TW201109033A - Albumin-amyloid peptide conjugates and uses thereof - Google Patents

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201109033 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於包含白蛋白-澱粉樣肽共軛物之治療性組 成物以及彼等之用途，更具體地說，本發明關於治療性組 成物於治療與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病（諸如阿茲海默 氏症）的用途。 【先前技術】 澱粉樣疾病或澱粉樣變性包括多種具有各式各樣外在 症狀的疾病狀態。這些病症之共同處爲存有直徑通常爲約 10到100奈米之異常細胞外蛋白纖維沈積，稱爲“澱粉樣纖 維”、“澱粉樣沈積”或“澱粉樣斑塊”，其侷限於特定器官 或組織區域。這類斑塊主要係由天然產生的可溶性蛋白質 或肽組成。這些不溶性沈積一般係由直徑約1 〇-1 5奈米的 橫向纖維聚集體所組成。雖然其出現情形岐異，但以特定 染料（如：硫黃素τ，剛果紅）染色時，所有澱粉樣沈積 均具有共同的形態性質，且染色後在偏振光下具有獨特之 紅-綠雙折射出現。 與澱粉樣相關之疾病的特點爲存在於沈積中之蛋白質 類型。例如：神經退化性疾病（諸如疥癖、牛海綿狀腦炎 ，賈庫氏症等）的特點爲中樞神經系統中出現並累積抗蛋 白酶形式之普里昂蛋白（Prion)(稱爲AScr或PrP-27) ° 類似地，阿茲海默氏症（另一種神經退化性疾病）之特點 爲澱粉樣斑塊沈積和神經纖維纏結。此情況中’斑塊和血 -5- 201109033 管澱粉樣係經由纖維狀β澱粉樣蛋白沈積形成。其他疾病 (諸如成人發作型糖尿病）（第11型糖尿病）之特點爲澱 粉樣局部累積在胰臟中。 各促澱粉樣變蛋白有能力折疊成β-摺板及形成不溶性 纖維（其可在細胞外或細胞內沈積）。促澱粉樣變蛋白（ 雖然胺基酸序列不同）具有形成纖維和結合其他成分（諸 如蛋白聚糖、澱粉樣Ρ和補體成分）之相同性質。再者， 各促澱粉樣變蛋白具有可催化β-摺板細胞形成的胺基酸序 列（雖然這些胺基酸序列並不相同）。舉例而言，該澱粉 樣Ρ纖維與阿茲海默氏症患者中之死亡神經元細胞和小神 經膠質增生有關。在活體外進行測試時，該澱粉樣β肽顯 示出可觸發小神經膠質細胞（腦巨噬細胞）之活化過程， 此點可以解釋阿茲海默氏症患者大腦中出現小神經膠質增 生及大腦炎症。 在第Π型糖尿病患者中見到之另一種澱粉樣變性類型 中，該促澱粉樣變蛋白ΙΑΡΡ顯示出在體外誘導β-胰島細胞 毒性。因此，在第Π型糖尿病患者之胰臓中出現ΙΑΡΡ纖維 可能促成β胰島細胞（蘭氏細胞（Langerhans))損失和 器官功能障礙。 最重要的澱粉樣病之一爲阿茲海默氏症，此爲一種影 響西方世界總人口約0.5-1 %的進行性神經退化性疾病。阿 茲海默氏症之特點爲大量澱粉樣斑塊沈積在大腦中。此沈 積被認爲係造成該疾病之病理且大多數防止阿茲海默氏症 的辦法係致力於減少、消除或防止澱粉樣斑塊形成。澱粉 -6- 201109033 樣斑塊之主要組成爲β澱粉樣狀（Α β )，一種透過澱粉樣 先驅蛋白（ΑΡΡ )分裂產生之40-42胺基酸蛋白質。 專利申請案US20070172496號揭示包含Αβ ( 33-42) 肽（可被單株抗體辨識之肽）及白蛋白之共軛物，這些共 軛物係作爲用於測定來自患者（其曾以由衍生自Α β ( 1 - 4 2 )肽之不同肽和稱爲配體呈現組件之〇 LP Α開形成的複合 物免疫化）之樣本中是否存有抗-Αβ抗體之ELISA分析中 的捕捉抗原。 因此，本技藝中需要額外之能誘導有效且持續降低血 漿中澱粉樣含量並減少澱粉樣沈積之數目的致免疫組成物 [發明槪要] 於第一種觀點中，本發明關於用於藥物中之包含自 Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽及白蛋白的共軛物。 於另一觀點中，本發明關於用於醫學上之包含共軛物 及佐劑之組成物，該共軛物包含自Αβ ( 1 -42 )之C端區衍 生之肽及白蛋白。 於另一觀點中，本發明關於用於治療或預防與澱粉樣 蛋白沈積相關之疾病的包含至少一種自Αβ ( 1 -42 )之C端 區衍生之致免疫肽及白蛋白的共軛物或包含至少一種自 Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之致免疫肽和白蛋白及佐劑的組 成物。 201109033 【發明內容】 發明之詳細說明 用於藥物中之本發明的共軛物 令人驚訝地，本發明的作者發現投服包含自澱粉樣β 蛋白（1-42) [Αβ( 1-42)]之C端區衍生的肽和白蛋白的 共軛物可產生對抗該肽之抗體並降低蛋白Αβ( 1-40)及 Αβ ( 1-42)(其爲阿茲海默氏症中澱粉樣斑塊之主要成分 )的血清含量。這些結果開啓用於治療，預防和/或改善 與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病的新治療窗口。 因此，於一觀點中，本發明關於用於藥物中之包含自 Αβ ( 1-42 )之C端區衍生的致免疫肽和白蛋白的共軛物。 自Αβ( 1-42)之C端區衍生的致免疫肽 此處所使用之“致免疫肽”一詞係指包含等位基因-特異性再現單位（motif )、抗原決定部位或其他序列之 肽，如此，該多肽或片段將結合MHC分子並誘導對抗衍生 該致免疫肽之抗原（亦即該澱粉樣β肽）的細胞毒性T淋巴 細胞（“CTL”）反應，及/或Β細胞反應（例如：製造抗體 )，及/或Τ-輔助子淋巴細胞反應，及/或遲發型過敏（ DTH )反應。用於測定指定之肽是否爲免疫原性的合適方 法顯示於，例如：本發明之實例中。這些方法係基於該致 免疫肽被投予動物後在動物體內產生抗澱粉樣β抗體之能 力。 此處所使用之術語“澱粉樣β肽”一詞可與Αβ、澱粉樣β -8- 201109033 蛋白互換，“Αβ”、“βΑ P”，“Αβ肽”或“ A(3肽”係指在阿 茲海默氏症（AD)、唐氏症及荷蘭型遺傳性濺粉樣變性 腦出血（HCHWA-D)患者大腦中發現的老年斑塊和血管 澱粉樣沈積（澱粉樣血管病）的主要化學成分的肽族群。 無論爲何種形式，澱粉樣P肽爲β -澱粉樣先驅蛋白（APP )之片段’該ΑΡΡ包含可變數目的胺基酸（通常爲39-43個 胺基酸）。此處所使用之“ Α β ( 1 - 4 2 ) ”係關於對應於a ρ ρ 之胺基酸6?2至713的42胺基酸肽，其係藉由β_和分泌酶 將澱粉樣先驅蛋白進'行一系列蛋白質水解來產生。 澱粉樣β肽通常以“ Α β ( X - y ) ”表示，其中χ代表澱粉 樣β肽之胺基端的胺基酸號碼’而y代表羧基端之胺基酸號 碼。例如：Α β ( 1 -4 0 )爲一種其胺基端從胺基酸1號開始 ，羧基端結束於胺基酸4〇號之澱粉樣β肽，此序列訂爲 SEQ ID NO ： 1 » 本發明中，“自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽”欲指具 有2至40個胺基酸殘基，包含Αβ( 1-42) C端區之一部分 或全部的肽。此術語亦包括包含實質上相似於Αβ ( 1 -42 ) C端區之區的肽（諸如結構性變體）。 “實質上相似”一詞係指二種肽序列，當最佳比對時， 其至少有百分之五十的序列同一性’較佳爲具有至少百分 之六十的序列同一性，更佳爲具有至少百分之七十的序列 同一性，更佳爲具有至少百分之八十的序列同一性’更佳 爲具有至少百分之九十的序列同一性’再更佳爲具有至少 百分之九十五或更高的序列同一性（例如··百分之九十九 -9 - 201109033 的序列同一性）。較佳地，不等同之殘基位置的差別在於 保留性胺基酸取代。保留性胺基酸取代係指具有類似側鏈 之殘基互換。例如，具有脂族側鏈之胺基酸群爲甘胺酸、 丙胺酸 '纈胺酸、白胺酸和異白胺酸；具有脂族羥基側鏈 之胺基酸群爲絲胺酸和蘇胺酸；具有包含醯胺之側鏈的胺 基酸群爲天門冬醯胺和麩醯胺；具有芳族側鏈之胺基酸群 爲苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；具有鹼基側鏈的胺基酸群 爲賴胺酸'精胺酸和組胺酸；具有包含硫之側鏈的胺基酸 群爲半胱胺酸和甲硫胺酸。 不等同之殘基位置亦可由肽類似物（包括非天然胺基 酸或這類之衍生物）所組成。通常，類似物與天然肽之相 異處係在一 '二或數個位置上，一般係憑藉保留性取代。 一些類似物亦包括非天然胺基酸或在一、二個或數個 位置處的N或C端胺基酸之修改。非天然胺基酸之實例爲 (不受限於此）：D-胺基酸、α,α-二取代之胺基酸、N-烷 基胺基酸、乳酸、4-羥基脯胺酸、y-羧基麩胺酸化物、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基賴胺酸、ε-Ν-乙醯賴胺酸、0-磷酸絲胺酸、 Ν-乙醯絲胺酸、Ν-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥 基賴胺酸、Ω-Ν-甲基精胺酸及異天門冬胺酸。

於本發明之共軛物的特殊體系中，自Αβ (1-42)之C 端區衍生的肽係選自Αβ(35-42 ) (SEQIDNO:2) 、Αβ (3 3 -42 ) ( SEQ ID NO ： 3 ) 、Αβ ( 3 3-40 ) ( SEQ ID NO :4) o 此處所使用之“A (3 ( 3 5-42 ) ”係關於對應於Αβ ( 1-42 -10- 201109033 )最後8個胺基酸的8個胺基酸。 此處所使用之“ Αβ ( 3 3 -42 ) ”係關於對應 42 )最後10個胺基酸的10個胺基酸。 此處所使用之"Αβ ( 3 3 -40 ) ”係關於對應 42)之33至40處之胺基酸的8個胺基酸。 自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生的肽（包括肽連 )可藉由固體或溶液相之肽化學的標準方法合成 術之槪要可在 Stewart and Young ( 1963 ) So Peptide Synthesis, W. H. .Freeman Co. ( San Fra 及 Meienhofer ( 1 9 7 3 ) Hormonal Proteins and Academic Press ( New York)中找到。在傳統之 方面，見 Schroder and Lupke, The Peptides, Academic Press ( New York)。 一般來說，這些方法包含將一個或多個胺基 當保護之胺基酸連續加入不斷增長的肽鏈。正常 第一個胺基酸之胺基或羧基係藉由合適之保護基 後，經保護之胺基酸係連接惰性固態支撐或在溶 ，此係經由在適合形成醯胺鍵聯之條件下將下一 加入具有經適當保護之互補（胺基或羧基）基的 行。然後，自此新加入之胺基酸殘基移除保護基 一個胺基酸（經適當保護的），等等。當所有所 酸已依適當順序連接後，依序或同時移除任何剩 基（及任何固態支撐）以產生最終之肽。藉由簡 一般程序可能一次添加超過一個胺基酸至日益增 於 Α β ( 1 - 於 Αβ ( 1 - 接子基團 。固相技 lid Phase ‘ n c i s c ο )， Peptides, 溶液合成 Vol. 1， 酸或經適 情況下， 保護。然 液中使用 個胺基酸 序列中進 並加入下 需之胺基 餘之保護 單修改此 長之鏈上 -11 - 201109033 ’例如：經由（在不會將對掌性中心外消旋化之條件下） 將經保護之三肽與經適當保護之二肽偶合，再去保護後可 形成五肽。於一較佳體系中係利用能與半胱胺酸之氫硫基 反應的雙官能試劑將半胱胺酸殘基添加到該致免疫肽之N 端上，以促進該肽與載體分子的偶合反應。 白蛋白 如上述，本發明之一種觀點係關於包含自Αβ ( 1-42 ) 之C端區衍生之肽及白蛋白的共軛物於藥物中之用途。 此處所使用之“白蛋白”係指血漿中最豐富的蛋白質， 根據物種之起源，其單體形式之分子量約爲65至67千道耳 吞。“白蛋白”一詞可與“血清白蛋白”交替使用，而不欲界 定與本發明之經改質的肽類形成共軛物的白蛋白來源。因 此，此處所使用之“白蛋白” 一詞可指自天然來源（諸如血 液或漿液性流體）純化之白蛋白，或可指經化學合成或重 組產生的白蛋白。在各種體系中，白蛋白變體或天然白蛋 白之衍生物可用於形成本發明之共軛物。於一些體系中， 該白蛋白爲哺乳動物白蛋白，或其變體或衍生物。可使用 之哺乳動物白蛋白的非限制性實例包括人、牛、羊、山羊 、兔子、貓、狗、豬、靈長類動物或嚼齒類動物白蛋白。 於較佳之體系中，該哺乳動物白蛋白爲人白蛋白。 於一較佳體系中，該人白蛋白係自血液或漿液性流體 純化。例如：白蛋白可自個體或實驗動物之血清或血漿樣 品純化，較常用者爲牛血清白蛋白，但亦可利用任何標準 12- 201109033 方法（諸如藉由 Cohn方法（Cohn EJ et al.，J dm CAem Soc 1946; 68: 459-75 )或 Kistler 及 Nitschmann 方法（

Kistler P and Nitschmann HS., Vox Sang 1 962 ； 7 ： 414-24 )之冷乙醇分餾或色層分析純化法（Bergloff JH. et al_ In : Curling J M, e d. Separation of Plasma Proteins. Uppsala: Pharmacia，1 9 8 3 ； 51-8)或冷乙醇分餾與色層 分析純化法之組合）從來自其他動物（雞、豬、兔，等） 之血清中萃取。白蛋白亦可自蛋白（卵清蛋白）取得。另 一種白蛋白，儲存之白蛋白，可從一些植物（如：大豆） 之種子中提取。 於另一體系中’該白蛋白爲重組白蛋白。於一特殊體 系中，該白蛋白爲重組之人白蛋白（此處稱爲“rHA”）。 於各種體系中，rH A可在哺乳動物和非哺乳動物有機體中 製造。於一體系中，該rHA係在非哺乳動物有機體中製造 。可用於製造rHA之非哺乳動物有機體的實例包括，但不 限於：酵母、細菌、植物、真菌和昆蟲。於—體系中，該 rHA係在整個植物或整個真菌中製造。於另一體系中，該 rHA係在經培養之植物細胞、經培養之真菌細胞或經培養 之昆蟲細胞中製造。於另一體系中，該r Η A係在非人類之 哺乳動物或非人類之哺乳動物細胞中製造。可用於製造 r Η A之非人類哺乳動物的實例包括，但不限於那些屬於下 列其中之一者：牛科、犬科、豬科、嚼齒目、兔形目及靈 長目（不包括人類）。於一特殊體系中，可用於製造rHA 之非人類的哺乳動物係選自牛、狗、豬、綿羊、山羊、大 -13- 201109033 鼠、小鼠、兔子、黑猩猩或大猩猩。於另一體系中’用於 製造rHA之非人類哺乳動物細胞爲（不受限於此）：牛、 狗、豬、綿羊 '山羊、齧齒類、兔子、或非人類之靈長類 動物細胞。與自人血或漿液性流體純化之白蛋白相比較， 在非人類之有機體中製造之rHA的主要優點爲在rH A之製 造過程中沒有自人衍生之產品。使用這種經控制之製造方 法可產生結構異質性較少之更純的產品。先前之硏究指出 可溶性rHA與自人血或漿液性流體純化之人白蛋白在其生 化特性，放射標示效率和體外及體內之生物學行爲方面並 無顯著差異。見 ’ Dodsworth et al·，1 996，Biotechnol. Appl. Biochem. 24 : 1 7 1 -1 76。於一特殊體系中，該白蛋 白爲商標名稱 RECOMBUMIN ( R )所指稱之rHA (諾維 信（Novozymes)公司，英國諾丁漢）。RECOMBUMIN ( R )爲利用重組酵母技術在體外製造之重組的人白蛋白， 在重組酵母技術中，經基因改質之酵母（釀酒酵母）分泌 可溶性rHA，然後，收成此rHA，再將其純化並配製以作 爲供製造生物品或醫療設備塗層之賦形劑。 或者，用於形成本發明之共軛物的白蛋白、白蛋白變 體或衍生物可從商業來源取得，例如：以RECOMBUMIN (R )(諾維信公司，英國諾丁漢）；PLASBUMIN ( R ) 公司（Talecris Biotherapeutics，北卡羅來納州 Research Triangle Park ); ALB AGEN ( R )(新世紀製藥，阿拉巴 馬州亨茨維爾）：人白蛋白（C 〇 r t e X - B i o c h e m，加州聖林 德羅）、人血清白蛋白，ZLB Behring公司（普魯士國王 -14- 201109033 (KingofPrussia)，賓州），或 ALBREC(R)(日本， Mistubishi製藥）。 本發明中’“白蛋白”係指任何具水溶性之蛋白質，其 可適度溶解於濃鹽溶液中並經歷熱凝固（蛋白質變性）。 其分子量爲約65,000且係由609個（在大部分物種中，包 括人白蛋白）至615個（諸如雞白蛋白）各種數目二胺基 酸所組成。其均包含可透過二硫鍵與致免疫肽共軛結合之 3 5個半胱胺酸殘基。適合用於取得根據本發明之共軛物的 白蛋白包括，但不限於人白蛋白（SEQ ID NO: 5)或其 成熟部分（SEQ ID NO: 5之胺基酸25至609 )及牛白蛋白 (SEQ ID NO: 6)或其成熟部分（SEQ ID NO: 6之胺基 酸25至6〇7)。本發明中所使用之白蛋白亦包括來自保留 性胺基酸取代之白蛋白結構性變體（如上述關於自Α β ( 1 · 42) C端區衍生之肽的解釋）。 於某些體系中，本發明之共軛物包含白蛋白之分子變 體，例如：WO 2005/05 89 5 8 (其全部內容納爲此文之參 考資料）中所描述者。重組之人血清白蛋白變體可從新世 紀製藥（阿拉巴馬州，亨茨維爾）購得，名稱爲 AlbagenTM。用於形成根據本發明之共範物的白蛋白可使 用熟習本技藝之人士所已知之方法或材料取得。例如：可 從下列商業來源購得白蛋白，例如：諾維信公司（加州戴 維斯；自釀酒酵母衍生之重組的人白蛋白）；Cortex-Bio c h e m (加 州聖林 德羅： 血清白 蛋白） 、Talecris Biotherapeutics (北卡羅來納州硏究三角公園（Research 201109033

Triangle Park);血清白蛋白）；ZLB Behring公司（普 魯士國王，賓州），或新世紀製藥（阿拉巴馬州ille :源 於畢赤酵母（Pichia pastupsilonris)之重組的人白蛋白） 〇 白蛋白之變體可能包括從人類族群中之多形型白蛋白 產生的天然變體。現已有超過30種明顯不同之人血清白蛋 白的遺傳變體在各種條件下藉由電泳分析被鑑定出。見， 例如：Weitkamp et al，Ann. Hum. Genet·，36 ( 4) :381- 92 ( 1 973 ) ； Weitkamp, Isr. J. Med. ScL, 9(9) ： 1 23 8 -4 8 ( 1 973 ) ; Fine et a 1, Biomedicine, 25 ( 8 ) : 29 1 -4 ( 1 976 ) ； Fine et al, Rev，Fr. Transfus. immunohematoL, 25 ( 2 ) ： 1 49-63. ( 1 982 ) ； Rochu et al, Rev. Fr. Transfus. Immunohematol. 31 ( 5 ) ： 725 -3 3 ( 1 98 8 )；

Arai et al, Proc. Natl. Acad. Sd. U.S.A 8 6 ( 2 ) : 4 3 4-8 ( 1 989 )，其全部內容納爲此文之參考資料。於一體系中， 本發明提供以白蛋白之分子變體形成的共軛物。 於一些體系中，本發明之共軛物包含與白蛋白爲實質 上同源之白蛋白衍生物。例如：其胺基酸序列與白蛋白之 胺基酸序列至少75%、至少80%、至少85%、更典型爲90% ，且最常爲95 %相同之白蛋白同系物可用來形成共軛物。 於某些體系中，該白蛋白同系物包含游離之半胱胺酸。 於一些體系中，本發明之共軛物包含白蛋白之結構衍 生物。白蛋白之結構衍生物可能包括擁有白蛋白型活性之 蛋白質或肽類，例如：白蛋白之功能片段。於一些體系中 -16- 201109033 ，該衍生物爲白蛋白之抗原決定簇，即，可被抗 體辨認之多肽部分。於一些體系中，該重組白蛋 何可能藉由修改編碼人血清白蛋白之基因取得之 半衰期的蛋白質。舉例而言（但不受限於此）， 白可包含插入或缺失之m(白蛋白之微量金屬結 從而減少或排除結合微量金屬（如：鎳和/或銅 國專利案編號6,787，63 6中所述者，該篇全部內 考）。減少白蛋白與微量金屬結合對降低正在接 組成物治療之個體對微量金屬過敏之可能性可能 於某些體系中，白蛋白衍生物包括任何藉由 白蛋白取得之具有高血漿半衰期的大分子。於一 ，該白蛋白係藉脂肪酸修改。於一些體系中，該 藉金屬離子修改。於一些體系中，該白蛋白係藉 具有高親和力之小分子修改。於一些體系中，該 藉糖類（包括，但不限於葡萄糖、乳糖、甘露糖 )修改。 白蛋白之結構衍生物可利用熟習本技藝之人 任何方法產生，這些方法包括，但不限於經寡核 (定點）之誘變作用、丙胺酸掃描及聚合酶鏈反 )誘變作用、定點誘變作用（見Cotter，Bio chem 7 ( 1 9 8 6 )，Zoller and Smith, Methods Enzymol 50 ( 1987))、卡式誘變作用（cassette mutage: 限制選擇誘變作用（Wells et alphal, Gene 34 3 1 98 5 ))或其它任何可在經選殖之編碼白蛋白的 白蛋白抗 白可爲任 具高血漿 重組白蛋 合區）， )(如美 容納入參 受白蛋白 有利。 體外修改 些體系中 白蛋白係 對白蛋白 白蛋白係 和半乳糖 士已知之 苷酸介導 應(PCR J 2 3 7 1 -1 54 3 29-n e s i s )、 ]5 - 3 2 3 ( D N A上執 -17- 201109033 行以製造白蛋白變體DN A或編碼白蛋白結構衍生物之序列 的已知技術（Ausubel et alphal，Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York ( current edition ) ，S ambrook et al，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3d ed, Cold Spping Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ( 2001 )，其全部內 容倂爲此文之參考資料）。 於某些體系中，白蛋白衍生物包括任何藉由體外修改 白蛋白以具有較天然白蛋白爲高之血漿半衰期的大分子。 於一些體系中，該白蛋白係藉一或多種脂肪酸修改。於一 些體系中，該白蛋白係藉一或多種金屬離子修改。於一些 體系中，該白蛋白係藉一或多種對白蛋白具高親和力之小 分子修改。於一些體系中，該白蛋白係藉由一或多種糖類 (包括，但不限於葡萄糖、乳糖、甘露糖和半乳糖）修改 〇 人血清白蛋白製劑（不論是自血清衍生或重組產生者 )可包含非毓基白蛋白（即“封端”白蛋白）和锍基白蛋白 (即“未封端”白蛋白）之異質混合物。該人白蛋白多肽包 含35個半胱胺酸殘基，其中34個形成17個安定化二硫化物 橋聯。雖然毓基白蛋白之位置3 4處的半胱胺酸殘基包含游 離SH基，在非锍基白蛋白中之相同殘基包含混合之二硫 化物與’例如，半胱胺酸或穀胱甘肽，或已被金屬離子或 其他加合物氧化，從而使锍基較不具反應性或無法使用。 通常’將重組之白蛋白與任何能夠將氧化之白蛋白-Cys3 4 -18- 201109033 轉化成還原之白蛋白-c y s 3 4的作用劑（諸如 DTT )、锍基甘醇酸（TGA )或β-锍基乙醇 觸來增加巯基白蛋白。 於本發明之某些體系中，該重組白蛋白 結合反應前去糖化。咸信，白蛋白之去糖化 母菌中製造之重組白蛋白）可能產生在形成 有有利之耐受性和穩定性的白蛋白。一般而 去糖化時可使用熟習本技藝之人士已知之用 化的蛋白質還原之任何技術和任何條件？ Miksik et al ( J. Chromatogr. B. Biomed. 1997，699: 311-345)中所描述者）。或者 用酶催化法去糖化。例如：去糖化可利用内 同內糖苷酶之混合物進行去糖化。 於另一體系中，該重組白蛋白可進一步 利之共軛特異性，即，降低形成非Cys34共 。例如，可將重組白蛋白與可化學上封閉殘 人類血清白蛋白上已知可在此處形成共價加 作用劑接觸。可使用任何本技藝中已知之能 上除Cys34外之反應性部位的作用劑。於一 作用劑封閉賴胺酸殘基。白蛋白包含可變數 基（例如：人白蛋白中爲60，牛白蛋白中爲 25-3 0個賴胺酸殘基係位於白蛋白之表面且 作用。因此，於一些體系中，該作用劑封閉 人士已知之任何可能形成共價加合物的白蛋 二硫蘇糖醇（ (BME))接 可在進行共軛 (尤其是在酵 共軛物方面具 言，將白蛋白 於將非酶性糖 民進行（諸如 S ci. Appl.， '白蛋白可利 I糖苷酶Η或不 處理以取得有 軛物的可能性 基（此殘基爲 合物之處）之 夠封閉白蛋白 些體系中，該 目之賴胺酸殘 6 1 )，其中之 容易進行共轭 熟習本技藝之 白賴胺酸殘基 -19- 201109033 ，諸如白蛋白之 Lys71、Lysl99、Lys351、Lys525、 Lys54卜 連接子區 自Αβ( 1-42)之C端區衍生之肽和白蛋白可直接連接 ，或可經由一或多個連接基團（以下亦稱爲間插分子或間 隔子部分）連接。 於本發明共軛物之特殊體系中，若該至少一種致免疫 肽與白蛋白係藉由連接子區連接；該連接子區所包含之與 其連接的致免疫肽不超過一個。 於本發明之共軛物的另一特殊體系中，該連接至少一 個致免疫肽及白蛋白的連接子區包含一個半胱胺酸，較佳 地，該半胱胺酸係位於該致免疫肽之N端。 於某些體系中，該連接基團爲生物相容性聚合物，例 如：肽或含有烷基或烷氧基之聚合物。於一特殊體系中， 該連接基團爲具有不穩定化學鍵之肽，該化學鍵可被酶分 解或可在特定之化學條件（例如，酸性條件）下被分解。 於一體系中，該經改質之肽包含透過一或多個連接基共價 連接肽類之反應基。於某些體系中，該連接基包括一或多 個反應基，通常爲一個連接基。於某些體系中，該連接基 之長度爲1至100個原子。如本文所述，該連接基之長度係 以該連接基所連接之基團間的最短原子鏈中之原子的數目 表示。於某些體系中’該連接基具有1至1〇〇個原子、1至 80個原子、1至60個原子、1至5〇個原子、]至4〇個原子、1 •20- 201109033 至30個原子、1至20個原子、10至20個原子或5至15個原子 。當出現超過一個連接基時’該連接基可爲相同或相異之 連接基。該連接基可藉由熟習本技藝之人士已知的任何方 法或技術連接自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生的肽。示範之方 法或技術描述於美國專利案編號6849714中，其全部內容 納爲此文之參考資料。 連接基可包含一或多個烷基，諸如甲基、乙基、丙基 、丁基’等基團、烷氧基、烯基、炔基或經烷基取代之胺 基、環烷基、多環基、芳基、多聚芳基、經取代之芳基、 雜環基和經取代之雜環基。 於某些體系中’該連接基可選自包括胺基和羧基之連 接基，包括，但不限於：ΑΕΑ' ΑΕΕΑ和ΟΑ。於某些體系 中，該連接基可爲長度爲1至100個原子之ΑΕΑ的聚合物。 於某些體系中，該連接基可爲長度爲1至100個原子之 ΑΕΕΑ聚合物。於某些體系中，該連接基可爲長度爲1至 1 〇〇個原子之ΟΑ聚合物。連接基之說明性實例包括甘胺酸 、賴胺酸、麩胺酸、異白胺酸或精胺酸殘基之單體、二聚 體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體、八聚體 、九聚體、十聚體、--聚體、十二聚體、ΑΕΑ、ΑΕΕΑ 或ΟΑ (如：ΟΑ二聚體（-ΟΑ-ΟΑ-)或ΟΑ三聚體（-0八-ΟΑ-ΟΑ-)或彼等之任何組合（如：GIyn、LySn、ΟΑ、 ΑΕΑ或ΑΕΕΑ之任何組合，其中n=l、2、3、4、5、6、7、 8、9、10、11或12))。於一些體系中，該連接基具有單 一賴胺酸。該單一賴胺酸可經修改以直接連接反應基或經 -21 - 201109033 由一或多個連接基連接。例如：K基可透過，例如：側鏈 之ε胺基連接反應基或一或多個額外的連接子。這類包括 單一賴胺酸之連接子實例有，例如：（單體）aK(單體）b、Κ (單體）。和（單體）dK之序列，其中a、b、c和d各爲大 於或等於1之整數，例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12或更大。於一些實例中，a和b可能相同，而在 其他實例中，a和b並不相同。例如，a可能爲3，而b可能 爲4以提供具有下列序列之連接基：（OA)nK(〇A)n、 (OA)nK(AEA)n、（G)nK(OA)n、（〇A)nK(G)n，其中 n = 1、2 、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。於其中該反應基 係位於介於二個TMPs之間的連接子上的情況中，介於二 個TMPs之間的總長度通常不超過1〇〇個原子。連接該連接 基之處不被認爲是介於二個TMPs之間的連接子的一部分 〇 該連接基可包括上述生物相容性聚合物的任何組合。 例如：聚甘胺酸連接子可與一或多個任何構形之AEA、 AEE A或Ο A的單體組合。於一體系中，該聚甘胺酸連接子 係連接該聚甘胺酸連接子中之第一個或最後一個甘胺酸殘 基的N端或C端處之一個或多個AEA、AEEA或OA單體。或 者’一或多個AEA、AEEA或OA之單體係插入聚甘胺酸連 接子中之甘胺酸殘基間。於特殊之體系中，該反應基（例 如：MPA、GMBA、NHS、磺酸基-NHS、MBS 或 GMBS) 係透過一或多個連接基（包括，例如：聚甘胺酸連接子、 聚甘胺酸-賴胺酸連接子、AEEA、AEA或OA、或其任何組 -22- 201109033 合）連接肽之體系中。於某些其中該反應基係透過超過一 個連接基連接肽，各連接基可獨立選自通常爲下列者之群 體：聚甘胺酸、聚賴胺酸、AEA、AEEA和OA。於一些體 系中，該連接基之數目（例如：單體型聚合物單位）係從 1至 2、1至 3、1至 4、1至 5、1至 6、1至 7、1至 8、1至 9、1 至10、1至11、1至12。當有一個以上之連接基時，該連接 基可爲相同或相異之連接基。例如：可以任何順序使用聚 甘胺酸、聚賴胺酸、AEA、AEEA和/或OA其中之一的任何 組合。於一些體系中，該反應基（通常爲MPA )係經由一 前一後排列之1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11或 12 個聚甘胺酸、聚賴胺酸、AE A、AEEA或Ο A連接基連接肽 。於另一體系中，該反應基（通常爲MP A )係經由以分支 構形排列之 1、2' 3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12 個 聚甘胺酸、聚賴胺酸、AEA、AEEA或OA連接基連接肽。 於另一體系中，該連接基爲一個肽部分，此肽部分可 作爲自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽與白蛋白間之鉸鏈區 ，使該二者能夠彼此獨立地移動但仍保持其本身各自之三 維形狀。從這個意義而言，根據本發明之較佳的非天然中 間胺基酸序列將是其特點爲可允許此移動之結構延性的鉸 鏈區或是非天然之可彎曲的連接子。該可彎曲之連接子可 爲長度爲20個胺基酸或更少之可彎曲的連接子肽。於更佳 之體系中，該連接子肽包含2個或更多個選自下列之胺基 酸：甘胺酸、絲胺酸、丙胺酸和蘇胺酸。於本發明之更佳 體系中，該可彎曲之連接子爲聚甘胺酸連接子，但不限於 -23- 201109033 聚甘胺酸、聚麩胺酸、聚異白胺酸、聚精胺酸或其他合適 之包含二或多個胺基酸的連接基。於一些實例中，該胺基 酸連接基可包含至少二、三、四、五、六、七、八、九、 十、十一或十二個胺基酸殘基（例如：甘胺酸或賴胺酸殘 基）。聚甘胺酸連接子可包含一或多個插入任何結構中之 不同殘基（如：賴胺酸殘基），例如：接近N-或C端，或 在甘胺酸殘基之延伸的中間。於其他體系中，聚甘胺酸連 接子係與一或多個任何構形之AEA、AEEA或OA單體組合 。於一體系中，該聚甘胺酸連接子係在該聚甘胺酸連接子 中之第一個或最後一個甘胺酸殘基的N -或C端處連接一 個或多個AEA、AEEA或OA單體。或者，AEA、AEEA或 OA之一或多個單體係插入聚甘胺酸連接子中之甘胺酸殘 基之間。在實例中，當使用聚甘胺酸作爲連接子時，該聚 甘胺酸可包含單一賴胺酸’以提供能與另一連接子或蛋白 質反應之游離ε胺基。這類包含胺基酸（如：單一賴胺酸 )之聚甘胺酸的實例具有’例如：（G)aK(G)b、K(G)<^ (G)dK (其中a、b、c和d各自爲大於或等於1之整數，例如 :1、2、3、4、5、6、7、8、9、10' 11、12 或更大）之 胺基酸序列。於一些實例中，a和b可能相同，而在其他實 例中a和b並不相同。例如：a可能爲3，而b可能爲4。於一 些實例中，該在聚甘胺酸連接子中之單一賴胺酸可本身連 接至其他部分，如：連接基、反應基或反應基之殘基。例 如：賴胺酸殘基可透過，例如：該側鏈之ε胺基連接一或 多個其他連接子。 -24- 201109033 連接子/間隔子序列之可能實例包括SGGTSGSTSGTGST ( SEQ ID NO : 7) 、AGSSTGSSTGPGSTT ( SEQ ID NO ： 8 )或 GGSGGAP ( SEQ ID NO: 9)和 GGGKGGGG ( SEQ ID NO : 1 0 )。這些序列被用於將經設計之捲曲螺旋體與其 他蛋白質結構區結合（Muller，Κ·Μ·，Arndt，Κ.Μ· and Alber，T·，M et h. Enzymology, 2 0 0 0, 328 : 26 1 -2 8 1 )。 較佳地，該連接子包含胺基酸序列GGGVEGGG ( SEQ ID Ν Ο : 1 1 )或係由其組成。 該連接子區的作用係提供介於自Αβ ( 1-42 )之C端區 衍生的肽與白蛋白之間的空間。因此，可確保該自Αβ( 1-42 )之C端區衍生之肽的二級結構不受白蛋白之存在影響 ，反之亦然。該間隔子宜具有肽的性質。較佳地，該連接 子肽包含至少2個胺基酸、至少3個胺基酸、至少5個胺基 酸、至少1 〇個胺基酸、至少1 5個胺基酸、至少20個胺基酸 、至少30個胺基酸、至少40個胺基酸、至少50個胺基酸、 至少60個胺基酸、至少70個胺基酸、至少80個胺基酸、至 少90個胺基酸或約1〇〇個胺基酸。 此外，該連接子可藉共價鍵與鄰接自Αβ ( 1-42 )之C 端區衍生之肽及白蛋白的成分鍵結，且較佳地，該間隔子 本質上爲非致免疫性及/或不包含任何半胱胺酸殘基。在 類似的方式中，該間隔子之三維結構宜爲線性或實質上線 性。 該連接子可包含四聯蛋白之殘基5 3 -5 6 (形成四聯蛋 白中之β板）和殘基57-59 (形成四聯蛋白中之轉折）（ -25- 201109033

Nielsen, B.B. et al., FEBS Lett. 412 ： 3 8 8-3 96, 1 997 )。 節段之序列爲GTKVHMK (SEQIDNO:12)。當此連接 子存在於天然四聯蛋白中時，其具有可將三聚體化結構區 與CRD結構區結合之優點，因此其適合用於將三聚體化結 構區連接另一個一般之結構區。此外，所產生之構造物預 計不會比無連接子之構造物更具致免疫性。 或者，可選擇來自人纖維黏連蛋白之聯絡索（ connecting strand) 3的子序列作爲連接子（對應於胺基酸 1992-2102) ( SWISSPROT 數據庫編號，登記 P02751)。 宜使用對應於胺基酸編號2037-2049之子序列 PGTSGQQPSVGQQ ( SEQ ID NO: 13)，而在該子序列內 的片段〇丁3〇(5(3£(5 1〇>1〇:14)(對應於胺基酸2038-2042 )爲更佳者。此構造物的優點爲其並非很容易水解分 裂且並不容易致免疫，因爲纖維黏連蛋白在血漿中所存在 之濃度非常高。 另外，合適之肽連接子可以小鼠IgG3之上鉸鏈區的10 個胺基酸殘基序列爲基礎。此肽（PKPSTPPGSS，SEQ ID NO: 15)已被用來製造藉由捲曲螺旋體二聚體化的抗體 (Pack P. and Pluckthun, A., 1 992，Biochemistry 31 ： 1 5 79- 1 5 84 )且可作爲根據本發明之間隔子肽。人IgG 3之 上鉸鏈區的對應序列甚至更佳。人IgG3序列預期在人體中 將無致免疫性。於一較佳之體系中，該連接子肽係選自具 序列APAETKAEPMT ( SEQ ID NO ： 16)之肽或具序列 GAP的肽。 -26- 201109033 於一特殊體系中，該連接子區不包括下列群體：-N(CH2-)2 ' -NHCH< 或-NHCH(CH2-)2。

於一特殊體系中，本發明之共軛物不具有下列結構： CO- Lb-NH-P-CO-Y X-La — R<

CO- Lb-NH-P-CO-Y 其中 R代表- N(CH2-) 2，-1^^(：11<或-1^11(：11(<：112-) 2’ X代表氫或肽基，且 LA爲可選擇地存在且爲胺基酸或含有至少2個胺 殘基之肽， LB爲可選擇地存在且爲胺基酸或含有至少2個胺 殘基之肽1 P爲選自全長之澱粉樣蛋白或與澱粉樣蛋白實質上相 似的蛋白質或其片段的肽， Y爲 OH或 NH2， 及其藥學上可接受的鹽類。 自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽與白蛋白之共軛物 一旦可取得足量之自Αβ ( 1 -42 )之C端區衍生之肽和 白蛋白，可經由將此二種成分在適合形成此二者間之共價 複合物的條件下接觸以形成本發明之共軛物。 不論該致免疫肽及該白蛋白是否藉由連接基直接連接 ’本發明設想該肽係透過其Ν端連接（C端呈現）或透過 其C端連接（Ν端呈現）白蛋白分子的這二種可能性。於 一較佳之體系中，該致免疫肽在白蛋白分子中係C端呈現 -27- 201109033 。此處所使用之“ c端呈現”一詞係指透過其N端區與載體 蛋白（白蛋白）連接，使C端仍保持可被免疫系統辨認之 肽類。 當該肽和白蛋白分子係經由連接子連接時，此通常係 經由使用可與肽之N端的游離α -胺基及白蛋白分子中之— 級胺基（無論是來自賴胺酸基團或Ν端之游離α -胺基）反 應的雙同官能團試劑來達成。適合用於連接該致免疫肽之 —級胺基和白蛋白的雙同官能團試劑包括，但不限於：二 醛類，諸如戊二醛、乙二醛、丁二醛、乙基丁二醛、2·甲 基戊二醛、3 -甲基戊二醛、己二醛，等。 白蛋白在溶液中與自Αβ( 1-42)之C端區衍生之肽接 觸’該溶液所包含之肽對白蛋白的最終莫耳比爲約〇. 1 : 至約1 0,000 : 1。於一些體系中’該最終莫耳比爲約75〇〇 :1、5000: 1' 約 2500: 1、約 1000:】、約 75〇: !、約 5 00 : 1、約 250 : 1、約 100 : i、約 75 : i、約 5〇 : i、約 25 :1、約 10: 1、約 7·5: 1、約 5: 1' 約 2.5: 1 或約 1: 1。 於一些體系中，該最終莫耳比爲約〇·1: 1至1: 1。於一些 體系中’該最終莫耳比爲約〇.1 : 1、〇.2 : 1、〇 3 : 1、〇 4 :1 、 〇·5 : 1 、 〇·6 : 1 ' 0.7 : 1 、 0.8 : 1 、 0.9 : 1 。 該共轭物之第一和第二成分的偶合係藉由與自Αβ ( ^ 42 )之C端結構區衍生之肽的任何部位偶合的反應發生。 該反應基係根據其與白蛋白形成穩定之共價鍵（例如：經 由與白蛋白上之一個或多個胺基、羥基或锍基反應）的能 力選擇。較佳地，反應基僅與白蛋白上之—個胺基、羥基 -28- 201109033 或锍基反應。因此，該反應基可連接被熟習本技藝之人士 認爲適合之狀或連接基之任何部位。於某些體系中，該反 應基係連接該肽或衍生物之骨幹。於某些體系中，該反應 基係連接該肽或衍生物之N端，如：N端胺。於某些體系 中，該反應基係連接該肽或衍生物之C端，如：C端羧基 。於某些體系中，該反應基係連接該肽或衍生物之側鏈， 如：該肽或衍生物之側鏈羥基、锍基、胺基或羧基。於特 定體系中，該反應基係連接該肽或衍生物之賴胺酸側鏈的 ε胺基。於特定體系中，該反應基係連接該肽之N端或C端 內所找到的半胱胺酸殘基。 爲了與蛋白質上之官能基形成共價鍵，個人可使用各 種各樣之活性羧基（特別是酯類）作爲化學反應基。羧基 通常轉化爲反應性中間體（諸如很容易受到蛋白質上之胺 、硫醇和羥基官能攻擊之Ν-羥基琥珀醯亞胺（NHS )或馬 來醯亞胺）。將NHS和馬來醯亞胺反應基引至肽上可經由 使用雙官能連接試劑執行，這些雙官能連接試劑係諸如馬 來醯亞胺-苯甲醯-琥珀醯亞胺（MBS ) 、γ-馬來醯亞胺基- 丁醯氧基琥珀醯亞胺酯（GMBS )、二硫代雙-Ν-琥珀醯亞 胺丙酸酯（DTSP ) 、Ν-琥珀醯亞胺基3- ( 2-吡啶二硫基） (SPDP )、琥珀醯亞胺基反-4·(馬來醯亞胺基甲基）-環 己烷-1-羧酸酯（SMCC )、琥珀醯亞胺基1乙醯硫代醋酸 酯（SATA)、二苯甲酮4 -馬來醯亞胺、λ'- ( (2-吡啶二 硫基）乙基）-4-疊氮基水楊醯胺（PEAS; ΑΕΤ)。這類 雙官能連接劑可根據所選擇之保護基活化肽上之羧基或胺 -29- 201109033 基。 或者，可透過使用偶合劑（諸如N，N，二環己基碳二亞 胺（DCC)、鹽酸1-乙基- 3-(3-二甲基胺丙基）碳二亞胺 (EDAC )、等）來活化衍生物（如：馬來醯亞胺丙酸、 [2-[2·[2 -馬來醯亞胺基丙醯胺基（乙氧基）乙氧基]醋酸 )’並接著與肽上之胺反應來將馬來醯亞胺加至肽上。亦 可使用類似之作用劑（如DC C和EDAC )將衍生物（如： 馬來醯亞胺基烷基胺）加至肽上之羧基部分。 一級胺爲NHS酯類之主要目標。存在於蛋白質之N端 上之可接近的ε-胺基與NHS酯反應。然而，在蛋白質上之 ε-胺基可能不適合或無法進行NHS偶合。雖然5個胺基酸 之側鏈中有氮，但只有賴胺酸之ε-胺明顯地與NHS酯反應 。當NHS酯共軛反應物與一級胺反應釋出Ν-羥基琥珀醯亞 胺時，可形成醯胺鍵。這些含有琥珀醯亞胺基之反應基在 此稱爲琥珀醯亞胺基。 於特殊體系中，該白蛋白上之官能基爲位於胺基酸殘 基34 ( Cys34 )上之單一游離锍基，而該化學反應基爲含 馬來醯亞胺基之基團，諸如MP A。MP A代表馬來醯亞胺丙 酸或馬來醯亞胺丙酸酯。這類含馬來醯亞胺基之基團在此 稱爲馬來醯亞胺基。 於一些體系中，藉由此處所描述之過程形成的共軛物 包含共價連接在治療肽上之琥珀醯亞胺基或馬來醯亞胺基 的白蛋白。於一些體系中，白蛋白胺基、羥基或锍基係經 共價連接至該治療肽上之琥珀醯亞胺基或馬來醯亞胺基。 -30- 201109033 於一些體系中，白蛋白半胱胺酸34锍基係共價連接至該治 療肽之賴胺酸的ε胺基上之[2-[2-[2-馬來醯亞胺基丙醯胺 基（乙氧基）乙氧基]乙醯胺連接子。 於一特殊體系中，該反應基爲可選擇地透過連接基在 單一界定之胺基酸處連接該肽之單一 ΜΡ Α反應基且該MP A 係在白蛋白之單一胺基酸殘基（宜爲半胱胺酸34)處共價 鍵連接白蛋白。於較佳之體系中，該白蛋白爲重組之人白 蛋白。 於某些體系中，該反應基可連接適合連接這類反應基 之治療肽的任何殘基。該殘基可爲該肽之終端或內部殘基 。於某些體系中，該反應基可連接該肽之羧基端或胺基端 。於有利之體系中，該反應基係連接至該肽之單一部分。 這可以利用熟習本技藝之人士已知之保護基達成。於某些 體系中，該治療肽之衍生物可包含一倂入之殘基以供連接 該反應基。可用於連接之殘基包括，但不限於：半胱胺酸 、賴胺酸、天門冬胺酸和麩胺酸殘基。該殘基可經由游離 之α-胺基端被倂在該肽之內部或末端，例如：在N端胺基 酸殘基處。於某些體系中，該反應基係連接內部之賴胺酸 殘基。於某些體系中，該反應基係連接末端之賴胺酸殘基 。於某些體系中，該反應基係連接胺基端之賴胺酸殘基。 於某些體系中，該反應基係連接羧基端之賴胺酸殘基，例 如：在該治療肽之羧基端的賴胺酸殘基。 於其他體系中，根據所選擇之巯基活化計劃，透過優 先形成分子間二硫鍵的方法可將經活化之二硫鍵基團與治 -31 - 201109033 療肽之半胱胺酸或半胱胺酸類似物偶合。根據所選擇之以 活化基團將一個毓基活化，再與第二個游離锍基反應以選 擇性地形成蛋白質或肽類之間之不對稱的二硫鍵的方法已 有記述，以緩和由於形成對稱二硫鍵而減少產量的問題。 見 D. Lambdandreu et a 1, "Methods in Molecular Biology" (M . W . Pennington and B . M . Dunn, eds . ) . V ο 1. 35, p . 91 . Humana Press. Totowa. N. J., ( 1 9 9 4 )。較佳地，這 類活化基團爲那些以吡啶亞磺醯基爲基礎者（M. S. Bernatowicz el id., Int.J. Pept. Protein Res. 28 ： 107 ( 1 9 8 6 ))。較佳地，使用2，2 ’ -二硫代吡啶（D T D P )( Carlsson el al., D i up s i 1 ο n ch e m . J . 1 73 : 7 2 3 ( 1 9 7 8 ) ； L . H. Kondej ewski el a 1., Bio conjugate Chem. 5 : 602 ( 1994)或2.2、二硫代雙（5-硝基吡啶）（NPYS)(J. Org. Chem. 56: 6477(1991)或 N-琥珀醯亞胺基 3-(2-吡啶二硫基）（SPDP )。此外，5,5·-二硫代雙（2-硝基 苯甲酸）（埃爾曼氏（Ellman )試劑）或6W-二硫代菸鹼 酸可作爲活化基。 根據這些方法，先將二硫鍵活化基團與含有半胱胺酸 或半胱胺酸類似物之治療肽在過量活化基團的條件下反應 。這些條件非常有利於形成包含與經活化之二硫化物基團 偶合的治療肽之治療性化合物且實質上未產生與二硫化物 鍵結之肽同二聚體。在偶合反應後，將生成之肽化合物純 化（諸如藉由逆相-HPLC )。當該肽化合物係與白蛋白反 應時則發生與第二個游離锍基之反應以形成治療性化合物 -32- 201109033 與血清白蛋白之間的共軛物。 透過亞硫酸分解反應計劃將治療肽半晄胺酸或半胱胺 酸類似物轉化成具有S-磺酸酯。在此項計劃中，首先經由 合成或重組方法合成治療肽。然後，使用亞硫酸分解反應 將S-磺酸酯透過其半胱胺酸或半胱胺酸類似物锍基連接於 治療肽，在亞硫酸分解反應之後，將治療肽化合物純化（ 諸如藉由梯度管柱色層分析法）。然後，使用S-磺酸酯化 合物形成治療狀化合物與血液成分（宜爲血清白蛋白）間 之共軛物。 根據包含該治療肽之不同成分的性質，以反應基修改 治療肽以供與白蛋白共軛結合的方式將有很大的不同。該 合成程序將經過選擇以使其簡單，提供高產量，並可產生 高純度的產品。通常，化學反應小組將在肽合成作用之最 後階段產生，例如：以羧基酯化以形成活性酯。用於製造 經改質之促胰島素肽的特殊方法描述於美國專利案編號 6,3 29,3 3 6、6,8 49,7 1 4或 6,8 8 7,849 中。 本發明之共軛物的第一和第二成分的共軛結合可以不 同的方式進行。一種可能性爲將官能基在不會干擾該治療 性活性成分之活性的位置中與該成分直接共軛結合。如本 發明所理解，官能基與分子中負責該分子之特有化學反應 的一組特殊原子有關。該官能基之實例包括，但不限於羥 基、醛、烷基、烯基、炔基、醯胺、羧醯胺、一級、二級 、三級及季胺、胺氧基、疊氮化物、偶氮基（二酸亞胺） 、节基、碳酸化物、醋、醚、乙酸醯（glyoxylyl)、鹵院 -33- 201109033 基、鹵甲醯基、亞胺、亞醯胺、酮、馬來醯亞胺、異腈化 物、異氰酸化物、羰基、硝酸化物、亞硝酸化物、硝基、 亞硝基、過氧化物、苯基、膦、磷酸化物、膦酸基、吡啶 基、硫化物、磺醯基、亞硫醯基、硫酯、锍基和經氧化之 3,4-二羥苯丙胺酸（〇0?八）基團。 另一種可能性係藉由使用雙同官能基或雙異官能基結 合第一和第二成分。該雙官能基可先與自Αβ( 1-42)之C 端區衍生之肽共I®結合，再與白蛋白共鞭結合，或者，可 能先將該雙官能基與白蛋白共軛結合，再將其與自Α β ( 1 -42)之C端區衍生之肽共軛結合。這些類型之共軛物的說 明性實例包括稱爲酮肟（描述於US20050255042中）之共 軛物類，其中該共軛物之第一成分包含與存在於雙異官能 基中之酮基鍵結之胺氧基，而該酮基則與共軛物中之第二 成分中的胺基鍵結》 於其他體系中，用於共軛結合本發明共軛物之第一和 第二成分的作用劑可經光分解、化學、熱或酶處理。特別 値得注意的爲使用可經由細胞靶的中之酶水解的連接劑， 從而使該治療性活性化合物僅在細胞內釋出。可在細胞內 處理之連接劑類型的實例已說明於W004054622、 W006I 076 1 7、W Ο 0 7 0 4 6 8 9 3 和 W Ο 0 7 1 1 2 1 9 3 中。 本發明之共軛物的成分可經化學方式改質，其先決條 件爲該二種成分之二級結構和官能性保持不變。用於將多 肽鏈化學改質之方法爲熟習本技藝之人士所周知，其包括 以透過存在於半胱胺酸部分中之锍基共軛結合爲基礎的方 -34- 201109033 法 '以透過存在於賴胺酸部分中之一級胺基共軛結合爲基 礎的方法（US6809186)、以透過N-和C端部分共鈪結合 爲基礎的方法。適合用於修改多肽以令其可與其他化合物 偶合之試劑包括：戊二醛（其可令化合物與多肽之N端結 合）、碳二醯亞胺（其可令化合物與多肽之C端結合）、 琥珀醯亞胺酯類（例如MB S、S M C C )(其可活化ν端及半 胱胺酸部分）、聯苯胺（BDB)(其可活化酪胺酸部分） 、過碘酸化物（其可活化蛋白質中之糖基化的碳水化合物 部分）。 於特殊體系中，該自Αβ( 1-42)之C端區衍生之肽還 包含額外之Ν端Cys。 於另一體系中，包含血清蛋白之經改質的肽係經由在 玻管中（活體外）將該經改質之肽與血清蛋白共價連接， 從而使該肽之反應基的殘基與該血清蛋白形成共價鍵來製 備。於一體系中，該血清蛋白與個體爲自體同源。於一特 定體系中，該血清蛋白係自該個體分離出。於某些體系中 ，該自個體分離出之血清蛋白係在其與該經改質之肽共價 連接前自存在於血液中之其他蛋白質和/或血液細胞中純 化出。根據此體系，由此產生之共軛物係投予從其中分離 出血清蛋白之個體，或投予自體同源個體。於另一體系中 ，該血清蛋白爲重組之血清蛋白。通常，該血清蛋白爲重 組白蛋白；最典型地，該血清蛋白爲重組之人白蛋白。於 較佳之體系中，本發明之共軛物係經由下述步驟形成：將 包含馬來醯亞胺基之經改質的肽與含锍基之血清蛋白（通 -35- 201109033 常爲白蛋白）在PH6.5至7.4之條件下接觸以通常形成無法 在生理條件下分裂之穩定的硫醚鍵聯。於某些較佳之體系 中，該血清蛋白爲重組之人白蛋白或重組之牛白蛋白。 於一體系中，該該經改質之肽係在其C端醯胺化。於 另一體系中，該經改質之肽不在其C端醯胺化。本發明之 經改質之肽、共軛物或化合物亦可包含這類經醯胺化之肽 。於一體系中，該經改質之肽係在其N端醯化。於另一體 系中，該經改質之肽不在其N端醯化。本發明之經改質之 肽、共軛物或化合物亦可包含這類經醯化之肽。 藉由肽N端處之半胱胺酸殘基將致免疫肽與白蛋白偶 合可容許與白蛋白分子中所找到之半胱胺酸殘基一樣多之 肽分子與單一白蛋白分子偶合。例如：牛血清白蛋白（ BSA)包含35個半胱胺酸殘基，此35個半胱胺酸殘基可被 多達35個N端Cys-改質之肽佔據以取得具有至少1、2、3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、 23 、 24 、 25 、 26 、 27 、 28 、 29 、 30 、31、32、33、34或35個肽分子之共軛物。 或者，利用能與一級胺基反應之雙同官能團試劑將致 免疫肽與白蛋白偶合，該共軛物可包含與白蛋白分子中發 現之賴胺酸殘基一樣多之肽分子。例如：牛血清白蛋白（ B S A )包含5 8個賴胺酸殘基，此5 8個賴胺酸殘基可被多達 58個致免疫肽佔據以取得具有至少1、2、3、4、5、6、7 、8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、 15、 16、 17' 18、 19、 20 、21、 22、 23、 24、 25、 26、 27' 28' 29、 30、 31、 32、 -36- 201109033 33、 34、 35、 36、 37、 38、 39、 40、 41、 42、 43、 44、 45 、46 、 47 、 48 、 49 、 50 、 51 、 52 、 53 、 54 、 55 、 56 、 57或 5 8個肽分子之共軛物。 用於藥物中之本發明組成物 本發明之共軛物可在個體中誘導免疫反應，使特定對 抗Αβ ( 1-42 )之抗體的量增加並降低血清中之澱粉樣負載 。但是，如熟習本技藝之人士所知，免疫反應可利用佐劑 •增加，以增強該共軛物之抗原性。因此，於另一觀點中， 本發明提供用於藥物中之包含本發明之共軛物及佐劑的組 成物。 此處所使用之“佐劑”一詞係指能與本發明之共軛物組 合以在個體中增强、改善或調節免疫反應，且對個體無不 利影響的免疫調節物質。 佐劑透過數種機制（諸如招募淋巴樣細胞和誘導細胞 因子）發揮其免疫調節性能。細胞因子佐劑包括，但不限 於：粒細胞-巨噬細胞株落刺激因子、介白素-1 2、GM-C S F、合成之胞壁醯二肽類似物或單磷醯脂Α。其他佐劑 實例係選自完全弗氏（Freunds )佐劑、不完全弗氏佐劑 、QS21、氫氧化鋁凝膠、MF59、磷酸鈣、樂補欣（ liposyn)、皂素、角黨烯、L121 ' emulsigen單磷酷脂A ( MPL )、聚山梨醇酯80、霍亂毒素（CT) 、LTK及LTK63 。較佳地，該佐劑爲被核准投予人類之類的佐劑，諸如氫 氧化鋁凝膠、磷酸鈣和MF5 9。 -37- 201109033 於更特殊之體系中，該佐劑爲刺激Th2型免疫反應之 類型，諸如，例如氫氧化鋁凝膠和CT。經由誘導Th2型反 應有利於產製抗發炎細胞因子，諸如IL-4、IL-10和TGF-β ，以及產製1£〇1和IgG2b抗體類。用於引出明顯之Th2型反 應的較佳佐劑包括，例如：磷酸聚合物（Guy et al. 1 998, Vaccine 16: 850-856)和明礬（例如：氫氧化鋁、磷酸鋁 )° 本發明可使用任何一般作爲佐劑之“氫氧化物”或“磷 酸鹽”佐劑。該稱爲“氫氧化鋁”之佐劑通常爲氧化氫氧 化鋁鹽類，其通常至少部分爲結晶型。該稱爲“磷酸鋁”之 佐劑通常爲羥基磷酸鋁，往往還含有少量硫酸鹽（即，羥 基磷酸硫酸鋁）。其可藉由沈澱取得，而在沈澱期間之反 應條件和濃度影響取鹽中磷酸取代羥基之程度。 纖維形態（例如：在透射電子顯微照片中所見者）爲 氫氧化鋁佐劑之典型形態。氫氧化鋁佐劑之pi通常爲約1 1 ，即，佐劑本身在生理pH値下具有正表面電荷。據報導 ’氫氧化鋁佐劑在pH 7.4下，每毫克Al3 +之吸附量爲1.8至 2.6毫克蛋白。 磷酸鋁佐劑之P〇4/Al的莫耳比通常爲〇.3至1.2，較佳 爲0.8至1.2，更佳爲0.95±0.1。磷酸鋁一般爲非晶形，特 別是羥基磷酸鹽。典型之佐劑爲無定形羥基磷酸鋁，其 P04/A1的莫耳比爲0.84至0.92，包括0.6毫克Al3 + /毫升。 磷酸鋁一般爲粒狀（如：在透射電子顯微照片中所見之板 狀形態）。吸附任何抗原後，典型之粒子直徑範圍係在 -38- 201109033 0.5-20微米（如：約5“ 0微米）。據報導，磷酸鋁佐劑在 PH 7.4下，每毫克Al3 +之吸附量爲0.7至1,5毫克蛋白。 磷酸鋁之零電荷點（PZC )與磷酸取代羥基之程度爲 負相關’且此取代度可根據藉由沈澱法製備該鹽時使用之 反應物的反應條件和濃度而有不同。P Z C値亦經由改變溶 液中之游離磷酸根離子（較多之磷酸鹽=較酸之P Z C )的 濃度或經由添加緩衝劑（諸如組胺酸緩衝劑（使PZC較鹼 ))而改變。根據本發明所使用之磷酸鋁之PZC通常爲4.0 至7 . 〇，較佳爲5.0至6 · 5 (例如：約5 · 7 )。用於製備本發 明之組成物的鋁鹽懸浮液可包含緩衝劑（如：磷酸鹽或組 胺酸或T r i s緩衝液），但這並不總是必要的。該懸浮液宜 爲無菌且無熱原。懸浮液可包含游離之水性磷酸根離子， 如：存在濃度爲 1.0至20mM，較佳爲5至15 mM，更佳爲 約1 0 mM。該懸浮液亦可包含氯化鈉。 本發明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁二者之混合物。在此 情況中，磷酸鋁可能較氫氧化鋁多，例如：重量比至少爲 2: 1，如：> 5: 1、> 6: 1、>7: 1、>8: 1、>9: 1，等 〇 用於投予患者之組成物中的Al4 +濃度宜少於1〇毫克/毫 升，如：<5毫克/毫升、<4毫克/毫升、<3毫克/毫升、<2 毫克/毫升、<1毫克/毫升，等。較佳之範圍爲0.3至1毫克/ 毫升。較佳地，最高爲0.8 5毫克/劑量。 另一方面，該佐劑爲刺激Thl型免疫反應之類型。此 處所使用之第1型佐劑或Th 1佐劑一詞係欲定義刺激Th 1 ( -39 - 201109033 第1型）反應（或偏向或傾向第1型反應且7112(第2型）反 應相對較弱之反應）的佐劑。Th 1免疫反應（特徵爲產生γ 干擾素（IFN-γ )且與對抗病毒和胞內細菌之保護性免疫 相關）可爲所需的，因此，於另一特殊體系中’該佐劑爲 刺激Thl型免疫反應之類型。用於引出顯著之Thl型反應 的較佳佐劑可選自如下群體：完全弗氏佐劑、單磷醯脂A 、3-去- Ο-醯化單磷醯脂A ( 3D-MPL)、鋁鹽、含CpG寡 核苷酸、免疫刺激DNA序列、官素、Montanide ISA 720 ( 賽比克（Seppic)·，法國）、SAF' ISCOMS ( CSL )、 MF-59 ( Chiron) 、SBAS-3、SB。其他較佳之 Thl佐劑包 括SAF ( Chiron公司，美國，加州）、SB AS之佐劑系列（ 如：SBAS-2 或 SBAS-4，可從 SmithKline Beecham，比利 時Rixensart取得）、Detox ( Corixa，蒙大拿州漢密爾頓 )、RC-529 ( Corixa，蒙大拿州漢密爾頓）和其他胺烷基 胺基葡糖苷 4-磷酸鹽（AGPs )，諸如那些描述於美國專 利案編號6113918和6355257中者（其全部內容納爲此文之 參考資料）。 本發明亦設想刺激Th 1和Th2型二者之佐劑的組合。 於較佳之體系中，該刺激Thl和Th2型之佐劑爲皂素。皂 素爲在多種植物物種之樹皮、葉、莖、根，甚至花中發現 的固醇糖苷類和三萜糖苷類之異源群體。來自皂皮樹科（ Quillaia saponaria)莫利納皂樹（Molina)之樹皮的官素 已被廣泛硏究作爲佐劑。皂素亦可從棕菝契（Smilax ornata)(墨西哥薇葜（sarsaprilla))、滿天星（ -40- 201109033

Gypsophilla paniculata )(新娘面紗）以及巷巴戟（ Saponaria officinalis)(肥皂根）之商品取得。皂素佐劑 調製劑包括純化之調製劑（諸如QS2 1 )，以及脂質調製 劑（諸ISCOMs )。皂素組成物已利用HPLC及RP-HPLC純 化。利用這些技術特異純化之餾分已鑑定出，包括QS 7、 QS 17、QS 18、QS21、QH-A、QH-B 及 QH-C。較佳地， 該皂素爲QS21。皂素調製劑亦可包含固醇，諸如膽固醇 。皂素和膽固醇之組合可用於形成稱爲免疫刺激複合物（ ISCOMs )之獨特粒子。ISCOMs通常還包括磷脂（諸如磷 脂醯乙醇胺或磷脂醯膽鹼）。任何已知之皂素均可用於 ISCOMs中。較佳地，該ISCOM包括一或多種QuilA、QHA 及QHC。ISCOMs進一步描述於參考資料45 -47中。可選擇 地，該ISCOMs可缺少額外的清潔劑。以皂素爲底質之佐 劑的發展回顧可在 Barr et al. ( Advanced Drug Delivery Reviews, 1 99 8，3 2 . 247 -2 7 1 )及 Sjolanderet et al_ (

Advanced Drug Delivery Reviews, 1 99 8，3 2 : 3 2 1 -3 3 8 )中 找到。 與未經共軛之肽相較下，根據本發明之共軛物可具有 改善之藥物動力學性質。該肽之藥物動力學性質包括，例 如：其吸收和排泄率、其組織分佈略圖、其代謝率及其毒 性。通常’與未經共轭之肽類相較下，本發明之共轭物在 體內的排泄率下降及/或循環半衰期增加。 用於本發明之較佳共軛物類包括： -41 - 201109033 肽 載體 佐劑 NH2-MVGGVVIA-COOH (Αβ35-42) 白蛋白 Rehydragel ΗΡΑ NH2-GLMVGGVVIA-COOH (Αβ33-42) 白蛋白 Rehydragel ΗΡΑ NH2-MVGGVVIA-COOH (Αβ35-42) 白蛋白 Abisco NHz-GLMVGGWIA-COOH (Αβ33-42) 白蛋白 Abisco NH2-CMVGGVVIA-COOH (Ap35-42Cys) 白蛋白 Rehydragel ΗΡΑ NH2-CGLMVGGVVIA-COOH ( Ap33-42Cys ) 白蛋白 Rehydragel ΗΡΑ NH2-CMVGGVVIA-COOH (Ap35-42Cys) 白蛋白 Abisco NH2-CGLMVGGVVIA-COOH ( Ap33-42Cys) 白蛋白 Abisco NH2-CGLMVGGW-COOH (Ap33-40Cys) 白蛋白 Rehydragel HPA NH2-CGLMVGGVV-COOH (Ap33-40Cys) 白蛋白 Abisco 本發明之治療方法 如在記述開端已提到者，本發明之組成物已被證明可 用於治療與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病。因此’於另一觀 點中，本發明關於包含自Αβ( 1-42)之C端區衍生之肽及 白蛋白之共軛物或關於用於治療與澱粉樣蛋白沈積相關之 疾病的包含自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽和白蛋白’以 及佐劑之組成物。 於另一觀點中，本發明關於包含自ΑΡ (丨-42 )之C端 區衍生之肽和白蛋白之共軛物或關於用於製造用於治療與 澱粉樣蛋白沈積相關之疾病的藥品之包含自Αβ ( 1 _42 )之 C端區衍生之肽和白蛋白，以及佐劑的組成物。 於另一觀點中，本發明關於用於治療與澱粉樣蛋白沈 積相關之疾病的方法，其包含投予有此需要之個體包含自 Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽和白蛋白之共軛物或包含自 Αβ ( 1-42 )之C端區衍生之肽和白蛋白，以及佐劑之組成 -42 - 201109033 物。 此處所使用之“治療（treat、treatment及 treating) ’， 係指投服治療上有效量之本發明組成物或含彼之藥學製劑 而改善一或多種與疾病相關之症狀。因此，此處所使用之 “治療”涵蓋哺乳動物（尤其是人）之任何疾病、失調或病 況的治療，包括：（a )預防容易罹患但未被診斷出已罹 患某疾病或病況之個人發生該疾病或病況；（b )抑制疾 病或病況，即，遏制其發展；或（c )減輕疾病或病況， 即，使疾病或病'況復原或改善該疾病或病況之一或多種症 狀。藉由此方法治療之個體族群包括爲不良病況或疾病所 苦之個體，以及處於發展出該病況或疾病之風險中的個體 。因此，熟習本技藝之人士意識到一種治療可能改善患者 的病況，但未必是完全治癒該疾病。如此處所使用之“失 調”和“疾病”一詞可交替使用以指稱個體中損害身體機能 且可能致命的異常或病理狀況。 此處所使用之“治療上有效量”之詞組係指足以防止（ 宜爲至少降低約2 5 %，較佳爲至少5 0 %，最佳爲至少9 0 % )病理特徵之臨床上有意義之改變的量。在本發明方面， 此一詞亦可指足以改善或逆轉與澱粉樣蛋白沈積相關之疾 病（諸如阿茲海默氏症）有關的一或多種症狀之量。特定 言之，治療之“治療上有效量”可能導致至少一種下列症狀 改善、減輕或消除：記憶障礙、持續不退的悲傷或焦慮、 感情空虛、無望、悲觀、內疚、無用、無助、失去對曾享 受之嗜好和活動的興趣或樂趣、活力降低、或疲勞、難以 -43- 201109033 專注、記憶、或作決定、失眠、清晨醒來或睡過頭、食慾 和/或體重下降或暴食和體重增加、死亡或自殺之想法和 自殺企圖、煩躁、易怒和對治療不反應之持續存在的身體 症狀（諸如頭痛、消化功能失調和慢性疼痛）。當施用個 別之活性成分時（單獨投藥），此詞係僅指該成分。當施 用一種組合物時（無論是組合、依序或同時投予），此詞 係指產生治療效果之活性成分的合倂量。 “個體”一詞係指動物，較佳爲哺乳動物，包括非靈長 類動物（如：牛、豬、馬、貓、狗、大鼠或小鼠）和靈長 類動物（如：猴子或人）。於較佳之體系中，該個體爲狗 。於更佳之體系中，該個體爲靈長類動物，再於更佳之體 系中，該靈長類動物爲人。 在本發明的背景下，“與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病” 包括可被侷限於一種器官（即“局部化之澱粉樣變性”）或 擴散至數種器官（稱爲“系統性澱粉樣變性”）之與澱粉樣 蛋白累積相關之疾病。可藉本發明之組成物治療之與澱粉 樣蛋白沈積相關的疾病包括，但不限於表1中所示之疾病 -44 - 201109033 疾病_ 阿茲海默氏症 包涵體肌炎（IBM)， 第2型糖尿病 帕金森氏症 傳染性海綿狀腦病（狂牛病） 杭丁頓氏（Huntington's)症 甲狀腺髓樣癌 心律不整 動脈粥樣硬化 類風濕姓關節炎 主動脈內側殿粉樣 泌乳素瘤 家族性澱粉樣多發性神經病 遺傳性非神經病性系統性殿粉樣變性 透析相關性澱粉樣變性 芬蘭澱粉樣變性 格子狀角膜營養不良 腦澱粉樣血管病變 腦澱粉樣血管病變（冰島型） 系統性AL#粉樣變性 特色蛋白_ β類澱粉 β類澱粉 ΙΑΡΡ (胰澱素（Amylin)) α-共核蛋白 普里昂蛋白（Prion) 杭丁頓蛋白（Huntingtin) 降鈣素 心房排泄利鈉因子(Atrial natriuretic factor) 載脂蛋白AI 血清類澱粉A Medin 泌乳素 轉甲狀腺素蛋白（Transthyretin ) 溶菌酶 β2-微球蛋白 凝溶膠蛋白（Gelsolin) 角膜上皮蛋白（Keratoepithelin ) β類澱粉 半胱胺酸蛋白酶抑製素（Cystatin )

免疫球蛋白輕鏈AL 繼發性澱粉樣變性可能與慢性感染（諸如肺結核）或 慢性炎症（諸如類風濕性關節炎）有關，其包括常見形式 之繼發性澱粉樣變性（其亦出現在家族性地中海熱（FMF )和長期血液透析患者中之另一型系統性澱粉樣變性中） 。侷限型澱粉樣變性包括，但不限於第Π型糖尿病及其任 何相關疾病、神經退化性疾病（諸如癢病）、牛海綿狀腦 炎、賈庫氏症、阿茲海默氏症、腦澱粉樣血管病及與普里 昂蛋白相關之疾病。該澱粉樣疾病之標誌爲沈積在器官中 -45- 201109033 之澱粉樣斑塊（以纖維爲主，其亦可由獨特之纖維蛋白或 肽類所組成）。 因此，於一特殊之體系中，與澱粉樣蛋白沈積相關之 疾病係選自阿茲海默氏症、賈庫氏症、腦澱粉樣血管病或 與普里昂蛋白相關之疾病和肌肉退化。 如熟習本技藝之人士所理解者，當該套組之組成物係 用於治療與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病時，所有與本發明 之組成物或套組於藥物中之用途有關的特殊體系亦適用。 因此，與使用本發明之共軛物或組成物的治療方法相關之 特殊體系爲： •該自Αβ(1-42)之C端區衍生之肽係選自Αβ (35-42 )(SEQ ID NO : 2) 、Αβ ( 3 3 -42 ) ( SEQ ID NO : 3)、 Αβ ( 3 3 -40 ) ( SEQ ID NO : 4 )； •該自Αβ( 1-42)之C端區衍生之肽進一步包含額外 之N端Cys ; •該白蛋白爲牛血清白蛋白； •該佐劑宜爲Thl或Th2型佐劑，且 •本發明之組成物或來自本發明之套組的活性成分係 每二週投服一次。 這些特殊體系之詳細說明可在先前段落中找到。 於另一較佳體系中，與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病係 選自阿茲海默氏症、賈庫氏症、腦澱粉樣血管病或與普里 昂蛋白相關之疾病。 本發明之共軛物或本發明之組成物可藉由不同方法投 -46 - 201109033 服’例如：經由靜脈內、腹膜內、皮下、肌肉內、局部、 皮內、口服、鼻內或氣管內途徑投服，以及經由局部、系 統性投服或直接投至靶的部位（局部方式）。投服活性成 分之不同方法、欲使用之賦形劑的檢視和製造彼等之過程 的檢視可在 Tratado de Farmacia GalSnica，C. Fauli i Trillo， Luzan 5， S. A. de Ediciones, 1 993 and in Remington's Pharmaceutical Sciences ( A.R. Gennaro, Ed. )，20th edition, Williams & Wilkins PA, USA ( 2000 )中 找到。 本發明中’“局部方式”據理解爲將本發明之共軛物局 部投至人或動物身體之特定處》較佳地，投服至有快速血 流之部位’例如：靜脈、周圍或中心血管。其他路徑可能 在投藥與緩釋技術或保護性母質結合時使用。此外，經由 鼻腔投服之黏膜免疫化爲一種合適的方法，因爲已知這類 投藥途徑將有利於Th2型反應。 該給藥攝生法將由醫生和臨床因素決定。如醫學中眾 所周知，劑量係取決於許多因素，包括患者之生理特徵（ 年齡、尺寸、性別）、所使用之投服方法、疾病之嚴重性 、所使用之特定化合物及個別之藥物動力學性質。 於一特殊體系中，本發明之組成物或來自本發明套組 的活性成分係每二週投服一次。 本發明之組成物或來自本發明套組的活性成分已被證 明可用於藥物中。 在醫學上之使用方面，本發明之組成物可爲先驅藥物 -47- 201109033 、鹽、溶劑化物或包合物之形式，無論是經分離之形式或 與其他活性成分合倂。根據本發明之組成物可與藥學上可 接受之賦形劑一起配製。用於本發明中之較佳賦形劑包括 糖、澱粉、纖維素、膠和蛋白質。 由於熟習本技藝之人士可理解，本發明之組成物可藉 由本技藝中已知之習知方法配製成固體（例如：錠劑、膠 囊、糖衣片、顆粒、栓劑、結晶型或可重構成以提供液體 形式之無定形之無菌固體，等）、液體（例如：溶液、懸 浮液、乳劑、酏劑、塗劑、軟膏，等）^或半固體（凝膠 、油膏、乳膏，等）製藥劑型。藥學上可接受之載體的實 例已爲本技藝所知且包括磷酸鹽緩衝之生理食鹽水溶液、 水、乳劑（諸如油/水乳劑）、不同類型之潤濕劑，無菌 溶液，等。 下列方法和實例將被解釋爲說明性的，而非限制本發 明的範圍。 【實施方式】 以P-澱粉樣蛋白之c端序列將狗免疫化是是安全的且 耗盡來自血液之蛋白質 實例1 :以Αβ ( x-42)肽類免疫化 L材料及方法 1.動物的特徵 本發明中使用十二歲大之任一性別的比格犬。動物之 特徵摘要於表1中。其係自商業來源取得，並一直住在聖 -48- 201109033 地亞哥大學之飼養狗窩。實驗期間，動物被安置在三個集 體狗窩中，可自由進出室內/室外並提供隨意食用之經配 製的狗食和水。就在實驗開始前先徹底確認這些動物（包 括身體和神經學檢查、血液生化値和血象），並宣告健康 〇 由對最終分配給各小組之治療完全無知之臨床獸醫將 這些動物分配在四個組（A、B、C和D ; 11 = 3 )中。每週探 察動物們出現之對疫苗的臨床反應徵兆。在第3次免疫接 種後再進行另一完整之辨識（亦包括血液生化學和血象） 〇 根據歐洲和西班牙對動物處理之法規（86/609/EU， Real Decreto 1 20 1 /2005 )治療動物並盡力將動物的痛苦 減至最少。這項硏究係由聖地亞哥大學之倫理委員會核准 2.免疫原之製備方法 使用倂入4種不同疫苗調製劑中之合成Αβ ( 3 5 -42 )肽 (當經由SPDP共軛結合時帶有額外之Ν端Cys)作爲抗原 (0.4毫克/注射）爲動物進行免疫接種。這些調製劑各自 與蛋白質載體（藍載體（BC;皮爾斯（Pierce )，伊利諾 州羅克福德；A和B組）或牛血清白蛋白（B S A ;西格瑪（ Sigma)，西班牙馬德里；C和D組））；和佐劑（無論是 rehydragel HPA ( RH ; Quimibios (製造商是 Reheis)，西 班牙巴塞隆那；A和C組）或阿比斯科-3 00 ( AB ; -49- 201109033

Isconova AB，烏普薩拉科技園，SE-751 83，瑞典烏普薩 拉；B和D組））合倂。 2.1.使用SPDP將合成肽與BSA偶合： 首先，製備20mMSPDP(N-琥珀醯亞胺基 3- (2-吡 啶二硫基）丙酸酯：50毫克/8毫升DMSO )之貯存溶液。 接著，將5毫克之BSA溶解於1毫升之PBS/5mM EDTA，pH 8中，並將50微升之20 mM SPDP溶液加入BSA中。將此溶 液在室溫下培育2小時。然後，以PBS/EDTA平衡脫鹽柱並 將緩衝液與SPDP-改質之BS A交換，以去除反應副產品及 過量之未反應的SPDP試劑。 接著，利用下列議定計劃測定SPDP修改水準： a)以PBS將100微升之經SPDP改質和脫鹽的BSA稀釋 成1毫升》 b )測量並記錄與PBS/EDTA空白管相比較下，該蛋白 質樣本在343 rim處的吸光度（以一式三份進行測試）。 c)將10微升之15毫克/毫升DTT加入1毫升之經SPDP 改質的蛋白質樣品中，混合之。 d )在精確之1 5分鐘後’測量並記錄該經還原之樣本 在343 nm處的吸光度。 e )使用下列公式： (DTT後之平均A343)-(DTT前之平均A343) 8080

MW BSA

X 毫克 毫升

=X 之 若X係在5至6’5之間’將2毫克之合成肽加入5毫克之 -50- 201109033 經SPDP改質的BSA中。 測定SPDP改質之水準後，將反應混合物培育並攪拌 18-24小時過夜，將反應混合物冷凍乾燥。 2.2.利用戊二醛將合成之狀與藍載體偶合： 將2毫升硼酸鹽緩衝液（pH 10)和66微升（ 200毫克/ 毫升）之藍載體添加至反應小玻璃瓶中並輕輕混合。接著 ，將12毫克之合成肽加入該反應瓶中。同時，經由加入硼 酸鹽緩衝液（pH 10)將戊二醛稀釋至0.3%。 接著，將1毫升新鮮製備之〇 . 3 %戊二醛溶液慢慢加入 反應小玻璃瓶中並一邊在室溫下攪拌，使其在室溫下，黑 暗中反應2小時（該溶液變成黃色）。爲了封閉未反應之 戊二醛，將2 5 0微升之甘胺酸1M添加到反應小玻璃瓶中並 輕輕混合，在室溫下再培育3 0分鐘。然後，將此反應混合 物轉移到以P B S平衡之脫鹽柱中。將反應混合物冷凍乾燥 並溶解成合適之濃度。 因此，本發明中所使用之四種不同之調製劑如下： A)與藍載體加2 00微升Rehydragel ΗΡΑ共軛結合之 400微克 Αβ ( 35-42) ° Β )與藍載體加2〇〇微升阿比斯科-3 00共軛結合之400 微克 Αβ( 35-42)。 C)與BSA加200微升RehydragelHPA共軛結合之400微 克 Αβ ( 3 5-42 )。 D )與B S Α加3 7微升阿比斯科-3 0 0共軛結合之4 0 0微克 -51 - 201109033 Αβ ( 3 5 -42 )。 所使用之合成肽爲： •當與帶有戊二醛之藍載體共軛結合時： 1. 在狗中（及小鼠；見下文）：Αβ (35-42) ( ΝΗ2- MVGG VVIA-COOH ) ( SEQ ID NO : 2) 2. 在兔子中（見下文）：Αβ( 3 3-42 ) ( ΝΗ2- GLMVGG VVIA-COOH ) ( SEQ ID N〇 ： 3) .當與帶有SPDP之BSA共軛結合時： 1·在狗中（及小鼠；見下文）：APcys-(35-42)( NH2-CMVGGVVIA-COOH) ( SEQ ID NO ： 17) 2. 在兔子中：Apcys- ( 33-42 ) ( NH2-CGLMVGGVVIA- COOH ) ( SEQ ID NO : 18)(見下文） 3. 免疫化議定計劃和採血 將動物（狗）分成4組並各分配該4種疫苗調製劑中之 任一種。以Αβ 3 5-42經背部皮下途徑爲動物免疫接種並監 測不良反應。該免疫化和取樣之計劃表示於第1 ( A )圖 中。簡言之，每二週爲動物注射一次，共7次。C和D組中 之狗在第7次注射後7個月接受額外之第8次免疫接種。 在第1次接種前（W0)和第3次（第5週：W5)、第5 次（W9 )及第7次（W13 )免疫接種後一週自頸靜脈收集 血液樣本入帶有EDTA及蛋白酶抑制劑（complete mini毫 克/10毫升，羅氏公司）的聚丙烯小瓶中（第1圖）。在第 7次免疫接種後4個月（W31 )及加強免疫接種後之第1和 -52- 201109033 第3週（分別爲W43和W45)自C和D組之動物取得額外之 血液樣本。 將樣品輕輕地混合並保存在4 °C最多2小時，再在 4000g離心10分鐘。然後，將血漿等分成數份並冷凍在-80 °C直到使用時。此外，在每次萃取中，自每一隻動物收集 〜1毫升血液入不含EDTA的聚丙烯小瓶中以取得血清。令 此樣本在室溫下凝結1小時，再在4000g離心10分鐘，然後 ，收集血清並保存在-8 0 °C直至進行血液生化學之測定。 在第1次免疫接種前1週及第13週，第7次免疫接種後 ，在全身麻醉及無菌條件下收集腦脊液（C S F )樣品（第 1圖）。將這些C S F樣本等分成數份並冷凍在-8 0 °C直到使 用時。 4.血漿及腦脊液中之抗Αβ抗體分析 在96槽聚丙烯盤中藉由直接ELIS A測定抗Αβ抗體。在 4°C下，以在1〇〇 mM的碳酸氫鈉和2Μ胍鹽酸鹽緩衝液（ pH 9.6)中之2.5微克/毫升人類Αβ( 1-42)肽（# 24224 An aSp ec，美國加州聖荷西）塗覆微量滴定盤之槽一整夜 。然後，以3 00微升之清洗緩衝液（0.5M Tris，1 ·5Μ氯化 鈉，0.5% Tween20; pH 8)清洗盤3次；以300微升之封閉 緩衝液（0.05 M Tris，0.2%Tween20，0.5%BS A ; pH 8 ) 在3 7 °C下封閉兩小時，再另外清洗3次。在3 7 °C下，將經 塗覆的96槽盤與100微升在載體緩衝液（0.05 M Tris， 0.5 Μ 氯化鈉，0.05%BSA，0.05%Tween20 ； pH 8)中之 -53- 201109033 狗血漿的3倍系列稀釋液（一排10槽，從第一槽中之1 : 30 血漿稀釋液開始）一起培育1小時。分析之最大血漿稀釋 倍數爲l/l〇x31()。各盤中之第11和第12行塡入不含血漿之 載劑緩衝液以作爲空白對照組。然後，清洗盤並在37 t下 與100微升在載劑緩衝液中之與辣根過氧化酶共軛之兔子 抗狗IgG抗體（Jackson InmunoResearch·英國薩福克）的 1: 1 000稀釋液一起培育1小時，清洗3次，並與在用於 ABTS之緩衝液（羅氏公司.西班牙巴塞羅那）中的 0.0375%ABTS (羅氏公司·西班牙巴塞羅那）一起培育。 在自動盤式儀（Synergy 4，Biotek.美國佛蒙特州威努斯 基）上於405 nm處讀取吸光度。 利用單株6E〗0抗體作爲相同ELIS A盤上之標準來計算 血漿抗Αβ抗體的濃度，並以微克/微升表示。經由吸光度 對各槽中之稀釋液的對數之非線性回歸測定各血漿樣本的 EC5 0 ( GraphPad Prism 3.02)。此外，血漿之終點力價係 定義爲其中之吸光度較空白槽之平均吸光度高3倍的最大 血漿稀釋倍數。 血漿中之游離Αβ肽的測定方法 以來自Araclon生物技術（西班牙，Zaragoza )之 ABtest-40和ABtest-42 ELISA試劑套組，依照製造商的指 示利用間接三明治ELIS A法測量狗血漿及腦脊液中之Αβ 1 -42及Αβί -40的含量。 -54 - 201109033 II ·結果 在整個實驗期間動物保持健康和活力。特別是，未檢 測到對疫苗之反應徵兆。從〇到第1 3週之平均體重增加爲 Ul.7公斤（表1)。在這段期間內只有二隻動物體重減輕 (各1公斤，其分別代表這二隻動物在〇週時之體重的4% 和 7 % )。 動物之特徴 組另IJ/狗 — 性別 年齡 (歲） 在W0時之 雷量（公斤） 在W13時之 重量（公斤） 增加之重量 (公斤） %重量變化 雌 11 16 18 2 12,50 雄 6 23 22 -1 -4,35 -^Λ3 雄 8 22 23,45 1,45 6,59 雌 10 13 13 0 0,00 〜B2 雄 6 21 23 2 9,52 〜B3 雄 12 24,45 26,7 2,25 9,20 雌 6 18 18 0 0,00 ^C2_ 雄 6 16 16 0 0,00 雄 10 24,5 29 4,5 18,37 ^Pl 雄 6 14 13 -1 -7,14 雄 6 15 15 0 0,00 雄 10 18,7 21,5 2,8 14,97 平均値 18,80 19,89 1,08 4,97 --- SD 4,10 5,22 1,68 8,03 1.抗-Αβ ( 1-42)抗體力價 Α和Β組 將A和B組內之動物的血漿吸光度對6 E 1 0標準進行內 201109033 插時未偵測到免疫前樣本和在W5、W9和W 1 3收集之樣品 間有一致差異（表2 A和第2 A圖）。經過3和7次（分別爲 W5和W1 3)之免疫接種後，血漿抗體力價（以相當於微克 /微升之6 E 1 0測量）中之增加係數非常低（A組分別爲 〇.8±0.2 和 0.8 ±0.2;B組分別爲 1.2 ±0.1 和和 1.3 ±0.3, 表3)。從第0週到第13週，A組和B組動物中之特異性抗 體（抗-Αβ42 )的血漿EC5〇値非常低。確實，在所有這些 狗中，W 0至W 5之期間血漿E C 5 〇値下降（狗B 2例外，其僅 在此時間點顯示出微不足道的增量）（表2B及第2A-C圖 )。此外，免疫接種後’即使是這些狗之最濃的血漿稀釋 液（1 : 3 0 )亦未測量到較免疫前血漿樣本中所測得者高 出3倍的吸光度（表2C)。因此’此二組中之狗均被視爲 對其對應之疫苗調製劑無反應（八和18) ° -56- 201109033 表2不同時間點時特異性抗-Αβ42抗體之血漿力價 Α組：同等於微克/微升之單株抗體6Ε10 組別/狗 W0 W5 W9 W 13 W31 W43 W45 A1 0,0028 0,0016 0,0015 0,0016 A2 0,0024 0,0023 0,0018 0,0023 A3 0,0027 0,0022 0,0028 0,0021 B1 0,0019 0,0023 0,0070 0,0033 B2 0,0025 0,0031 0,0022 0,0028 B3 0,0027 0,0028 0,0029 0,0032 C1 0,0016 0,0205 0,0147 0,0084 0,0008 0,0017 0,0019 C2 0,0010 0,0113 0,0083 0,0093 0,0007 0,0040 0,0041 C3 0,0022 0,0276 0,0214 0,0206 0,0021 0,0089 0,0102 D1 0,0025 0,1075 0,0933 0,1048 0,0076 0,0716 0,0520 D2 0,0017 0,0529 0,0406 0,0294 0,0028 0,0229 0,0164 D3 0,0019 0,0321 0,0138 0,0256 0,0024 0,0088 0,0071 B組：特異性抗體（抗-Αβ42)之血漿EC50値 組別/狗 W0 W5 W9 W 13 W31 W43 W45 Α1 49 42 35 29 Α2 170 85 158 133 A3 155 111 132 115 Β1 51 47 235 66 Β2 186 253 123 93 Β3 79 60 41 59 C1 45 773 722 385 68 46 49 C2 147 473 350 385 70 114 129 C3 123 1349 994 853 70 336 460 D1 51 6759 5738 6302 319 4202 2733 D2 53 2956 2021 1378 66 1122 790 D3 57 1550 752 1169 61 365 267 C組：吸光度較空白對照組所具者高3Χ之最大稀釋度之倒數 組別/狗 W0 W5 W9 W 13 W31 W43 W45 Α1 270 270 90 270 Α2 270 270 270 270 A3 270 270 270 270 Β1 270 270 810 810 Β2 270 810 270 270 Β3 270 270 270 270 C1 90 2430 2430 2430 270 270 270 C2 90 2430 2430 2430 90 810 810 C3 270 2430 2430 2430 810 2430 2430 D1 270 21870 21870 21870 2430 21870 7290 D2 270 7290 7290 7290 810 7290 2430 D3 270 7290 2430 7290 810 2430 810 -57- 201109033 表3相對於免疫前血漿之增加係數（相等於微克/微升之6E10) 組別/狗 W0AV0 W5/W0 W9/W0 W13AV0 W31AV0 W43/W0 W45/W0 A1 1,0 0,6 〇,5 0,6 A2 1,0 l,〇 0,8 1,0 A3 Ι,ο 0,8 1,0 0,8 平均値士SD 1，0±0,0 0,8士0,2 0,8±0,3 0,8士 0,2 B1 1,0 1,2 3,6 1,7 B2 1,0 1,2 0,9 u B3 ι,ο u u 1,2 平均値tSD 1，0±0,0 1，2±0，1 1，9±I，5 1,3±0,3 Cl l.o 12,5 8,9 5,1 0,5 1,0 1，1 C2 1,0 11,8 8,6 9,7 0,7 4,2 4,2 C3 1,0 12,6 9,7 9,4 1,0 4,1 4,6 平均値士SD 1,0±0,0 12,3±0,4 9,1 ±0,6 8,1 ±2,6 0,7±0,2 3，1±1，8 3,3±1，9 D1 1,0 42,8 37,2 41,7 3,0 28,5 20,7 D2 1,0 30,6 23,5 17,0 1,6 13,2 9,5 D3 1,0 17,1 7,4 13,7 1,3 4,7 3,8 平均値土SD 1，0±0,0 30,2±12,8 22,7±14,9 24,1±15,3 2,0±0,9 15,5±12，1 11，3±8,6 C和D組 相對於A和B組中所觀察到者，以疫苗調製劑C和D治 療之狗顯示出在血漿抗體力價上有實質性修改。此二組中 之所有狗的反應（如藉由6E10標準測量者），EC5Q値或終 點稀釋倍數均循相同的模式（雖然在組間和組內二者均觀 察到數量差異）（表2A-C )。一般模式的特點爲免疫接 種3次後抗體力價實質增加，但W5至W 1 3之抗體力價則維 持僅有輕微的修改（第2A-C圖）。因此，免疫接種3次後 -58- 201109033 ，抗體力價大幅提高，但接下去進行四次每二週之疫苗注 射後抗體力價並未大幅增加（甚至略有下降）。實際而言 ，免疫接種3和7次後（分別爲W5和W13 ) ，C組中力價（ 以相當於微克/微升之6E10測量）分別乘以係數12.3±0·4和 8.1±2.6 ; D組中之力價分別乘以30·2±12·8和24.1±15.3。 (表3 ) 最後一次免疫接種後4個月（W3 1 )力價已降到非常 低的水準（表2 )。然而D組中之狗的抗體力價仍高於免 疫前血漿中之抗體力價的1倍（表3 )。然後’ C和D組中 之狗接受額外之第八次免疫接種，此係在第7次免疫接種 後7個月，以相對應之疫苗調製劑進行。在此加强注射後 ，D組中之抗體力價大幅增加（相對於免疫前血漿中者係 增加1 5.5 ± 1 2 . 1倍，表3 )，C組中之增加程度較低（相對 於免疫前血漿中者係增加2」±1.8倍’表2 )(第2A_C圖） 。一般而言，在任何時間點，D組中之動物的抗體力價總 是較C組中之動物高。然而’ D組中反應較小之狗的力價 增量（案例D 2 )與C組中之狗的力價增量非常相似（表3 ，第2、3圖）。 -59- 1 Αβ肽力價 2 三明治E LI S Α法未偵測到未反應者組別之動物（Α和Β )中，免疫前血漿和在W5、W9和W 1 3收集之樣品間’ Αβ1-42或Αβ1-40的濃度有一致差異（表4A-B ’第3A_B圖 )。經過3和7次（分別爲W5和W12 )之免疫接種後’血發 201109033 Αβ 1-42濃度中之變化係數非常低（A組分別爲1.2 ±0.7和 1 · 0 ± 0.0 ; B 組分別爲 0 · 9 ± 0.0 和 1 . 0 ± 0 · 1，表 5 A )。類似地 ，免疫接種3和7次（分別爲W5和W13 )後，血漿Αβ1-40 濃度的變化係數非常低（此二週和此二組均爲〇·9 ±0.1。 表 5Β )。 表4Α以皮克/毫升計之肽Αβ1-42的濃度 組別/狗 W0 W5 W9 W 13 W31 W43 W45 CSFW0 CSFW 13 Α1 4,16 7,50 2,76 4,31 556,85 509,70 Α2 32,92 32,92 32,92 32,71 253,06 322,77 A3 19,98 20,07 20,24 19,62 421,88 300,12 Β1 47,00 46,40 47,00 47,00 299,86 420,84 Β2 20,33 20,33 21，83 22,01 283,94 367,18 Β3 33,33 33,33 32,82 32,71 314,82 228,06 C1 5,20 <3,125 <3,125 <3,125 4,70 <3,125 <3,125 718,84 532,56 C2 26,46 15,00 <3,125 <3,125 17,53 <3,125 <3,125 519,74 581,28 C3 16,35 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 671,03 649,07 D1 74,76 30,58 23,33 28,60 41,96 42,62 29,10 677,44 731,28 D2 17,56 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3，125 783,95 888,61 D3 16,85 15,51 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 488,97 762,05 表4Β以皮克/毫升計之肽Αβ1-40之濃度 組別/狗 W0 W5 W9 W 13 W31 W43 W45 CSFW0 CSFW 13 Α1 61,29 52,55 52,55 55,19 3633,96 3831,76 Α2 58,67 52,76 55,21 60,84 2269,62 2719,62 A3 60,26 64,88 63,00 54,64 2534,52 2822,02 Β1 104,31 38,70 39,86 <3,125 2890,55 3586,15 Β2 68,77 58,67 63,87 65,16 2371,54 2610,96 Β3 79,30 80,89 93,87 84,78 2449,42 2273,46 C1 27,47 <3,125 21,72 <3,125 24,44 <3,125 <3,125 3503,87 2711,61 C2 56,89 33,03 29,62 35,53 39,39 28,49 21,67 2632,58 3416,45 C3 41,67 <3,125 <3,125 <3,125 27,80 <3,125 <3,125 3121,29 2945,81 D1 106,94 59,06 48,69 46,14 70,71 46,78 55,07 3139,03 3206,77 D2 59,70 <3,125 <3,125 22,04 24,92 <3,125 25,55 3737,74 3426,45 D3 51,67 38,71 26,44 <3,125 33,26 <3,125 35,30 2955,16 3214,84 -60- 201109033 表5A相關於免疫前血漿，肽Αβ 1-42C 戸之增量係數 組別/狗 wo/wo W5AV0 W9/W0 W13AV0 W31/W0 W43/W0 W45/W0 Α1 1,0 1,8 0,7 1,0 Α2 1,0 ι,ο ι,ο 1,0 A3 1,0 1,0 ι,ο 1,0 平均値tSD 1，0 土 〇,〇 1，2±0,5 0,8 ± 0,2 1,0 ±0,0 B1 1,0 1,0 1,0 1,0 B2 1,0 1,0 1,1 u B3 1,0 1,0 1,0 1,0 平均値±SD 1,0 ±0,0 0,9±0.0 1，0 土 0.0 1，0±0.1 Cl 1,0 0,2 0,2 0,2 〇,9 0,2 0,2 C2 l,〇 0,6 〇,〇 0,0 〇,7 0,0 0,0 C3 1,0 〇,l 0,1 0,1 〇,l 〇,i 〇,i 平均値±SD 1,0 ±0,0 0,2 ± 0,3 0,0 ±0,1 0,0 士 0，1 0,5 ±0,1 0,0 士 0，1 0,0±0，1 D1 l,〇 0,4 0,3 0,4 0,6 0,6 0,4 D2 Ι,ο 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 〇,l D3 1,0 0,9 0,1 〇,i 0,1 0,1 0,1 平均値士SD 1,0 ±0,0 0,4 ± 0,4 0，I ±0’1 0,1 vO,2 0,2 ± 0,3 0,2 ± 0,3 0，1 士 0,2 表5B相關於免疫前血漿，肽Αβ l-4〇q 3之增量係數 組別/狗 wo/wo W5/W0 W9/W0 W13AV0 W31AV0 W43/W0 W45AV0 A1 1,0 0,9 0,9 0,9 A2 1,0 0,9 0,9 1,0 A3 1,0 1，1 1,0 0,9 平均修SD i,o ±0,0 0,9±0，1 0,9 ± 0,1 0,9 ±0,1 B1 l,〇 1,0 1,0 1,0 B2 l,〇 0,9 0,9 0,9 B3 1,0 1,0 1,2 U 平均値±SD i，o±o,o 0,9 ±0,1 1,0 v 0,1 0,9 v 0,1 Cl 1,0 0,0 0,8 0,0 0,9 0,0 0,0 C2 1,0 0,6 0,5 0,6 〇,7 0,5 0,4 C3 l,〇 0,0 0,0 0,0 0,7 0,0 0,0 平均修tSD i，o 士 〇,〇 0,2 ± 0,3 0,4 ± 0,4 0,2 ± 0,3 0,7 ±0,1 0，1 ±0,3 0，1 土 0,2 D1 1,0 0,6 〇,5 0,4 0,7 0,4 0,5 D2 1,0 0,0 0,0 〇,4 0,4 0,0 0,4 D3 1,0 0,7 0,5 0,0 0,6 0,0 0,7 平均値土SD 1,0 ±0,0 〇,4 ± 0,4 0,3 ± 0,3 0,2 ± 〇,2 0,5 ±0,1 0，J 土 0,2 0,5 土 0，1 -61 - 201109033 與A和B組中所觀察者相反’以疫苗調製劑c和D治療 之狗顯示出其血漿Αβ ( 1-42)濃度具有實質性修改。這些 變化依循之模式特點爲6隻狗中有5隻狗之Αβ( 1-42)在 W5時（免疫接種3次後）大幅下降至無法檢測到（<3 .1 25 皮克/毫升；表4Α ;第3Α圖）。該肽濃度維持在檢測不到 之水準直到W13 ;在W31 (第七次免疫後4個月）時顯示出 當抗體力價接近時免疫前之水準時該肽濃度增加；然後在 W42之加强（第8次）注射後再次下降（第1圖）。這些變 化的幅度係反映在表5Α中。有點令人驚訝的是，Αβ1-4〇 之血漿濃度顯示出依循之變化模式非常類似於Αβ ( 1 -42 ) (表4 Β和5 Β，第3 Β圖）。在任何時間點時抗體力價與肽 濃度之間的對應性表示於第4圖中。 儘管實驗期間，C和D組之血漿抗體力價在任何時間 點均有很大的差異，但Α β肽濃度的波動則依循類似之時 間進程。這暗示即使是高抗體力價亦不足以將Αβ肽自循 環中清除。 實例2 :以Αβ ( χ-40 )肽免疫化 I.材料與方法 1.動物的特徵 本發明中使用六歲大之任一性別的比格犬。其係自商 業來源取得，並一直住在聖地亞哥大學之飼養狗嵩。實驗 期間，動物被安置在三個集體狗窩中’可自由進出室內/ 室外並提供隨意食用之經配製的狗食和水°就在實驗開始 -62- 201109033 前先徹底確認這些動物（包括身體和神經學檢査、血液生 化値和血象），並宣告健康。 由對最終分配給各小組之治療完全無知之臨床獸醫將 這些動物分配在二組（A和B; n = 3)中。每週探察動物們 出現之對疫苗的臨床反應徵兆。在第3次免疫接種後再進 行另一完整之辨識（亦包括血液生化學和血象）。 根據歐洲和西班牙對動物處理之法規（86/609/EU， Real Decreto 1 20 1 /2005 )治療動物並盡力將動物的痛苦 減至最少。這項硏究係由聖地亞哥大學之倫理委員會核准 2.免疫原之製備方法 使用倂入2種不同疫苗調製劑中之合成Αβ ( 33-40 )肽 (當經由SPDP共軛結合時帶有額外之Ν端Cys )作爲抗原 (0.4毫克/注射）爲動物進行免疫接種。這些調製劑各自 與蛋白質載體（藍載體（BC ;皮爾斯，伊利諾州羅克福 德；A組）或牛血清白蛋白（BSA ;西格瑪，西班牙馬德 里；B組））：和佐劑阿比斯科-300 ( AB;IsconovaAB， 烏普薩拉科技園，SE-7 5 1 8 3，瑞典烏普薩拉）合倂。 使用實例1中之相同程序（見材料和方法，項目2.1 ) 將含N端半胱胺酸之肽與藍載體和帶有SPDP之白蛋白共軛 結合。 本發明中所使用之二種不同調製劑如下： A )與藍載體加200微升阿比斯科-300共軛結合之400 -63- 201109033 微克合成肽。 B )與BSA加37微升阿比斯科-3 00共軛結合之400微克 合成狀。 所使用之合成肽爲： •當與SPDP共軛結合時： 在兔子中：Apcys- ( 3 3 -40 ) ( N Η 2 - C G L Μ V G G V V- COOH ) ( SEQ ID NO ： 19)(見下文） 3.免疫化議定計劃和採血 將動物分成2組並各分配該2種疫苗調製劑中之任一種 (見上述（A)和（B))。經背部皮下途徑爲動物免疫 接種並監測不良反應。該免疫化和取樣之計劃表示於第1 (B)圖中。簡言之，每二週爲動物注射一次，共7次。 在第1次接種前（W0)和第1次免疫接種後第1週（W1 )、第 5 週（W5) '第 7週（W7)、第 9 週（W9)、第 11 週（W11)和第13週（W13)自頸靜脈收集血液樣本入帶 有EDTA及蛋白酶抑制劑（complete mini 毫克/10毫升， 羅氏公司）的聚丙烯小瓶中（第1(B)圖）。 將樣品輕輕地混合並保存在4 °C最多2小時，再在 4000g離心10分鐘。然後，將血漿等分成數份並冷凍在-80 t直到使用時。此外，在每次萃取中，自每一隻動物收集 〜1毫升血液入不含EDTΑ的聚丙烯小瓶中以取得血清。令 此樣本在室溫下凝結1小時，再在4000g下離心1〇分鐘，然 後，收集血清並保存在-8 〇 °C直至進行血液生化學之測定 -64- 201109033 在第1次免疫接種前1週（wo)及第13週（W13)(第 7次免疫接種後），在全身麻醉及無菌條件下收集腦脊液 (CSF )樣品（第1 ( B )圖）。將這些CSF樣本等分成數 份並冷凍在-80°C直到使用時。 4.血漿及CSF中之抗Αβ抗體分析

在96槽聚丙烯盤中藉由直接ELIS A測定抗Αβ抗體。在 4°C下，以在100 mM的碳酸氫鈉和2Μ胍鹽酸鹽緩衝液（ pH 9.6)中之 2_5 微克 / 毫升人 Αβ ( 1-40)肽（# 24224 AnaSpec，美國加州聖荷西市）塗覆微量滴定槽一整夜。 然後，以3 00微升之清洗緩衝液（0.5M Tris，1.5M氯化鈉 ，0.5% Tween20; pH 8)清洗盤3次；以300微升之封閉緩 衝液（0.05 M Tris > 0.2%Tween20 > 0.5%BSA ； pH 8)在 3 7 °C下封閉兩小時，再另外清洗3次。在3 7 °C下，將經塗 覆的96槽盤與100微升在載劑緩衝液（〇.〇5 M Tris，0.5M 氯化鈉，0.05%BSA，0.05%Tween20; pH 8)中之狗血漿 的3倍系列稀釋液（一排10槽，從第一槽中之1 : 30血漿稀 釋液開始）一起培育1小時。分析之最大血漿稀釋倍數爲 1/1 0x3 1()。各盤中之第11和第12行塡入不含血漿之載體緩 衝液以作爲空白對照組。然後，清洗盤並在3 7 °C下與1 〇〇 微升在載劑緩衝液中之與辣根過氧化酶共軛之兔子抗狗 抗體（Jackson InmunoResearch. 英國薩福克）的1: 1000稀釋液一起培育1小時，清洗3次，並與在用於ABTS -65- 201109033 之緩衝液（羅氏公司.西班牙巴塞羅那）中的 0.0375%ABTS (羅氏公司.西班牙巴塞羅那）一起培育。 在自動盤式儀（Synergy 4，Biotek.美國佛蒙特州威努斯 基）上於40 5 nm處讀取吸光度。 利用單株6E 10抗體作爲相同ELISA盤上之標準來計算 血漿抗Αβ抗體的濃度，並以微克/微升表示。經由吸光度 對各槽中之稀釋液的對數之非線性回歸測定各血漿樣本的 EC50 ( GraphPad Prism 3.02)。此外，血漿之終點力價係 定義爲其中之吸光度較空白槽之平均吸光度高3倍的最大 血漿稀釋度。 血漿中之游離Αβ肽的測定方法 以來自Araclon生物技術（西班牙，Zaragoza)之 ABtest-40和ABtest-42 ELISA試劑套組，依照製造商的指 示利用間接三明治ELIS A法測量狗血漿及腦脊液中之Αβ 1 -42及Αβ1-40的含量。 H .結果 在整個實驗期間動物保持健康和活力。特別是，未檢 測到對疫苗之反應徵兆。 1.抗-Αβ ( 1-40)抗體力價 以疫苗調製劑Β治療狗較有效’其血漿抗Αβ40抗體力 價顯示出大幅修改。此組中之所有狗的反應（如藉由抗 -66 - 201109033 Αβ40抗體及EC5Q値或終點稀釋倍數測量者）均循相同的模 式（雖然在組間和組內二者均觀察到數量差異）（表6， A-B板）。以B調製劑治療之狗中的一般模式的特點爲免 疫接種2次（W5 )後抗體力價大幅增加，但W5至W9之抗 體力價則維持僅有輕微的修改（第5 A圖）。因此，免疫 接種2次後，抗體力價大幅提高，但接下去注射疫苗後抗 體力價並未增加（甚至略有下降，具體而言，第7次免疫 接種後（W 1 3 ) ，B組中之力價稍微降至低於W 5之數値（ 表6及第5 A圖）。 表6在不同時間點時血漿中之特異性抗-Αβ40抗體力價 Λ板：同等於奈克/微升 -之抗-Αβ40抗體 組別/狗 W0 W5 W9 W13 Α1 0,3483 0,4705 0,7251 0,8830 Α2 0,4196 0,5876 0,6284 0,4501 A3 0,5214 0,4450 0,5214 0,4603 Β1 0,3585 10,1860 11,6729 8,0932 Β2 0,7913 7,1359 9,9314 6,0361 Β3 1,6111 2,2272 2,2629 2,5175 Β板：特異性抗體（抗-Αβ4〇)之血漿EC50値 組別/狗 W0 W5 W9 W13 A1 49,47 26,92 38,54 31,01 A2 n.d. n.d. n.d. 14,97 A3 25,2 29,84 24,14 46,67 B1 31,44 1328 1593 831,1 B2 66,85 906,8 1031 571,9 B3 42,15 150,9 154 129,1 -67- 201109033 2· Ap肽力價 以疫苗調製劑B治療之狗顯示出其血漿Αβ ( 1 ·42 )濃 度具有大幅修改。這些變化依循之模式特點爲Αβ( 1-42) 肽在W 5時（免疫接種2次後）大幅下降至無法檢測到之點 (<3 .125皮克/毫升；表7Α )。該肽濃度維持在檢測不到 之水準直到W13。然而，以疫苗調製劑Α治療之狗的血漿 Αβ ( 1-42)濃度未並顯示出任何修改。Αβ1-40肽之血漿濃 度顯示出依循之變化模式非常類似於Αβ ( 1-42 )(表7Β )° 比較ELISA中免疫接種前（W0)和W13之CSF量後， 以疫苗治療後二組動物（A和B)中之Αβ1_4〇和Αβ(1-42 )肽量下降。令人驚訝地，Α組中之狗的含量甚至較Β組 中者爲低，雖然來自A組之狗並未出現免疫反應。 表7A以皮克/毫升計之肽Αβ1-42濃度 組別/狗 W0 W1 W5 W7 W9 W11 W13 CSFW0 CSFW13 Α1 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 13,28 12,00 13,60 464,35 441,77 Α2 10,64 11,49 13,19 10,08 15,17 12,62 15,17 349,84 160,32 A3 17,15 14,60 14,04 14,60 15,17 18,85 15,74 345,00 196,61 Β1 17,43 23,81 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 403,06 237,74 Β2 30,19 18,38 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 263,55 195,81 Β3 <3,125 12,34 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 261,13 200,65 -68- 201109033 表7B以皮克/毫升計之肽Αβ 1-40濃度 組別/狗 W0 W1 W5 W7 W9 W11 W13 CSF W0 CSF W13 Α1 47,89 47,70 49,95 49,01 50,14 52,01 54,64 2576,97 2053,48 Α2 48,56 47,36 40,16 40,76 42,36 45,56 48,36 2734,55 1414,09 A3 37,76 44,96 40,36 45,36 50,76 42,76 49,16 2616,36 1393,64 Β1 59,33 51,08 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 2752,73 2363,33 Β2 67,20 52,20 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 1665,61 1042,88 Β3 46,36 44,56 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 <3,125 1831,52 1676,97 實例3 :大腦免疫化之效果 I ·材料和方法 爲了硏究大腦中免疫化之效果，進行急性實驗，其中 動物在以下列三種調製劑免疫化後被處死： (1) Apx_42 + BSA + Th2 型佐齊!l ( Rehydragel )。 (2) ΑβΧ-42 + BSA +混合之Thl/Th2型佐劑（阿比斯 科）。 (3 )對照組：白蛋白+ Th2型佐劑。 將額葉、嗅內區、顳葉區和小腦區之樣品在含有蛋白 酶抑製劑混合物的TBS(pH7.4)中均化，再在4°C下，在 貝克曼（Beckman) MLA-55旋轉機中於175000g下離心

3 0分鐘。該由此產生的上清液被視爲各樣本之可溶分液。 然後’將沈澱小九在含有蛋白酶抑製劑之混合物的TBS-TX ( ρΗ7·4 )中再次均化並在先前之同樣的條件下再次離 心。同樣地，將由此產生的沈澱小九再次在T B S -氯化胍中 均化並在室溫下，旋轉攪拌器中培育一整夜，然後在4°C -69 - 201109033 下’在貝克曼M LA-55旋轉機中於13000g下離心 1小時30 分鐘。丟棄沈澱小九並將所產生之上清液再懸浮於TBS-氯 化胍中’此部分被視爲是不溶分液。然後藉由ELISA定量 肽之濃度。 Π ·結果 以與BSA共軛結合之ΑβΧ-42免疫化可對可溶型肽類產 生強烈影響，相對於對照組，各治療組中之濃度降低超過 5 0%。不溶型中的濃度沒有明顯降低（第6圖）。對於不 同的大腦部分，所有區中之可溶型Αβ40的降低程度類似 ，而Αβ42肽則有輕微的差異（第7圖）。 如實例2和3中之情況，比較基線及治療後之時間點， CSF中之肽濃度並無差異。 本發明中所得之結果與Αβ免疫接種若係在發生Αβ聚 集前先投予可能更有效的延伸想法相一致。 【圖式簡單說明】 第1圖.此圖形說明免疫注射Α β肽（底部之箭頭）的 時間表（其指出線下方之免疫注射次數），收集血液樣本 的時間表（上方之箭頭）（其指出收集各樣本之對應時間 點（以週（W)表示）），CFS樣本係在第〇和13週（雙箭 頭）收集。（A )爲Αβ ( χ-42 )肽之免疫注射時間表且（ Β )爲Αβ ( χ-40 )肽的時間表。（A )中，左框架代表所 有動物依循的時間表，右框代表僅影響C和D組之額外干 -70- 201109033 預。 第2圖：（A-C)。血漿抗-Αβ抗體力價之演變。A) 血漿樣本之抗-Αβ抗體力價係以相等於微克/微升之單株抗 體6Ε10的方式表示。β )血漿樣本之抗-Αβ抗體力價係以 彼等之EC5〇表示。C)血漿樣本之抗-Αβ抗體力價係以最 大血漿稀釋倍數（其中之吸光度爲空白槽之平均吸光度的 3倍）之倒數表示。不同的時間點（以週表示）表示於水 平軸。每一條線代表一隻圖例中所指出之動物。各組動物 所接受之調製劑爲合成肽-藍載體（Blue Carrier )加 Rehydragel HPA(A)合成肽-藍載體加阿比斯科（Abisco )-300 (B);合成肽-BSA 加 Rehydragel ΗΡΑ ( C )及合 成肽-BSA加阿比斯科-3 00 ( D )。較短之連續線對應於其 中之治療係在第1 3週時停止之不起反應的動物（Α和Β組 )。C組中之動物係由斷開之線及對應之個別符號表示。 D組中之動物係由虛線及對應之個別符號表示。 第3圖（A-Β)血漿Αβ肽濃度之演變。A)代表Αβ1-42 肽之血漿濃度在不同時間點的演變。Β )代表Αβ 1-40肽之 血漿濃度在不同時間點的演變。橫軸與Υ軸在3 . 1 2 5皮克/ 毫升處交叉。爲了圖形之清晰，低於3. 125之數値以-5皮 克/毫升表示。不同的時間點（以週表示）表示於水平軸 。每一條線代表一隻圖例中所指出之動物。該4組動物（ A、Β、C和D )各接受不同之疫苗調製劑。較短之連續線 對應於其中之治療係在第1 3週時停止之不起反應的動物（ A和B組）。（:組中之動物係由斷開之線及對應之個別符號 -71 - 201109033 代表。D組中之動物係由虛線及對應之個別符號代表。 第4圖.相關於各實驗組之前免疫狀態的血漿抗體力價 和肽濃度之變化比率的演變。時間點（以週表示）表示於 水平軸。斷開之線代表血漿Αβ 1-42肽濃度於不同時間點相 關於前免疫狀態（W0 )之比率的演變。虛線代表血漿 Αβί-40肽濃度於不同時間點相關於前免疫狀態（W0)之 比率的演變。連續線代表血漿抗-Αβ抗體力價於不同時間 點相關於前免疫狀態（W0 )之比率的演變。在每一比例 方面，垂直軸中之數値代表該組中3隻動物的總和。爲了 圖形的清晰，血漿抗-Αβ抗體力價比率之數値已除以20。 第5圖.血漿抗- Αβ 3 3 -40抗體力價之演變。A )血漿樣 本之抗_Αβ抗體力價係以相等於奈克/微升之抗-Αβ40 ( SAR22)抗體的方式表示。Β)血漿樣本之抗-Αβ抗體力價 係以彼等之EC50表示。不同的時間點（以週表示）表示 於水平軸。每一條線代表一隻圖例中所指出之動物（A 1 -A3以黑色表示，而B1-B3以白色表示）。該二組（A和B ) 各接受不同之疫苗調製劑。 第6圖之圖形顯示出與對照組相比較時，兩組疫苗接 種組中可溶型或不溶型之肽濃度。Vacc.l對應於ΑβΧ-42 + BSA + Th2型佐劑，而Vacc.2對應於APX-42 + BSA+混合之 1'111/7'112型佐劑。第（1)欄對應於八01-4〇可溶型；第（2 )欄對應於Αβ1-42可溶型；第（3)欄對應於Αβ1-40不溶 型且第（4)欄對應於Αβ1-42不溶型。 第7圖之圖形顯示出與對照組相比較時，免疫接種組 -72- 201109033 0 12 3 1111 2 2 2 2 < < < < 201109033 序列表

<110> ARACLON BIOTECH <12〇>白蛋白-澱粉樣肽共軛物及彼等之用途 <130> P4840TWO0 <150> EP09382078 <151> 2009-05-26 <160> 19 <170> Patentln 3.5版 1 40

PRT 現代人 <400> 1 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser 1 5 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val 20 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 35 40

Gly Tyr Glu Val His His Gin Lys 10 15

Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie 25 30 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> 現代人 <400> 2

Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 1 5 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> 現代人 <400> 3 lie Ala 10

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213 >現代人 4 <400> 201109033

Gly Leu Met Val 1 Gly Gly Val Val 5 <210> 5 <211> 609 <212> PRT <213>現代人 <400> 5 Met Lys Trp Val 1 Thr Phe lie Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala 5 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala 20 25 30 His Arg Phe Lys 35 Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu 40 45 lie Ala Phe Ala 50 Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Glu Asp His Val 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80 Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95 Lys Leu Cys Thr 100 Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala 105 110 Asp Cys Cys Ala 115 Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gin 120 125 His Lys Asp Asp 130 Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val 135 140 Asp Val Met Cys 145 Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys 150 155 160 Lys Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro 165 170 175 Glu Leu Leu Phe 180 Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys 185 190 Cys Gin Ala Ala 195 Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu 200 205 -2- 201109033

Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gin Arg Leu Lys Cys 210 215 220

Ala Ser Leu Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val 225 230 235 240

Ala Arg Leu Ser Gin Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser 245 250 255

Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly 260 265 270

Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie 275 280 285

Cys Glu Asn Gin Asp Ser lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu 290 295 300

Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Asn Asp 305 310 315 320

Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser 325 330 335

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly 340 345 350

Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val 355 360 365

Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys 370 375 380

Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu 385 390 395 400

Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys 405 410 415

Glu Leu Phe Glu Gin Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gin Asn Ala Leu Leu 420 425 430

Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val 435 440 445 -3- 201109033

Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys 450 455

Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys 465 470

Leu Asn Gin Leu Cys Val Leu His 485

Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser 500

Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr 515 520

Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp 530 535

Arg Gin lie Lys Lys Gin Thr Ala 545 550

Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gin Leu 565

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys 580

Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val 595 600

Gly Ser Lys Cys Cys Lys His 460 Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val 475 480 Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg 490 495 Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe 510 Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala 525 Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu 540 Val Glu Leu Val Lys His Lys 555 560 Ala Val Met Asp Asp Phe Ala 570 575 Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe 590 Ala Ser Gin Ala Ala Leu Gly 605

Leu <210> 6 <211> 607 <212> PRT <213> 牛 <400> 6 Met Lys ί Trp Val Thr Phe lie Ser 1 5

Leu Leu Leu Phe Ser Ser Ala 10 15

Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg 20

His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu 35 40

Thr His Lys Ser Glu lie Ala 30

His Phe Lys Gly Leu Val Leu 45 -4- 201109033 lie Ala Phe Ser Gin Tyr Leu Gin Gin Cys Pro Phe Asp Glu His Val 50 55 60

Lys Leu Val Asn Glu Leu Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp 65 70 75 80

Glu Ser His Ala Gly Cys Glu Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp 85 90 95

Glu Leu Cys Lys Val Ala Ser Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Met Ala 100 105 no

Asp Cys Cys Glu Lys Gin Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Ser 115 120 125

His Lys Asp Asp Ser Pro Asp Leu Pro Lys Leu Lys Pro Asp Pro Asn 130 135 140

Thr Leu Cys Asp Glu Phe Lys Ala Asp Glu Lys Lys Phe Trp Gly Lys 145 150 155 160

Tyr Leu Tyr Glu lie Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu 165 170 175

Leu Leu Tyr Tyr Ala Asn Lys Tyr Asn Gly Val Phe Gin Glu Cys Cys 180 185 190

Gin Ala Glu Asp Lys Gly Ala Cys Leu Leu Pro Lys lie Glu Thr Met 195 200 205

Arg Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gin Arg Leu Arg Cys Ala 210 215 220

Ser lie Gin Lys Phe Gly Glu Arg Ala Leu Lys Ala Trp Ser Val Ala 225 230 235 240

Arg Leu Ser Gin Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Val Glu Val Thr Lys 245 250 255

Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp 260 265 270

Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr lie Cys 275 280 285

Asp Asn Gin Asp Thr lie Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Asp Lys -5- 201109033 290 295 300

Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys lie Ala Glu Val Glu Lys Asp Ala 305 310 315 320 lie Pro Glu Asn Leu Pro Pro Leu Thr Ala Asp Phe Ala Glu Asp Lys 325 330 335

Asp Val Cys Lys Asn Tyr Gin Glu Ala Lys Asp Ala Phe Leu Gly Ser 340 345 350

Phe Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ala Val Ser Val 355 360 365

Leu Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Glu Cys Cys 370 375 380

Ala Lys Asp Asp Pro His Ala Cys Tyr Ser Thr Val Phe Asp Lys Leu 385 390 395 400

Lys His Leu Val Asp Glu Pro Gin Asn Leu lie Lys Gin Asn Cys Asp 405 410 415

Gin Phe Glu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Phe Gin Asn Ala Leu lie Val 420 425 430

Arg Tyr Thr Arg Lys Val Pro Gin Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu 435 440 445

Val Ser Arg Ser Leu Gly Lys Val Gly Thr Arg Cys Cys Thr Lys Pro 450 455 460

Glu Ser Glu Arg Met Pro Cys Thr Glu Asp Tyr Leu Ser Leu lie Leu 465 470 475 480

Asn Arg Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Glu Lys Val 485 490 495

Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser 500 505 510

Ala Leu Thr Pro Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Ala Phe Asp Glu Lys 515 520 525

Leu Phe Thr Phe His Ala Asp lie Cys Thr Leu Pro Asp Thr Glu Lys 530 535 540 -6- 201109033

Gin lie Lys Lys Gin Thr Ala Leu Val Glu Leu Leu Lys His Lys 545 550 555

Lys Ala Thr Glu Glu Gin Leu Lys Thr Val Met Glu Asn Phe Val 565 570 575

Phe Val Asp Lys Cys Cys Ala Ala Asp Asp Lys Glu Ala Cys Phe 580 585 590

Pro 560 Ala Ala

Val Glu Gly Pro Lys Leu Val Val Ser Thr Gin Thr Ala Leu Ala 595 600 <210> 7 <211> 14 <212> PRT <2X3> 人工 <220> <223> SGGTSGSTSGTGST 連接子區 <400> 7 Ser Gly Gly Thr Ser Gly Ser Thr 1 5 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> AGSSTGSSTGPGSTT 連接子 <400> 8 605 10

Ala Gly Ser Ser Thr Gly Ser Ser Thr Gly Pro Gly Ser Thr Thr 15 10 15 <210> 9 <211> 7

<212> PRT <213>人工 <220> <223> GGSGGAP 連接子 <400> 9

Gly Gly Ser Gly Gly Ala Pro

1 <210> 10 <211> 8 <212> PRT 201109033 <213> 人工 <220> <223> GGGKGGGG 連接子 <400> 10 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly l 5 <210> 11 <211> Θ <212> PRT <213> 人工 <220> <223> GGGKGGGG 連接子 <400> 11 Gly Gly Gly Lys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> GTKVHMK 連接子 <400> 12 Gly Thr Lys Val His Met 1 5 <210> 13 <211> 13

<212> PRT <213>人工 <220> <2 23 > PGTSGQQPSVGQQ 連接子 <400> 13

Val Gly Gin Gin 10

Pro Gly Thr Ser Gly Gin Gin Pro Ser 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> GTSGQ連接子 <400> 14 -8- 201109033

Gly Thr Ser Gly Gin 1 5 <210> <211> <212> <213> 15 10 PRT 人工 <220> <223> PKPSTPPGSS 連接子 <400> 15

Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 16 11 PRT 人工 <220> <223> APAETKAEPMT 連接子 <400> 16

Ala Pro Ala Glu Thr Lys Ala Glu Pro Met Thr 1 5 10 <210> <211> <212> <213> 17 9 PRT 人工 <220> <223> 具N端Cys 之人A )8 (35-42) <400> 17

Cys Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 1 5 <210> 18 <211> <212> <213> 11 PRT 人工 <220> <223> 具N端Cys之人A yS 33-42 <400> 18

Cys Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 1 5 10 <210> 19 -9- 201109033 <211> 9 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> Cys-AB 33-40 <400> 19

Cys Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val 1 5 -10-

Claims (1)

1. 201109033 七、申請專利範圍： 1_ 一種用於藥物之共軛物，其包含至少一種自Ap(h 42)之C端區衍生之致免疫肽及白蛋白。 2 .如申請專利範圍第1項之共軛物，其中若該至少— 種致免疫肽及白蛋白係藉由連接子區連接，該連接子區所 含之與其連接的致免疫肽不超過一個。 3 ·如申請專利範圍第2項之共軛物，其中該至少一種 致免疫肽係藉由包含半胱胺酸之連接子區連接白蛋白分子 〇 4.如申請專利範圍第3項之共軛物，其中該半胱胺酸 係位於該致免疫肽之N端。 5·如申請專利範圍第1至4項中任一項之共軛物，其中 該自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生的肽係選自Αβ ( 3 5-42 )( SEQ ID NO : 2) 、Αβ ( 3 3 -42 ) ( SEQ ID NO ： 3)及 Αβ ( 33-40) ( SEQ ID NO: 4)中之一或多者。 6·如申請專利範圍第1至4項中任一項之共軛物，其中 該白蛋白爲牛血清白蛋白。 7. —種用於藥物之組成物，其包含如申請專利範圍第 1至6項中任一項之共軛物及佐劑。 8 .如申請專利範圍第7項之組成物，其中該佐劑係選 自Thl型佐劑、Th2型佐劑或混合型Thl/Th2型佐劑。 9. 一種包含至少一種自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生的致 免疫肽及白蛋白的共軛物，或一種包含至少一 #自六卩（ΙΑ】） 之 C 端區衍 生的致 免疫肽 和白蛋 白及佐 劑的組 成物， 201109033 其係用於治療或預防與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病。 1 0·如申請專利範圍第9項之供使用的共軛物或組成物 ，其中該共軛物或該組成物係每二週投服一次。 1 1 ·如申請專利範圍第1 0項之供使用的共軛物或組成 物’其中若該至少一種致免疫肽及白蛋白係藉由連接子區 連接’該連接子區所含之與其連接的致免疫肽不超過一個 〇 1 2 ·如申請專利範圍第9至1 1項中任一項之供使用的共 軛物或組成物，其中該自Αβ ( 1-42 )之C端區衍生的肽係 選自 Αβ(35·42) ( SEQ ID NO ： 2 ) ' Αβ ( 3 3-42 ) ( SEQ ID NO : 3)或 Αβ ( 33-40 ) ( SEQ ID NO : 4)。 1 3 ·如申請專利範圍第9至1 1項中任一項之供使用的共 軛物或組成物，其中該與澱粉樣蛋白沈積相關之疾病係選 自阿兹海默氏症、庫賈氏症（Creutzfeldt-Jakob disease) 、腦澱粉樣血管病（Cerebral Amyloid Angiopathy)或普 里昂蛋白相關疾病。 1 4.如申請專利範圍第9至1 1項中任一項之供使用的共 軛物或組成物，其中該白蛋白爲牛血清白蛋白。 I5·如申請專利範圍第9至11項中任一項之供使用的共 軛物，其進一步包含佐劑。 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項之供使用的共軛物，其中 該佐劑係選自Thl型佐劑、Th2型佐劑或混合型Thl/Th2型 佐劑。 1 7.如申請專利範圍第9至1 1項中任一項之供使用的共 -2- 201109033 軛物或組成物，其中該共軛物或該組成物係每二週投服一 次。 -3-