201106010 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於自以細胞觀察所攝影之時間序列景彡像，、 細胞分類的細胞之分類手法。 〜’進行 【先前技術】 動植物之活細胞被利用於藥品之效能評價或培養環产 評價，作為試驗樣本則需多數個細胞。因此，吾人進行二 細胞並予以增殖之細胞培養。在細胞培養中，由於在培 含有滅絕之細胞’在ES細胞或iPS細胞若不以複數且^中^ 度之細胞塊開始培養時，則無法保持社會性而無法增殖等，故 一般而言’係對1個培養基散布複數個細胞進行培^。作為— 面培養細胞一面觀察之裝置之代表例則可舉培養顯^鏡。… 培養顯微鏡具備形成適合於細胞培養之環境的培養裂 置’與顯微觀察培養容器内細胞的顯微觀察系，其構成 面培養活細胞’一面觀察細胞之分裂或單一化、分化等之狀況 (參照例如專利文獻1)。在藉由細胞培養而育成之細胞(細胞塊） 之挑選’係觀察者每隔一定時間進行顯微觀察，以細胞之觀察 所致感官評價提取群體(colony)。 、 【先前技術文獻】 【專利文獻】 【專利文獻1】日本特開2004-229619號公報^ 【發明内容】 【發明欲解決課題】 在藥品之效能評價或培養環境評價，為了提高評價精度吾 人謀求可使試驗樣本之特性一致者(均質性），理想是利用以單 一細胞作為起源之培養細胞，但是，在習知之細胞培養，觀察 者在顯微觀察時之細胞觀察所致感官評價係進行已成熟的細 胞之提取’而就已成熟的細胞之起源(例如是幾個細胞單一化 201106010 所形成者）’則非為評價之對象。又，難以以充分頻率進行長 期間持續的觀察’有極多的情況是觀察者在無法識別的觀察間 隙中’群體彼此間完成單一化。因此本發明之課題是，即使可 複數次提取已成熟的細胞之樣本’在每一樣本對藥效等產生差 異之情形，則難以進行適當的評價。 ” 本發明係鑒於前述課題而完成者，其目的在於提供一種可 因應細胞之構成而予以挑選•評價的手段。 " 【解決課題之手段】 例示本發明之第一態樣係細胞之分類手法。該分類手法， 取細胞與自第二影像所提取細胞之一一對 賦予-體化前之細胞資訊，在使第一影像=之胞 離賴數個之_，騎已分_各細顧予“ t 轴依順序偏_時實行細胞之提取及考時間 紋__，齡树 之時間所攝影的第二影像 間隔預設 驟；進行自該第1像合有之細胞之第二之步 細胞之-—對應，在像第二影像所提取的 為一個之情形，對-體化細該第二影像成 體化則之細胞資訊，該第 4 201106010 分離的各細胞賦予分離前之細 :J稷之情形，對已 影像沿著時間軸依順序偏移同時就時間序列 順序接替影像中所含有之各、=弟;·至第三之步驟依 定之時刻所攝影之鱗所含叙細;就所指 2驟而構成。此外，該影像處理程式胞資訊 所含有之細胞予以分之影像 取得===攝;影像處理裝^其具備: =像之影像解析㈣ 之第一影像析2自預設之時刻所攝影 -影=取:，與自;!胞：！ 前之細胞資訊，就時f k 胞賦予分離 時間軸依順序偏移同時實像^二影像沿著 替影像中所含右夕夂,I 胞>取及一一對應，依順序接 定時刻所攝影之#細胞貧訊’輸出部之構成係就所指 而輸;部係，影像影像所含有之細胞’ 贫箱w + = i这第一至第二處樣的本發明中，攝影第一影像的 H以3刻t、攝影第二影像的時刻係自該預設之時 3 ;ίί?ί軸，在__至麟__為止之方向實 人W、刻所攝影之影像中之細胞，根據回溯至觀察開 201106010 始時期為止所接替的各細胞 4 、 細胞之起源的細胞數之分類、「貝Λ進行按照成為構成各 又’使攝影第-影像的該預設 影像之時刻係自該預設之刻t ’攝影第二 細胞資訊之接替係沿著時間序列^之日:日^之，亥“+卜而 期至時間之經過方向實行 夺4軸，自觀察開始時 t有之細胞，根據至該時刻為察影像所 進行=趨減各_之域的細⑼胞資訊， 【發明效果】 观 裝置 細胞之提取及一一對應，使細胞移，同時進行 為各細胞之細胞資訊’根據所接替的細“乂序？替作 種可進行細胞縣極為财，係提供一 ^外,’根據細胞資訊之接替係沿著時間序列影像之 可減低=日H至觀察_咖為止之方向實行之方法，由於 t際之_數，故可減低演算處理之處理負 ° H _細胞資訊之接替係沿著時 j歹^像之時_’自觀察開始時期至時間之經過方向實行 源細胞培養之麟中，_卩物_各細胞之起 【實施方式】 兹就本發明實施方式，一面參照圖示一面說明如下。作為 t用本發明影像處理裝置的系統之一例，在第二圖及第三圖表 養觀察系統之概要構成圖及方塊圖，首先就培養觀察系統 之全體構成予以概要說明。 培養觀察系統BS，大致區分係由：設置於外殼1上部的 培養室2 ;收容、保持複數個培養容器1〇的存放架3 ;觀察培 6 201106010 養容器ίο内試料的觀察單 4 ;控制系統運作的控制單，.搬送培養容器10之搬送單元 盤7等所構成。 ，及具備影像顯示裝置的操作 培養室2係形成培養淨户 置溫度調整裝置21、加濕3 ’隨付著該培養室2有設 體的氣體供給裝置23 ％氣體或N2氣體等氣 濕度等之環境感測器25等:存^、檢測培養室2的溫度或 前後及上下之棚架狀的各棚|放：^〇cker)3係在形成分隔為 10可按照培養之細胞類、广疋固有之號碼牌。培養容器 培養容器中，胸===，例如在皿型之 培養容器ω中賦予編碼序i體；:養基;^主^保持。在各 號碼牌之方式收容。搬 γ; 養容器10並支持的支持臂4t。ϋ 43之刖端側設有可舉起培 明4察之下側照明試料的第-照 昭明心9 察系之光轴，自上方照明試料的第二 :及自下方照明試料的第三照明部53 ;進行試料之石 觀察系54 ;進行試料之微觀觀察的顯微觀察夺 置励等_成。在試料台15，於顯微ί 不系55之觀察區域設置有透明的窗部16。 #巨觀觀察系54之構成係具有：觀察光學系54a ; ^察光學，成像試狀像之C(：D _機等之成像^ c ’並取得自以第一照明部51所背光照明的培養容器1 方的全體觀察影像(巨麟）。顯微觀㈣55之構成^ · 由對物透鏡或中間變倍透鏡，螢光過it H等所構成觀察^系 光學系5域成像試料之像的冷卻CC以才目 機寺之成像裝置55c。對物透鏡及中間變倍透鏡係構成 由各自設置複數個，並改變透鏡之組合而可設定任意之颧: 率。在顯微觀察系55中，可取得被第二照明部S2戶^照明之名: 201106010 胞之透過像、被第三照明部53所照明之細胞之反射像、被第 二照明部53所照明之細胞之螢光像等之使培養容器10内細胞 經顯微鏡觀察的顯微觀察像(微觀像）。 影像處理裝置1〇0係以巨觀觀察系54之成像裝置54c、 顯2觀察系55之成像裝置55c所攝影’處理自該等成像裝置 ^輸入之錢’而產生全織察影像或酿觀察影像等之影 f。又，影像處理裝置1〇〇係對該等觀察影像(影像數據)實施 ^像解析、慢速(time lapse)影像之產生、細胞運動狀態的解 =、細胞成熟度解析、細胞構成解析等。此外，關於影像處理 裝置100則詳如後述。 ^控制單元6具有：實行處理的CPU61 ;設定、記憶培養 铖察系統BS之控制程式或控制數據等的R〇M62 ;暫時記^ ，有硬碟或DVD等輔助記憶裝置的觀察條件或影像數據。 RAM63等，並控制培養觀察系統Bs之運作。因此，如第三 圖所示，係使培養室2、搬送單元4、觀察單元5、操作盤1 之各構成機器與控制單元ό連接。在中，係設定 憶按照觀_式之培養f 2之環境條件，或觀察排^觀察^ 凡5中的觀察類別或觀察位置、觀察倍率等。又，在 中’係設置記錄以觀察單元5所攝影之影像數據的影像數 ’並以—對應於培養容器⑴之含有編碼序號或攝影 曰時專的索引•數據與影像數據之方式，加以記錄。 在操作盤7設置：設有鍵盤或鍵(switch)等輸出 知作面板7卜顯示操作晝面或觀察影像、解析結果等顯= 面板72，在操作面板71中，進行觀察程式之設定或條撰^ 動作指令等之輸人。職部65鲜财線或缝之通传格 而構成，在該通信部65與外部連接之電腦等之間， 制信號或觀察數據之傳送、接收。 仃匕 如此概要構成的培養觀察系統BS，係依照操作般 設定的觀察程式，來控制CPU61各部分之運作，且2 行培養容器ίο内試料之攝影。觀察程式一啟動，CPU6l則1
S 201106010 據s己憶於RAM63的環境條件來控 22等運作，並控制培養室2之環^皿又度^f =、加濕器 的觀察條件，根據觀察排程，啟動χγ於RAM63 自存放架3搬送觀察對象之S 仏4卜 進行觀察單元5所致觀察。例如，“ 並開始 係細胞之微觀觀察之情形， 二，/斤5又疋之觀察 察系55之光軸上，使第二昭日養10定位於顯微觀 開燈，在成像裝置55e上攝影顯微照明部53之光源 所攝影的培養細胞影像，解析取得 S 55c) 胞之挑選·評價極為有用的 2 對所培養的細 的功能。該功能可適當地利用於‘胞 之資訊(細胞資訊)賦予單化或分割前細胞 時間序列影像沿著 二胞=接替’就任意時刻之影像=ί =示===替實Ϊ細胞資訊，或者根據所接替的細胞資 刻t+χ之觀察影像中各細胞係由幾個 時 或是否存在由單-細胞所構狀群體。成， 在目前(最狀贿__，即可=== 201106010 ί價掌^長之細胞塊之起源或構成，而可準確地進行細胞之 又，例如在時刻t之觀察影像(第一影像) α，在前時刻“之觀察影像(第二影 細胞 分離的二個細胞各自賦予鋒前之細胞資二^’情形’已 依順序在沿著時間序列影像之時間轴 門'0^使其 實行，進行細胞資訊之接替，例如在時刻J 偏移並 出顯7F於時刻t有成為-個細胞C1的細胞α 像中輸 此時，藉由使時刻t-x成域察開始時之二2ϋ 在時刻t成為成長的細胞塊之細胞，在 即可仔知 何種細胞所構成，或是否存在:單====之 ^包J由使時刻t作為目前(最新之觀察時 養中細胞塊之起源或構成，準確地進行細胞之n握培 此=_細胞資賴細齡類，峨察朗内、、 刻之硯察影像所含有之細胞塊，可例示例如 才曰疋之時 的細胞個數以色彩區別表示影像中之細胞塊:ϋ細胞J 彩區別表示含有特定之起源細胞的細胞塊等之者，1色 J例示僅就後述之細胞塊之成熟度判定馳合^又1 的=塊，進行前述色彩區別顯示，或者‘ο: ，同，以框圍繞已狀成熟的細胞塊予別顯 悲。又，就觀察影像中所含有之細胞塊，‘ 1之7刀類形 ^^K(histogram)^^^ 胞之全體像之觀點言之亦為有效。 財騎培養的細 理裝植理可在影像處 圖’在影像處縣置卿巾所 =====麟彻爾處理程式 處理T係藉由將設定、記憶於ROM62的影像 處理以G卿、GP· CPU61所讀取，根據藉由 201106010 處理順序實行而構成。換言之，影像 置糊⑽丨_作為影像處理裝 說明康f像處理程式Gp，以成像裳置(在 (1)回溯日如下妨式進衍彡像處理。 gpi時，0之=輸入等而啟動影像處理程式 RAlUd λα 士 斤4 20 ’首先係在步驟S11中’自記愔於 新之觀察時wu=te(例如最 s，ir設定 散細過胞慮之器提取’可使用 胞，步驟S14中’相對於在第一影像中所提取之細 仃‘ 6己（附ID)。例如，記憶於的時刻 方,，」’ · ·，^，tc之時間序列影像係如第六圖之示意圖所示，在時 d t-tc之第一影像所含有之各細胞，賦予如〇、c2、。、··.、、 C6般之ID(識別號碼）。 接著，在步驟S15 ’於第一影像與第二影像之間，取得影 像所含有細胞之對應，進行追蹤所致的細胞資訊之接替。此 時，第一影像之複數個細胞在第二影像成為一個之情形，在已 一體化之細胞接替一體化前之細胞資訊，在第一影像之一個細 胞於第二影像分離成複數個之情形，在已分離的各細胞接替分 離前之細胞資訊。 細胞資訊之接替係由在第一影像存在細胞之區域、與在第 一影像存在細胞之區域之重疊來判斷，且在即使一部分重叠 (overlap even partially)之細胞接替第一影像之細胞資訊。觀察 影像之攝影間隔，一般而言，相對於細胞之移動速度係設定為 充分的小’在追蹤係使用到光學流(optical flow)的追縱、卡爾 201106010 ，過濾、器(kalman filter)等之線性預估(linear predicti〇n)方法。此 夕田卜’ ^察間隔並非充分’在第—影像與第二影像細胞區域無重 ，之^形’可使賴丨資赌前之細胞之轉與減值所致的 甸曼猶料之雜雜，舰卡毅韻器或微 匕濾态(partiClefilter)等之非線形移動預測方法進行追蹤。 如第六圖所示’時刻t—c之第一影像之細胞C2於時刻 t tc-之第二影像分離為二之情形(隨著時間二個細胞經單一 化的情形），作為細胞資訊係使細胞C2之 =如C2l ’般之ID。同樣地，第一影像之細胞二: 像分為三個’在此情形，於第二影像之各細胞被賦予接 替細月=5的ID之C5l、C52、C53之ID作為細胞資訊。 後：係就時間序列影像，使第—影像與第二影像沿著時間 回齡向’依順序偏移並實行前述步驟su至Sl5，將影 ，含有各細胞之細胞資訊依順序接替至時刻㈣為止。亦 」& a乍為第衫像，在時刻t=tc_2所取得的觀察影像作為第 二了進行細胞之追蹤，在已經接替細胞資訊之時刻之細 區域為即使有—部分重疊之_ v2之細胞接替細胞資
〇TL ^复該細胞資訊之㈣處理，直到第二影像成為時刻t=〇 Ϊ像’並導出時刻㈣中細胞資訊。在步驟S16，係根 康巧替的細胞資訊’在散佈細胞之_卜。，計數具有相同 =包=的細胞數，進行在_ te中成為—體的細胞之發生起 構成細胞數之計算、分鮮，在步驟S17巾解析結果 係自輸出部130輸出至顯示面板72等。 在第六圖係表示，將接替此細胞資訊交付各時刻之觀察影 L之各細胞而顯示的輸出例；與整理所接替的細胞資訊，並 在時刻tc中構成細胞α至C6的發生起源細胞的輸 出例(圖中右上部之分類圖）。 在將細胞 > 矾交付觀察影像中之各細胞而顯示之前者之 201106010 輸出例中，例如在時刻tc將成為細胞C5的細胞C5!、C521、 C5r、C53以相同色彩表示’在時刻te將成為細胞C4的細胞 C4〗、以其它相同色彩表示等，若在時刻、以成為細胞C1 至C6的細胞群之每一群予以分類顯示時，則可使細胞構成之 掌握更加容易化。又，就後者之輸出例，細胞C1至C6之發 生起源細胞之分類顯示與時刻te之觀察影像一起，可構成為顯 示於其側方(lateral)等，或者亦可構成為按照發生起源細胞之 數目（1個至η個)以色彩區別表示細胞ci至C6，根據此種輸 出表示，可進一步使細胞構成之掌握容易化。 藉由此種細胞資訊之顯示，根據細胞資訊的發生起源細胞 之分類顯示等，因而觀察者可明確得知，在時刻tc成為已成熟 的細胞塊之細胞C1係由單一細胞所構成之群體，或者在時刻 tc之觀察景^像中’所見到同樣地已成熟的細胞塊之細胞匸2、 C4、C5係各自由3個、2個、4個之發生起源細胞所構成等。 ，此外，以上係例示就時刻^之觀察影像所含之全細胞進行 追縱、’並輸出全細胞之細胞資訊或細胞分類之構成，不過亦可 構成為，時刻tc之觀察影像選擇解析對象並實行處理。例如， 以，鼠等指定自觀察影像全體實行解析的區域部分，或者以滑 鼠等選擇指定自觀察影像成長的細胞(例如第六圖中細胞C1、 C2、' C4、C5) ’或亦可構成為利用詳述於後的細胞之成熟判定 手法，自動選擇成熟細胞，實行解析處理。藉此，可將非有解 析=要j未成熟細胞等除外，減輕處理負擔，就所期望之細胞 以向速實行起源資訊之解析。 (11)，蹤時間軸之追蹤所致的發生起源細胞數之計算方法 接著，關於自觀察初期在時間轴之經時間方向進行追蹤之 發生起源巧胞數之計算方法加以說明。該方法之影像處理程式 GP2 ’係與第五圖所示影像處理程式Gpi之流程圖與基本構成 為相同，將第五圖中「時刻tc之輸入影像」替換為「時刻t=〇 之，入影像」、「時刻VI之輸入影像」替換為「時刻t=1之輸 入影像」、…、「時刻之輸入影像」替換為「時刻tc之輸入 13 201106010 影像」，藉由追蹤時間軸之經過方向而可實現。 垃接“方a面Λ在第五圖中’就相當於步驟S15之追縱所致的1D 田'㈣之接替)，與前文所述影像處理程式GP1不同之 报夕::例=於下:在適用該ID接替於影像處理程式GP2之情 王第七圖所示。在該圖中，在進行與影像處 理，之處理的步驟中提供相同步驟號碼表示。 作面板71之操作輸人等峨動影像處理程式 時’衫像解析部12〇,首先在步驟su中，自記憶於^刪 序列影像，讀出並取得時刻t=〇(以觀察者指'^有初期時 1 峨察日械)賴影^彡像、與在該次時^ ^所攝影之第二影像，在步驟阳中提取各影像所含有之細 進行驟/A1 2中’相對於第一影像中所提取之細胞， 進巧5己(附ID)。例如’記憶於从购的時刻卜〇卜. 岔影像係如第八圖之示圖所示’在時刻:=0 第二 衫像所言有之各細胞賦予如cl，c2，c3，...，cl2般之仍。 马像ίίϊ右if1!S15中，於第一影像與第二影像之間，取得 顧_D歸，可咖_示步^ft 在步驟S151係進行追蹤處理，即传.筮. .A ^ :=，在第二影像存在細胞的區:=== 1 =對於細胞之移動速度係設定為充分的小，可藉^ 2 、，·田胞區域之重複，進行細胞之一一對應 笛 二影像不致使細胞區域重叠之情形，可使用jus :之距離與相關值所致的追蹤，或卡爾曼過 t 曼過渡器或微粒過渡器等之非^形移動預估ί 在步驟⑽係判斷第-影像之二個以上細胞是否對應於 201106010 第二影像之-個細胞，在判斷第—影像之二個以上細胞對應於 第二影像之-個細胞(二個以上細胞經一體化)之情形 至步驟S153，在非對應於第二影像之—個細胞之情形則進行 至步驟S155b。在步驟S153，則進行按照第一影像之二個以上 ID之對應數的單一化數之總計，在步驟S155a中第一影像之 細胞之任- ID ’例如將最新的(最小)ω賦衫二影像之細胞 並接替細胞資訊。一方面，在步驟Sl52中判斷細胞無單一化 之情形’亦即’第-f彡像之細胞與第二影像之細胞係以j : J 對應時’或者第-影像之-個之細胞以第二影像分離成二個以 上細胞時，在步驟S155b中第一影像之細胞之ID則照樣被接 替。 例如’如第八圖所示’時刻t=〇之第一影像之細胞c2與 c3，在以時刻t=l之第二影像一體化成一個細胞之情形，在第 二影像之已一體化之細胞’於二個ID號碼中新的號碼之c2與 細胞之單一化數s=2係進行接替作為細胞資訊。同樣地第一影 像之細胞c9與clO係以第二影像進行一體化，在該情形，在 第二影像之已一體化之細胞，ID號碼C9與細胞單一化數s=2 係進行接替作為細胞資訊。 後續，係就時間序列影像，使第一影像與第二影像沿著時 間軸在經時間方向依順序偏移同時實行前述步驟su至S15， 將影像中所含有之各細胞之細胞資訊依順序接替至指定時刻 (例如現在時刻中最新之觀察時機)t=tc。亦即，其次之細胞資ς 接替處理，係使在時刻t=l取得的觀察影像作為第一影像，使 在時刻t=2取得的觀察影像作為第二影像，進行細胞之追蹤， 將已經接替細胞資訊的時刻t= 1之細胞與即使區域有一部分重 登時刻t=2之細胞，接替細胞資訊。 將该細胞資訊之接替處理重複進行直至第二影像成為時 刻t=tc之觀察影像為止，並導出時刻tc中細胞資訊。在步驟 參照第五圖），根據接替的細胞資訊，進行時刻、之觀察 影像中細胞之發生起源細胞與構成細胞數之計算、分類，在& 201106010 驟S17中自輸出部輸出於顯示面板π等。 在^圖係表示，將接替的細胞資訊交付各時狀 像中之各細胞齡顯示的輸_，與整理 Ί 時刻tc之觀察影像中細胞以、c2、c4、^的城貝況，就 不^生起源之細胞數的輸_(圖巾右下部之 胞資訊交付觀察影像中之各細胞並顯示的 、/田 tc之，触生起源細胞之數’以色彩區別顯 c2、=:c5:e9、cl2，即可更容易掌握各細胞之構成。 ，精由此種細胞資訊之顯示，根據細胞資訊的發 ，、，，田I之分類顯示等，則觀察者可明確得知，^ 熟的 = 包塊之細胞cl為由單一細胞所構成之群體 二影像’同樣地可見到成熟的細胞塊之細胞c2' C5夺cl ϋ自由3個、2個、4個之發生起源細胞 作為最新之觀察時機，藉由觀察影像每， ί ί 順序更新，持續解析，即可掌握目前所觀察之細 生ΪΪ或構成細胞數，可即時且準確地進行培養中細胞 路，例示就_t=G之觀察影像所含有之全細胞進行追 ^輸出全細胞之細胞資訊或細胞分_構成，不過亦 =為自時刻t=(U,2等初期之觀察影像選擇解析對象並實行 如以滑鼠等指定自觀察影像全體實行解析的區域部分， t者f可構成為，將在初腑職乎無酿到成長的細胞C4、 外’並麵献其它細胞，或錢的細胞之成熟 ^疋手法，自動選擇成熟細胞，實行解析處理。藉此，可將益 ，析必要的未成熟細胞外’減赠理負擔，就所期望之:田 胞以向速實行起源資訊之解析。 :接著，就以上說明的細胞資訊之顯示•發生起源細胞之分 類，示，在指定時刻中自動選擇充分成熟的細胞並予解析處理 之情形所使用之細胞之成熟判定手法加以說明。此外，在以下 201106010 為了表現細胞之成長狀態，則適宜使用細胞塊之語句。 培養細胞在培養基内向平面擴展的平面培養中， 在iPS細 二^細胞等之細胞成長成具有社會性之細胞塊之過程中開 二=二!_匕1複層化擴展至細胞塊全區域並漸成熟。因此，藉由 二序算自時間序列影像在各時刻或時刻関於細胞之複 Hi徵量(以下稱為複層化特徵量），並採用該複層化特徵 里之日上間的變化即可判斷細胞之成熟度(成熟狀態）。 .本„兒明書中，作為關於細胞之複層化之複層化特徵量有 旦(1)根據觀察影像間局部區域之區塊比對所致近似度的 姑:二(2)根據細胞塊之輪廓附近之亮度值的統計量、（3)根 據.、，田胞塊之輪廓形狀的統計量。 ⑴利用影像間局部區域之區塊比對所致近似度之方法 之觀時間中所攝影的時間序列影像中時刻t 以第二二3 :像’次時刻t+1之觀察影像(第二影像）， 汐====== 據5亥代表近似度使騎量作為複層化特徵量。 此係利用細胞不予複層化的單層區域之部位、與 下特徵者…個細胞在成長或複數細胞i隼 動或旋轉，亦可觀察細胞彼關之境界， 細胞塊内部由於變化是朝上下方向進行;:，在 影像之空間的構造或明亮度大幅改^刀I戈移動而起泡，故 的移畴之魏係以空間 比對時，匹配之程卿上有4 ^像之對應位置的周邊進行區塊 皰相對於此，在複層化區財，在細 匕内权不僅疋空間的移動，而且伴隨構造的變化，故即 201106010 ίίΐΣίϊΐ/f度亦低。可利用相闕值或差分值、 ίίίί 精嘛之情形，在 低，藉由代表近似度之又大°小，而則代表近似度變 間局部區域之區塊比對係在影像處理裝二 之影像處理程式GP中進行複声仆Λβ/ 貫丁本方法 之流程圖係如第九圖所示層化指之檢測處理之部分SP1 影像解析部⑽係首先在步驟切巾，自記憶於 胞取^刻|之第—影像(例如第十⑷圖所示細 2驟您中’藉由與影像處理程式gpi、嫩 記及d 气觀察影像中所含有細胞之提取、標 了減】在旦^之細胞與第二影像細胞之一-對應。此時，為
If i、= 胞之旋轉或移動所致效果’故進行各細胞 其H對準係以各細胞之重心位置或外接矩形之頂 最藉由使角度一致而使圖形力矩之相關呈 敢大(差f值最小）’即可抑制旋轉之效果。 像之作驟中’就第一影像之細胞，設定以形成影 ，象、i像素作為中心的局部區域a。「局部區域」a係如第十- 底之框包圍之表示，設定為相較於細胞塊之大小 係設定於5x5至15x15像素左右(起源細胞 ίί、。局部區域之位置’其之構成係例如以 、，，·田匕之輪廓端部作為起點加以自動設定而構成。 對。區定之局部區域，在步驟S34中係進行區塊比 ΛΛϋ在/—影像中如第十一⑷圖所設定的局部區域 中含ΐΐί位fii準’如第十一 (b)圖所示’相對於第二影像 ΐ之周邊’掃描局部區域A之亮度分布， 度’並探索匹配度最高的位置。近似度 ’ r μ分布之侧或差分值、或者乘法等， 在使用相關之情形’係探索相關值最大的(接近u位置，在使 201106010 匹ίΐΐΐΐ1形係探索差分值最小的(接近G)位置。接著、 ，配度最純置之近似度作為 ^^ ^者，以 RAM63。在後續則梂佶田鈿 罝心代衣近似度，並記錄於 變化係以細胞之移動作為主體:故在胞塊之 近1之值方面，「之相關值係取大的值(相關值接 代表近似度之相_取小的值 i p 之值)。在步驟S34，係使為比較基準之望一 像之局部【域a，在影像__設讀 ^ ίί)ΓΛ，依次進行區塊比對’就細胞塊全區域 得各部之代表近似度係表矛ί 複層化^狀況。U、近似度之分布就是表示細胞塊全體之 m在此西i目關值之大小，隨著自單層狀態進行至複層化，則 产:示複層化之程度則難以處理。因此，在影像處理 '將㈣S35中代表近似度之相關值予以反 轉，鼢者複層化之進行，而使值變大(0—接近υ。且 巧作為近似度之情形’進行卜相關值之處理广使用 ^值作為種度之_驗行丨差分則之融。在本說明 ^中，藉此該處理所計算的代表近似度係記載為「複層化程 度」。此外’相關值在計算上雖可取一！至+ 1之值，不過負的 值（1，0)係使焭度反轉之情形，因於細胞形狀並無意義， 故所計算的相關值為負值之情形，則以零替換，進行！—相關 值之處理。 少第十二圖中(a)係以虛線例示局部區域之大小，同時，在(b) ，例示將以步驟S35所計算的複層化程度之分布，以視覺上可 谷易判斷方式表現。在該(b)圖中，在被外形輪廓線 L包圍之 細胞塊MC内部，複層化程度低的部位為暗，複層化程度高的 201106010 邛位為明焭，其表現係以按照複層化程度之大小的多階段之級 ，顯^。由該圖明顯可知，就觀察影像所含有之各細胞塊，在 弟一影像之各時刻中可判斷在細胞塊之何等部位進行何 度之複層化。 十影像處理程式SP1亦具備··利用在步驟S35中所計算的 ^層化程度’卿經複層化的雜與不經複層化的部位的功 即’在步驟S36，將在步驟S35中所計算的複層化程度 預先設定的預減界仙賴，靖複層條度之值為 ，界值以上之區域已經複層化。步驟S36之處理，可因應後續 之影像處難狀處理流程絲自操作者之顯示要求等 來貫行。 來·所計算之各_之細胞塊各部之複層化程 二’ 3十鼻根據近似度之統計量，藉由該時間序列變化判斷細胞 f之ϋ。㈣近似紅料量可例舉化程度之總 和、（1丨)複層化部位之占有率。 作為根據近似度的統計量使师)複層化程度之總和之 ί，所計算之各時刻之細胞塊各部之複層化程 ^就細胞塊全體予以總和，求得每—細胞塊各時刻之複層化 程度之總和，藉由導出該複層倾度之總和之_序列變化， 即可判斷細胞塊之成熟狀態(成熟度）。含有前述複層化部位檢 測之程式SP卜根據複層化程度之總和之時間序列變化，判定 細胞塊之成熟度的影像處理程式SP2之流程圖係如第十三圖 所7F。 在圖示之流程圖中’在步驟Al〇，含有前文所述細胞塊之 ==位，之程式SP1(S31至防），在該步驟ai〇中， 係自時刻t之第-影像、與時刻t +!之 部區域之d塊比狀_ m巾細u局 例如’由時刻㈣之觀察影像(第-影像)與時刻ΐ 影 f第二影像），計算_ Μ中細胞塊各部之複層化程Ϊ二 後述同樣地依順序進行與麵狀細峨察影像之局部區^ 20 201106010 ^，J t=V1 t.t 二祭衫像u二影像)計算時刻te中細胞塊各部)之^ 釦，叫·筲益z I V 弟十一圖（b))就細胞塊全體予以她 ki:藉：Ιΐ:=ϊ，…，以k.)之複層‘ 化。 射了旱握在各時刻中各細胞塊何種程度之複層 在步驟A30，係順著時^丨t=1 0 1 t 所計算之各時刻之複片化程;^^…上仏…將步驟細 欠4m復層化私度之總和之值並列成時間序列，就 #T出稷層化程度之總和之時間序列變化。第十四圖係 塊，將藉由步称獅之 化予以圖表t導圖出中處 n " ^ M τ〜识平田馮目知刻t=0之經過時間、縱軸 規^程】度之總和之值除以局部區域之分割數並予正 規化(n_ahZat10n)之情形，則成為〇至〗之值。 ^細胞培養之初期過程，於細胞塊内部 ^因細胞各個之構造清楚，故複層化程度之總和係以== 月Ϊ塊成長並開始複層化時’由於細胞之構造則急遽變 化成一，准並複雜化，故複層化程度之總和之值開始上升，與複 ^化區域之擴大-起上升。複層化區域若擴展至細胞塊之^致 王區域時’總和值之上升鈍化，幾乎不再上升。再者時間一經 過，則今後經複層化的區域之各個細胞變成非常小而漸呈微細 構造變化，故複層化程度之總和取最大值後，有著若干降低之 傾向並推移。 因此，可自由步驟Α30之處理所導出的複層化程度之總 和之時間序列變化資訊(稱為複層化程度時間序列資訊)來判 斷各細胞塊之成熟狀態。例如，在複層化程度時間序列資訊 中，複層化程度之總和開始上升時，可判斷以該細胞塊之複層 化之成長開始進行，在複層化程度之總和上升時可判斷在成長 21 201106010 I處程度之總和取在預定以上的最大值時，或者超 越峰，進人毅期或減少期時，則可判_細胞塊已成熟。 之時ΐί 程式SP2 ’係自步驟A3G中所導出複層化程度 之巧序列減’就觀察影像中各細胞塊，在步驟A40計算 ίϊί，⑽如最新之觀察時機)為止複層化程度之總和ί 认:、大值’在具有最大值之情形，則判斷該細胞塊為成熟 、、·田I塊。一方面，至指定時刻^為止具有 則判斷該細胞塊尚未成熟。 ^ ，著’根據該影像處理程式SP2賴的成熟判斷，就判斷 成見、的細胞塊，實行前文所述影像處理程式GP卜GP2所致 ，細胞構成之_歧’錄^細胞資訊之齡紐生起源細 顯不。如此一來，預先進行成熟判定，根據在指定時刻中 自f選擇已充分絲的細胞，扣解析處理之構成，可將解析 ^為必要的未顧細胞等除外，減輕處理負擔，而僅就分株或 ^文試驗等所使用之充分成熟的細胞，以高速實行起源資訊之 解析。 、；^據近似度之統計量使用（ii)複層化部位之佔有率之方 ^ ’ :系，步驟S35中所計算之細胞塊各部之複層化程度之分 =，計算相對於各時刻之各細胞塊中細胞塊全體(在指定解析 範圍，情形為指定區域)之複素化部位之佔有比率，亦即，藉 由計算複層化部位之佔有率，導㈣時間序化，而判斷^ 胞塊之成熟狀態(成熟度）。含有前文所述區塊比對所致的複層 化。卩位仏測之私式SP1，根據複層化部位之佔有率之時間序列 變化來判定細胞塊之成熟度的影像處理程式SP3之流程圖係 如第十五圖所示。 ’、 、>在圖示之流程圖中，於步驟Β10係含有前文所述細胞塊 之複層化部位檢測之程式SP1(S31至S36)，在該步驟Β1〇中， ，自時刻t之第-影像與次時刻t+1之第二影像，藉由局部區 域之區塊比對計算時刻t+1中細胞塊各部之複層化程度，並 進行按照所計算複層化程度之大小予以複層化的部位之檢 22 201106010 測。例如，自時刻t=o之觀察影像(第一影像)與 觀察影像(第二影像)檢測在賴t=l中細胞塊之複声 位，在後續同樣地依順序進行與次時刻之觀察 對，自時刻W奴觀察影像(第一影像換時刻 像檢測時刻tc中細胞塊之複層化部位。 C； π/τ、办 在步驟Β20係就在步驟Β10所檢測之複層化 曾 各細胞塊所佔複層化部位之佔有率(面積比率） :二 ，各=刻(B_ t=l，2，...，te-l，tc，…）中複層化部位之佔有? 猎此可掌握各時刻中各細胞塊進行何等程度之複層化。 在步驟B30 ’係將在步驟B2〇所計算之各時刻曰之 位之占有率之值順著時刻t=123〜 = 位之占有率之值順著時刻t=1，2,3，^^== 复f匕部 列，就各細胞塊導出複層化部位佔有率^間序列^匕時g
影像中之一個細胞塊，將以步驟B20 G 為複層化部位之佔有率:、= ==過時間，縱轴 f細胞培養之初期過程，由於複層化雜大部 - 部，之佔有率以較低值推移。在細胞塊成長而複二 并'貞佔有相始提高，並與複層化11域之擴大-^上 展至細胞塊之大致全區域時，佔有^之g 鈍化，且在咼佔有率幾乎不再上升。 升 可判斷細胞塊層化佔有率時間序列資訊〕，而 開始複層ί ΐί開始上升時，可判斷在該細胞塊 長中。又，複在成 細胞塊已成熟 之佔有率在預設以上之值時，可判斷該 侣有率日$ 自步驟b3g中所導出之複層化 貝況就硯察影像中之各細胞塊，將指定時刻 23 201106010 ==最新之觀察時機)中複層化部位之佔有率， 比之判定基準的規定佔有率’麵驟⑽中加二 在複層化部位之佔有率為規定佔有率以上之 j細胞塊為已成熟之細胞塊。—方面，在指定時刻te中$2 :位之佔有料於蚊佔有率之情形，貞彳 ^ ί目有率爾察對象之細胞之類別== ①目的專而適宜設定，不過在ips細胞或ES細胞 硯 一般而言係設定於70至90%左右之範圍内。 頃形， 為成： 芬====== tti的未成熟細胞等除外，減輕處理負擔，僅就分株ί藥 所使用，分成熟之細胞，以高速實行起源資訊i解 析。接者，就利用根據細胞塊之輪廓附近之亮度 作為複層化特徵量之成熟度判定手法加以說明。/°置」 (2)利用根據細麟之輪軸近之亮度叙統計量的 使細胞予以平面培養時之觀察影像係如第十七^立 2。f培養初期，係如同圖⑻所示，匯集之細胞c接著= 養皿等之培養基底面，使細胞塊二維崎展。因此，在細^ MC之輪廓附近不太發生所謂「摻雜質(hal〇s)」。一方面、，細 塊成長並複層化，變得能進行三維地增_，由於在細胞塊上 輪廓部產生厚度’故如同圖⑼所示，因而在細胞塊Mc 廓附近產生摻雜質Η。輪廓附近之摻雜質，在觀察光學系 55a)為相位差顯微鏡之情形，可更明瞭地顯現。 、 本手法係利用伴隨此種細胞塊之複層化而成熟，在輪 近產生摻雜質而使亮度值變化之特性。根據亮度值之統計量之 例，係提不使細胞塊之輪廓附近之亮度值予以總和的亮产妯 和’沿著對細胞塊之總輪廓長之輪廓的一定亮度值以上之 24 201106010 (#师長度/總輪綠度）。本手法之影 像處，式SP4之流程圖係如第十八圖所示。 議㈣步驟C1G中記憶於 C15 山2,…，Vl，tc之時間序列影像，在步驟 GP2 時之觀察影像’藉由與影像處理程式哪、 取、t f樣的手法，進行觀察影像中所含有細胞之提 取彳示纪、及在各影像間細胞之一一對應。 輪产二步?二〇:Λ對於在步驟C15提取的各時刻之細胞塊之 外,、度值計算統計量。例如，根據亮度值之統 近ί ίΪ 度總和之情形’就沿著各細胞塊之輪廓的 + 或，3十异在各細胞塊亮度值之總和。近接區域之大小， 胞塊予以複層化時’按照以該觀察系所 細胞塊之總輪練的摻雜質之長度之比率之情形，相對 『^驟α5戶斤提取的細胞塊之輪靡線之總輪綠巧十= 方向 沿著為一定亮度值以上之部分之輪廓線的 ^驟C30’係根據在步驟⑽所計算之各時刻之亮
ΐίΪ蝴著時刻㈣，1，2,…，卜认排列成時間序列’就各i包 據亮度值的統計量之時間序列變化。第十九圖，係表 察影像個細胞塊，藉由步驟C2Q之時間序列變化 处理所計算之輪廓附近之亮度總和之時間的變化予Μ H ϊ=: 齡彳*—間，縱 ，的細胞塊MC之輪_近幾乎不見摻雜f， = ^和在⑽狀態下變化。在細胞塊成長朗始複層=，在匕 接近因複層化而使厚度增大的部位的輪廓附近呈 25 201106010 雜質，而亮度總和開始漸漸增加，盘 大。接著，如⑼般複層化區域顧大一起增 域時，則細胞塊全體被明亮的摻_、=束大致全區 度總和幾乎不再增加。作為根據亮^2旦輪_近之亮 於細胞塊之總輪靡長的摻雜質長n率之’在使用相對 時間序列變化進行推移。、比羊之情形’亦以同樣的 因此，可自根據以步驟⑽ =時間序列變化資訊(稱為亮度統計*^^之： 畊各細胞塊之成熟狀態。例如，在亮=貝^)判 :附近之亮度總和開始增加0二== 化之成長’在免度總和增树，崎在成長巾。接著， 之ΐ加傾向變的和緩’增加率呈現預設值以下時或 成和呈現規定之總和臨界值社時，可騎該細胞塊已 曰在影像處理程式SP4巾，自步驟C3〇中所導 訊’就觀察影像中各細胞塊，將指定時刻〔(例如 基準而預先δ又疋的規定之總和臨界值在步驟C40中相 ，輪廓附近之亮度總和為規定之總和臨界值以上之情形，則判 成熟的細胞塊，一方面，在指定時刻tc中輪細 度總和小於規定之總和臨界值之情形，則判斷該細胞塊 ίίίί=據亮度值之統計量’亦與相對於細胞塊之總輪廓 長的摻雜質長度之比率之情形相同，將相對於指定時刻t中細 胞塊之總輪的摻雜質長度之比率，與作為度之判定基 準而預先設定之摻雜質之規定比率相對照，在相對於總輪廓長 的摻雜質長度之比率為規定比率以上情形，則判斷細胞塊已成 熟。 一接著’根據影像處理程式SP4所致的成熟判斷，就判斷為 成熟的細胞塊，實行前文所述影像處理程式GP1、GP2所致的 細胞構成之解析處理，並輸出細胞資訊之顯示或發生起源細胞 26 201106010 之，示。因此，在本手法t，由於在敏時财已十分成孰的 動選擇並進行發生起源細胞等之解析處理，故將解析 ίΐ'ϋ之未成熟的細胞等除外，減輕處理負擔，可以高速實 辽起2=解析。接著彻「根據細胞塊之輪廓形狀之統計 里」作為稷層化特徵量的成熟度判定手法加以說明。 (3)利用根據細胞塊之輪廓形狀之統計量之手法 圖所不’在細胞培養之初期過程，因細胞c :近存在各個細胞，細胞塊之輪廓形狀成為4== =狀。在細胞塊之成長進行時，輪神之凹凸被緩緩吸收， 穩’在藉域層化使細輯造三維地形成的時 肺細胞塊進行成熟的程’利用細胞塊之輪 表歹！ &不細胞塊之輪腐之複雜度。細胞塊之輪靡 相鬼之面積的周圍長之比率(周圍長/面積 1予 示。+法之影像處理程式Gps之流程圖如第二十圖所 影像解析部12〇係在步驟m〇中讀 影像，在步驟D15情由姆於各日^ 之所含有細胞之提取：= 塊之=之細胞 眘心士 〃 據J逑細胞塊之輪廓形狀的統計量。a太 戶 細胞塊之輪·之複雜度’計算相對於最外ii n田胞塊之面積的周圍長(總輪廓長)之比率。窃 細胞塊根#__ ^量3 27 201106010 係就觀察影像中之一個細胞塊，將由步驟D2〇之 ‘ 化導出處理所計算之細胞塊輪廓之複雜度之時間的^ =變 =度圖中之橫轴係自時刻㈣之經過時間“^ 如第十七⑷圖、第十七(b)圖所示，在細胞培養之 細胞匯集而細胞塊擴展成二維，由於細胞塊之輪人= ΐίϋϊ複雜形狀，故在步驟D2G中所計算的輪廓之i雜 又阿值皮動。在細胞塊之成長進行時，凹凸被緩緩地明你 =廓形狀成為平穩，輪廓之複雜度隨著時間之經過而降低。再 =在，内部進行複層化時，細胞塊之輪靡形狀呈橢J 圓形，輪廓之複雜度在低值幾乎不再減少。 _至 因此，自根據以步驟D30之處理所導出的細胞塊之 統f量之時間序列變化資訊(稱為輪廓形狀統計量‘ 序列資訊），可判斷各細胞塊之成熟狀態。例如，;J ] =量時間序列資訊中，在輪廟之複雜度開始降低時1斷 =田胞塊向著複層化之轉_，在輪廓之複 =在複層化之成長中。，輪廓之複雜度之向= 降低率成為預設值以下時，或者輪廓之複雜度在規定Ϊ 硬雜度以下時，則可判斷該細胞塊已成熟。 在第二十圖所示影像處理程式GP5中，自步驟D3〇中所 導出輪廓雜統計量時間賴資訊，峨察影像巾之各細胞 ，，將指定__如最新之祕時機)中麵之複雜度與作 為成熟度之判定基準而預先設定之規定複雜度在步驟d4〇中 相對照，在細胞塊之輪廓之複雜度為規定之複雜度以下之情 形，則判斷該細胞塊為成熟的細胞塊。一方面，在^定時刻t 中細胞塊之輪廓之複超過規定之複雜度之情/則判斷該C 細胞塊尚未成熟。 接著’根據影像處理程式SP5所致的成熟判斷，就判斷為 成熟的細胞塊’實行前文所述影像處理程式Gpi、Gp2所致的 細胞構成之解析處理’並輸出細胞資訊之顯示或發生起源細胞 28 201106010 之顯示。因心即使在本手糾’在指定時射充分成熟的細 胞被自動選擇並進行發生起源細胞等之解析處理，故將解 為必要之未成熟的細胞等除外，可減輕處理負擔，並可以言 實行起源資訊之解析。 151、 第一圖係將以上說明的影像處理程式GP(Gn、Gp旦, 像處理程式SP(SP1 s SP5)加以組合，在指定時刻te中自^ 擇充分成熟的細胞，進行發生起源細胞等之解析處理的自魬 析程式AP之概要流程圖。 畔 在自動解析程式AP，首先讀出並取得步驟S1中 卜0，1，2，〜上-1入，"，之時間序列影像，在步驟32中，相對於^ 時刻之觀察影像，藉由敎所述手法，進行觀察影像中所含 細胞之提取、標記、及各影像間之細胞之一一對應。 1 接著，在步驟S3，係使影像處理程式spi至sp5之任— f，或者該等影像處理程式SP1至SP5予以複數組合，在々 定時刻U例如最新之觀察時機）巾就觀察影像所含有之細^ 塊，進行各細胞塊是否充分成熟之成熟度之判定處理。匕 ，著’在步驟S钟’就藉由步驟S3之成熟度判定處理 疋成的細胞塊，進行對關連之細胞塊之附ID(或者除了 未，熟的細胞塊之對細胞塊之附ID)。接著，在步驟s5二 ^理程式GIM、GP2之至少-者，亦即，使時間序列影= 者，間軸在_方向或經_方向之任—方向或兩方向，^ ^胞追蹤賊的ID鮮(細胞#默翻）。接著進行步 在源細胞與構成細缝之計#、分_之解析， 在^，87中輸出顯示解析結果於顯示面板72等。 實行自動解析程式AP，並顯示解析結果顯示之應 成例係如第二十二圖所示。在該^例二 2内二，设置：在顯示面板72之畫面，自收容於培養室 内^硬數個培養容器1G選擇觀察對象之培養皿選 之觀m戶Γ擇的培養容器之全體影像指定特定之觀察位置 觀/T、位置顯示資訊框82 ;就所指定的觀察位置，顯示解析 29 201106010 察影像齡資訊框83;就指定峨察位置(或 胞塊，顯示按照發生起源細胞數的組織 回導數(dei^vative)組織圖顯示資訊框85等。 組圖示之實關，絲示在培養皿麵資訊框81中選擇 ίίΪΐί，2之培養容11，在觀察位置齡資訊框82中 /V，日疋ϋ框之部位的狀態。在觀察影像顯示資訊框 中’係例不就藉由成熟細胞之判定處理判定在指定時刻t 細胞塊’顯示解析結果，在圖中係按照構成細胞塊之 數進行彩色之色彩區別顯示之構成。由該顯示可 ，硯⑦衫像中已成熟的細胞塊，可瞬間且正確地掌握是否 二 成之在，或是由幾個之發生起源細胞所構成 荨此外，猎由切換设置於該資訊框下部的顯示選擇 Ϊ楚可如第八圖所示，進行各細胞塊之單一化數之顯示， 欢笫/、圖所示各細胞塊之發生起源細胞之顯示等。 在導數喊醜讀t罐85，係就峽在彳旨料刻 ^的細胞塊，顯示為構成細胞塊之發生起源細胞^數 ^化數）、縱軸為各單—化數之細胞塊之健之組織圖 ，3織圖顯示，可掌握所培養細胞塊之全體像，例如，從^ 扬育料細胞或培養條件等之觀點言之，成為有效的資訊。 上說明，在本發明之細胞之分類手法、影像處理程式 Jr像J理裝置中，自以成像裝置所攝影之時間序列影像，使 弟一、第二影像沿著時間軸依順序偏移，同時進行細胞之提取 細胞之單一化或分離作為各細胞之細胞資訊依 ' 替，根據所接替的細胞資訊進行細胞之分類。因此，根 明’即使培養觀察已經過一定時間，藉由細胞之成長或 =化而使多數細胞在如成熟期之情形，亦可正確地掌握各細 匕之起源或構成’並準確地進行細胞之挑選·評價。 、 ^外，在以上說明的實施形態，雖然例示之彳冓成為，在谇 BS中被成像裝置攝影，並讀出記憶於RAM63 ^ 曰序列景>像(影像數據），解析各細胞，不過亦可構成為，在 201106010 其它觀察系統中，讀取記錄於所攝影之磁性記恃 胞取經由通信線路傳送而至之時間序列影像a等間 接著，就本發明之實施形態之細胞塊之製造方 十三圖並予說明。該製造方法，基本上係句冬.=弟— 養步驟(S11G);與使时述影像處理裝置，觀“ 養之細胞’進行因培養而變化之細胞中細胞ϋ分ί之 分頰步驟(S120至S190)。 刀頌t ” 1培養細胞之培養步驟(Sll〇);將在 ^養步驟中所培養之細胞’以成像ft置攝影，取得因 良化之細胞中細胞塊之時間序列影像之取得步驟 步驟中在取得的時間序列影像之中自預設之時刻)所& 2二景!像/ϊ取該影像所含有之細胞之第-提取:驟 提取該影像所含有之細胞的第二提取步驟(s刚）；進#自第t ί_取之㈣之―對應，判 像之複數個細胞被第二影像—體化成為1 ⑻H狀丨細胞鮮：影像分離成複數個 i达第—影像之複數個細胞被第二影像—體化而成為 t 一體化之細胞賦予一體化前之細胞資訊之步 々” 在使第—影像之1個細胞在第二影像分離成複數個 ttff ’，纟已分離的各細胞，賦予分離前之細胞資訊之步驟 在步驟S12G取得的各時間序列影像進行該等步驟 咖紅分丨^’使各時間序列影像作為該第—及第二影像沿著 =車^序分配’同時實行該細胞之提取及一一對應，依順 /C1 om〜像十所含有各細胞之該細胞資訊之接替步驟 j 就任意時刻所攝影之影像所含有之細胞，根據該接替 、、=貝§fl ’進行細胞塊之分類之分齡驟(S19G);根據預設 之基準，挑選細胞塊之挑選步驟(S200);採取、保存已挑選的 細胞塊之採取保存步驟(咖），而構成製造方法 。it匕夕卜，戶斤g 31 201106010 養之細胞可為來自人、牛、馬、豬、 來自植物之細胞。又，細胞塊之保存亦可為胞，亦可 【圖式簡單說明】 熟細胞並進行景;像::J 处1 ’其係進行自動識別已成 要構S圖係顯示作為本發明之適關的培養觀察系統之概 第三圖係前述培養觀察系統之方塊圖。 理裝置之概要構成之方塊圖。 處理程式GP1之流程^軸之方向解析時間序列影像的影像 理程玆以影像處 時間方向解析 筮士 + 像解析之態樣示意說明圖。 檢測;一 ⑷;^部區域之構成例 塊比對之狀況之說_^)對應位置之近旁部，用以說明實行區 M. 例示對細胞塊之局部區域之大小的說明圖 條紅料，以至白之 第十二圖係根據複層化程度之總和之時間序列變化判定 細胞塊之成熟度之影像處理程式SP2之流程V。㈣ 32 201106010 第十四圖係將複層化程度之總和之時間的變化 化的說明圖。 第十五圖係根據複層化部位之佔有率之時間序列判 定細胞塊之成熟度的影像處理程式SP3之流程圖。 第十六圖係將複層化部位之佔有率之時間3變化 化的說明圖。 第十七圖係細胞塊之觀察影像的示意的說明圖、(a)細胞培 養之初期過程、（b)複層化區域擴及全區域的成熟狀態。' ° 第十八圖係根據細胞塊之輪廓附近之亮度值總和等之 間序列變化’判斷細胞塊之成熟度的影像處理程式sp4之流程 圖。 第十九圖係將細胞塊之輪廓附近之亮度值總和之時 化予以圖表化的說明圖。 & 、第二十圖係根據細胞塊之輪廓形狀之複雜度等之時間序 列變巧判定細胞塊之成熟度之影像處理程式sp5之流程圖。 第一十一圖係將細胞塊之輪廓之複雜度之時間變化予以 圖表化的說明圖。 第二十二圖係顯示解析結果的使用者界面之構成例。 第二十三圖係顯示細胞塊之製造方法的流程圖。 【主要元彳 元件 說明 1 外殼 2 培養室 3 存放架 4 _ 搬送軍元 5 觀察單元 6 控制單元 7 卜—操作盤 _]0___ _培養容器 試料台 16 _ 窗部 21 _____溫度調鲞裝置 22 加溼器 33 201106010 23 氣體供給裝置 24 循環風扇 25 環境感測器 41 Z台 42 Y台 43 X台 45 支持臂 51 第一照明部 52 第二照明部 53 第三照明部 54 巨觀觀察系 54a 觀察光學系 54c 成像裝置 55 顯微觀察系 55a 觀察光學系 55c 成像裝置 61 CPU(電腦） 62 ROM 63 RAM 65 通信部 71 操作面板 72 顯示面板 81 培養皿選擇資訊框 82 觀察位置顯示資訊框 83 觀察影像顯示資訊框 85 導數組織圖顯示資訊框 100 影像處理裝置 120 影像解析部 130 輸出部 A 局部區域 AP 影像處理程式 BS 培養觀察系統 C 細胞 MC 細胞塊 L 外形輪廓線 H 摻雜質 GP1 ' GP2 影像處理程式 SP1 至 SP5 影像處理程式(進行成熟度判斷的副程式） 34