CN102713631B - 组织蛋白酶h的用途 - Google Patents

组织蛋白酶h的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN102713631B
CN102713631B CN201080049813.XA CN201080049813A CN102713631B CN 102713631 B CN102713631 B CN 102713631B CN 201080049813 A CN201080049813 A CN 201080049813A CN 102713631 B CN102713631 B CN 102713631B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cathepsin
neuropathic pain
cell
compound
pain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201080049813.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN102713631A (zh
Inventor
M·格鲍尔
M·米夏利斯
D·丁-普芬尼希-多夫
A·M·舒尔特
C·梅茨-魏德曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Aventis France
Original Assignee
Sanofi Aventis France
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Aventis France filed Critical Sanofi Aventis France
Publication of CN102713631A publication Critical patent/CN102713631A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102713631B publication Critical patent/CN102713631B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96466—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2842—Pain, e.g. neuropathic pain, psychogenic pain

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)

Abstract

本发明涉及组织蛋白酶H的用途。本发明的其它方面涉及用于筛选药物的方法、用于诊断疼痛易感性的方法以及用于治疗疼痛的方法。

Description

组织蛋白酶H的用途
本发明涉及组织蛋白酶H的用途。本发明的其它方面涉及用于筛选药物的方法、用于诊断疼痛易感性的方法以及用于治疗疼痛的方法。
在西方国家，慢性疼痛是未解决的重大健康问题，其逐渐损害数百万公民的健康和幸福。慢性疼痛严重困扰患有慢性疼痛的个人幸福并且往往伴随有或随后出现植物性症状(vegetativesigns)，这常常导致抑郁症。慢性疼痛致使个体受苦并造成巨大程度的社会经济损失。现有药理学疼痛疗法就功效和安全性而言均普遍不令人满意。
鉴于与现有疼痛治疗技术相关的严重缺陷，极需新的选择用于治疗持续疼痛以及用于与慢性疼痛潜在发展有关的诊断和预后。尤其是鉴于对疼痛神经生物学的快速增进的了解与提供有效治疗且无现有治疗技术缺陷的未满足的临床需求之间的巨大鸿沟，有需要致力于发现新型镇痛药类的新靶标。
因此，本发明的目的是提供用于开发和提供调节疼痛的新型药物的新方法。
通过使用组织蛋白酶H或其功能片段或衍生物以鉴定调节疼痛并且特别是神经性疼痛的化合物来达到该目的。
本发明基于发明人以下意想不到的发现，首次证明在小鼠神经性疼痛模型中组织蛋白酶H的表达与疼痛易感性密切相关。
按照国际疼痛研究协会的定义，疼痛是与实际或潜在组织损伤有关、或依据此类损伤来描述的不愉快的感觉和情绪体验。疼痛通常是感受伤害的神经系统激活的结果，其特化为探测并编码(encode)组织损伤或潜在损伤。因此，疼痛是身体警报系统的一部分，以启动使身体的实际或潜在损伤最小化的反应。疼痛可为医学病症的原发症状或可为疾病状态的继发效应，通常无任何生物学意义。
疼痛可为急性或慢性的。急性疼痛是表明潜在或实际损伤的生理信号。其伴随组织破坏、感染、炎症或其它急性起因而发生，是身体损伤或机能障碍后对个体的警告。急性疼痛若治疗不当，可导致慢性疼痛。
慢性疼痛是具有不同起因、持续期、强度和特定症状的疾病状态。
慢性疼痛可为感受伤害起源的、炎性或神经性的。认为感受伤害的疼痛与躯体或内脏的疼痛-敏感性神经纤维的持续激活成相当比例。神经性疼痛是由外周或中枢神经元组织的任何种类损伤导致的疼痛；认为其通过外周神经系统、CNS或两者中的异常体觉过程而持续。(关于疼痛机制的综述，参见例如Scholz和Woolf，2002；Julius和Basbaum，2001，Woolf和Mannion，1999；Wood，J.D.，2000；Woolf和Salter，2000.)
慢性神经性疼痛因不同患者而异。最近的数据表明，对于个体所遭受的痛苦的量，个体的疼痛易感性起重要作用，即对于疼痛，特别是对于神经性疼痛的发展有着重要的遗传诱因。本发明基于本发明人在啮齿动物慢性疼痛模型中旨在鉴定疼痛易感性基因(即决定在给定的固定程度的组织损伤存在下感受的疼痛量的基因)的大量研究。发明人使用的啮齿动物模型和实验设置使得在不同个体之间具有以下实验条件：a)可精确控制神经损伤的性质和一致性；和b)可使遗传及环境的变化性最小化。
组织蛋白酶H(CTSH；依据theAtlasofGeneticsandCytogeneticsinOncologyandHaematology(http://atlasgeneticsoncology.org)可替代的名称为：ACC-4、ACC-5、CPSB、DKFZp686B24257、EC3.4.22.16、MGC1519、aleurain、小链(minichain))是一种溶酶体蛋白酶。
人组织蛋白酶H的基因座在染色体15q24-125上(参见例如AtlasofGeneticsandCytogeneticsinOncologyandHaematology)。该基因包含跨越超过23kb基因组序列的12个外显子。人前组织蛋白酶原H(preprocathepsinH)的核苷酸序列为例如由Fuchs和Gassen，1989，NucleicAcidsRes.17：9471-9471公布的。大鼠组织蛋白酶H的基因结构为例如由Ishidoh等，FEBSLetters，1989，第253卷，number1，2，103-107公布。人15号染色体上CTSH的基因组序列可例如在NCBI主页以登录号NG_009614.1(SEQIDNO.1)而检索到。
组织蛋白酶H的基因具有TATA和CAAT-less启动子以及位于第一个外显子上游的一个GC框。两种不同形式的组织蛋白酶HcDNA已在前列腺组织和癌细胞系检测到：全长形式(CTSH)以及在信号肽区域具有12个氨基酸缺失的截短形式(CTSHδ10-21)(参见AtlasofGeneticsandCytogeneticsinOncologyandHaematology)。前酶原转录物的长度为1005bp。组织蛋白酶H的编码多核苷酸序列可公开地从NCBI核苷酸数据库以若干登录号获得，例如：BC006878(CTSH，完整编码序列，小鼠，SEQIDNO.4，NM_004390.3(人CTSH转录物变体1mRNA(SEQIDNO.2)，NM_148979.2(人CTSH，转录物变体2mRNA(SEQIDNO.3))。技术人员知道如何从NCBI数据库检索组织蛋白酶H的进一步的编码或基因组序列(其它物种的组织蛋白酶H；组织蛋白酶H的突变体或不同同工型，若存在)。若下文中提及组织蛋白酶H编码序列，这可指上述mRNA或编码序列的任一种；其中SEQID.NO.2、3和4的序列为优选的实例。
组织蛋白酶H的蛋白质序列可公开地从NCBI蛋白质数据库，例如以如下登录号获得：人(hs)组织蛋白酶H同工型前蛋白原：NP_004381(SEQIDNo.8)；hs同工型b前体：NP：683880(SEQIDNO.9)；鼠(小鼠)组织蛋白酶H：前蛋白原：NP_031827；小鼠同工型CRA_a：EDL20900，小鼠同工型CRA_b：EDL20901，大鼠(褐家鼠(rattusnorvegicus))组织蛋白酶H：NP_037071；组织蛋白酶H同工型CRA-a(褐家鼠)：EDL77562，组织蛋白酶H同工型CRA-b(褐家鼠)：EDL77563，组织蛋白酶H，此外，蛋白质序列可公开地从UniProtKB数据库(www.beta.uniprot.org)以如下登录号获得：P09668(HUMAN_CATH，人组织蛋白酶H，SEQIDNO.5)。如在下文中提及组织蛋白酶H蛋白或氨基酸序列，这可指上述蛋白质序列或由上述列举的编码序列翻译的蛋白质序列中的任一种；例如以下序列：SEQIDNO5、6、7、8或9。
NCBI是美国国立生物技术信息中心(邮寄地址：NationalCentreforBiotechnologyInformation，NationalLibraryofMedicine，Building38A，Bethesda，MD20894，USA；网址：www.ncbi.nhm.nih.gov)。更多序列(例如具有SwissProt或EMBL登录号的序列)可在www.beta.uniprot.org的UniProtKB数据库中检索到。
组织蛋白酶H是一种具有氨肽酶和较弱内肽酶功能的溶酶体蛋白酶。其属于C1(木瓜蛋白酶-样)半胱氨酸蛋白酶(C1(papain-like)cysteinproteases)家族。组织蛋白酶H蛋白作为335个氨基酸的前酶原合成并且蛋白水解加工成内体或溶酶体内的活性单链。除重链和轻链(一起命名为长链)之外，组织蛋白酶H还包含所谓的来源于前肽的小链“EPQNCSAT”。(关于组织蛋白酶H的结构，也可参见Turk等.，BiologicalChemistry，1997)。小链似乎参与组织蛋白酶H的氨肽酶活性并且在底物识别中起关键作用。缺乏小链的人组织蛋白酶H的重组形式显示为内肽酶(Valiljeva等，2003)。组织蛋白酶H的内肽酶底物为例如：Bz-Arg+NHNap、Bz-Arg+NH-Mec、Bz-Phe-Val-Arg+NHMec。其对于Pro-Gly+Phe和Pro-Arg+NHNap的底物具有二肽基肽酶活性。其对于以下底物具有氨肽酶活性：H-Arg-NH-Mec、Bz-Arg-NH-Mec、Bz-Arg-NH-Mec和H-Cit-NH-Mec(参见例如Rothe和Dodt，1992；Bz＝苯甲酰基，NH-Mec＝e-甲基香豆素基-7-酰胺；Cit＝瓜氨酸)。天然存在的组织蛋白酶H抑制剂为半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)、α2-巨球蛋白以及来自小鼠细胞毒淋巴细胞CTLA-2β的抗原。
组织蛋白酶H遍在表达并且在肾中表达水平最高。在一些癌组织中其表达可增加。组织蛋白酶主要位于内体-溶酶体区室，但也一定程度地分泌并且在血液中循环。
组织蛋白酶H的功能通常包括：蛋白酶活性例如水解酶活性，肽酶活性例如氨肽酶、二肽基肽酶、外肽酶或内肽酶活性，转酰酶活性(参见Koga等，1991)；裂解上述列举的底物；裂解天然C5并且产生趋化因子C5a，加工疏水性表面活性剂-相关蛋白C，裂解和/或降解纤连蛋白和纤维蛋白原。更具体而言，其作为溶酶体半胱氨酸蛋白酶参与细胞内的蛋白质降解。其通过裂解天然C5而参与趋化因子C5a的产生。组织蛋白酶H参与疏水性表面活性剂-相关蛋白C的加工。此外，其似乎还参与不稳定动脉粥样斑块的发展，以及还可能参与早期动脉粥样硬化生成。
本发明的用途使得能够鉴定用于预防和/或治疗疼痛并且特别是神经性疼痛的新物质。本发明的用途包括鉴定具有所需特性(即降低疼痛感)的化合物以及鉴定具有不合乎需要特性(即增加疼痛感)的化合物。此外，本发明使得能够进一步表征已鉴定的可用于预防和/或治疗任何疾病或疾病状态的化合物。在此情况下，本发明可例如用于排除经鉴定具有非所需副作用(即增加疼痛感)的活性化合物：可例如针对它们对组织蛋白酶H的影响(蛋白质和/或核酸，表达和/或功能等)来表征(profile)给定疾病的候选化合物。
用于本发明不同方面的化合物/测试化合物/活性化合物可为任何生物或化学物质或天然产品提取物，它们可通过生化或分子生物学方法来纯化、部分纯化、合成或制备。
在本发明不同方面的意义上认为有效调节疼痛的化合物可为对以下方面有影响的任何物质：组织蛋白酶H的功能之一或细胞中组织蛋白酶H的量(蛋白质或核酸)，对组织蛋白酶H的表达、翻译后修饰(例如N-糖基化或加工(例如裂解)、蛋白质折叠或活化。
为此，所述物质可调节组织蛋白酶H的任何功能(例如上文或下文列举的那些)。组织蛋白酶H的蛋白质活性可通过物质来调节，例如通过直接相互作用以及干扰组织蛋白酶H多肽/蛋白质或其片段来调节。所述物质还可调节组织蛋白酶H的表达，例如在转录(起始、延伸、加工等)、转录物稳定性、翻译水平上来调节。此外，其还可调节组织蛋白酶H的翻译后修饰、从无活性到活性形式的加工(将前原形式(prepro-form)裂解为活性蛋白质)、以及蛋白质折叠等。所述物质可直接或间接施加上述作用(间接地意即通过干扰(正向或负向)对组织蛋白酶H功能/蛋白质活性/表达等有影响的天然信号转导级联)。
组织蛋白酶H的功能包括上文列举的那些，例如蛋白酶活性；从一种或多种蛋白质底物的氨基端除去二肽的能力；与一种或多种蛋白质底物特异性相互作用的能力(蛋白质-蛋白质相互作用)，例如上文列举的那些；裂解和/或活化一种或多种蛋白质底物的能力，例如上文列举的那些；加工蛋白质或肽底物的能力，例如上文列举的那些；被上文列举的抑制剂之一抑制的能力。
组织蛋白酶H的功能通常还包括组织蛋白酶H蛋白或核酸或其片段与其它分子(包括但不限于蛋白质、肽、核酸、合成分子)相互作用的能力，并且优选涉及其相互作用于及裂解蛋白质底物的能力。
根据本申请，酶底物理解为可由酶修饰的任何分子。本发明范围内天然存在的底物为对应于其在天然生理学或病理学环境(例如上文列举的那些)中存在的形式并且亦能被相应的酶修饰的分子。
对疼痛特别是神经性疼痛的调节可为降低或升高。
根据本相关发明组的一个方面，可使用组织蛋白酶H的片段或衍生物。片段可为蛋白质、多肽或多核酸片段。
蛋白质或多肽的片段是当与组织蛋白酶H的全长实例相比时，携带一个或多个末端(n-和/或c-末端)和/或一个、两个或多个内部氨基酸缺失的蛋白质或多肽，片段包括，例如如图7的描述中列举的结构域和/或片段(参见下文)。
组织蛋白酶H蛋白的功能片段为具有至少一种或多种全长蛋白功能特性(特别是上文列举的特性)的该蛋白的任何片段。
多核苷酸片段是当与全长基因组或编码序列相比时，携带一个或多个末端(5’-和/或3’-末端)和/或一个、两个或更多个内部核苷酸缺失的多核苷酸或寡核苷酸。组织蛋白酶H核酸的功能片段为具有至少一种或多种全长多核酸(mRNA、基因组或编码序列)功能特性的任何片段。
术语组织蛋白酶H衍生物包括，与天然存在的形式相比，特别是与SEQIDNO：5、6、7、8或9的组织蛋白酶H比较，组织蛋白酶H的除缺失外的任何修饰类型。组织蛋白酶H的功能衍生物为具有至少一种并优选两种或更多种未修饰的蛋白的功能特性的该蛋白的任何衍生物。衍生物包括例如氨基酸或核苷酸序列的修饰或任何其它种类的修饰，例如导致例如使多肽或多核苷酸稳定的化学或生物学修饰(例如核酸骨架的硫代磷酸修饰或氨基酸之间键的交换等)，或使多肽或多核苷酸能特异性靶向某些细胞或促使其进入细胞或被细胞摄取的修饰(例如细胞渗透磷酸肽，邻位偶联(orthocoupling)到细胞渗透肽载体，例如基于触角(antennapedia)/渗透，基于TAT和信号-肽的序列；或偶联到针对特定转运蛋白或输入物(importer)的配体部分)。
本发明另一方面涉及异源表达组织蛋白酶H或其功能片段的非人转基因动物用于鉴定或分析调节疼痛并且特别是神经性疼痛的化合物的用途。
非人动物可为任何非人动物。优选啮齿类，例如大鼠或小鼠。
转基因动物为在其基因组中携带特意转入其中的外源DNA的动物。可按照标准程序将外源DNA引入动物基因组(参见例如TransgenicAnimalTechnologyALaboratoryHandboook.C.A.Pinkert编辑；AcademicPressInc.，SanDiego，California，1994(ISBN：0125571658)。
术语异源表达是指不同于在宿主生物体中正常基因表达的表达(涉及表达的基因的稳态水平、量、时机或组织分布，或涉及表达的基因类型(即所述基因通常完全不在该宿主中表达))。异源表达可为组成型或诱导型的。本领域熟知合适的诱导型表达系统(例如四环素诱导型系统等)。生物体可为细胞或非人动物。
依据另一方面，本发明涉及异源表达组织蛋白酶H或其功能片段的非-人转基因动物作为用于增强疼痛敏感性，特别为神经性疼痛敏感性的模型系统的用途。
本发明的又一方面涉及非-人组织蛋白酶H敲除动物用于鉴定或分析调节疼痛并且特别为神经性疼痛的化合物的用途。
敲除生物体(例如动物或细胞)是指其中基因的表达或功能部分或全部缺失的生物体，包括基因组敲除以及功能敲除、诱导型敲除以及组成型敲除。本领域熟知敲除生物体的产生以及可用于产生敲除生物体的细胞或动物。组织蛋白酶H-敲除小鼠的产生描述于Pham和Ley，1999中。
本发明再一方面涉及非人组织蛋白酶H敲除动物作为用于降低疼痛并且特别是降低神经性疼痛敏感性的模型系统的用途。
异源表达组织蛋白酶H或其功能片段的细胞用于鉴定调节疼痛，特别是神经性疼痛的化合物的用途是本发明的另一方面。
细胞可为任何原核或真核细胞，例如能够用核酸载体转染并表达报告基因的细胞。它们包括大体上的原代细胞和来自细胞培养物的细胞，例如真核细胞培养物，其包括来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母(s.pombe)或酿酒酵母(s.cerevisiae))的细胞；或原核细胞培养物，优选毕赤酵母(Pichia)或大肠杆菌(E.coli)。可通过熟知技术(例如取血技术、组织穿刺技术或手术技术)获得来源于组织的细胞和样品。
根据一个实施方案，使用与其未修饰状态相比具有较低组织蛋白酶H活性的修饰细胞。这样，若待测化合物能够增强或恢复已降低的或完全废除的组织蛋白酶H活性，则例如可以对其进行试验。或者，在疼痛敏感性降低的情况下，不论所述物质是否能执行其功能(例如疼痛调节或甚至是在另一疾病状态或疾病的情况中的功能)，都可对其进行试验。
修饰可为任何类型的修饰(稳定或瞬时，优选稳定)，所述修饰导致降低组织蛋白酶H的活性、组织蛋白酶H转录物稳态水平(即通过激活组织蛋白酶H转录或转录物稳定性)或组织蛋白酶H蛋白稳态水平(即通过激活组织蛋白酶H翻译或其翻译后加工；通过调节组织蛋白酶H翻译后修饰或通过激活其稳定或通过抑制其降解)。这可例如通过以下技术来实现：使用组织蛋白酶H的显性负突变体(dominantnegativemutant)、反义寡核苷酸、组织蛋白酶H的RNAi构建体，产生功能或基因组组织蛋白酶H敲除(其可例如为诱导型)或本领域已知的其它合适技术。对于以上技术的综述，参见例如：CurrentprotocolsinMolecularbiology(2000)J.G.Seidman，第23章，附录52，JohnWiley和Sons，Inc.；GeneTargeting：apracticalapproach(1995)，编辑：A.L.Joyner，IRLPress；GeneticManipulationofReceptorExpressionandFunction，2000；AntisenseTherapeutics，1996；Scherr等，2003。
按照一个实施方案，使用组织蛋白酶H敲除细胞。本领域熟知用于产生敲除的合适细胞系，参见例如CurrentprotocolsinMolecularBiology(2000)J.G.Seidman，第23章，附录52，JohnWiley和Sons，Inc；或GeneTargetingapracticalapproach.(1995)编辑A.L.Joyner，IRLPress。Pham和Ley，1999(DPPI鼠胚胎干细胞敲除克隆的产生，参见第8628页，左栏，上半部)亦公开了组织蛋白酶H(DPPI)敲除细胞的产生。
因此，本发明的另一方面涉及组织蛋白酶敲除细胞用于鉴定或分析调节疼痛，特别是神经性疼痛的化合物的用途。
此外，组织蛋白酶敲除细胞作为用于降低疼痛，特别是神经性疼痛敏感性的模型系统的用途是本相关发明组的另一方面。
按照本发明另一实施方案，与参考细胞(例如处于其未修饰状态的同样的细胞)相比，所述细胞可具有更高量的组织蛋白酶H。该细胞系统可用于模拟疼痛敏感性增强的状态，这是因为组织蛋白酶H的表达量与疼痛敏感性相关。
因此，本发明还涉及异源表达组织蛋白酶H或其功能片段的细胞作为用于增强疼痛敏感性，特别是神经性疼痛敏感性的模型系统的用途。
异源表达与组织蛋白酶H启动子和/或增强子表达上连接的报告基因的细胞用于鉴定或分析调节疼痛，特别是神经性疼痛的化合物的用途是本相关发明组的另一实施方案。
本发明以上方面基于本领域通常已知的典型报告基因测定。为此，将选择的启动子插入适于所选宿主细胞类型的表达载体中，所述启动子位于所选报告基因上游，这样，启动子若有活性则使报告基因表达。随后将构建体引入到所选宿主细胞中。本领域熟知合适的转化或转染方法以及用于细胞培养和报告基因表达检测的条件(参见例如以下所列标准文献)。本领域熟知合适的条件以及载体、报告基因和必要试剂(其也可市售)。
载体为环状或线性多核苷酸分子，例如DNA质粒、噬菌体或粘粒，多核苷酸片段(例如从其它载体切下或通过PCR扩增并插入到克隆载体中的多核苷酸片段)借助其可在合适的细胞或生物体中特异性扩增。表达载体使得在宿主细胞或生物体中能够异源表达目的基因(例如报告基因)。细胞或生物体类型主要取决于目的并且对其选择是在技术人员知识范围内。用于扩增核酸的合适的生物体例如主要是具有高繁殖率的单细胞生物体，例如细菌或酵母。合适的生物体亦可为从多细胞组织分离和培养的细胞，例如从各种各样生物体产生的细胞系(例如来自草地贪夜蛾(SpodopteraFrugiperda)的SF9细胞等)。合适的克隆载体为本领域所知并且其购自不同的生物技术供应商，例如RocheDiagnostics、NewEnglandBiolabs、Promega、Stratagene及其它更多。合适的细胞系例如购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。
为异源表达蛋白质或多肽，细胞可为能够用核酸载体转染并表达目的基因(例如报告基因)的任何原核或真核细胞。这些细胞包括大体上的原代细胞和来自细胞培养物的细胞，优选真核细胞培养物，其包括来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HEK293、RIN-5F、HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母或酿酒酵母)的细胞；或原核细胞培养物，优选毕赤酵母或大肠杆菌。可通过熟知技术(例如取血技术、组织穿刺技术或手术技术)获得来源于组织的细胞和样品。
在本申请情况中，术语“转染”是指将核酸载体引入到宿主细胞(原核或真核)中，因此包括术语“转化”。
转染可为稳定转染或瞬时转染。
组织蛋白酶H启动子是组织蛋白酶H基因的部分，若将其引入合适的表达载体中且位于基因产物的编码序列的上游，其能够驱动目的基因产物表达。组织蛋白酶H启动子是组织蛋白酶H基因5’-序列的基因组上游的部分，其操纵下游已转录区域的转录激活并且例如可获自Ishidoh等.，FEBSletters，1989orIshidoh等，Biomed.Biochim.Acta，1991，50(4)：541-7。
报告基因可为使得容易定量其基因产物的任何基因。各种各样用于真核或原核宿主的报告基因以及检测方法和必要试剂为本领域所知并可市售。这些报告基因包括例如β内酰胺酶(lacZ)、萤光素酶、绿色或蓝色荧光蛋白(GFP或BFP)、DsRed、HIS3、URA3、TRP1或LEU2或β-半乳糖苷酶等的基因。这些基因编码可借助可见(颜色或发光)反应容易检测到的蛋白质(例如lacZ、萤光素酶)。它们包括可借助可见(颜色或发光)反应或表达时赋予对抗生素例如氨苄青霉素(Ampicillin)或卡那霉素(Kanamycin)抗性的基因产物容易检测到的基因产物。其它报告基因产物使得表达细胞能在某些条件下生长，例如营养缺陷型基因。
报告基因的功能片段是使得容易定量其基因产物的给定报告基因的任何片段。
报告基因的功能片段是使得容易定量其基因产物的给定报告基因的任何片段。
在本申请情况中，术语“转染”是指将核酸载体引入到宿主细胞(原核或真核)中，因此包括术语“转化”。
转染可为稳定转染或瞬时转染。
细胞可为能够用核酸载体转染并表达报告基因的任何原核或真核细胞。这些细胞包括大体上的原代细胞和来自细胞培养物的细胞，优选真核细胞培养物，其包含来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母或酿酒酵母)的细胞；或原核细胞培养物，优选毕赤酵母或大肠杆菌。可通过熟知技术(例如取血技术、组织穿刺技术或手术技术)获得来源于组织的细胞和样品。
在本发明以上方面的情况中，对照载体可为包含报告基因或其功能片段的任何合适载体，但其中报告基因的表达不是由(功能性)组织蛋白酶H启动子驱动。这可例如意味着报告基因或其功能片段没有可操作地连接至功能性组织蛋白酶H启动子(即完全缺乏组织蛋白酶H启动子，包括无功能的组织蛋白酶H启动子或启动子片段或其中启动子和报告基因的连接不是功能性的)。另一可能性是报告基因或其功能片段可操作地连接至除组织蛋白酶H启动子之外的另一启动子(例如SV40或另一标准启动子)。还可将功能载体和对照载体转染到同一细胞中，但此情况下报告基因需要有差异。
可例如按照下述或本领域已知测定来进行符合以上用途的化合物的鉴定。
测定是监测生物学过程的任何类型的分析方法或系统。适宜地，在细胞或生化(体外)系统中重现代表生理代谢途径部分以及病理病况部分的分子级联和机制。因此，可根据其干扰或调节这些级联或机制的能力来测定潜在药物化合物的药理学活性。
对于在药物筛选，特别是新型药物化合物的高通量筛选中的应用，所述测定必须可重复，并还优选可升级(scable)且可靠。在本发明范围内，高通量筛选意指本发明方法用含几毫升甚至几纳升或甚至更少的极小体积的样品以极小规模地例如在96、386或1536孔板上实施。因此，在短时间内可分析极大量的样品。高通量筛选主要包括借助单个测定对大约500.000种不同化合物就某种能力进行筛选。所述测定优选适用于针对调节研究中的靶分子的活性的能力来高通量筛选化学物质。测定类型取决于例如所用靶分子的类型(例如多肽或多核苷酸)以及测定该靶分子活性所依据的“读出”即参数(参见下文)。
不同类型的所述测定通常为本领域所知并且可购自供应商。
用于不同目的的合适测定包括放射性同位素或荧光测定，例如荧光偏振测定(例如由Panvera提供的市售测定)，或用于测量标记成员与非标记成员的相互作用(例如标记的蛋白质与其未标记蛋白质-配体的相互作用)的PackardBioScience(HTRF；ALPHAScreenTM)。
更多实例包括基于细胞的测定，其中细胞系稳定(诱导型或非诱导型；染色体的或附加型)或瞬时表达重组目的蛋白。这些测定包括例如报告基因测定，其中根据报告酶的活性来测量对某些启动子或信号转导级联成员的信号转导途径的调节，所述报告酶的表达在所述某些启动子的调控之下。对于此类型的测定，重组细胞系需构建成含有受限定的启动子调控的报告基因，所述启动子本身将被研究或受研究中的信号转导级联调控。合适的报告酶通常为本领域所知，其包括萤火虫萤光素酶、海肾(renilla)萤光素酶(例如由Packardreagents市售)、β-半乳糖苷酶。合适的细胞系视测定目的而定，但通常包括易于转染和易于培养的细胞系，例如HeLA、COS、CHO、NIH-3T3等。
为测定蛋白酶活性，已知典型的蛋白酶测定方式：例如用在底物的某一位置携带报告标签(例如发射冷光/荧光或其它信号的蛋白质/肽或实体)和在另一位置携带猝灭剂(实体(例如抑制报告标签信号发射的另一种肽，只要底物是完整/未裂解的即可))的底物；将底物与组织蛋白酶H在合适条件下孵育，以使底物裂解，从而导致可检测信号(例如光发射)因为猝灭剂与报告标签的分离而发射。
本领域熟知其它类型的测定和其它类型的“读出”。用于检测细胞中组织蛋白酶H活性的一种测定可例如从Rüttger等，BioTechniques，2006获得。
本发明测定涉及例如：
鉴定或分析调节和/或预防疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供至少两份样品；
b.将含有组织蛋白酶H或其功能片段或衍生物的一份样品与化合物接触，
c.在化合物存在下，测定组织蛋白酶H的活性，
d.在化合物不存在下，测定组织蛋白酶H的活性，和
e.比较c)与d)中的组织蛋白酶H的活性。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.将组织蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物与测试化合物接触；和
b.测定所述测试化合物是否调节组织蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的活性。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.将具有可检测量或活性的组织蛋白酶H或其功能片段或衍生物的细胞与测试化合物接触；
b.测定所述测试化合物是否能够调节细胞中存在的组织蛋白酶H或其功能片段或衍生物的量或活性。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.在转录活性系统中将编码组织蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的核酸与测试化合物接触；和
b.测定在所述化合物存在下在所述系统中存在的编码组织蛋白酶H蛋白或其功能片段或衍生物的mRNA的量；和
c.测定所述化合物是否能够调节所述系统中存在的编码组织蛋白酶H蛋白或功能片段或衍生物的mRNA的量。
转录活性系统为至少具有进行转录单元的转录反应能力的任何生化或细胞系统。此类系统为本领域熟知并且包括市售细胞以及体外转录系统或试剂盒(例如基于细胞提取物)。
用于鉴定或分析调节和/或预防疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.提供用包含可操作地连接到报告基因或其功能片段的组织蛋白酶H基因或其功能片段的启动子的核酸载体转染的细胞；
b.提供用包含没有可操作地连接到功能性组织蛋白酶H启动子的报告基因或其功能片段的对照载体转染的细胞；
c.测定在测试化合物存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性；
d.测定在测试化合物不存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性。
用于鉴定或分析调节疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.选择调节组织蛋白酶H活性的化合物作为测试化合物；和
b.将所述测试化合物给予感觉疼痛的受试者，以测定疼痛是否被调节。
鉴定或分析调节和/或预防受试者疼痛优选神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
c.测定在一种或多种测试化合物存在下组织蛋白酶H或其功能片段或衍生物的生物学活性，以鉴定一种或多种调节组织蛋白酶H生物学活性的调节化合物；和
d.测试一种或多种调节化合物降低受试者疼痛(特别是神经性疼痛)和/或疼痛感觉(特别是神经性疼痛感觉)和/或疼痛敏感性(特别是神经性疼痛敏感性)的能力。
本发明另外方面涉及用于给患者群分类并协助医生调整/改进其对个体患者的治疗的药物基因组学方法，例如：
用于分析个体疼痛(特别是神经性疼痛)阈的方法，所述方法包括分析与一种或多种参考样品相比所取的所述个体样品中的组织蛋白酶H的量，以确定所述样品中存在的组织蛋白酶HmRNA和/或蛋白质的量是否不同于一种或多种参考样品的组织蛋白酶HmRNA和/或蛋白质的量，其中存在较高的量则表明所述个体的疼痛(特别是神经性疼痛)敏感性增加，而存在较低的量则表明所述个体的疼痛(特别是神经性疼痛)敏感性降低。
用于调整预防和/或治疗个体疼痛的药物剂量的方法，所述方法包括检查所取的个体样品，以确定所述样品中存在的组织蛋白酶HmRNA和/或蛋白质的量是否不同于一种或多种参考样品的组织蛋白酶HmRNA和/或蛋白质的量，所述剂量根据所取个体样品中蛋白质和/或mRNA的量是否不同于一种或多种参考样品中蛋白质和/或mRNA的量来调整，其中在所取个体样品中组织蛋白酶H的量较高表明需要较高剂量，而在个体样品中组织蛋白酶H的量较低则表明需要较低剂量。
本文使用的术语“所取样品”是指取自/分离自一个或多个个体(人或非人动物)的身体的生物样品。生物学材料和生物样品包括例如细胞、组织或器官的制备物或部分(例如脑、血液、肝、脾、肾、心脏、血管等)，优选来源于脊椎动物，并且更优选来源于哺乳动物(包括人)。还包括来自细胞培养物的细胞，优选真核细胞培养物，其包括来源于多细胞生物体和组织的细胞(例如HeLA、CHO、COS、SF9或3T3细胞)或单细胞生物体例如酵母(例如裂殖酵母或酿酒酵母)的细胞；或原核细胞培养物，优选毕赤酵母或大肠杆菌。可通过熟知技术(例如取血技术、组织穿刺技术或手术技术)获得来源于组织的细胞和样品。重组分子的制备和来自细胞或组织的天然存在的分子的纯化以及细胞或组织提取物的制备为本领域技术人员所熟知(亦参见例如下文列举的标准文献)。
术语“参考样品”是指取自具有已知给定疼痛表型的一个或多个个体的生物样品，或指体外生物样品(例如来源于体外细胞或组织培养物的样品(例如培养的细胞))，并且其在某些特性(例如其组织蛋白酶H活性、量或表达的水平)上对应于给定疼痛表型(例如高疼痛敏感性或低疼痛敏感性)。
本发明又一方面涉及用于检测组织蛋白酶H的工具(means)在用于通过分析取自待检个体身体的生物样品来测定个体中增强的疼痛敏感性(特别是神经性疼痛敏感性)中的用途。
用于检测组织蛋白酶H的工具可为能够特异性检测生物样品中存在的组织蛋白酶H多肽/蛋白质或核酸的任何工具。
检测组织蛋白酶H蛋白或多肽的工具可为能特异性检测野生型组织蛋白酶H蛋白/多肽的任何工具，并且还可为特异性检测具有与野生型多肽/蛋白质相比一个或多个关于大小或氨基酸序列的突变的组织蛋白酶H蛋白/多肽的工具。此类工具的优选实例为能够特异性检测组织蛋白酶H蛋白的抗体，例如用于免疫组织学或免疫组织化学技术(例如检测组织学组织切片中组织蛋白酶H蛋白或其某些突变或固定在合适载体例如膜、芯片、ELISA板等上的组织蛋白酶H蛋白)。
检测组织蛋白酶H核酸的工具可例如为检测组织蛋白酶HmRNA/cDNA或基因组DNA(野生型或还具有与野生型组织蛋白酶H核酸相比关于其长度或其核酸序列的一个或多个突变)的工具。所述工具可例如为特异性检测和/或定量组织蛋白酶HmRNA的工具，并优选包括或为特异性组织蛋白酶H核酸探针或引物组，所述核酸探针或引物组能够扩增组织蛋白酶HDNA，或例如用于PCR测序(用于检测核苷酸序列中的突变)，或能够扩增组织蛋白酶HcDNA，例如用于RTPCR(用于检测和/或定量组织蛋白酶HmRNA的表达)。另一工具可例如为能够在标准条件下与组织蛋白酶HmRNA或cDNA特异性杂交的核酸探针，例如用于RNA印迹或芯片杂交技术。
术语野生型是指在自然界或在给定生物体的标准实验室原种中存在的基因型或表型。根据一个优选实施方案，组织蛋白酶H的野生型序列为SEQIDNO：1、2、3、4、5、6、7、8和/或9的序列。
本领域熟知合适引物的设计和合成(亦参见上文)。用于检测组织蛋白酶H的引物组可例如为以下引物组：
第1组：(用于检测人CTSH转录物变体1的产物长度＝154个核苷酸，用于检测人CTSH转录物变体2的产物长度＝118个核苷酸)：
正向引物5’-GCGCTCCCAGTTGACGCTCT-3’(SEQIDNO.10)
反向引物5’-CACGCACAGTTCGGCGGC-3’(SEQIDNO.11)
第2组：(用于检测人CTSH转录物变体1的产物长度＝153个核苷酸，用于检测人CTSH转录物变体2的产物长度＝117个核苷酸)：
正向引物5’-CGCTCCCAGTTGACGCTCTGG-3’(SEQIDNO.12)
反向引物5’-CACGCACAGTTCGGCGGC-3’(SEQIDNO.13)。
根据本发明一个实施方案，所述工具为用于扩增组织蛋白酶H核酸的引物组，并且优选包含SEQIDNo.10、11(共为第1组)、12和/或13(共为第2组)的引物中至少之一的引物组。
根据本发明另一优选实施方案，所述工具为用于检测组织蛋白酶H核酸的探针。本领域熟知合适探针的设计和合成(亦参见下文标准文献)。
根据本发明又一优选实施方案，所述工具为用于特异性检测组织蛋白酶H蛋白或多肽的抗体。
本领域熟知合适的抗体或其功能片段的制备，例如通过在适当情况下在例如弗氏佐剂和/或氢氧化铝凝胶存在下用组织蛋白酶H蛋白或其片段来免疫哺乳动物例如兔(参见例如Diamond，B.A.等(1981)TheNewEnglandJournalofMedicine：1344-1349)。可随后用熟知方法(例如借助柱色谱来纯化)自血液分离由于免疫反应而在动物中形成的多克隆抗体。可例如按照Winter&Milstein(Winter，G.&Milstein，C.(1991)Nature，349，293-299)的已知方法制备单克隆抗体。本领域也熟知产生单克隆抗体的合适程序(参见例如下文所列文献的标准方法)。在本发明情况下，术语抗体或抗体片段还包括抗体或其抗原-结合部分，它们已重组制备，在适当情况下还可对其进行修饰，例如嵌合抗体、人源化抗体、多功能抗体、双特异性或多特异性抗体(oligospecificantibody)、单链抗体和F(ab)或F(ab)2片段(参见例如EP-B1-0-368684、US4,816,567、US4,816,397、WO88/01649、WO93/06213或WO98/24884)。组织蛋白酶H抗体为市售的，例如山羊抗-小鼠组织蛋白酶H，目录#BAF1013，R&DSystems(Minneapolis，USA)、大鼠抗-小鼠组织蛋白酶H，目录#MAB1013，R&DSystems(Minneapolis，USA)、山羊抗-小鼠组织蛋白酶H，目录#AF1013或兔抗-人组织蛋白酶H，目录#ABIN285430(antibodies-onlineGmbH，Germany，参见http://www.antikoerper-online.de)或小鼠抗-人组织蛋白酶H，目录#ABIN165388(antibodies-onlineGmbH，Germany)。
组织蛋白酶H抗体的制备以及对来自人组织胞质溶胶和血清的人组织蛋白酶H的检测例如在Schweiger等，JournalofImmunologicalMethods，2001，第165-172页(参见例如第166-167页的材料和方法)中详述。
本发明另一方面涉及用于测定个体疼痛特别是神经性疼痛敏感性的诊断试剂盒，测试试剂盒包括至少一种用于检测生物样品中组织蛋白酶H的工具及其用途。
在本发明情况下，应将测试试剂盒理解为在本申请中确定的组分的任意组合，它们在空间上联合共存到功能单元，并可含有另外组分。
在本发明情况下，测试试剂盒至少包括用于检测生物样品中的组织蛋白酶H(例如量/或突变)的工具，其适当地连同用于进行检测反应(例如借助用于测定组织蛋白酶H活性的抗体、酶反应等来免疫学检测组织蛋白酶H)的合适的缓冲液和/或试剂、和/或样品制备物以及任选的用于进行相应检测技术的操作手册。
本发明的其它方面涉及治疗方法，例如：
用于在正经受疼痛的受试者中治疗疼痛的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的在所述受试者中降低组织蛋白酶H量或活性的组合物。这可为组织蛋白酶H的总量或总活性，或是在某种组织中的量或活性，例如在神经组织、在淋巴组织或免疫系统细胞(例如肥大细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、T-细胞(例如CD8+T-细胞)等)中的量或活性，其中治疗有效量包括足以改善个体疼痛感觉或敏感性(特别是关于神经性疼痛)的量。
本发明另一方面涉及用于降低受试者疼痛(并且特别是神经性疼痛)敏感性的方法，所述方法包括给予所述受试者治疗有效量的降低所述受试者中(例如在淋巴组织或神经组织或免疫系统细胞中)的组织蛋白酶H的量(例如表达、半衰期)或活性的组合物。
此外，本发明涉及用于调节非人雌性受试者的后代中疼痛(并且特别是神经性疼痛)敏感性的方法，所述方法包括将赋予受调节的组织蛋白酶H表达的核酸转移(例如电穿孔)到受精卵中，将所述受精卵转移到非人代孕母体中，并选出符合其组织蛋白酶H表达特性(与野生型受试者例如小鼠相比组织蛋白酶H表达降低或废除)的后代。
本发明另一方面涉及能够降低组织蛋白酶H活性和/或表达的用于治疗疼痛并且特别是神经性疼痛的化合物。
本领域已知组织蛋白酶H的抑制剂，例如E-64d(参见例如Rüttger等，BioTechniques，41：469-473，2006)以及Kirschke，H等，1995，ProteinProfile2：1581-1643)。
为生产药物，可将本发明组织蛋白酶H调节剂与合适的添加剂或辅助物质一起配制，所述添加剂或辅助物质例如生理缓冲溶液，例如氯化钠溶液、软化水；稳定剂，例如蛋白酶或核酸酶抑制剂，优选抑肽酶、ε-氨基己酸或胃酶抑素A；或多价螯合剂，例如EDTA；凝胶制剂，例如白凡士林、低粘度石蜡和/或黄蜡等，视给药类型而定。
合适的另外的添加剂为例如去污剂，例如TritonX-100或脱氧胆酸钠；还有多元醇，例如聚乙二醇或甘油；糖，例如蔗糖或葡萄糖；两性离子化合物，例如氨基酸(例如甘氨酸或特别是牛磺酸或甜菜碱)和/或蛋白质(例如牛血清白蛋白或人血清白蛋白)。优选去污剂、多元醇和/或两性离子化合物。
生理缓冲液优选具有约6.0-8.0的pH(特别是约6.8-7.8的pH，尤其是约7.4的pH)和/或约200-400毫渗克分子/升、优选约290-310毫渗透分子/升的同渗质量摩尔浓度。通常用合适的有机或无机缓冲液调节药物的pH，例如优选用磷酸盐缓冲液、tris缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷)、HEPES缓冲液([4-(2-羟乙基)哌嗪子基]乙磺酸)或MOPS缓冲液(3-吗啉代-1-丙磺酸)。相应缓冲液的选择通常视所需缓冲液摩尔浓度而定。磷酸盐缓冲液适用于例如注射溶液剂及输注溶液剂。
可用常规方式给予药物，例如借助口服剂型(例如片剂或胶囊剂)；借助粘膜(例如鼻腔或口腔)；以皮下植入放置形式；借助注射剂、输注剂或凝胶剂，其含有本发明药物。还可表面或局部给予药物，以便治疗上述特定关节病，若合适以脂质体复合物形式。此外，可借助透皮治疗系统(TTS)进行治疗，所述系统使得可在时间上控制药物释放。例如，可从EP0944398A1、EP0916336A1、EP0889723A1或EP0852493A1获知TTS。
若仅将相对少量的溶液剂或混悬剂(例如约1-约20ml)给予身体，则通常使用注射溶液剂。若给予大量溶液剂或混悬剂(例如1升或更多升)，则通常使用输注溶液剂。因为与输注溶液剂相比，在注射溶液剂情况下仅给予几毫升，所以在注射时血液或组织液的pH及渗透压的小差异本身并不能被注意到，或仅就疼痛感觉方面在不显著的程度上其本身可被注意到。因此，通常不必在使用前稀释本发明制剂。然而，在给予相对大量的情况下，应该在临给药前将本发明制剂简单稀释到获得至少接近等渗溶液的程度。等渗溶液实例为0.9％浓度的氯化钠溶液。在输注情况下，可例如用无菌水进行稀释，同时可例如经由所谓分流术(bypass)进行给药。
根据本发明不同方面的一个优选实施方案，可作为分离的分子使用组织蛋白酶H、其衍生物或片段。
在本发明情况下，术语“分离的分子”(特别就组织蛋白酶H而言)是指从天然来源纯化的组织蛋白酶H多核苷酸或多肽以及纯化的重组分子(其中术语纯化的包括部分纯化以及完全纯化)。
重组多肽或多核苷酸分子的制备和从细胞或组织纯化天然存在的分子以及细胞或组织提取物的制备为本领域技术人员所熟知(亦参见例如以下所列标准文献)。
它们包括例如基于所公布的基因组或编码多核苷酸序列经由聚合酶链式反应(PCR)来扩增所需长度的多核苷酸，随后将所产生的多核苷酸克隆到宿主细胞中(参见例如以下所列标准文献)。
在本发明情况下，术语“多肽”是指包含通过肽键彼此连接的氨基酸的分子，其含有以线性方式彼此连接从而形成多肽链的至少50个氨基酸。较短的这类分子称为肽。术语“蛋白质”是指包含至少一条多肽链的分子，但也可指包含不止一条彼此缔合或结合的多肽链的分子。因此，术语“蛋白质”也包括术语“多肽”。
实施例：
材料与方法
所用小鼠品系
使用5种不同的近交小鼠品系：AKR/J(AKR)、CBA/J(CBA)、C3H/HeJ(C3H)、C57BL/6J(B6)和C58/J(C58)。从Jackson实验室(BarHarbor，ME，USA)获得小鼠。已证明这些小鼠品系就若干体内疼痛测量值方面而言显著不同(Mogil等1999)。
总RNA分离
用PicoPureTMRNA分离试剂盒(Arcturus)按照制造商的说明书从DRG(背根神经节)分离总RNA。用2100生物分析仪和RNA6000NanoLabChipTM试剂盒(Agilent)评估RNA质量。
AffymetrixGeneChipTM微阵列
按照Baugh，L.R，Hill，A.A.，Brown，E.L.和Hunter，C.P.(2001)NucleicAcidsRes.29，e29用500ng总RNA与100pMT7-(dT)24寡聚体(GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-dT24SEQIDNO：14)，并遵循制造商的说明书用SuperScriptII逆转录酶来进行第一链cDNA的合成。合成双链cDNA，然后用苯酚-氯仿接着乙醇沉淀步骤来提取。用BioArray高产RNA转录标记试剂盒(BioArrayHighYieldRNATranscriptionLabelingkit)(Enzo)遵循制造商说明书用双链cDNA样品进行体外转录反应。在37℃将转录反应物孵育16小时。使用用于RNA清理的RNeasyTMMini试剂盒(Qiagen)方案来纯化cRNA，用分光光度计定量。用RNA片段化缓冲液(200mMTris-乙酸、500mMKOAc、150mMMgOAc、pH8.1)使生物素-标记的cRNA片段化。遵循制造商说明书进行小鼠基因组4302.0GeneChipsTM(Affymetrix)杂交及染色。用GeneChipTM3000扫描仪对微阵列扫描，输入扫描的数据并用Resolverv5.1表达数据分析软件(RosettaBiosoftware)分析。
L5脊椎神经横切和假手术程序
在麻醉小鼠中使左L5脊椎神经暴露，然后部分去除横突(transverseprocess)。在与L4脊椎神经分开后，横切L5脊椎神经。假手术(Shamsurgery)与L5脊椎神经横切手术相同，但不横切L5脊椎神经(参见DeLeo等2000)。
测定缩足阈值
用动态足底触觉测量仪(dynamicplantaraesthesiometer)评估缩足阈值(pawwithdrawalthreshold，PWT)(参见Szabo等2005)。在小鼠适应金属网地板隔离间后，将刺激物放置在动物的后爪下，由电动致动器驱动的直金属丝触及足底面，并且施加逐渐增大的力，直到动物移开脚爪(缩足阈值，PWT)。评估经过手术的同侧后爪和对侧后爪的PWT。每只动物仅使用一次。在所有动物实验中，遵守意识清醒动物的研究伦理指导方针，并由当地伦理委员会批准该程序。
相关性分析
为进行相关性分析，将每一只神经横切动物(Chung动物)的“疼痛表型”定义为C1-S1，其中C1＝ln(同侧PWT/对侧PWT)，S1＝平均值同一品系的所有假手术动物ln(同侧PWT/对侧PWT)。
对每一只Chung动物定义两个差异转录调控的测量值，并且每一测量的基因基于其强度表达数据。对于各个基因及动物，采用“原始强度测量值”作为由Resolver表达数据分析软件(v5.1)计算的强度测量值。对特定基因和Chung动物，计算“log比率测量值”ln(C2/S2)，其中C2＝Chung表达强度，S2＝平均值同一品系的所有假手术动物
假手术表达强度。
在计算相关性之前，过滤基因集合以排除表达低于噪声水平及无显著的Chung对比假手术调节的基因。符合条件的基因必须在至少60％的绝对倍数变化≥1.5的Chung动物中或至少20％的绝对倍数变化≥2.0的Chung动物中被调控。此外，相应的基因表达必须在至少5只由各自强度p-值＜0.001定义的动物中为可检测(“存在”)的。
用R软件包(http://www.r-project.org/)来计算每一基因在疼痛表型分数与所定义的转录调节测量值之一之间的Pearson相关系数。基于这些，按照Storey等(2002)的方法产生统计显著性p-值及相应的假发现率(false-discoveryrate，FDR)。认为在“log比率测量值”或“强度测量值”下具有FDR＜0.05的基因显著相关。
附图说明
图1：组织蛋白酶H-相关曲线
图1显示每一个体小鼠在L5DRG中其神经性疼痛表型(机械超敏感性，X-轴)和相应组织蛋白酶H的基因调控(log比率(Chung对比假手术对照)，Y-轴)。根据所用品系对小鼠数据进行颜色编码。进行Pearson相关性分析，显示疼痛表型和组织蛋白酶H基因调控这两个参数显著正相关。这意味着对于个体小鼠，在经过神经性手术的Chung小鼠L5DRG中组织蛋白酶H表达越高，机械痛觉过敏越显著，其如行为测试所显示。
这种显著的相关性表明组织蛋白酶H基因表达对于诱导神经性疼痛表型的因果关系。
图2：组织蛋白酶H-强度数据
在chung或假手术后在AKR、CBA和C57品种的各个小鼠的L5神经节中组织蛋白酶H表达的绝对值。
图3：根据NCBI参考序列：NG_009614.1(SEQIDNO.1)的人第15号染色体上组织蛋白酶H的基因组DNA序列。
图4：NM_004390.3的人组织蛋白酶H转录物变体1的编码序列，其长度为1494bp并且编码组织蛋白酶H的更长同工型A(SEQIDNO：2)。
图5：NM_148979.2的人组织蛋白酶H转录物变体2的编码序列(SEQIDNO：3)，其长度为1458bp并且编码组织蛋白酶H的更短同工型B。依据上述NCBI条目，该转录物变体缺乏与变体1相比另外的符合读框的区段，从而产生与由转录物变体1编码的同工型A相比更短的蛋白质(同工型B)。这可产生更可能为分泌性蛋白而非溶酶体蛋白的蛋白质(同工型B)。
图6：NCBI条目BC006878.1的小鼠组织蛋白酶H的编码序列(SEQIDNO.4)。
图7：UniProtKB/Swiss-ProtP09668的人组织蛋白酶H蛋白序列(SEQIDNO.5)，其包含335个氨基酸并且构成人组织蛋白酶H(同工型A)的前原形式。该序列进一步被加工成成熟形式；其被裂解成下列3条链：组织蛋白酶H小链、组织蛋白酶H重链、组织蛋白酶H轻链(轻链与重链一起可称为大链)；所有的链通过二硫键结合在一起。第1-22位氨基酸构成信号肽(长度为22个aa)，第23-97位氨基酸构成激活肽(长度为75个aa)，第98-105位氨基酸构成组织蛋白酶H的小链(长度为8个aa)，第106-115位氨基酸构成前肽(长度为10个aa)，第116-335个氨基酸构成组织蛋白酶H的长链(长度为220个aa)，其由通过二硫键结合在一起的重链和轻链组成，第116-292位氨基酸构成组织蛋白酶H的重链(长度为177个aa)，第293-335位氨基酸构成组织蛋白酶H的轻链(长度为43个aa)。
图8：NM_004390.3的人同工型A的前蛋白原(SEQIDNO：6；由SEQIDNO.2翻译的氨基酸序列)。
图9：NM_148979.2的人同工型B的前蛋白原(SEQIDNO：7；由SEQIDNO：3翻译的氨基酸序列)。
图10：NP_004381.2的人组织蛋白酶H同工型前蛋白原的蛋白质序列(SEQIDNO.8).
图11：NP_683880.1的人组织蛋白酶H同工型b前体蛋白质的蛋白质序列(SEQIDNO.9).
参考文献
DeLeoJA等(2000)TransgenicexpressionofTNFbyastrocytesincreasesmechanicalallodyniainamouseneuropathymodel(在小鼠神经病模型中星形细胞的TNF转基因表达增加机械的异常性疼痛).Neuroreport11：599-602。
StoreyJD.(2002)Adirectapproachtofalsediscoveryrates(假发现率的直接方法).JournaloftheRoyalStatisticalSociety，B系列，64：479-498。
SzaboA等(2005)Roleoftransientreceptorpotentialvanilloid1receptorsinadjuvant-inducedchronicarthritis：invivostudyusinggene-deficientmice(潜在的vanilloid1受体瞬时受体在辅药诱导的慢性关节炎中的作用：用基因缺陷型小鼠的体内研究).J.Pharmacol.Exp.Ther.314：111-119。
Julius和Basbaum“Molecularmechanismsofnociception(伤害感受的分子机制)”，Nature，第413卷，13.2001年9月，第203-209页；
Scholz和Woolf“Canweconquerpain(我们能征服疼痛吗)”，Natureneurosciencesupplement，第5卷，2002年11月，第1062-1067页；
Wood，J.D.“PathobiologyofVisceralPain：MolecularMechanismsandTherapeuticImplicationsII.geneticapproachestopaintherapy(内脏疼痛的病理学：分子机制及治疗影响II.疼痛治疗的遗传学方法)”，AmericanJournalpfPhysiologicalGastrointestinalLiverPhysiology，2000，第278卷，G507-G512；
Woolf和Mannion“Neuropathicpain：aetiology，symptomsmechanisms，andmanagement(神经性疼痛：病因、症状机理和控制)”，TheLANCET，第353卷，1999年6月5日，第1959-1964页；
WoolfJ.和SalterM.W.“NeuronalPlasticity：IncreasingtheGaininPain(神经可塑性：疼痛增加)”，Science，第288卷，2000年6月9日，第1765-1768页；
Pham，C.T.N.；Armstrong，R.J.；Zimonjic，D.B.；Popescu，N.C.；Payan，D.G.；Ley，T.J.“Molecularcloning，chromosomallocalization，andexpressionofmurinedipeptidylpeptidaseI(鼠二肽基肽酶I的分子克隆、染色体定位及表达)”J.Biol.Chem.272：10695-10703，1997；
Pham，C.T.N.；Ley，T.J.：”DipeptidylpeptidaseIisrequiredfortheprocessingandactivationofgranzymesAandBinvivo(体内加工并激活粒酶A和B需要二肽基肽酶I)”.Proc.Nat.Acad.Sci.96：8627-8632，1999；
Rao，N.V.；Rao，G.V.；Hoidal，J.R.：”Humandipeptidyl-peptidaseI(人二肽基-肽酶I)”.J.Biol.Chem.272：10260-10265，1997；
Manour，S.，Thomas，K.R.，和Capecchi，M.R.，1989，“disruptionoftheproto-oncogeneInt-2inmouseembryo-derivedstemcells：ageneralstrategyfortargetingmutationssonon-selectablegenes(来源于小鼠胚胎的干细胞中的原癌基因Int-2的破裂：靶向非选择性基因突变的通用策略)”，Nature336，348-352；
Soriano，Pl，Montgomery，C.，Geske，R.，和Bradley，A.，1991，“Targeteddisruptionofthec-srcproto-oncogeneleadstoosteopetrosisinmice(c-src原癌基因的靶向破裂导致小鼠骨硬化病)”，Cell65，693-702；
Turk，B.，Turk，D和Turk，V.，Lysosomalcysteineproteases：morethanscavengers(溶酶体半胱氨酸蛋白酶：不只是清除剂).BiochimBiophysActa.2000Mar7；1477(1-2)：98-111；
TurkB.，TurkV和TurkD.，1997，StructuralandFunctionalAspectsofPapain-LikeCysteineProteinasesandTheirProteinInhibitors(木瓜蛋白酶-样半胱氨酸蛋白酶及其蛋白质抑制剂的结构和功能方面)，BiologicalChemistry，第378卷，第141-150页；
TurkV.，Turk.B和Turk.D，2001，LysosomalCysteineProteases：FactsandOpportunities(溶酶体半胱氨酸蛋白酶：事实与机会)，TheEMBOJournal，第20卷，No.17第4629-4633页.
Rüttger，A，Mollenhauer，J.，R.，Gütschow，M和Wiederanders，B.，Microplateassayforquantitativedetermminationofcathepsinactivitiesinviablecellsusingderivativesof4-methoxy-β-naphthylamide(用4-甲氧基-β-萘胺衍生物来定量测定活细胞中组织蛋白酶活性的微量培养板测定)，Biotechniques41：469-473(2006年10月)；
Kirschke，H.，A.J.Barrett和N.D.Rawlings，1995，Proteinases1：lysosomalcysteineproteinases(蛋白酶1：溶酶体半胱氨酸蛋白酶)：ProteinProfile2：1581-1643).
IshidohK.，Suzuki，K.，Katunuma，N和Kominami，E.，GeneStructuresofRatCathepsinsHandL(大鼠组织蛋白酶H和L的基因结构).，BiomedicaandBiochimicaActa，1991；50(4-6)：541-7.
IshidohK.，KominamiEl，KatunumaN和SuzukiK.，1989，GenestructureofratcathepsinH(大鼠组织蛋白酶H的基因结构)，FEBSLetters第253卷，number1，2，103-107；
RotheM和DodtJ，1992，StudiesontheAminopeptidaseActivityofRatCathepsinH(对大鼠组织蛋白酶H的氨肽酶活性的研究)，EuropeanJournalofBiochemistry，210，759-764
VasiljevaO.，DolinarM.，TurkV和TurkB.，2003，RecombinantHumanCathepsinHLackingtheMiniChainIsanEndopeptidase(缺乏小链的重组的人组织蛋白酶H是内肽酶)，Biochemistry2003，42，13522-13528；
SchweigerA，StabucB.，PopovicT，TurkV和KosJ.，1997，Enzyme-linkedimmunosorbentassayforthedetectionoftotalcathepsinHinhumantissuecytosolsandsera(用于检测人组织胞质溶胶和血清中总组织蛋白酶H的酶联免疫吸附测定)，JournalofImmunologicalMethods201(1997)165-172；
Koga，H.，MoriN.，YamadaH.，NishimuraY，KazuoT.，KatoK和ImotoT.，1991，RatCathepsinH-CatalyzedTransacylation：ComparisonsoftheMechanismandtheSpecificitywithPapain-SuperfamilyProteases(大鼠组织蛋白酶H-催化的转酰基作用：比较木瓜蛋白酶-超家族蛋白酶的机制和特异性)，JournalofBiochemistry110，939-944.
标准实验室方法文献
若无另外说明，则按照或可按照以下标准文献来实施标准实验室方法：
Sambrook等(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual.第二版.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY.第545页；
CurrentProtocolsinMolecularBiology；定期更新，例如第2000卷；Wiley&Sons，Inc；编辑：FredM.Ausubel，RogerBrent，RobertEg.Kingston，DavidD.Moore，J.G.Seidman，JohnA.Smith，KevinStruhl.
CurrentProtocolsinHumanGenetics；定期更新；Wiley&Sons，Inc；编辑：NicholasC.Dracopoli，HonathanL.Haines，BruceR.Korf，CynthiaC.Morton，ChristineE.Seidman，J.G.Seigman，DouglasR.Smith.
CurrentProtocolsinProteinScience；定期更新；Wiley&Sons，Inc；编辑：JohnE.Coligan，BenM.Dunn，HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher，PaulT.Wingfield.
MolecularBiologyoftheCell；第三版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；GarlandPublishing，Inc.NewYork&London，1994；
ShortProtocolsinMolecularBiology，第5版，由FrederickM.Ansubel(编辑)，RogerBrent(编辑)，RobertE.Kingston(编辑)，DavidD.Moore(编辑)，J.G.Seidman(编辑)，JohnA.Smith(编辑)，KevinStruhl(编辑)，2002年12月，JohnWiley&Sons，Inc.，NewYork；
TransgenicAnimalTechnologyALaboratoryHandboook.C.A.Pinkert编辑；AcademicPressInc.，SanDiego，California，1994(ISBN：0125571658)；
Genetargeting：APracticalApproach，第2版，JoynerAL编辑。2000.IRLPressatOxfordUniversityPress，NewYork；
ManipulatingtheMouseEmbryo：ALaboratoryManual.Nagy，A，Gertsenstein，M.，Vintersten，K.，Behringer，R.，2003，ColdSpringHarborPress，NewYork；
Remington′sPharmaceuticalSciences，第17版，1985(对于生理上耐受的盐(无机或有机)，特别参见第1418页)。
实验室方法标准文献
若无另外说明，则按照或可按照以下标准文献所列出的标准方法来实施实验室方法：
Sambrook等(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual.第2版.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY.第545页或CurrentProtocolsinMolecularBiology；
CurrentProtocolsinMolecularBiology；定期更新，例如第2000卷；JohnWiley&Sons，Inc；编辑：FredM.Ausubel，RogerBrent，RobertEg.Kingston，DavidD.Moore，J.G.Seidman，JohnA.Smith，KevinStruhl；
CurrentProtocolsinHumanGenetics；定期更新，例如第2003卷；JohnWiley&Sons，Inc；编辑：NicholasC.Dracopoli，HonathanL.Haines，BruceR.Korf，CynthiaC.Morton，ChristineE.Seidman，J.G.Seigman，DouglasR.Smith；
CurrentProtocolsinProteinScience；定期更新，例如第2003卷；JohnWiley&Sons，Inc；编辑：JohnE.Coligan，BenM.Dunn，HiddeL.Ploegh，DavidW.Speicher，PaulT.Wingfield；
MolecularBiologyoftheCell；第3版；Alberts，B.，Bray，D.，Lewis，J.，Raff，M.，Roberts，K.，Watson，J.D.；GarlandPublishing，Inc.NewYork&London，1994；
GeneTargeting：apracticalapproach(1995)，编辑：A.L.Joyner，IRLPress；
Remington′sPharmaceuticalSciences，第17版，1985。

Claims (18)

1.组织蛋白酶H用于鉴定调节神经性疼痛的化合物的用途，其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
2.异源表达组织蛋白酶H的非人转基因动物用于鉴定或分析调节神经性疼痛的化合物的用途，其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关，其中所述用途不是诊断性且不是治疗性。
3.异源表达组织蛋白酶H的非人转基因动物作为用于增强的神经性疼痛敏感性的模型系统的用途，其中所述用途不是诊断性且不是治疗性。
4.非人组织蛋白酶H敲除动物用于鉴定或分析调节神经性疼痛的化合物的用途，其中较低的组织蛋白酶H活性与较低的疼痛敏感性呈正相关，其中所述用途不是诊断性且不是治疗性。
5.非人组织蛋白酶H敲除动物作为用于降低的神经性疼痛敏感性的模型系统的用途，其中所述用途不是诊断性且不是治疗性。
6.异源表达组织蛋白酶H的细胞用于鉴定调节神经性疼痛的化合物的用途，其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
7.异源表达组织蛋白酶H的细胞作为用于增强的神经性疼痛敏感性的模型系统的用途。
8.组织蛋白酶H敲除细胞用于鉴定或分析调节神经性疼痛的化合物的用途，其中在所述敲除细胞中较低的组织蛋白酶H活性与较低的疼痛敏感性呈正相关。
9.组织蛋白酶H敲除细胞作为用于降低的神经性疼痛敏感性的模型系统的用途。
10.异源表达与组织蛋白酶H启动子或与组织蛋白酶H启动子和增强子表达上连接的报告基因的细胞用于鉴定或分析调节神经性疼痛的化合物的用途，其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
11.鉴定或分析调节和/或预防神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供至少两份样品；
b)将含有组织蛋白酶H的一份样品与化合物接触，
c)在化合物存在下，测定组织蛋白酶H的活性，
d)在化合物不存在下，测定组织蛋白酶H的活性，和
e)比较c)与d)中的组织蛋白酶H的活性，
其中组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
12.用于鉴定或分析调节和/或预防神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.将组织蛋白酶H蛋白与测试化合物接触；和
b.测定所述测试化合物是否调节组织蛋白酶H蛋白的活性，
其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
13.用于鉴定或分析调节和/或预防神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.将具有可检测量或活性的组织蛋白酶H的细胞与测试化合物接触；
b.测定所述测试化合物是否能够调节细胞中存在的组织蛋白酶H的量或活性，
其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
14.用于鉴定或分析调节和/或预防神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.在转录活性系统中将编码组织蛋白酶H蛋白的核酸与测试化合物接触；和
b.测定在所述化合物存在下在所述系统中存在的编码组织蛋白酶H蛋白的mRNA的量；和
c.测定所述化合物是否能够调节所述系统中存在的编码组织蛋白酶H蛋白的mRNA的量，
其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
15.用于鉴定或分析调节和/或预防神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a)提供用包含可操作地连接到报告基因的功能性组织蛋白酶H基因启动子的核酸载体转染的细胞；
b)提供用包含没有可操作地连接到功能性组织蛋白酶H启动子的报告基因的对照载体转染的细胞；
c)测定在测试化合物存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性；
d)测定在测试化合物不存在下a)的细胞和b)的细胞的报告基因活性，
其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
16.用于鉴定或分析调节神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.选择调节组织蛋白酶H活性的化合物作为测试化合物；和
b.将所述测试化合物给予感觉疼痛的受试者，以测定疼痛是否被调节，
其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关，
其中所述方法不是诊断性且不是治疗性。
17.鉴定或分析在受治疗者中调节和/或预防神经性疼痛的化合物的方法，所述方法包括：
a.测定在一种或多种测试化合物存在下组织蛋白酶H的生物学活性，以鉴定一种或多种调节组织蛋白酶H生物学活性的调节化合物；和
b.测试一种或多种调节化合物降低受试者疼痛、疼痛感觉或疼痛敏感性的能力，
其中所述方法不是诊断性且不是治疗性，
其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
18.用于鉴定调节神经性疼痛的化合物的方法，包括测定组织蛋白酶H的表达，其中所述组织蛋白酶H表达与神经性疼痛表型呈正相关。
CN201080049813.XA 2009-08-31 2010-08-27 组织蛋白酶h的用途 Expired - Fee Related CN102713631B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP09290659.3 2009-08-31
EP09290659A EP2293072A1 (en) 2009-08-31 2009-08-31 Use of cathepsin H
PCT/EP2010/062525 WO2011023786A1 (en) 2009-08-31 2010-08-27 Use of cathepsin h

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102713631A CN102713631A (zh) 2012-10-03
CN102713631B true CN102713631B (zh) 2015-12-09

Family

ID=42150608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080049813.XA Expired - Fee Related CN102713631B (zh) 2009-08-31 2010-08-27 组织蛋白酶h的用途

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20120252878A1 (zh)
EP (2) EP2293072A1 (zh)
JP (2) JP5980116B2 (zh)
KR (1) KR20120073261A (zh)
CN (1) CN102713631B (zh)
AR (1) AR078002A1 (zh)
AU (1) AU2010288468B2 (zh)
BR (1) BR112012004450A2 (zh)
CA (1) CA2772004A1 (zh)
IL (1) IL218326A (zh)
MX (1) MX346460B (zh)
MY (1) MY179784A (zh)
RU (1) RU2574005C2 (zh)
SG (2) SG178929A1 (zh)
TW (1) TW201113033A (zh)
WO (1) WO2011023786A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2532755A1 (en) * 2011-06-10 2012-12-12 Sanofi-Aventis Methods and uses based on Slfn2 expression and relating to the identification and profiling of compounds for use in the treatment or prevention of pain
CN105969904B (zh) * 2016-07-27 2019-10-11 北京泱深生物信息技术有限公司 多发性骨髓瘤生物标志物

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
FR2739031B1 (fr) 1995-09-27 1997-11-21 Lhd Lab Hygiene Dietetique Systeme matriciel transdermique d'administration d'un oestrogene et/ou d'un progestatif a base de copolymere styrene-isoprene-styrene, procede de preparation et utilisation en therapeutique
US5736154A (en) 1996-03-11 1998-04-07 Fuisz Technologies Ltd. Transdermal delivery system
ATE218328T1 (de) 1996-03-25 2002-06-15 Lohmann Therapie Syst Lts Transdermales therapeutisches system mit geringer applikationsdicke und hoher flexibilität sowie herstellungsverfahren
AUPO379596A0 (en) 1996-11-22 1996-12-19 Soltec Research Pty Ltd Percutaneous delivery system
US20040055022A1 (en) * 2000-02-08 2004-03-18 Nick Cheng Compositions and methods for screening therapeutic agents
US20030138803A1 (en) * 2001-07-27 2003-07-24 Brooksbank Robert Alan Identification and use of molecules implicated in pain
US20030148314A1 (en) * 2001-08-01 2003-08-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of colon cancer
US20060241074A1 (en) * 2001-08-14 2006-10-26 The General Hospital Corporation Methods for treatment of pain
US20030144234A1 (en) * 2001-08-30 2003-07-31 Buxton Francis Paul Methods for the treatment of chronic pain and compositions therefor
US20030212003A1 (en) * 2002-02-14 2003-11-13 Hermann Lubbert Cathepsin Y for the development of a medicament for the treatment of pain
US20070015271A1 (en) * 2002-04-04 2007-01-18 Rosen Craig A Human secreted proteins
US6897240B2 (en) * 2002-05-08 2005-05-24 The Regents Of The University Of California Thio semicarbazone and semicarbazone inhibitors of cysteine proteases and methods of their use
US7261882B2 (en) * 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
ES2367311T3 (es) * 2004-04-15 2011-11-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Productos de degradación proteolítica de map-2 como biomarcadores de diagnóstico para las lesiones neurales.
EP2105742A1 (en) * 2008-03-26 2009-09-30 Sanofi-Aventis Use of cathepsin C

Also Published As

Publication number Publication date
MX2012002627A (es) 2012-05-08
US20120252878A1 (en) 2012-10-04
WO2011023786A1 (en) 2011-03-03
SG178929A1 (en) 2012-04-27
KR20120073261A (ko) 2012-07-04
IL218326A (en) 2015-10-29
JP5980116B2 (ja) 2016-08-31
JP2016104013A (ja) 2016-06-09
JP2013502912A (ja) 2013-01-31
MX346460B (es) 2017-03-22
EP2293072A1 (en) 2011-03-09
AU2010288468B2 (en) 2015-04-30
CN102713631A (zh) 2012-10-03
MY179784A (en) 2020-11-13
IL218326A0 (en) 2012-04-30
AU2010288468A1 (en) 2012-03-15
EP2473855A1 (en) 2012-07-11
AR078002A1 (es) 2011-10-05
BR112012004450A2 (pt) 2016-11-16
RU2574005C2 (ru) 2016-01-27
TW201113033A (en) 2011-04-16
RU2012112539A (ru) 2013-10-10
SG10201507228XA (en) 2015-10-29
CA2772004A1 (en) 2011-03-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102150046B (zh) 组织蛋白酶c的用途
CN101360835A (zh) 用于鉴定可用于情感障碍治疗的试剂的生物标记和方法
CA3082591A1 (en) Markers for the diagnosis and treatment of non-alcoholic steatohepatitis (nash) and advanced liver fibrosis
CN102165315A (zh) 用于使用20基因群组评估及治疗溃疡性结肠炎和相关疾病的标记物和方法
US20140179552A1 (en) Methods and compositions for diagnosing osteoarthritis in a feline
CN102713631B (zh) 组织蛋白酶h的用途
US10370714B2 (en) Th-17 differentiation markers for rosacea and uses thereof
US20160076102A1 (en) Molecular targets for als and related disorders
GEBAUER et al. Patent 2772004 Summary
US20240085433A1 (en) Methods of using mesothelin
이한별 Studies on circulating microRNA biomarkers in dog and monkey acute pancreatic injury models
WO2008104303A1 (en) Cte1 as a biomarker for ppara modulators
WO2008104286A1 (en) Mte1 as biomarker for ppara modulators

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20151209

Termination date: 20170827

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee