Bz=苯曱醯基，NH-Mec = e-甲基香豆醯基_7_醯胺；’ Cit=瓜胺酸）。組織蛋白酶η之天然生成的抑制劑有血清賤 蛋白（cystatin)、α2-巨球蛋白以及來自小鼠毒性細胞淋巴細 CTLA-2P之抗原。 組織蛋白酶Η係無所不在地高量表現於腎臟中。在某 些癌組織中其表現可能會增加。組織蛋白酶主要係位於内 體-溶酶體小室中’但亦某種程度上分泌及循環於血液中。 組織蛋白酶Η之功能一般係包括：蛋白酶活性例如水 酶活性，肽酶活性例如胺肽酶、二肽基肽酶、外肽酶或 酶活性，轉酿基酶活性(參見K〇ga等人，1991);裂解上 質；裂解原生的C5和產生趨化因子C5a，處理疏水性= 活性劑有關的蛋白C，裂解及/或降解纖維連接 a—11)和纖轉Μ。更射之，錢涉及在胞内蛋 白質降解中作為溶酶體半胱胺酸蛋自酶m裂解 的C5參與趨化因子C5a之生成。、组織蛋白酶h涉及梳水 界面活性财_蛋自c之處理。再者，其似乎涉及不穩 硬化斑塊之生成，以及可能亦涉入早期的動脈； 化之發生。 8 201113033 本發明之用途可用於辨識供預防及/或治療疼痛（且特別 疋神經病性疼痛）之新穎物質。本發明之用途包括辨識具所 欲特性（亦即’降低疼痛感受）之化合物，以及辨識具不欲特 性（亦即，增加疼痛感受）之化合物。再者，本發明化合物能 將已辨識出對預防及/或治療任何疾病或病態有用之化合物 進一步定性。在此情況下，本發明可，例如可用於排除經辨 識具不欲副作用之活性化合物（亦即，增加疼痛感受）。特定 疾病之候選化合物，例如可就其對組織蛋白酶Η之影響（蛋 白質及/或梭酸，表現及/或功能等）分析。 當用於本發明不同方面時，化合物/試驗化合物/活性化 合物可為任何藉由生化或分子生物法純化、部份純化、合成 或製造之生物或化學物質或天然產品萃取物。 就本發明之不同方面而言，被視為具調節疼痛活性之化 合物可為任何對組織蛋白酶Η之其中一項功能或對細胞中 組織蛋白酶Η之量（蛋白質或核酸）、組織蛋白酶η表現、轉 譯後修飾作用（例如Ν-糖基化或作用（例如裂解）、蛋白質摺疊 或活化具有影響之物質。 就此’此物質可調節任何組織蛋白酶Η之功能（例如， 該等上列或下列者）。組織蛋白酶Η蛋白活性可藉由此物質 例如以直接相互作用及干預組織蛋白酶Η多肽/蛋白質或其 片段來調節。此物質亦可調節組織蛋白酶Η之表現，對例如 轉錄階段(起始，延伸，作用等）、轉錄安定性、轉譯。再者， 其可調節組織蛋白酶Η之後轉錄修飾作用、組織蛋白酶η 從非活化到活化型之作用（將前體型裂解成活化蛋白）以及蛋 201113033 白質摺#等。此物質可直接或間接影 指，亦即藉由干預（正向或負 向)對組織蛋白酶二效應(間接係 活性/表現㈣科之天纽號傳遞級^ Μ輕/蛋白質 組織蛋白酶Η之功能包括如 ^由"或多個蛋白質基質之胺基端移肽t蛋白酶活 或多種蛋白質基質，例如上列者，專—作：，力；與〜 蛋白質交互作用）；裂解及/或活化-或多種^力（蛋白質、 ^上列者之能力；處理蛋白質或肽基質，例如^基質’例 核酸或其片⑽他二二亦包括組織蛋白酶Η蛋白$ ς:成的分子)作用之能力，且較佳地=狀、核 解蛋白質基質之能力。 關其作用和裂 在本申請書之範嘴内已了解酵 J修敎分子。在本發明範圍内，天然生成的可麵酵 中5亥等基質係在天然的生 广貝為符合其 疼=之㈣可為•或增加。 ，，物。片段可為蛋白質、多肽i多核之 段為二織蛋白_之實例’蛋白質或多肽之片 多個二酸及/或C，及/或内部刪除—、二或 所列的功能區及⑽4狀見下3包括，例如第7圖說明中 201113033 組織蛋白酶Η之功能性片段為具有至少一或多 種全長 蛋白之功能特性的任何此蛋白之片段，特別是如上所歹 相較於全長的基因或編碼序列，多核苷酸之片 ° 帶一或多個末端(5，-及/或3，-)及/或内部刪除一、二或=為鴣 苷酸之多核苷酸或寡核苷酸。組織蛋白酶Η核酸之功=個核 段為具有至少一或多種全長多核苷酸之功能特性的体随片 段(mRNA、基因或編碼序列）。 何片 相較於天然生成的型式，特別是相較於無冊】除的 IDsNO : 5、6、7、8或9之組織蛋白酶H，術語組織 Η之衍生物包括任何組織蛋白酶η之修飾型。組織蛋白酶 之功能性衍生物為具有至少一種，較佳地二或多種未=鸥Η 白之功能特性的任何此蛋白之衍生物。衍生物包括，> 都蛋 基酸或核苷酸序列之修飾型或任何其他種類修 彳如胺 化學或生物_，產生例如安定多肽或多核^^= 骨架或胺基酸間鍵交換之硫代磷酸酯修飾作用），戈二馱 或多核《專-標定製特定細胞，或f助其進人細胞或2 胞吸收(例如細胞穿透㈣酸肽、與細胞穿透性肽載體鄰ς 偶合，例如以觸角蛋白（antennapedia)/滲透、ΤΑΤ及訊號肽 為主之序列；或與專一轉運體或轉入體之配體部件偶合f。 本發明另—方面係關於非人類基因轉絲物異 :=:ΓΗ或其功能性片段用於辨識或分析調節疼痛(且 特別疋神！病性疼痛）之化合物之用途。 如大物可為任何非人類動物。較佳的為健類’例 11 201113033 基因轉殖動物為在其基因組中攜帶外源DNA之動物， 其中外源DNA為有意轉置其中。將外源DNA導入動物基因 組中可根據標準程序來進行(參見，例如Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor l Academic Press Inc.，San Diego, California，1994 (ISBN : 0125571658))。 術語異體表現係指與宿主正常基因表現不同之表現（有 關此表現基因之穩定狀態程度、量、時序或組織分布，或有 關表現基因之類型（亦即，此基因正常下完全不會表現在此 宿主中乃。異體表現可為本質上的或可誘導的。適合的可誘 導表現系統已為本項技術所熟知（例如四環黴素可誘導系統 或其類似物）。生物體可為細胞或非人類動物。 根據另一方面，本發明係關於非人類基因轉殖動物異體 表現組織蛋白酶Η或其功能性片段作為增進疼痛敏感性(特 別是神經病性疼痛敏感性)之模型系統之用途。 又本發明另一方面係關於非人類組織蛋白酶η剔除動 物用於辨識或分析調節疼痛江特別是神經病性疼痛）之化合 物之用途。 σ 、基因剔除生物體(例如動物或細胞)係指#中基因之表現 或功能部分或完全刪除’並包括基因組以及功能性剔除、可 誘導和本質上剔除之生物體。基因剔除生物體之產生以及 可用於產生基因剔除生物體之細胞或動物，已為本項 所熟知。組織蛋_ Η _小鼠之產生係描述於和 Ley， 1999 中0 12 201113033 本發明另一方面係關於非人類組織蛋白酶H剔除動物 作為減低賴（且_是減低神_性疼痛）之模型系統 途。 本發明另一方面為細胞異體表現組織蛋白酶H或其功 能性片段驗賴卿㈣（制是神m疼痛）之化合物 之用途。 細胞可為任何原核細胞或真核細胞，例如能以核酸載 體轉染或表現報導基因之細胞。這些主要包括初代細胞和 細胞培養之細胞，例如真核細胞培養包括衍生自多細胞生物 和組織之細胞(例如HeLA、CH〇、cOS、SF9或3T3細胞）， 或單細胞生物例如酵母(例如粟酒裂殖酵母(s· p〇mbe)或釀酒 酵母（s. cerevisiae))，或原核細胞之細胞培養，較佳地畢赤 酵，(Pif hia)或大腸桿菌（E c〇li)。衍生自組織的細胞和樣本 可藉由热知的技術，例如抽血、組織穿刺或外科技術來取 得。 根據一實施例，係使用相較於未修飾狀態，具有較低 的組織蛋白酶Η活性之修飾細胞。此方法可例如試驗所欲 試驗的化合物是否能增進或恢復已降低或完全消失的縝織 蛋白酶Η活性。或其可試驗此等物質在低疼痛敏感性的情 況下是否能表現其功能（例如疼痛調節或甚至在另/參病狀 態或疾病情況下之功能）。 修飾可為能降低組織蛋白酶Η活性，組織蛋白酶Η轉 錄安定狀態程度（亦即藉由活化組織蛋白酶Η轉錄或轉錄安 定化）或組織蛋白酶Η蛋白安定狀態程度（亦即藉由活牝铒織 13 201113033 蛋白酶Η轉譯或其後轉s睪處理；藉由調節組織蛋白酶η後 轉s睪修飾作用或藉由活化其文定化作用或藉由抑制其降解） 之任何類型之修飾（安定型或過渡型，較佳地安定型）。此 可，例如藉由使用組織蛋白酶Η之顯性負突變體、反義寡核 苷酸、組織蛋白酶Η之RNAi結構，藉由產生功能性或基因 性組織蛋白酶Η剔除(其可，例如可誘導的）或其他本項技術 中已知的適合技術來完成。上述技術之概觀，請參見例如 Molecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplemtent 52, John Wiley and Sons, Inc. ； Gene Targeting ： a practical approach (1995), Editor ： A.L. Joyner, IRL Press ； Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000 ; Antisense Therapeutics，1996 ; Scherr et al，2003.。 根據一實施例，係使用組織蛋白酶H剔除細胞。產生 剔除細胞之適合的細胞株已為本項技術所熟知，請參見例 如 Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman， Chapter 23，Supplement 52，John Wiley and Sons, Inc ;或 Gene Targeting a practical approach. (1995) Ed. A.L. Joyner, IRL Press。組織蛋白酶H (DPPI)剔除細胞之產生亦公開於 Pham 和 Ley，1999(the generation of DPPI murine embryonic stem cell knock out clones,參見第8628頁，右攔上半部分）。 因此，本發明另一方面係關於組織蛋白酶剔除細胞用於 辨識或分析調節疼痛（特別是神經病性疼痛）之化合物之用 途。 14 201113033 再者’本相關發明群組之另一方面為組織蛋白酶剔除 細胞作為減低疼痛（特別是減低神經病性疼痛敏感性)之模型 系統之用途。 根據本發明另一實施例，相較於參照細胞（例如其未修 飾狀態之相同細胞），此細胞可具有較高量的組織蛋白酶 H。當組織蛋白酶Η之量與疼痛敏感性相關時，此細胞系統 可用於模擬增進疼痛敏感性之狀況。 本發明因此亦關於細胞異體表現組織蛋白酶Η或其功 能性片段作為增進疼痛敏感性(_是神_性疼痛敏感性） 之模型系統之用途。 〃本相關發明群組之另-實施例為可表現連接組織蛋白 酶Η啟動子及/或增強子之細胞異體表現報導基因用於辨識 或分析調節疼痛（特別是神經病性疼痛)之化合物之用途。 本發明上述方面係基於本項技術中習知的典型報導基 因分析。就此，係將選擇的啟動子嵌入適合所選的宿主細 胞類型之表現载體’若啟動子為活化的，則選擇的報導基因 上游以此方式使報導基因表現。隨後將此建構物導入選擇 的宿主細胞中。適合用於轉變或轉染之方法以及細胞培養 條件和偵測報導基因表現，已為本項技術所熟知（參見下文 所列之標準文獻）。適合的條件已為本項技術所熟知，以及 載體報導基因及所需的試劑亦可從市面上取得。 载體為一環狀或直鏈的多核苷酸分子，例如DNA質 體、嗤菌體或黏粒(cosmid) ’在多核苦酸片段(例如由其他載 體裁刀或卩PCR肖巾田並肷人選殖的載體中）的幫助下，可專 201113033 一於適合的細胞或生物體中增幅。表現载體能使目的基因 (例如報導基因）異質表現於宿主細胞或生物體中。細胞或生 物體之種類主要係依目標而定，且選擇係在熟習技術者了 解的範圍内。適合用於增幅核酸之的生物體，例如大多數 為高增殖率之單細胞生物，諸如細菌或酵母菌。適合的生 物體亦可為由多細胞組織中分離和培養的細胞，諸如由各 種生物體所產生的細胞株（例如來自秋行軍蟲（Spodoptera Frugiperda)之SF9細胞等）。適合的選殖載體已為本項技術 所知並可由市面上從多個生技供應商，例如羅氏醫藥儀器 公司（Roche Diagnostics)、紐英儉生物技術公司（New England Biolabs)、普洛麥格公司（Promega)、Stratagene公司及更多的 供應商購得。適合的細胞株例如可在市面上由美國典型培 養物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)購 得。 對於蛋白質或多肽之異體表現，此細胞可為任何能以 核酸載體轉染及表現目的基因（例如報導基因）之原核或真核 細胞。這些主要包括初代細胞和細胞培養之細胞，較佳地 真核細胞培養’其包括衍生自多細胞生物和組織之細胞(例 如 HEK293、RIN-5F、HeLA、CHO、COS、SF9 或 3T3 細 胞），或單細胞生物例如酵母（如粟酒裂殖酵母（s· Pombe)4 釀酒酵母(S. cerevisiae))，或原核細胞培養，較佳地畢赤酵 母(Pichia)或大腸桿菌（E.coli)。衍生自組織的細胞和樣本可 藉由熟知的技術，例如抽血、組織穿刺或外科技術來取 得。 201113033 在本申請書之内文中，術語「轉染」係指將核酸載體導 入宿主細胞（原核細胞或真核細胞）中且因此包括術語「轉 變」。 轉染可為穩定或過渡性轉染。 組織蛋白酶Η啟動子為組織蛋白酶Η基因之一部分’ 若導入至適合的基因產物編碼序列之表現載體上游’能驅 動目的基因產物之表現。組織蛋白酶Η啟動子為組織蛋白 酶Η基因5’-序列之基因體上游之部分’其引導下游、轉錄 區域之轉錄活化，並且能例如由Ishidoh等人，FEBS letters， 1989 或 Ishidoh 等人，Biomed. Biochim. Acta，1991，50(4): 541-7衍生。 報導基因可為能讓其基因產物容易定量之任何基因。 用於各種真核細胞或原核細胞宿主之各種報導基因以及偵 測方法和所需的試劑為本項技術中所已知並可由市面購 得。這些包括，例如β内酿胺酶(lacZ)、冷光酶、綠色或藍 色螢光蛋白（GFP 或 BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1 或 LEU2或β半乳糖苷酶。這些基因編碼蛋白質可容易以可見 的（顏色或發光)反應(例如lacZ、冷光酶)偵測到。這些包括 表現時可容易以可見的（顏色或發光)反應偵測到之基因產物 或具抗生素如安比西林(Ampicillin)或卡那黴素(Kanamycin) 抗性之基因產物。其他報導基因產物能使表現細胞在特定 的條件下生長，例如營養缺陷基因。 報導基因之功能性片段為任何能容易定量其基因產物 之特定報導基因片段。 17 201113033 在本申請書之内文中，術語「轉染」係指將核酸載體導 入宿主細胞中（原核細胞或真核細胞）且因此包括術語「轉 轉染可為穩定或過渡性轉染。 細胞可為任何能以核酸載體轉染和表現報導基因之原 核或真核細胞。這些主要包括初代細胞和細胞培養之細 胞，較佳地真核細胞培養，其包括衍生自多細胞生物和組 織之細胞(例如HeLA、CHO、C〇s、SF9或3T3細胞），或單 細胞生物例如酵母(如粟酒裂殖酵母(s. p〇mbe)或釀酒酵母(s. cerevisiae))，或原核細胞培養，較佳地畢赤酵母(pichia)或 大腸桿陳响。衍生自組織的細胞和樣本可藉由熟知的 技術’例如減、組織穿刺或外科技術來取得。 在本發明上述方面之内文中，對照健 載體，其包括報導基因戋苴劢& # μ t 麥規Μ ww、，其 片段，但其中報導基因之 表見並非由(功此性)組織蛋白酶Η啟動子所驅動。此可能係 基因或其功能性片段並非操作上= 蛋白酶Η啟動子偶合(亦即完全缺乏組、=織 包含非功能性組織蛋白酿Η 轲Η啟動子 動子和報導基因之偶合段’或其中啟 段在操作上與另外的啟動子偶合而 非組織蛋⑽Η啟動子(例如s或而 功能性紐和對__可㈣幼同的細;^動在^ 況下報導基因需不同。 也中仁在此情 根據上述用法辨識化合物可例如根據下述分析或本項 201113033 技術中已知的分析來進行。 分析可為任何類型的分析法或監測生物過程之系統。 適合地，代表生理代謝路徑以及病理狀況之部分的分子級 聯及機制係在細胞或生化（體外）系統中複製。潛在的醫藥化 合物之藥理活性因此可根據其干預或調節這些級聯或機制 之能力來測定。 就用於藥物篩選，特別是新穎醫藥化合物之高通量篩 選，此分析需為可複製的且較佳地亦為可調整及穩固的。在 本發明範圍中，高通量篩選係指本發明之方法係以非常小 量，例如在96、386或1536孔盤上於數毫升至數奈升或甚 至更少範圍内之非常小量樣本中來進行。因此，可在短時 間内分析大量的樣本。高通量篩選主要包括以單一分析篩 選大約500.000種不同的化合物之特定能力。此分析較佳地 係適合用於高通量篩選化學物質其在監控下對調節目標分 子活性之能力。分析的類型係依例如所用的目標分子之類 型而定（例如蛋白質或多核苷酸)且「讀出值」，亦即參數， 據此測定目標分子之活性（參見下文）。 不同類型之此等分析為本項技術中所習知並可從市面 上由供應商購得。 適合不同目的之分析涵蓋放射性同位素或螢光分析， 例如偏極化螢光分析（例如Panvera在市面所供應的）或 Packard BioScience(HTRF ; ALPHAScreen1M)用於測量標定 物與非標定物之相互作用（例如標定的蛋白質與其未標定的 蛋白質-配體之相互作用）。 19 201113033 更多的實例包括以細胞為主的分析，其中細胞株係穩 定地(可誘導或非誘導；染色體型或附加型）或過渡地表現重 組的目的蛋白。這些分析包括，例如報導基因分析，其中 調控特定啟動子或訊號傳導級聯之成員的訊號傳導路徑係 根據報導酵素之活性所測量，其表現係由該特定啟動子來 控制。就此類型的分析’重組的細胞株之建構必須在一定 義的啟動子之控制下含有此報導基因，或其係由自我監督 或於監督下由訊號傳遞級聯所調控。適合的報導酵素為本 項技術範圍中所習知並包含螢火蟲螢光酶、水母冷光酶(例 如（Packard之市售試劑）、β-半乳糖苦酶。適合的細胞株係依 照分析的目標而定’但主要包含容易轉染和容易.培養之細 胞株，例如 HeLA、COS、CHO、ΝΙΗ-3Τ3 等。 就蛋白酶活性之測定，典型的蛋白酶分析格式為已知： 例如使用在基質的一位置上搞帶報導標籤(例如發光/螢光或 其他訊號發射蛋白/肽或實體）及在另一位置上攜帶熄滅劑 (一種實體(例如另一種抑制報導標籤訊號發射之肽，只是此 基質會完好無缺/不會裂解)之基質；將基質以組織蛋白酶Η 於適合的條件下培養，使得基質裂解’因為熄滅劑和報導標 籤分離，而導致可偵測的訊號發射出（例如發射光線）。 其他類型的分析及其他類型的「讀出」已為本項技術所 熟知。用於偵測細胞中組織蛋白酶Η活性之分析可得自 Rtittger 等人，BioTechniques，2006。 本發明之分析係關於，例如： 201113033 一種辨識或分析調節及/或預防疼痛，較佳為神經病性 疼痛之化合物之方法，其包括下列步驟： a. 提供至少二種樣本； b. 將一含組織蛋白酶Η或其功能性片段或衍生物之樣本 與化合物接觸， c. 在化合物存在下，測定組織蛋白酶Η之活性， d. 在無化合物下，測定組織蛋白酶Η之活性，及 e. 將c)之組織蛋白酶Η活性與d)之組織蛋白酶Η活性相 比較。 一種辨識或分析調節及/或預防疼痛，較佳為神經病性疼 痛之化合物之方法，其包括： a. 將組織蛋白酶Η蛋白或其功能性片段或衍生物與試驗 化合物接觸；及 b. 測定試驗化合物是否能調節組織蛋白酶Η蛋白或其功 能性片段或衍生物之活性。 一種辨識或分析調節及/或預防疼痛，較佳為神經病性疼 痛之化合物之方法，其包括： a. 將具有一可偵測量或活性之組織蛋白酶Η或其功能性 片段或衍生物之細胞與試驗化合物接觸； b. 測定試驗化合物是否能調節存在細胞中的組織蛋白酶 Η或其功能性片段或衍生物之量或活性。 一種辨識或分析調節及/或預防疼痛，較佳為神經病性疼 痛之化合物之方法，其包括： 21 201113033 a. 將編碼組織蛋白酶η蛋白或其功能性片段 核酸與試驗化合物，於轉錄活化系統中衍生物之 b. 在該化合物之存在下，測定該系統中編騎=> Η蛋白或其功能性片段或衍生物之蛋白輪 c. 測定該化合物是否能調節存在該系統中的編置’及 白酶Η蛋白或其功能性片段或衍生物之蛋 轉錄活性系統為任何至少具有進行轉錄單位 量 應此力的生化或細胞系統。此糸統已為本項技術所熟Ί 括細胞以及體外轉錄系統或市售套組（例如以細胞^ 基礎）。 一種辨識或分析調節及/或預防疼痛，較佳為神經病性疼 痛之化合物之方法，其包括： 汽 、 a. 提供經核酸載體轉染之細胞，該载體包括操作上偶入 至報導基因或其功能性片段之組織蛋白酶Η基因咬 其功能性片段之啟動子； / b. 提供經對照載體轉染之細胞，該載體包括並未操作上 偶合至報導基因或其功能性片段之組織蛋白酶H基 因或其功能性片段之啟動子； c. 在化合物存在下，測定在試驗a)和b)細胞的報導基因 活性； d.在無試驗化合物下，測定a)和b)細胞的報導基因活性。 一種辨識或分析調節疼痛，較佳為神經病性疼痛之化合 物之方法，其包括： a.選擇一調節組織蛋白酶Η活性之化合物作為試驗化合 22 201113033 物，及 b.將該試驗化合物投予疼痛感受之對象，以測定疼痛是 否有受到調節。 一種於一對象中辨識或分析調節及/或預防疼痛，較佳 為神經病性疼痛之化合物之方法，其包括： a. 在一或多種試驗化合物之存在下分析組織蛋白酶Η或 其功能性片段或衍生物之生物活性，以辨識一或多 種具調節組織蛋白酶Η生物活性之調節化合物，及 b. 在一對象中試驗一或多種調節化合物其減低疼痛（特 別是神經病性疼痛）及/或疼痛感受（特別是神經病性 疼痛感受）及/或疼痛敏感性（特別是神經病性疼痛敏 感性）之能力。 在本發明其他方面係關於用於分類病患群組及協助醫 師調整/改善個別病患之治療之藥物基因體學方法，例如： 一種於個體中分析疼痛（(特別是神經病性疼痛）閥值之 方法，其包括於該個體的取樣中分析組織蛋白酶Η之量，與 一或多個參照樣本相比較，是否存在於該樣本中的組織蛋白 酶H mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參照樣本中之量不 同，其中於該個體中存在較高的量表示疼痛（特別是神經病 性疼痛）敏感性增加，而存在較低的量表示疼痛（特別是神經 病性疼痛）敏感性減低。 一種調整用於預防及/或治療個體疼痛之醫藥劑量之方 法，該方法包括檢驗個體之取樣，是否存在於該樣本中的組 織蛋白酶H mRNA及/或蛋白質之量與一或多個參照樣本中 23 201113033

之量不同’該劑量之調整係依照個體取樣中蛋白及/或mRNA 之1是否與一或多個參照樣本中之量不同而定；其中於個體 取樣中較高的組織蛋白酶Η量表示需要較高的劑量，個體樣 本中較低的組織蛋白酶Η量表示需要較低的劑量。 如文中所用’術語「取樣」係指由一或多個個體（人類 或非人類動物）之身體中所取出/分離之生物樣本。生物物質 和生物樣本包括’例如細胞、組織或器官（例如腦、血液、 肝，、脾臟、腎臟、心臟、血管等）之製備物或部分，較佳 地知·自脊椎動物’而更佳地得自哺乳動物（包括人類）。亦包 含來自細胞培養之細胞，較佳地真核細胞培養，其包括衍 生自多細胞生物和組織之細胞（例如HeLA、CHO、COS、 SF9或3T3細胞）’或單細胞生物例如酵母菌（例如粟酒裂殖 或釀酒酵母），或原核細胞培養，較佳地畢赤酵母或大 腸扣菌。衍生自組織的細胞和樣本可藉由熟知的技術，例 如抽血、組織穿刺或外科技術來取得。重組分子之製備物 及來★自細胞或組織之天'然生成分子的純化物，以及細胞或 組織萃取物之製備物已為熟習本項技術者所熟知（參見，例 如下文所列之標準文獻）。 術5吾「參照樣本」係指取自-或多個患有特定疼痛表型 之個體的生物樣本或體外生物樣本(例如源 自體外細胞或組 織培養(例如培養的細胞)之樣本及肖定性質（例如其組織蛋 活性、量絲現之程度)與特定疼痛表型(例如高疼痛 敏感性或低疼痛敏感性)相符之樣本。 本心月另方面係關於’藉由分析取自所欲檢驗之個 24 201113033 體身體的生物樣本，偵測個體中組織蛋白酶Η供測定疼痛敏 感性增加之裝置之用途。 偵測組織蛋白酶Η蛋白或多肽之裝置可為任何能特別 偵測存在生物樣本中之組織蛋白酶Η多肽/蛋白或核^之裝 置。 μ - 偵測組織蛋白酶Η蛋白或多肽之裝置可為任何能專一 偵測野生型組織蛋白酶Η蛋白/多肽之裝置，且亦可為專一 偵測包含一或多個突變體之組織蛋白酶Η蛋白/多肽，就有 關大小或胺基酸序列與野生型組織蛋白酶Η多肽/蛋相比較 之裝置。此裝置之較佳的實例為能專一偵測組織蛋白酶Η蛋 白之抗體’例如用於免疫組織化學或免疫組織化學技術（例 如於組織學組織切片中偵測組織蛋白酶Η蛋白或其特定突 變體’或固定在適合載體上之組織蛋白酶Η蛋白’如膜、晶 片、ELISA盤等）。 债測組織蛋白酶Η核酸之裝置可為例如偵測組織蛋白 酶H mRNA/cDNA或基因體DNA，野生型或包含一或多個 突變體’就其長度或其核酸序列與野生型組織蛋白酶Η核酸 相比較之裝置。此裝置可為專一偵測及/或定量組織蛋白酶Η mRNA之裝置’且較佳地包含或為專一的組織蛋白酶η核酸 探針’或能增幅組織蛋白酶H DNA之引子組，或例如用於 PCR排序（用於偵測核苷酸序列中之突變物）或能增幅組織蛋 白酶H cDNA ’例如用於rt PCR(用於偵測及/或定量組織蛋 白酶H mRNA表現）。另外的裝置可為例如於標準條件下能 專一與組織蛋白酶HmRNA或cDNA雜交之核酸探針，例如 25 201113033 用於北方墨點 術誶f &日曰片雜交技術。 :卜 2、3、4 特定體于二型係指於自然界或標準實驗室庫存中發現之 白酶Η之野&因型或表型。根據一較佳的貫施例，組織蛋 8及/或9^序列為― t文）。彳自的目^子之設計和合成已為本項技術所熟知（亦參見 έ i.r用"、、且織蛋白酶η之引子組可如下： 二苦酸人類CTSH轉錄變體1之產物長度=154 個核苷酸）.於偵測人類CTSH轉錄變體2之產物長度=118 月 y P | -了—

〇 ⑼ 丨十 5’-GCGCTCCCAGTTGACGCTCT-3, (SEQ ID 反置弓丨子 5，-CACGCACAGTTCGGCGGC-3，（SEQ ID NO.11) 組2 ··(用於偵測人類CTSH轉錄變體1之產物長度=153 個核苷酸’用於偵測人類CTSH轉錄變體2之產物長度=117 個核苷酸）： 前置引子 5，-CGCTCCCAGTTGACGCTCTGG-3，（SEQ ID NO.12) 反置弓丨子 5，-CACGCACAGTTCGGCGGC-3’（SEQ ID NO.13) 〇 根據本發明一實施例，此裝置為增幅組織蛋白酶H核酸 之引子組，且較佳地為包括至少其中一組SEQ ID NOs. 10、 11(與組1共同）、12及/或13(與組2共同）之引子組。 26 201113033 根據本發明另一較佳的實施例’此裝置為偵測組織蛋白 酶Η核酸之探針。適合的探針之設計和合成已為本項技術所 熟知（亦參見下文之標準文獻）。 又根據本發明另一較佳的實施例，此裝置為專一彳貞測組 織蛋白酶Η蛋白或多肽之抗體。 適合的抗體或其功能性片段之製備物同樣已為本項技 術所熟知，例如藉由以組織蛋白酶Η蛋白或其功能性片段’ 若需要，在例如佛朗氏佐劑(Freund，sacjjuvan)及/或氫氧化銨 凝膠之存在下’使哺乳動物（例如兔子）免疫（參見，例如 Diamond, B.A.等人（1981) The New England Journal of Medicine : 1344-1349)。在動物中因免疫反應所形成之多株 抗體’可隨後使用熟知之方法由血液中分離，及例如以管柱 層析純化。單株抗體例如可依照Winter & Milstein之已知的 方法來製備（Winter, G. & Milstein，C. (1991) Nature, 349, 293-299)。製造單株抗體之適合的製程同樣已為本項技術所 熟知（參見例如下文所列標準方法之文獻）。在本發明内文 中’術語抗體或抗體片段亦包括經重組製備，及若需要經修 飾之抗體或其抗原結合部分，例如嵌合抗體、人源化抗體、 多功能性抗體、雙特異性或寡特異性抗體、單股抗體及F(ab) 或 F(ab)2 片段(參見例如 EP-B1-0 368 684、US 4,816,567、 US 4,816,397 > WO 88/01649 、 WO 93/06213 或 WO 98/24884)。組織蛋白酶H抗體亦可從市面上購得，例如 R&D Systems公司型號BAF1013之羊抗小鼠組織蛋白酶 Η(美國明尼阿波利斯）、R&D Systems公司型號MAB1013之 27 201113033 大鼠抗小鼠組織蛋白酶Η (美國明尼阿波利斯）、型號afi〇13 之山羊抗小鼠組織蛋白酶Η或型號ABIN285430之兔抗人組 織蛋白S# Η(德國antibodies-online公司，參見http : //www.antikoerper-online.de)或型號 ABIN165388 之小鼠抗人 組織蛋白S# Η(德國antibodies-online公司）。 製造組織蛋白酶Η抗體及偵測來自人類組織胞質液和 漿液之人類組織蛋白酶Η係例如詳述於Schwdger等人，

Journal of Immunological Methods，2001，第 165_172 頁（來見 例如第166-167頁之材料和方法）。 本發明另一方面係關於測定個體疼痛且特別是神經病 性疼痛敏感性之診斷套組，此試驗套組包含至少一用於偵測 生物樣本中的組織蛋白酶H之裝置及其用途。 、 上在本發明内文中，應了解試驗套組可為任何本申請書 所認定的組件之組合，該組合係經組成，以空間上共存， 成為一功能裝置且其可含有另外的組件。 在本發明内文中，試驗套組係包括至少一用於侦測樣本 中組織蛋白酶Η(例如量/或突㈣)之裝置，適合地共同與適 合的缓衝劑及/或試_於進行_反應(例如藉由抗體之組 織蛋白酶Η免疫偵測、用於分析組織蛋白酶Η活性之酵素 反應或其類似反應）及/或樣本製備物，以及視需要，用於進 行個別偵測技術之操作手冊。 本發明其他方面係關於治療之方法，例如： 於一感受疼痛的對象中治療疼痛之方法，其包括投予該 對象一治療上有效量之降低該對象中組織蛋白酶Η量或活 28 201113033 性之組成物。此可為組織蛋白酶Η之量或活性共同或於特定 組織’例如神經組織、淋巴組織或免疫組織之細胞如肥大細 胞、巨噬細胞、中性粒細胞、Τ細胞（例如CD8+ Τ-細胞）等， 其中治療上有效量包括足以改善個體疼痛（特別是有關神經 病性疼痛）感受或敏感性之量。 又本發明另一方面係關於減低一對象中疼痛（且特別是 神經病性疼痛）敏感性之方法，其包括投予該對象一治療上 有效量之降低該對象中組織蛋白酶Η量(例如表現、半衰期） 或活性（例如淋巴或神經組織或免疫系統之細胞）之組成物。 再者’本發明係關於於非人類雌性對象之後代中調節疼 痛（且特別是神經病性疼痛）敏感性之方法’其包括將給予調 節組織蛋白酶Η表現之核酸轉入(例如電穿孔)合子中，將合 子轉入非人類的代養母中並根據其組織蛋白酶Η表現特性 選擇後代(相較於野生型對象，例如小鼠，減低或消除組織 蛋白酶Η表現）。 本發明另一方面係關於能降低組織蛋白酶Η活性及/或 表現供治療疼痛（且特別是神經病性疼痛）之化合物。 、-且、哉蛋白_ Η之抑制劑已為本項技術所知，例如E_64d (參見，例如 Riittger 等人，BioTechniques, 41 : 469-473, 2006) 及 Kirschke，Η 等人，1995, Protein Profile 2 : 1581-1643)。 就製造本發明組織蛋白酶Η之調節劑醫藥品可以適合 的添加劑或辅助物質，例如生理緩衝溶液，如氯化鈉溶液' t礦質水、安定劑例如蛋白酶或核酸酶抑制劑，較佳為抑肽 酶(aprotinin)、（ε_胺基己酸或抑胃肽a (pepstatin A)或螯合劑 29 201113033 例如EDTA、凝膠調配物，例如白凡士林、低黏度石蠟及/ 或黄蠟等，依照給藥種類來調配。 適合的其他添加劑有，例如清潔劑，例如Triton X_l〇〇 或去氧膽酸鈉，以及多醇類例如聚乙二醇、糖例如蔗糖或葡 萄糖，二性離子化合物例如胺基酸如甘胺酸或特別是牛磺酸 或甜菜鹼及/或蛋白質例如牛或人類血清白蛋白。清潔劑、多 醇及/或二性離子化合物為較佳的。 生理緩衝溶液較佳地具有約6.0-8.0之pH，特別是約 6.8-7.8之pH，特別是約7.4之卩1^，及/或約200-400毫滲克 分子/公升’較佳地約290-310毫滲克分子/公升之滲透壓。 醫藥品之pH —般係使用適合的有機或無機緩衝液來調整， 例如’較佳地係使用磷酸緩衝液、tris缓衝液(叁(羥曱基)胺 基甲烧)、HEPES緩衝液（[4-(2-經乙基）派α井基]乙續酸）或 MOPS緩衝液(3-嗎淋基-1-丙續酸）。各別的緩衝液之選擇一 般係依照所欲的緩衝液滲透壓而定。磷酸緩衝液適用於，例 如注射和灌注溶液。 醫藥品可以習用的方法’例如以口服劑型如鍵劑或膠 囊、經由黏膜例如鼻腔或口腔、以植入皮膚下之栓劑形式， 以注射、輸注或含有本發明醫藥品之凝膠來給藥。另可局部 才又予醫藥品用以治療特定的如上述之關節疾病，若需要，以 微脂體複合物之形式。再者，治療可藉由能暫時控制醫藥品 釋放之皮膚滲透治療系統(TTS)來進行。TTS可由，例如Ep〇 944 398 A卜 EP 0 916 336 A卜 EP 0 889 723 A1 或 EP 〇 852 493 A1得知。 201113033 若僅投予身體相當小量的溶液或懸浮液例如約1至約 20毫升，一般係使用注射溶液。若投予大量的溶液或懸浮液 例如約一或更多公升，一般係使用輸注溶液。因為，與輸注 溶液相反，注射溶液僅給予數毫升的情況下，注射中來自pH 和血液滲透壓或組織液之小差異本身並不顯著，或僅對疼痛 感受有微不足道程度的顯著性。因此，使用前稀釋本發明調 配物，一般而言並不需要。然而，在相當大量給藥的情況下， 本發明調配物應在給藥前簡單稀釋到達至少約得到等張溶 液之程度。等張溶液之實例為0.9%濃度的氯化鈉溶液。就輸 注的情況，稀釋可例如使用無菌水來進行，而給藥可例如經 由所謂的繞道來進行。 根據本發明不同方面之一較佳的實施例，組織蛋白酶 Η、其衍生物或片段可用作分離分子。 在本發明内文中，術語「分離分子」特別是有關組織蛋 白酶Η，係指由天然來源純化之組織蛋白酶Η多核苷酸或多 肽以及純化的重組分子（其中術語純化包括部分純化以及完 全純化）。 重組的多肽或多核苷酸分子之製備物和來自細胞或組 織之天然生成分子之純化物，以及細胞或組織萃取物之製 備物為熟習本項技術者所熟知（亦參見例如下文所列之標準 文獻）。 這些包括例如以公開的基因體或編碼多核苷酸序列為 基準，經由聚合酶鏈鎖反應（PCR)增幅所欲長度之多核苷 31 201113033 酸’及隨後於宿主細胞中選殖所產生的多核苷酸(參見例如 下文所列之標準文獻）。 在本發明内文中’術語「多肽」係指包含以肽鍵相互鍵 結的胺基酸之分子’其含有直線模式至少50個相互偶合的 胺基酸，以形成一多肽鏈。此類較短的分子稱為肽。術語「蛋 白質」係指包含至少一個多肽鏈之分子，但亦可指包含一個 以上相互結合或鍵結的多肽鏈之分子。因此，術語「蛋白質」 亦包含術語「多肽」。 【實施方式】 實例： 材料和方法： 所用的小氣品糸 使用五種不同的近交小鼠品系：AKR/J(AKR)、CBA/J (CBA)、C3H/HeJ(C3H)、C57BL/6J(B6)及 C58/J(C58)。小鼠 係得自傑克森實驗室（The Jackson Laboratory美國緬因州巴 爾港）。就這些小鼠品系，有關數種體内的疼痛測量已顯示 顯著的差異(Mogil等人，1999)。 總RNA分離： 依照製造商之說明書以PicoPureTM RNA分離套組 (Arcturus公司）分離來自DRG(背根神經節）之總RNA。使用 2100 Bioanalyzer 及 RNA 6000 Nano LabChipTM 套組(Agilent 公司）評估RNA之質性。.

Affymetrix GeneChipTM 微陣列分析： 使用 500 ng 總 RNA，以 100pM T7-(dT)24 寡聚物 32 201113033 (GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCG G-dT24SEQ ID NO : 14)根據 Baugh, L.R，Hill，A.A.，Brown， E.L.及 Hunter, C.P. (2001) TVwc/e/c jczWs 及烈· 29，e29 及 Superscript II反轉錄酶，依照製造商說明書進行First-strand cDNA合成。合成雙股的cDNA及然後使用酚-氯仿萃取，接 著進行乙醇沉澱步驟。以雙股的cDNA樣本，使用BioArray 高效RNA轉錄標定套組(Enzo公司）根據製造商說明書進行 體外轉錄反應。將轉錄反應於37。(：培養16h。使用RNA清 除之尺价357頂迷你套組(Qiagen公司）法純化CRNA並以分 光光度計定量。將生物素標定的CRNA使用RNA碎斷緩衝 液(200mM Tris-乙酸鹽、500mM KOAc、150mM MgOAc，pH 8.1)打碎。根據製造商說明書進行小鼠基因體430 2 〇 GeneChips™ (Affymetrix公司）之雜交及染色。使用 GeneChipTM 3000掃描器來掃描微陣列，輸入掃描數據並使 用Resolver v5.l表現數據分析軟體(R〇settaBi〇software公司） 分析。 L5脊神經之截斷及偽手術過裎： 讓麻醉的小鼠左邊L5脊神經暴露出及然後將橫突部分 移除。與L4脊神經分離後，截斷L5脊神經。偽手術係與L5 脊神經截斷手術相同，然而，以脊神經並未截斷（參見DeLe〇 等人，2000)。 測定縮足閥值： 縮足闕值(P W T)係使用腳底觸覺測定儀來評估（參見 Szabo等人，2005)。在適應金屬網地面之箱室後，將刺激器放 33 201113033 置在動物的後爪，將電動傳動器所驅動的直的金屬絲接觸爪 底表面並施加一漸增的上升力直到動物移開爪子（縮足閥值， PWT)。評估與手術端同測及對側後爪之PWT。每隻動物僅 使用一次。所有的動物實驗皆遵守意識動物研究之倫理準 則’且過程係經當地倫理委員會核准。 相關分析： 對於相關分析，就各神經截斷動物(Chung動物）之「疼 痛表型」係以C7-67來定義，其中 矣今Cl = In(同測PWT/對侧PWT)及 S1 =平均所有相 同品系偽手術 動物In(同侧PWT/對側PWT)。 對於各Chung動物係以二次分化轉錄調控評量來定義且 各測量的基因係以其強度表現數據為基準。就個別的基因和 動物’係採用「原始強度評量」作為以Resolver表現數據分 析軟體(v5.1)所計算之強度評量計算。就特定基因和chung 動物之「對數比率（1(^如丨〇)評量」係計算為/„(^2/^2>)，其中 C2=Chung表現強度，而S2=平均所有相 同品系偽手術動物 偽表現強度。 在計算相關性前，將基因組過濾以排除表現在噪聲級以 下和無顯著Chung及偽調控之基因。合格的基因在至少6〇〇/0 的Chung動物中必須具絕對倍數變化=>1.5之調控，或在至少 20%的Chung動物中必須具絕對倍數變化=>2.0之調控。又， 對應的基因表現必須在至少五隻動物中可偵測出（「存在」）， 如各別的強度所定義P-值<0.001。 疼痛表型得分和其中一項所定義的轉錄調控測量值間 的各基因之皮爾森相關係數(Pearson correlation coefficient) 34 201113033 係使用R套裝軟體所計异（http . //www.r-project.org/)。基於 此，統計顯著性P-值和對應的錯誤發現率(FDR)係依照Storey 等人(2002)之方法所產生。在「對數比率評量」或「強度評 量」下FDR< 〇.〇5之基因則視為顯著相關。 【圖式簡單說明】 第1圖：組織蛋白酶H-相關圖 第1圖係顯示在L5 DRG中各個小鼠其神經病性疼痛表 型（機械性過敏，X-軸)及對應的組織蛋白酶Η之基因調控（對 數比率（Chung vs.偽對照），Υ-軸）。小鼠數據係依照使用的品 系以顏色編號。進行皮爾森相關分析並顯示二個參數疼痛表 型和組織蛋白酶Η基因調控之顯著正相關性。其係表示就個 別的小鼠，在Chung-手術神經病性小鼠中υ DRG組織蛋白 之表現越局’則在行為試驗中展現的機械性痛覺過敏則 越顯著。 此顯著的相關性代表組織蛋白酶Η基因表現對引發神經 病性疼痛表型之因果關係。 第2圖：組織蛋白酶Η-強度數據 在chung或偽手術後’個別的AKR、CBA及C57品系小鼠 之L5神經節的組織蛋白酶η表現之絕對值。 第3圖：根據NCBI參照序列，在15號染色體上人類組織 蛋白酶Η之基因體DNA序列：NGJ)0%14.1 (SEQIDN0. 1)。 第4圖：根據NM—004390.3之人類組織蛋白酶Η轉錄變體 1的編碼序列（SEQ ID NO : 2)，其具有1494 bp長度及編碼較 長的組織蛋白酶Η之同型物A。 35 201113033 第5圖：根據NM一 148979.2之人類組織蛋白酶H轉錄 變體2的編碼序列（SEQIDNO: 3)，其具有1458 bp長度及 編碼較短的組織蛋白酶Η之同型物B。根據上$錄 號，當與由轉錄變體1所編碼的同型物Α相比較時，相較於 變體1，此轉錄變體缺少替代的讀框斷片，產生較短的蛋白 (同型物B)。此可產生比溶酶體蛋白可能更具分泌性之蛋白 (同型物B)。 第6圖：根據NCBI登錄號BC006878.1之小鼠組織蛋白酶 Η的編碼序列（SEQ ID N0.4)。 第7圖··根據UniProtKB/Swiss-ProtP〇9668之人類組織蛋 白酶Η蛋白序列（SEQ ID ΝΟ·5)，其包含335個胺基酸及建構 人類組織蛋白酶Η之前體（同型物A)。將此序列進一步楚理成 為成熟型；其係裂解為下列3個鏈：.組織蛋白酶η迷你鏈、組 織蛋白酶Η重鏈、組織蛋白酶Η輕鏈(輕和重鏈可共同稱為大 鏈）；所有的鏈係共同以二硫鍵所支撐。胺基酸1_22構成訊號 肽(22個aa長），胺基酸23-97構成活化肽(75個aa長），胺基酸 98-105構成組織蛋白酶Η迷你鏈(8個aa長），胺基酸106-115構 成前肽（10個aa長），胺基酸116-335構成組織蛋白酶Η長鏈 (220個aa長）其包含以二硫鍵共同支撐之重鏈和輕鏈，胺基酸 116-292構成組織蛋白酶Η重鏈（177個aa長），胺基酸293-335 構成組織蛋白酶Η輕鏈(43個aa長）。 第8圖：根據NM_004390.3之人類同型物A蛋白質前體 (SEQIDNO : 6 ; SEQIDN0.2之轉譯的胺基酸序列）。 第9圖：根據ΝΜ_148979·2之人類同型物B蛋白質前體 36 201113033 (SEQ ID NO : 7 ; SEQ ID N0.3之轉譯的胺基酸序列）。 第10圖：根據NP_004381.2之人類組織蛋白酶Η同型物A 蛋白質前體的蛋白序列（SEQ ID N0.8)。 第11圖：根據NP_683880.1之人類組織蛋白酶Η同型 物Β蛋白質前體的蛋白序列（SEQ ID NO.9)。 37 201113033 參考文獻：

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Current Protocols in Human Genetics ； regularly uptdated ； Wiley & Sons，Inc ; Editors : Nicholas C. Dracopoli，Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith. 201113033

Current Protocols in Protein Science ； regularly updated ； Wiley & Sons, Inc ； Editors · John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.

Molecular Biology of the Cell ； third edition ； Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D. ； Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994 ；

Short Protocols in Molecular Biology, 5th edition, by Frederick M. Ansubel (Editor), Roger Brent (Editor), Robert E. Kingston (Editor), David D. Moore (Editor), J.G. Seidman (Editor), John A. Smith (Editor), Kevin Struhl (Editor), October 2002, John Wiley & Sons, Inc” New York“

Transgenic Animal Technology A Laboratory Handboook. C.A. Pinkert, editor ； Academic Press Inc., San Diego, California, 1994 (ISBN ： 0125571658)

Gene targeting · A Practical Approach, 2nd Ed., Joyner AL, ed. 2000. IRL Press at Oxford University Press, New York ； Manipulating the Mouse Embryo · A Laboratory Manual. Nagy, A, Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R., 2003, Cold Spring Harbor Press, New York ；

Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 Edition, 1985 (for physiologically tolerable salts (anorganic or organic), see esp. p. 1418)

Standard Literature for Laboratory Methods ·

If not indicated otherwise, laboratory methods were or can be 42 201113033 performed according to standard methods listed in the below standard literature '

Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning ： A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp or Current Protocols in Molecular Biology;

Current Protocols in Molecular Biology； regularly updated, e.g. Volume 2000 ； John Wiley & Sons, Inc i Editors · Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.

Current Protocols in Human Genetics ； regularly uptdated, e.g. Volume 2003 ; John Wiley & Sons, Inc ; Editors : Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.

Current Protocols in Protein Science ； regularly updated, e.g. Volume 2003 ； John Wiley & Sons, Inc ； Editors ： John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.

Molecular Biology of the Cell i third edition ； Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D. ； Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994 ； 43 201113033

Gene Targeting : a practical approach (1995), Editor : A丄. Joyner, IRL Press

Remington’s Pharmaceutical Sciences, Edition 17, 1985. 44 201113033 序列表 <110〉赛諾菲阿凡提斯公司 <120〉組織蛋白酶Η之用途 <130> DE2009/140 <150〉09290659.3 <151> 2009-08-31 <160> 14 <170> Patentln version 3.3 <210〉 1 <211〉 30329 <212> DNA <213〉人類 <400> 1 atggacagag ccgtctatcc agccatccct tcttctattc attcatccac acatgcatcc 60 aaacacatag ccaggcaccc aaccactgag ccaatcccct accgacctac catataaaat 120 cagcctgtgg atgtggaagg agtcccacct cttaccagca ggcctactta acttctccaa 180 gtctcaatct cttcatctga aaattgagta tgtgtatgct cataagggcc ttcacagggt 240 tgttatgagc agtaaataac aaaacccatg tgaatggtgg ctattatatt accatggtaa 300 gaaaatgaat gtggcaaaag gcccagcttg tctgctacaa tgttggctct aacaggtgat 360 ctggaaaacc agtcaaacct gtagttaaca gttgtggggg gtgggggagg ggggtgataa 420 agttgtgtta tcctttttgt tatccccaga ttcagcttaa ggaaaagaat aaatggatgt 480 ggggcaggta acaatgacta gaacattcat gcaggaggca ttctgcatgc aggcagtgac 540 201113033 tgcagattcc aggacctgtg gttagcggac tcctattgat gtttctggga actctagacc 600 tggaagttca ggtaggtagg caagcctcag gactcatcgt catcacttgt 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gccaggtggc actggggaca gacgtcccag tgtcttggga gtgcaacggc catggcgtca agcttcgtgc aggcaaggag ctcagcccac agaaacaacc gggacagggc atctgggcca ttgcaaacct ccgcaagcga tgggagtccc cgcgccgccc ggcgcactgg gcgtgctggc gcttgtagga tctccagcct cagagtgtca ccttctctag gtcccatctg accagggaaa ggtggagccc tgcccttgca cctgctcttc aggctctgaa caaggagcca tttcccccag gagggttgcc cagtgggcgc gggctgcctg cgtctgcggt gagagggtgc gctccggagg acggggaggg ccagaggagc agaataccaa cacagaggac cagcttcccc tagagtaggt gcactcagac caggactcct tcctgtctac cctactgcct cttaaagacc agaacctagg ctagaggctc tcattccttc ccagctccag gagaaggctg 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6 201113033 gcgctgagag gctgtctgaa ttccagagca gggcttggca aactttttct gtgaaagacc agacggtaaa taacttaggc tttatggtgg tctctgtagc aactactaac tctgccatgg tagtgtgata gcaaccatag attgtatgta agtgagtcag tgtaactggg ttctaataaa tgatttttat ggccactgaa atttcagttt caagggattt ttgggtgcta cgaaatatgt ttcttctaac catttaaaat tgtaagaaac cgtttgtagc ccaggagctg 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caggaaggtg gctctctcct tgccaggaaa gagggagtag aaagtgtcag gggtgagaca cgggccagca ccatatggag attctcctga cagaagcaga agaaccaaaa gaactgaaag ggccgggtgc ggtggctcac acctgcaatc ccagcacttt gggaggccga ggtgggtgga tcacctgagg tcaggagctc gagaccaacc tagccaacat gatgaaaccc tgtctctacc caaaatacaa aaattagctg ggtgtggtgg tgcacgcctg taatcaggct actcgggagt ctgaggcagg agaatcgttt gaaccctgga ggtgaaggtt gcagtgagca gagattgcac cattgcactc cagcctgggc aacagagtga 25680 25740 25800 25860 25920 25980 26040 26100 26160 26220 26280 26340 26400 26460 26520 26580 26640 26700 26760 24 201113033 gactccgtct caaaagaaaa aaagaactga aaggagttct ctcacggaga ctaaatgtga ttacatcacc accttacatg cctccctggt ccgctgtggg gaacattgct ctaaagcgct caaagaggcg ttgttggatg ggactgtcat tgcttttatc cttcccatat gatcacctct ttttgaattt tgttttccag tacttcctgc cataaaactc cagataaagt aaaccatgca gtactggctg ttgggtatgg agaaaaaaat gggatccctt actggatcgt gaaaaactct tggggtcccc agtggggaat gaacgggtaa gcagctccca ggtcccactt ctgggagggg gatgttgctc aggcctggag gccctggggg catcacttcc acctcagagt tacggcttcc acagacgagc tggtcagcca agccctaggc caggccaggg ggaaagggag catgagaatg tagcctccac atttccaagc ccccatttgc agccctcaca gggccccagg tctttaggac gctgcaggga gagcaggagg ccagctggct cagaaggact gctaggaaaa cagctcagaa cttggaactc tgctggcacg aaatcagtgt ctgggagggt ccgtctttga gaaatcaaag caacaaatgt acccctgatc actgacagcc cctccttccg ggagaaaagg ctggcatggg gcggcctggg tgtatatgct gctgtgcctt tgtcctgtcc tcccagattc catgtccttg tctgaaaagg agagctttcc tgttccctcg ggctcctggt gataaaatag ctgtgtgagg gcccggccag ggctaagagg gggccctcgg taaattttcg ggagaagtgg gatatggatc attcatttgg cagctaagga gagggaagaa tgaattcttc acaaagtcag gtccgtgatt tgccggtgat caaataagcc gaatgctact gttttatgaa taaatttaga gggtctcacc cctgaagtca gctcttggtg agcagcaaaa cattctagaa aggcctgtgg tggggagacc gccggccggg cctcagctcc tctttctgcc caggtacttc ctcatcgagc gcggaaagaa 26820 26880 26940 27000 27060 27120 27180 27240 27300 27360 27420 27480 27540 27600 27660 27720 27780 27840 27900 25 201113033 catgtgtggc ctggctgcct gcgcctccta ccccatccct ctggtgtgag ccgtggcagc cgcagcgcag actggcggag aaggagagga acgggcagcc tgggcctggg iggaaatcct gccctggagg aagttgtggg gagatccact gggaccccca acattctgcc ctcacctctg tgcccagcct ggaaacctac agacaaggag gagttccacc atgagctcac ccgtgtctat gacgcaaaga tcaccagcca tgtgccttag tgtccttctt aacagactca aaccacatgg accacgaata ttctttctgt ccagaagggc tactttccac atatagagct ccagggactg tcttttctgt attcgctgtt caataaacat tgagtgagca cctccccaga tggagcatgc tggtcctggg ccatgactca aaccaggtct gtcctcgcca ctcagtctcc caggagggag gcatcagggg gtgtccaggc tctggctggg aggatggtgg gggtgctggc ggtattatcc accagatggg gtatccagga tgaagagcag gcttaatttg agatcttgac tatttgtccc aaacctgagt ggagaggtgg ggaggaagga gaaaaacggg ccaagctgcg gcagaggcag gattcaaacc cacaatgtca gcccagaagc ctgtacttct ctgtgtggcc tccccagtct cagctgccta ctcctactca gactctgccc cccacctcca catgagactg cccacccctt cctcaccaac cccttattta tttcaaacgt gcccagatgc tcctgtcgtt tccacaccat cccttccctt atcttgcctt ttgagaaatc ttgatctctg tttagagggc ggccatgaag ttgctgctgc ttcctgaagc ctccgggctc tgggatgtct gtagaacaag ctggagtcca 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aatttatgta tttttagtag agatggggtc tcaccatgtt 29640 ggtcaagctg gtctcgaact cctgacctca agtgatccca aagtgctggg attacaggag 29700 tgtgagcaac cgcacccagc ctgaaagcat aatttctgaa tttgacaaag attctcaaat 29760 caatggtcag ttgtataaaa ggattcccat tgaagtcagt ggtataaaag gattcccatt 29820 gaagatacat ggcaaataag tctaagggta ccattcttgc ttacatctat ctggaagatc 29880 tggctgctgt gataaataaa cccaattaat atttgcagac agcatgataa tgtggctaaa 29940 aacattcagg agaatcaaca aaacttagaa ctaatgaaag agttctgaaa gtggctggat 30000 accagaaaaa aaaatcaaaa actcagaaaa aatacactat tttttgttac tattgcaact 30060 ttactattgc aacaaaacca gcagctagga ataaccacca aaaagtctta tatgaagaaa 30120 attactaaat taataacact ataaaggaag acttagataa atggagagcc accatattct 27 201113033 tttgttgttg ttgttgagac agagtctcac actgttgccc gggctggagt gcaatggcat 30240 gatcttggct cactgcaacc tccgcctccc gggttcacgt gattctcctg cctcagccac 30300 ccgagtagct gggattacag gtgcccacc 30329 <210〉 2 <211〉 1494 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 2 ccacgctcgt gccgctcccc ccccgcgctc ccagttgacg ctctgggccg ccacctccgc 60 ggaccctgag cgcaagagcc aagccgccag cgctgcgatg tgggccacgc tgccgctgct 120 ctgcgccggg gcctggctcc tgggagtccc cgtctgcggt gccgccgaac tgtgcgtgaa 180 ctccttagag aagtttcact tcaagtcatg gatgtctaag caccgtaaga cctacagtac 240 ggaggagtac caccacaggc tgcagacgtt tgccagcaac tggaggaaga taaacgccca 300 caacaatggg aaccacacat ttaaaatggc actgaaccaa ttttcagaca tgagctttgc 360 tgaaataaaa cacaagtatc tctggtcaga gcctcagaat tgctcagcca ccaaaagtaa 420 ctaccttcga ggtactggtc cctacccacc ttccgtggac tggcggaaaa aaggaaattt 480 tgtctcacct gtgaaaaatc agggtgcctg cggcagttgc tggactttct ccaccactgg 540 ggccctggag tctgcgatcg ccatcgcaac cggaaagatg ctgtccttgg cggaacagca 600 gctggtggac tgcgcccagg acttcaataa tcacggctgc caagggggtc tccccagcca 660 ggctttcgag tatatcctgt acaacaaggg gatcatgggt gaagacacct acccctacca 720 28 201113033 gggcaaggat ggttattgca agttccaacc agccaacatc acaatctatg acgaggaagc tgtgagcttt gcctttgagg tgactcagga cagtacttcc tgccataaaa ctccagataa tggagaaaaa aatgggatcc cttactggat aatgaacggg tacttcctca tcgagcgcgg ctcctacccc atccctctgg tgtgagccgt agaggaacgg gcagcctggg cctgggtgga tccactggga cccccaacat tctgccctca aaggaggagt tccaccatga gctcacccgt ccttagtgtc cttcttaaca gactcaaacc aagggctact ttccacatat agagctccag aaacattgag tgagcacctc cccagatgga 〈210〉 3 <211〉 1458 <212〉 DNA <213〉人類 <400> 3 ccacgctcgt gccgctcccc ccccgcgctc ggaccctgag cgcaagagcc aagccgccag ctgcgccgcc gaactgtgcg tgaactcctt tggaaaggcc atcggctttg tcaaggatgt 780 gatggtggag gctgtggccc tctacaaccc 840 cttcatgatg tatagaacgg gcatctactc 900 agtaaaccat gcagtactgg ctgttgggta 960 cgtgaaaaac tcttggggtc cccagtgggg 1020 aaagaacatg tgtggcctgg ctgcctgcgc 1080 ggcagccgca gcgcagactg gcggagaagg 1140 aatcctgccc tggaggaagt tgtggggaga 1200 cctctgtgcc cagcctggaa acctacagac 1260 gtctatgacg caaagatcac cagccatgtg 1320 acatggacca cgaatattct ttctgtccag 1380 ggactgtctt ttctgtattc gctgttcaat 1440 gcatgctggt cctggaaaaa aaaa 1494 ccagttgacg ctctgggccg ccacctccgc 60 cgctgcgatg tgggccacgc tgccgctgct 120 agagaagttt cacttcaagt catggatgtc 180 29 201113033 taagcaccgt aagacctaca gtacggagga gtaccaccac aggctgcaga cgtttgccag 240 caactggagg aagataaacg cccacaacaa tgggaaccac acatttaaaa tggcactgaa 300 ccaattttca gacatgagct ttgctgaaat aaaacacaag tatctctggt cagagcctca 360 gaattgctca gccaccaaaa gtaactacct tcgaggtact ggtccctacc caccttccgt 420 ggactggcgg aaaaaaggaa attttgtctc acctgtgaaa aatcagggtg cctgcggcag 480 ttgctggact ttctccacca ctggggccct ggagtctgcg atcgccatcg caaccggaaa 540 gatgctgtcc ttggcggaac agcagctggt ggactgcgcc caggacttca ataatcacgg 600 ctgccaaggg ggtctcccca gccaggcttt cgagtatatc ctgtacaaca aggggatcat 660 gggtgaagac acctacccct accagggcaa ggatggttat tgcaagttcc aacctggaaa 720 ggccatcggc tttgtcaagg atgtagccaa catcacaatc tatgacgagg aagcgatggt 780 ggaggctgtg gccctctaca accctgtgag ctttgccttt gaggtgactc aggacttcat 840 gatgtataga acgggcatct actccagtac ttcctgccat aaaactccag ataaagtaaa 900 ccatgcagta ctggctgttg ggtatggaga aaaaaatggg atcccttact ggatcgtgaa 960 aaactcttgg ggtccccagt ggggaatgaa cgggtacttc ctcatcgagc gcggaaagaa 1020 catgtgtggc ctggctgcct gcgcctccta ccccatccct ctggtgtgag ccgtggcagc 1080 cgcagcgcag actggcggag aaggagagga acgggcagcc tgggcctggg tggaaatcct 1140 gccctggagg aagttgtggg gagatccact gggaccccca acattctgcc ctcacctctg 1200 tgcccagcct ggaaacctac agacaaggag gagttccacc atgagctcac ccgtgtctat 1260 gacgcaaaga tcaccagcca tgtgccttag tgtccttctt aacagactca aaccacatgg 1320 30 201113033 accacgaata ttctttctgt ccagaagggc tactttccac atatagagct ccagggactg 1380 tcttttctgt attcgctgtt caataaacat tgagtgagca cctccccaga tggagcatgc 1440 tggtcctgga aaaaaaaa 1458 <210〉 4 <211〉 1372 <212> DNA 〈213〉小家鼠 <400> 4 gggaccgggc agtgagcgcc gagatgtggg ctgcgctgcc gctgctgtgc gctggggcct 60 ggctgctgag tactggggcc accgccgagc tgaccgtgaa cgccatagaa aagtttcact 120 ttaagtcatg gatgaaacag catcaaaaga cgtacagctc ggtggagtac aaccacagac 180 tgcagatgtt tgccaacaac tggaggaaga ttcaagccca caaccagagg aaccacacat 240 ttaaaatggc attgaaccag ttttcagata tgagctttgc tgaaataaaa cacaaattcc 300 tttggtcaga gcctcagaat tgctcagcca ccaaaagtaa ctacctccga ggtacaggcc 360 cctacccttc ctccatggac tggaggaaga aaggaaatgt tgtttcgcca gtgataaatc 420 agggggcctg tggcagctgc tggactttct ctaccacggg ggccctagag tcagctgtgg 480 ctattgccag tgggaaaatg ctgtctttgg ctgagcagca gctggtggat tgtgcccaag 540 ccttcaacaa tcatggctgc aaaggaggtc tccccagcca ggccttcgag tacatcctat 600 acaacaaggg catcatggaa gaagacagct acccttacat aggcaaggat agttcatgca 660 gattcaaccc ccaaaaagct gttgcattcg tcaagaatgt tgtcaacatc acactcaatg 720 31 201113033 acgaggctgc aatggttgag gctgtggctc tatacaaccc tgtgagcttc gcctttgagg 780 tgactgaaga ttttttgatg tataaaagtg gcgtctactc cagtaaatcc tgtcataaaa 840 ctccagataa agtaaaccat gcagtcctgg cggttggcta tggagaacag aatggattac 900 tctactggat tgtgaaaaac tcttggggct cccagtgggg ggagaatggg tacttcctca 960 ttgaacgtgg gaagaacatg tgtggcctgg ctgcttgtgc ctcctatccc attcctcagg 1020 tataagccac ggctgcacgg gcaactgatt ggcagaccaa gggaggaact ggtccttcga 1080 tgagaatgcc accctggaga aaattgtgtg gaaatccacc cagaggccct ctcactcctg 1140 agtctagacg cctaaagaca ggaaggacaa acttgaatag cgacaagccc acccacgtga 1200 catcatcacc agaaatacgc ttggattgtg gttttttaat gacccaaacc cacgtggacc 1260 tagaatcgtc tctctttcca gctctcttca tgtactggga gctgtaatgg ttaccttttc 1320 tatgttgtgt attcaataaa cacacagtaa atacctcaaa aaaaaaaaaa aa 1372 <210〉 5 <211> 335 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 5

Met Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ala Trp Leu Leu Gly 15 10 15

Val Pro Val Cys Gly Ala Ala Glu Leu Ser Val Asn Ser Leu Glu Lys 20 25 30 32 201113033

Phe His Phe Lys Ser Trp Met Ser Lys His Arg Lys Thr Tyr Ser Thr 35 40 45

Glu Glu Tyr His His Arg Leu Gin Thr Phe Ala Ser Asn Trp Arg Lys 50 55 60 lie Asn Ala His Asn Asn Gly Asn His Thr Phe Lys Met Ala Leu Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Asp Met Ser Phe Ala Glu lie Lys His Lys Tyr Leu Trp 85 90 95 .

Ser Glu Pro Gin Asn Cys Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Leu Arg Gly 100 105 110

Thr Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Asn Phe 115 120 125

Val Ser Pro Val Lys Asn Gin Gly Ala Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe 130 135 140

Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala lie Ala lie Ala Thr Gly Lys 145 150 155 160

Met Leu Ser Leu Ala Glu Gin Gin Leu Val Asp Cys Ala Gin Asp Phe 165 170 175

Asn Asn His Gly Cys Gin Gly Gly Leu Pro Ser Gin Ala Phe Glu Tyr 180 185 190 33 201113033 lie Leu Tyr Asn Lys Gly lie Met Gly Glu Asp Thr Tyr Pro Tyr Gin 195 200 205

Gly Lys Asp Gly Tyr Cys Lys Phe Gin Pro Gly Lys Ala lie Gly Phe 210 215 220

Val Lys Asp Val Ala Asn lie Thr lie Tyr Asp Glu Glu Ala Met Val 225 230 235 240

Glu Ala Val Ala Leu Tyr Asn Pro Val Ser Phe Ala Phe Glu Val Thr 245 250 255

Gin Asp Phe Met Met Tyr Arg Thr Gly lie Tyr Ser Ser Thr Ser Cys 260 265 270

His Lys Thr Pro Asp Lys Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr 275 280 285

Gly Glu Lys Asn Gly lie Pro Tyr Trp lie Val Lys Asn Ser Trp Gly 290 295 300

Pro Gin Trp Gly Met Asn Gly Tyr Phe Leu lie Glu Arg Gly Lys Asn 305 310 315 320

Met Cys Gly Leu Ala Ala Cys Ala Ser Tyr Pro lie Pro Leu Val 325 330 335 34 201113033 <210> 6 <211〉 335 <212〉 PRT <213〉人類 <400> 6

Met Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ala Trp Leu Leu Gly 15 10 15

Val Pro Val Cys Gly Ala Ala Glu Leu Cys Val Asn Ser Leu Glu Lys 20 25 30

Phe His Phe Lys Ser Trp Met Ser Lys His Arg Lys Thr Tyr Ser Thr 35 40 45

Glu Glu Tyr His His Arg Leu Gin Thr Phe Ala Ser Asn Trp Arg Lys 50 55 60 lie Asn Ala His Asn Asn Gly Asn His Thr Phe Lys Met Ala Leu Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Asp Met Ser Phe Ala Glu lie Lys His Lys Tyr Leu Trp 85 90 95

Ser Glu Pro Gin Asn Cys Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Leu Arg Gly 100 105 110

Thr Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Asn Phe 115 120 125 35 201113033

Val Ser Pro Val Lys Asn Gin Gly Ala Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe 130 135 140

Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala lie Ala lie Ala Thr Gly Lys 145 150 155 160

Met Leu Ser Leu Ala Glu Gin Gin Leu Val Asp Cys Ala Gin Asp Phe 165 170 175

Asn Asn His Gly Cys Gin Gly Gly Leu Pro Ser Gin Ala Phe Glu Tyr 180 185 190 lie Leu Tyr Asn Lys Gly lie Met Gly Glu Asp Thr Tyr Pro Tyr Gin 195 200 205

Gly Lys Asp Gly Tyr Cys Lys Phe Gin Pro Gly Lys Ala lie Gly Phe 210 215 220

Val Lys Asp Val Ala Asn lie Thr lie Tyr Asp Glu Glu Ala Met Val 225 230 235 240

Glu Ala Val Ala Leu Tyr Asn Pro Val Ser Phe Ala Phe Glu Val Thr 245 250 255

Gin Asp Phe Met Met Tyr Arg Thr Gly lie Tyr Ser Ser Thr Ser Cys 260 265 270

His Lys Thr Pro Asp Lys Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr 36 201113033 275 280 285

Gly Glu Lys Asn Gly lie Pro Tyr Trp lie Val Lys Asn Ser Trp Gly 290 295 300

Pro. Gin Trp Gly Met Asn Gly Tyr Phe Leu lie Glu Arg Gly Lys Asn 305 310 315 320

Met Cys Gly Leu Ala Ala Cys Ala Ser Tyr Pro lie Pro Leu Val 325 330 335 <210〉 7 <211〉 323 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 7

Met Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Ala Glu Leu Cys Val Asn 15 10 15

Ser Leu Glu Lys Phe His Phe Lys Ser Trp Met Ser Lys His Arg Lys 20 25 30

Thr Tyr Ser Thr Glu Glu Tyr His His Arg Leu Gin Thr Phe Ala Ser 35 40 45

Asn Trp Arg Lys lie Asn Ala His Asn Asn Gly Asn His Thr Phe Lys 50 55 60 37 201113033

Met Ala Leu Asn Gin Phe Ser Asp Met Ser Phe Ala Glu lie Lys His 65 70 75 80

Lys Tyr Leu Trp Ser Glu Pro Gin Asn Cys Ser Ala Thr Lys Ser Asn 85 90 95

Tyr Leu Arg Gly Thr Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Val Asp Trp Arg Lys 100 105 110

Lys Gly Asn Phe Val Ser Pro Val Lys Asn Gin Gly Ala Cys Gly Ser 115 120 125

Cys Trp Thr Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala lie Ala lie 130 135 140

Ala Thr Gly Lys Met Leu Ser Leu Ala Glu Gin Gin Leu Val Asp Cys 145 150 155 160

Ala Gin Asp Phe Asn Asn His Gly Cys Gin Gly Gly Leu Pro Ser Gin 165 170 175

Ala Phe Glu Tyr lie Leu Tyr Asn Lys Gly lie Met Gly Glu Asp Thr 180 185 190

Tyr Pro Tyr Gin Gly Lys Asp Gly Tyr Cys Lys Phe Gin Pro Gly Lys 195 200 205

Ala lie Gly Phe Val Lys Asp Val Ala Asn lie Thr lie Tyr Asp Glu 210 215 220 38 201113033

Glu Ala Met Val Glu Ala Val Ala Leu Tyr Asn Pro Val Ser Phe Ala 225 230 235 240

Phe Glu Val Thr Gin Asp Phe Met Met Tyr Arg Thr Gly lie Tyr Ser 245 250 255

Ser Thr Ser Cys His Lys Thr Pro Asp Lys Val Asn His Ala Val Leu 260 265 270

Ala Val Gly Tyr Gly Glu Lys Asn Gly lie Pro Tyr Trp lie Val Lys 275 280 285

Asn Ser Trp Gly Pro Gin Trp Gly Met Asn Gly Tyr Phe Leu lie Glu 290 295 300

Arg Gly Lys Asn Met Cys Gly Leu Ala Ala Cys Ala Ser Tyr Pro lie 305 310 315 320

Pro Leu Val <210> 8 <211〉 323 〈212〉 PRT <213〉人類 <400〉 8

Met Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Ala Glu Leu Cys Val Asn 39 201113033 15 10 15

Ser Leu Glu Lys Phe His Phe Lys Ser Trp Met Ser Lys His Arg Lys 20 25 30

Thr Tyr Ser Thr Glu Glu Tyr His His Arg Leu Gin Thr Phe Ala Ser 35 40 45

Asn Trp Arg Lys lie Asn Ala His Asn Asn Gly Asn His Thr Phe Lys 50 55 60

Met Ala Leu Asn Gin Phe Ser Asp Met Ser Phe Ala Glu lie Lys His 65 70 75 80

Lys Tyr Leu Trp Ser Glu Pro Gin Asn Cys Ser Ala Thr Lys Ser Asn 85 90 95

Tyr Leu Arg Gly Thr Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Val Asp Trp Arg Lys 100 105 110

Lys Gly Asn Phe Val Ser Pro Val Lys Asn Gin Gly Ala Cys Gly Ser 115 120 125

Cys Trp Thr Phe Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala lie Ala lie 130 135 140

Ala Thr Gly Lys Met Leu Ser Leu Ala Glu Gin Gin Leu Val Asp Cys 145 150 155 160 40 201113033

Ala Gin Asp Phe Asn Asn His Gly Cys Gin Gly Gly Leu Pro Ser Gin 165 170 175

Ala Phe Glu Tyr lie Leu Tyr Asn Lys Gly lie Met Gly Glu Asp Thr 180 185 190

Tyr Pro Tyr Gin Gly Lys Asp Gly Tyr Cys Lys Phe Gin Pro Gly Lys 195 200 205

Ala lie Gly Phe Val Lys Asp Val Ala Asn lie Thr He Tyr Asp Glu 210 215 220

Glu Ala Met Val Glu Ala Val Ala Leu Tyr Asn Pro Val Ser Phe Ala 225 230 235 240

Phe Glu Val Thr Gin Asp Phe Met Met Tyr Arg Thr Gly lie Tyr Ser 245 250 255

Ser Thr Ser Cys His Lys Thr Pro Asp Lys Val Asn His Ala Val Leu 260 265 270

Ala Val Gly Tyr Gly Glu Lys Asn Gly lie Pro Tyr Trp lie Val Lys 275 280 285

Asn Ser Trp Gly Pro Gin Trp Gly Met Asn Gly Tyr Phe Leu lie Glu 290 295 300

Arg Gly Lys Asn Met Cys Gly Leu Ala Ala Cys Ala Ser Tyr Pro lie 41 201113033 305 310 315 320

Pro Leu Val <210〉 9 <211〉 334 <212〉 PRT <213〉人類 <400〉 9

Met Trp Ala Thr Leu Pro Leu Leu Cys Ala Gly Ala Trp Leu Leu Gly 15 10 15

Val Pro Val Cys Gly Ala Ala Glu Leu Cys Val Asn Ser Leu Glu Lys 20 25 30

Phe His Phe Lys Ser Trp Met Ser Lys His Arg Lys Thr Tyr Ser Thr 35 40 45

Glu Glu Tyr His His Arg Leu Gin Thr Phe Ala Ser Asn Trp Arg Lys 50 55 60 lie Asn Ala His Asn Asn Gly Asn His Thr Phe Lys Met Ala Leu Asn 65 70 75 80

Gin Phe Ser Asp Met Ser Phe Ala Glu lie Lys His Lys Tyr Leu Trp 85 90 95 42 201113033

Ser Glu Pro Gin Asn Cys Ser Ala Thr Lys Ser Asn Tyr Leu Arg Gly 100 105 110

Thr Gly Pro Tyr Pro Pro Ser Val Asp Trp Arg Lys Lys Gly Asn Phe 115 120 125

Val Ser Pro Val Lys Asn Gin Gly Ala Cys Gly Ser Cys Trp Thr Phe 130 135 140

Ser Thr Thr Gly Ala Leu Glu Ser Ala lie Ala lie Ala Thr Gly Lys 145 150 155 160

Met Leu Ser Leu Ala Glu Gin Gin Leu Val Asp Cys Ala Gin Asp Phe 165 170 175

Asn Asn His Gly Cys Gin Gly Gly Leu Pro Ser Gin Ala Phe Glu Tyr 180 185 190 lie Leu Tyr Asn Lys Gly lie Met Gly Glu Asp Thr Tyr Pro Tyr Gin 195 200 205

Gly Lys Asp Gly Tyr Cys Lys Phe Gin Pro Gly Lys Ala lie Gly Phe 210 215 220

Val Lys Asp Val Ala Asn lie Thr lie Tyr Asp Glu Glu Ala Met Val 225 230 235 240

Glu Ala Val Ala Leu Tyr Asn Pro Val Ser Phe Ala Phe Glu Val Thr 245 250 255 43 201113033

Gin Asp Phe Met Met Tyr Arg Thr Gly lie Tyr Ser Ser Thr Ser Cys 260 265 270

His Lys Thr Pro Asp Lys Val Asn His Ala Val Leu Ala Val Gly Tyr 275 280 285

Gly Glu Lys Asn Gly lie Pro Tyr Trp lie Val Lys Asn Ser Trp Gly 290 295 300

Pro Gin Trp Gly Met Asn Gly Tyr Phe Leu lie Glu Arg Gly Lys Asn 305 310 315 320

Met Cys Gly Leu Ala Ala Cys Ala Ser Tyr Pro lie Pro Leu 325 330 <210〉 10 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223〉前置引子 <400> 10 gcgctcccag ttgacgctct <210〉 11 〈211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工 201113033 <220〉 <223〉反置引子 <400〉 11 cacgcacagt tcggcggc 18 <210〉 12 <211〉 21 <212> DNA <213〉人工 <220〉 〈223>前置引子 <400〉 12 cgctcccagt tgacgctctg g 21 <210> 13 <211> 18 〈212> DNA <213〉人工 <220> <223〉反置引子 <400〉 13 cacgcacagt tcggcggc 18 <210> 14 <211> 39 <212〉 DNA 〈213>人工 45 <220〉 201113033 <223〉（dt) 24寡聚物引子 <400〉 14 ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcgg

Claims (1)

1. 201113033 七 、申請專利範圍： 1. 一種組織蛋白酶Η之用途，Α在田& 性疼痛之化合物。 -係用於辨識調節神經病 2· 人類基因轉殖動物異體表現組織蛋白酶Η之用 3用於觸或分經祕疼痛之化合物。 .=人，員基因轉殖動物異體表現組織蛋白酶Η之用 係作為增進神經病性疼痛敏感性之模型系統。 .員組織蛋白酶Η剔除動物之用途，其係用於 辨識或刀析調節神經病性疼痛之化合物。 5· 人類_蛋白酶Η剔除動物之用途，其係作為 減低神經病性疼痛敏感性之模型系統。 6.:種細胞異縣現組織蛋自_或其魏性片段之用 j ’其係用於辨識調節神經病性疼痛之化合物。 .種、、、田胞異體表現組織蛋白酶H或其功能性片段之用 途，其係作為增進神經病性疼痛敏感性之模型系統。 八種、、且織蛋白酶H剔除細胞之用途，其係用於辨識或 分析調節神經病性疼痛之化合物。 9.二種組岐自酶H齡細胞之崎，錢作為減低神 經病性疼痛敏感性之模塑系統。 10· —種細胞之用途，該細胞異體表現一種可表現上連接 ^織蛋白酶Η啟動子及/或增強子或其功能性片段之報 導基因，係用於辨識或分析調節神經病性疼痛之化人 物。 σ Π'種辨識或分析調節及/或預防神經病性疼痛之化合 201113033 物之方法，其包括下列步驟： a. 提供至少二個樣本； b. 將一含組織蛋白酶Η或其功能性片段或衍生物之 樣本與化合物接觸， c. 在化合物存在下測定組織蛋白酶Η之活性， d. 在無化合物下測定組織蛋白酶Η之活性，及 e. 將c)之組織蛋白酶Η活性與d)之組織蛋白酶Η活 性相比較。 12. —種辨識或分析調節及/或預防神經病性疼痛之化合 物之方法，其包括： a. 將組織蛋白酶Η蛋白或其功能性片段或衍生物與 試驗化合物接觸；及 b. 測定試驗化合物是否能調節組織蛋白酶Η蛋白或 其功能性片段或衍生物之活性。 13. —種辨識或分析調節及/或預防神經病性疼痛之化合 物之方法，其包括： a. 將具有一可偵測組織蛋白酶Η或其功能性片段或 衍生物之量或活性之細胞與試驗化合物接觸； b. 測定該試驗化合物是否能調節存在細胞中的組織 蛋白酶Η或其功能性片段或衍生物之量或活性。 14. 一種辨識或分析調節及/或預防神經病性疼痛之化合 物之方法，其包括： 2 201113033 a. 於轉錄活化系統中，將編碼組織蛋白酶Η蛋白或 其功能性片段或衍生物之核酸與試驗化合物接 觸，及 b. 在該化合物存在下，測定該系統中編碼組織蛋白 酶Η蛋白或其功能性片段或衍生物之mRAN量， 及 c. 測定該化合物是否能調節存在該系統中編碼組織 蛋白酶Η蛋白或其功能性片段或衍生物之mRNA 的量。 15. —種辨識或分析調節及/或預防神經病性疼痛之化合 物之方法，其包括： a. 提供一以核酸載體轉染之細胞，該載體包括操作 上與報導基因或其功能性片段偶合之組織蛋白酶 Η基因或其功能性片段之啟動子：； b. 提供一以對照載體轉染之細胞，該載體包括操作 上未與功能性組織蛋白酶Η啟動子偶合之報導基 因或其功能性片段； c. 在試驗化合物存在下，測定a)和b)細胞的報導基 因活性； d. 在無試驗化合物下，測定a)和b)細胞的報導基因 活性。 16. —種辨識或分析調節神經病性疼痛之化合物之方法， 其包括： 3 201113033 a. 選擇一調節組織蛋白酶Η活性之化合物作為試驗 化合物，及 b. 將該試驗化合物投予一具疼痛感受之對象以測定 疼痛是否有受到調節。 17. —種於一對象中辨識或分析調節及/或預防神經病性 疼痛之化合物之方法，其包括： a. 在一或多種試驗化合物之存在下，分析組織蛋白酶 Η或其功能性片段或衍生物之生物活性，以辨識 一或多種具調節組織蛋白酶Η生物活性之調節化 合物，及 b. 在一對象中試驗一或多種調節化合物其減低疼 痛、疼痛感受或疼痛敏感性之能力。 4