TW201109014A - Cyclohexenone compound of Antrodia cinnomomea that suppresses growth of tumor cell of skin cancer - Google Patents

Description

201109014 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於一種化合物之新應用，尤其係關於一種利用由 牛樟芝（如⑽而以脈職萃取物中所分離純化之化合物抑 制皮膚癌腫瘤細胞生長之用途。 【先前技術】 隨著戶外休閒活動的增加以及大氣臭氧層被破壞，全球皮膚 春癌的發生率及死亡率即呈現逐漸增加的趨勢，造成人體健康上的 重大問題。皮膚癌的發生有種族差異性，其羅患率以白種人最常 見5種人-人之，黑種人最低，且皮膚癌好發的年齡層以成年人 較多。大部分的皮膚癌都發生在臉部、頸部、耳朵、前臂和手背 等邛位其發生的原因包括長期大量的曝露於日光下、慢性化學 藥劑的接觸，或在具有放射線的環境中長時間曝露等。 目前臨床上治療皮膚癌主要有放射療法、外科手術切除法、 籲電燒刮除法、冷象療法和局部化學療法等。面積較小的皮膚癌以 上述治療方式即可達到不錯的治療料^，但對於分佈廣或多發性 的皮膚癌，除治療難度提高外，也常對患者造斜觀上的影響。 此外，不論是補線治療或化料療，f會導致衫卿用或不 適症狀，因此研發可以抑制皮膚癌腫瘤細胞生長且無有害副作用 之物質係可提供臨床治療的另一種選擇。 牛樟之(Antrodia cimamomea) ’在台灣民間又稱為樟菇、棒 藏、樟内藏、牛樟蒜或紅樟，是本省獨有之藥甩員，其係屬於 201109014 非_目(抑岭多孔菌科㊇細_㈣之多年生 類由於樟之在自然界中僅寄生於台灣特有的保育類牛掉木樹幹 之中工〜㈣壁組織上，加上人為的盜伐使得寄生於其中方能 生長之野生牛樟芝數量更形稀少，且由於在自錄態下樟芝子實 體的生長相當緩慢，_野生樟芝數量稀少域格昂貴。 ，牛樟之之子實體衫年生，無柄，呈木栓質至木質其具強 烈之樟樹香氣，且形態多變化，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。 • •生時為扁平型並呈鮮紅色，之後其周邊會呈現放射反捲狀，並 向四周擴展生長’顏色轉變為淡紅褐色歧黃褐色並有許多 細孔’且其麵牛樟芝之顯舰最豐富_位。 ”在台灣民俗醫學上，牛樟芝具有祛風行氣、化齋活血、溫中 消積、解毒義錢鎮靜止痛之功效，並視為上好轉毒劑，凡 2物中毒，腹篇’喔吐，農藥中毒均有解毒作用，此外對改善肝、 胃機能障礙及血_環疾刺具捕·療功效。牛樟芝如同一 瞻般自藥用之蕈細’具有許錢雜的成分，已知的生理活性成分 .中，包括：三_化合物（triterpen()ids> #_(ρ()_ϋ5， 如P-D-葡聚醣）、腺芽(aden〇sine)、維生素(如維生素b、於鹼酸卜 蛋白質（含免疫球蛋白）、超氧歧化酵素（sup_ide ―， SOD)、微置το素(如：妈、碟、鍺）、核酸、固醇類以及血壓穩定 物質(如antodiaadd傳，此些生理活性成分被認為具有抗腫瘤、增 加免疫能力、抗過敏、抗病菌、抗高血壓、降錄及降膽固醇等 多種功效，且有助於護肝及肝臟相關疾病之治療。 201109014 有關樟芝的成分研究，大多著重在大分子的多酿體 (polysaccharides)和小分子的三萜類（trite卬enoids)和固醇類 (steroids)，其中，樟芝含有大分子之多醣體，以不同單糖組成存在 於其子實體及菌絲體中，但經光譜分析後皆含有具生理活性之 β-D-葡聚醣(β-D-glucans);三萜類化合物是由三十個碳元素結合成 六角形或五角形天然化合物之總稱，牛樟芝所具之苦味即主要來 自三萜類此成分，且其亦係被研究最多之成份。從子實體得到的 • 三萜類化合物有antrocin、4,7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯輩二氧環 (4,7-dimethoxy-5-methy-l，3- benzodioxole)和2,2'，5,5’-四甲氧基 -3,4,3、4’-雙-亞曱二氧基二甲基聯苯 (2,2',5,5'-teramethoxy-3,4,3',4'-bi-methylenedioxy-6,6,- dimethyl biphenyl) (Chiangeia/.，1995)，以麥角留烧（ergostane)為骨架之 新三萜類化合物antcin A、antcin B、antcin C antcin E、antcin F、 methyl antcinate G 和 methyl antcinate H (Chemg ei a/.，1995， 鲁 1996)。子實體另含以麥角留烷為骨架的化合物包含Zhankuic acid A、B 及C zhankuic acid D 和 zhankuic acid E (Chen and Yang， 1995，Yang 1996) ’以羊毛甾烧（lanostane)為骨架的新化合物15a-乙醯-去氫硫色多孔菌酸（15 a -acetyl-dehydrosulphurenic acid )、去 氫齒孔酸（dehydroeburicoic acid )與去水硫色多孔菌酸 (dehydrasulphurenic acid ) ° 雖然由目前諸多之實驗可得知牛棒芝萃取物具有前述功效， 且其所含成分亦陸續被分析出，但究竟萃取物中之何種有效成分 201109014 可促成牛樟芝之抑綱症功效，並未發表具體之細有效成分， 有待進-步實驗研絲鮮，故若織出鱗取物中所含真正有 效抑制腫瘤生長之齡，將有利於牛樟芝抑癌細機轉的研究， 並對牛樟芝朗於癌症例如皮膚癌之治療與預防有莫大的助益。 【發明内容】 山^瞭牛樟芝萃取财究竟是何成分具麵癌之效果，本發

(1) 甲二ΧΓ⑼或硫⑻’γ係氧或硫:職基⑻ 甲土（CH3)或(CH2)m-CH3，R2係氫基、甲 係氫基、甲基或(CH2)m-CH3，m=i〜12. 土 S 2in 3 ch3 ch考為如下所示式(2)之化合物 I | 3 〇 lj CH,

如式(1)結構式之化合物中，較佳去也 (2) ，3-二曱氧基_6_曱基-5 埽）-2-環己烯酮 式(2)之化合物，其化學名為乍經基 3’7’11_ 二甲基 _2,6，ι〇_ 十二碳 201109014 (4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5(37ji.trime^ 6 ^ 〇-trienyl)_eyd*X_2-_e)，分子式為c義〇4，物為淡黃色粉 末狀，分子量為390。 、 本發明中式⑴、式(2)之化合物係分離純化自牛掉芝水萃取物 或有機溶劑萃取物，有機溶劑可包括醇類（例如甲醇、乙醇或丙 醇）、醋類（例如乙酸乙酷）、炫類（例如己燒）或齒烷（例如氣 甲烷、氯乙烷），但並不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為 乙醇。 … 藉由前述化合物，本發明係將其應用於抑制腫瘤細胞生長 上，使能進一步應用包括於治療癌症之醫藥組成份中，增益癌症 之治療效果。本發明對該化合物得翻之細包括對於皮膚癌腫 瘤細胞之生長抑制，藉由抑制該等腫瘤細胞之迅速生長，進而抑 制腫瘤之增生，而延緩腫瘤之惡化。其中’較佳之化合物係式(2) 之4-經基-2,3_二曱氧基_6_曱基_5 (3,7，u_三曱基_2,6，1〇_十二破三 稀）-2-環己稀酮。 另一方面，本發明中亦可將式(1)或/與式(2)之化合物利用於抑 制皮膚癌腫瘤細胞生長之醫藥組成物的成分卜前述醫藥組成物 除包括有效劑量之式⑴或/與式(2)之化合物外，尚可包括藥學上可 接=的載體。細可為賦糊（如水）、填細（如紐或殿粉）、 黏合劑（如纖維素衍生物）、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味 劑’但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依-般習知藥學之製 備方法生產製造κ⑴或/與舶成分劑i與—種以上之載 體相混合’製備出所需之咖，此綱可包括輔、粉劑、粒劑、 膠囊或其他液n製劑，但未以此為限。 201109014 以下將配合圖式進-步朗本發_實 所 的實施例係用以闡明本發明，並非 I非用以限夂本發明之範圍，任何 “此胁者，在魏轉翻之精神域㈣，料做些許更 動=飾’因此本發明之保護酬當視後社申範圍所界 定者為準。 【實施方式】 • 經萃取過後之牛樟芝水萃取物或有機溶劑萃取物，可進一步 藉由高效軸層析加时離純化，之後再鱗—分液（fracti〇n) 進行抑癌效糾職。最後’騎對具抑癌奴之分液進行成分 分析，將可能產生抑癌絲的成分分職—步做皮膚癌腫瘤細胞 之抑制效糊試。最終即發縣發明巾如切v式⑵之化合物係具 有抑制皮膚癌腫瘤細胞生長之效果。 為方便說明本發明，以下將以式⑺之—基 甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，1〇_十二碳三稀）_2_環己婦酉同化合物進 籲行說明。此外’為證實4-經基-2,3-二甲氧基_6_曱基J ( 3,7 1 甲 基-2,6，10-十二碳三烯）_2_環己烯嗣化合物對腫瘤細胞生長之抑制 效果，本發明中係以MTT分析法，根據美國國家癌症研究所 (National Cancer Institute，NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對皮膚癌 腫瘤細胞進行細胞存活率之測試。由該些測試證實，4__其_23_ 二甲氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，l〇-十二碳三烯）己烤 酮對於皮膚癌腫瘤細胞：A431細胞系可降低其存活率，相對之下 並可同時降低生長半抑制率所需濃度（即ICw值），因此得藉由. 4-經基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5 ( 3,7，11-三甲基-2,6，1〇·十二碳三^ ) 201109014 -2-環己烯酮，應用於皮膚癌腫瘤細胞之生長抑制上，而進一步可 利用於皮膚癌之治療。茲對前述實施方式詳盡說明如下： 實施例1 : 4_經基_2,3_一曱氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三稀） -2-環己烯酮的分離 將100克左右之牛樟芝菌絲體、子實體或二者之混合物，置 入三角錐形瓶中，加入適當比例的水與醇類（7〇%〜1〇〇%醇類水溶 • 液），其中該醇類較佳為乙醇，於20〜25。(：下攪拌萃取至少1小時 以上，之後以濾紙及0.45 μιη濾膜過濾，收集濾液即得牛樟芝萃 取液。 將則述收集之牛樟芝萃取液’利用高效能液相層析儀(High

Performance Liquid chromatography)，以 RP18 的層析管(column) 進行刀析，並以曱醇(A)及〇 ι〇/〇_〇 5%醋酸水溶液(B)做為移動相 (mobile phase)(其溶液比例係：〇〜1〇分鐘，B比例為95%〜2〇% ; Φ 10〜20分鐘，B比例為2〇%〜10%; 2〇〜35分鐘，B比例為10%〜9〇%; 5 40刀知，b比例為1〇%〜95%)，在每分鐘1如之速度下沖提， 同時以紫外-可見光全波長偵測器分析。 將25分鐘至30分鐘之沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀 之固體產物，此即4-羥基-2,3-二甲氧基-6-曱基-5 (3,7，11-三甲基 ^6’1^十二碳三烯）環己烯酮。經分析’其分子式為C24H38〇4， 刀子里390 ’橡點（m.p.)為48°C〜52〇C。核磁共振（NMR)分 析值則如下所示：kNMRiOX^Cppm) :1.51、1.67、1.71、1.75、 1.94、2 、ο Λ。 2.〇7、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07 與 5·14。 201109014 13C-NMR(CDCl3)3(ppm) : 12.3 卜16.卜 16.12、17.67、25.67、26.44、 26.74、27.00、39.7卜 39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120.97、 123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45 與 197.12。 實施例2 : 體外抗皮膚癌腫瘤細胞之活性測試 為進一步測試實施例1中所發現化合物對腫瘤細胞之抑制效 鲁 果，本實施例將根據美國國家癌症研究所(National Cancer Institute， NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實施例1中所分離之4-經基 -2,3-二曱氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯）-2-環 己烯酮化合物’加入含有人類皮膚癌腫瘤細胞A431的培養液中， 進行腫瘤細胞存活性之測試。其中’細胞存活性之測試可採習知 之MTT分析法進行分析，而皮膚癌腫瘤細胞八431係為人類皮膚 癌細胞株(human epidermoid carcinoma cell line)〇 I MTT分析法是一種常見用於分析細胞增生（cell proliferation)、存活率（percent 0f viable cdls)以及細胞毒性 (cytotoxicity )的分析方法。其中，1^丁（3_[4,5_ dimethylthiazol-2-yl]2,5_diphenyltetrazolium bromide)為一黃色染 劑，它可被活細胞吸收並被粒腺體中的琥珀酸四唾還原酶 (succinate tetrazolium reductase)還原成不溶水性且呈藍紫色的 formazan，因此藉由f〇rmazan形成與否，即可判斷並計算細胞之 存活率。 首先將人類皮膚癌細胞AC 1於含有！ 0%胎牛血清脚丨— 201109014 serum)之DMEM培養基進行培養，該培養基尚包含100 U/ml之盤尼 希林(Penicillin)，及 100 pg/ml之鏈黴素(Streptomycin)，並於5 % C〇2 ’ 37°C環境中培養24小時。將增生後之細胞以PBS清洗一次， 並以1倍之骑蛋白酶-EDTA處理細胞，隨後於1，200 rpm下離心5分 鐘’將細胞沈殿並丟棄上清液。之後加入1〇 ml的新培養液，輕微 搖晃使細胞再次懸浮，再將細胞分置於96孔微量盤内。測試時， 分別於每一孔内加入30、10、3、1、0·3、0.1與〇.〇3 pg/ml的牛樟 _ 之萃取液作為對照組(未經純化分離之總萃取物）；以及於每一孔内 加入30、10、3、1、0.3、0.1 與〇.〇3 pg/ml的4-羥基-2,3·二 f 氧基-6-甲基-5 (3,7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯）_2•環己烯酮作為試驗 組’於37 C、5% C〇2下培養48小時。其後，於避光的環境下於 每一孔内加入2.5 mg/ml的MTT，反應4小時後再於每一孔内加入 100 μΐ的lysis buffer終止反應。最後以酵素免疫分析儀在57〇咖吸 光波長下測定其吸光值，藉以計算細胞的存活率，並推算出其生 長半抑制率所需濃度（即K：5◦值），其結果如表一所示。 表·體外對皮膚癌腫瘤細胞存活率之測試結果 ______碑试樣品 了P flirt/ 1、 ---- 一由表一中可知，藉由4-經基-2,3-二甲氧基-6·曱基·5 (切 二甲基_2,6，1〇-十二碳三烯）：2_環己稀明的作用，歸於八州 顏皮膚癌腫瘤細胞之IC5〇值為〇·18μδ/ιη1，相較於咖且牛掉芝; 取混合物所馨之IC5G讎巾未示)佩的多，因此可證實怖 201109014 萃取物中之4-羥基-2,3-二曱氧基-6-曱基-5 (3,7，^·三曱基_2,6，1〇_ 十二碳三烯）_2_環己烯酮確實能夠利用於皮膚癌腫瘤細胞生長之 抑制。 綜上所述，本發明分離自牛樟芝之4_羥基_2,3_二甲氧基_6_甲 基-5 (3,7，11_三曱基_2,6，10-十二碳三烯）_2_環己稀嗣化合物，係 可有效抑制皮膚癌腫瘤細胞之生長。另—方面，因牛樟芝環己稀 酮化合物係為天鮮取之物f，故其制於抑财膚癌時，並不 會引，患者不適或產生毒性、併發症等其他副作用，且其亦可與 化療藥劑朗’以減少化療藥物使賴量並降低化療藥劑所 引發之副侧；此外，亦可將其製備成治療皮膚癌之醫藥組成物， 其卜該醫藥組成物除包含有效劑量之牛樟芝環己_化合物 外尚可包括藥學上可接受的載體。載體可為賦形劑（如水） 充劑（如紐或_)、黏合劑（如纖維素衍 、 解劑、吸彳猶劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發 ，可依-《知藥學之製備方法生產製造，將有 f環己稀嗣化合物與-種以上之載體相混合，製備出所3 以此限藉以達到治療皮膚癌腫瘤疾病之目的。 12

Claims (1)

1. 201109014 七、申請專利範圍： 1、一種將具有下列結構式之化合物利用於製備抑制皮膚癌腫瘤細 胞生長之藥物的應用：

   其中，X係氧（0)或硫（s)，Y係氧或硫;Ri係氫基（H)、 φ 甲基（CH3)或(CH2)m-CH3，R2 係氫基、甲基或(CH2)m-CH3， R3 係氫基、曱基或(CH2)m-CH3，m=l〜12 ; n=l〜12。 2、 如申請專利範圍第i項所述之應用，其中該化合物係4-羥基-2,3- 二甲氧基-6-甲基-5 (3,7,11-三曱基-2,6,10-十二碳三烯）：環己 烯酮（4-11丫(11'〇乂丫-2,3-出11^11〇\)^6-11^11>^5(3,7，11-1；1^1116也丫1-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone ) ° 3、 如申請專利範圍第2項所述之應用，其中該化合物係由牛樟芝 ^ 萃取物所分離製得。 4、 如申請專利範圍第3項所述之應用，其中該化合物係由牛樟芝 之水萃取物所分離製得。 其中5亥化合物係由牛棒芝 5、如申請專利範圍第3項所述之應用 之有機溶劑萃取物所分離製得。 酯 6、 如申請專利細第5項所述之應用，其中該有機溶 類、醇類、烷類及鹵烷所組成的族群。 ’、、自 7、 如申請糊細第6項所述之_，其中該_係乙醇。 13 201109014 8、 如申請專利範圍第1項所述之應用，其中該皮膚癌腫瘤細胞係 A431細胞系。 9、 一種用於抑制皮膚癌腫瘤細胞生長之醫藥組成物，包括一有效 劑量如申請專利範圍第1項所述之化合物以及一藥學上可接受 之載體。 10、 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 4_經基_2,3_二甲氧基-6-甲基_5(3,7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三 烯）-2-環己烯酮（^hydroxyJJ-dimethoxyA-methy-SpjJl-trimethyl- dodeca-2,6，l〇-trienyl)-cyclohex-2_enone) 〇 11、 如申請專利範圍第1〇項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 由牛樟芝萃取物所分離製得。 12、 如申請專利範圍第u項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 由牛樟芝之水萃取物所分離製得。 13、 如申請專利範圍第u項所述之醫藥組成物，其中該化合物係 由牛樟芝之有機溶劑萃取物所分離製得。 14、 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組成物，其中該有機溶劑 係選自酯類、醇類、烷類及鹵烷所組成的族群。 15、 如申請專利範圍第14項所述之醫藥組成物，其中該醇類係乙 醇。 16、 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其"亥皮膚癌腫 瘤細胞係A431細胞系。 201109014 四、指定代表圖： (一) 本案指定代表圖為：第（無）圖。 (二) 本代表圖之元件符號簡單說明： 五、本案若有化學式時，請揭示最能顯示發明特徵的化學式：