CN106133503B - 球状体评价方法以及球状体评价装置 - Google Patents

Abstract

具有：确定包括球状体及球状体的周围区域在内的图像中的球状体所占的球状体区域的工序(S105)；根据球状体区域的图像密度求出球状体的光密度的平均值以及该光密度在所述球状体内的偏差的工序(S106)；根据球状体区域的轮廓求出球状体的圆度的工序(S107)；根据球状体区域的周缘部以及中央部各自的图像密度求出球状体的清晰度的工序(S108)；以及将光密度的平均值、光密度的偏差、球状体的圆度以及球状体的清晰度代入规定的运算公式来求出球状体的损坏度的工序(S109)。

Description

球状体评价方法以及球状体评价装置

技术领域

本发明涉及根据拍摄有球状体(Spheroid)的图像评价该球状体的损坏度的评价方法以及评价装置。

相关申请的相互参照

以下所示的日本申请的说明书、附图以及权利要求书中的公开内容通过引用其所有内容记载在本说明书中。

日本特愿2014-063860(2014年3月26日申请)；

日本特愿2014-167074(2014年8月20日申请)。

背景技术

作为用于调查化合物对细胞的影响的一个试验公知有菌落形成法。该方法利用只要培养环境适当细胞就反复繁殖形成菌落的特性。即，在添加有作为评价对象的化合物的环境下培养细胞，根据在该环境下形成的菌落数量的计算结果，评价化合物对细胞的生死具有怎样的影响(例如，参照专利文献1)。在该方法中，通常，将在琼脂培养基等的表面二维繁殖的细胞菌落作为计算对象。

另一方面，作为更接近生物体的细胞的培养方法具有三维培养，此时，被培养出的细胞形成球状的块，因此称为球状体(细胞聚集块)。球状体不仅是由一个细胞繁殖而成的，而且是多个细胞相互靠近聚集而成的。因此，在对球状体的观察过程中，需要判断多个细胞的球状体形成能力或球状体维持能力。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2005-502354号公报

发明内容

发明所要解决的问题

由于球状体具有立体结构，所以仅从一个方向进行观察很难正确判断其状态。因此，作为定量地评价球状体状态的方法，向培养基中添加试剂，测定细胞因生物化学反应而产生的吸光或发光状态。但是，这样测定的测定结果的偏差大，另外，试剂等的成本高。而且，在测定时，存在因球状体被破坏而不能够继续试验的问题。

因此，希望确立一种以非侵入的方式观察球状体的状态且简单可靠地评价球状体的状态的技术。例如考虑拍摄球状体的光学图像并根据该图像判断球状体状态的方式。但是，至今没有确立一种分析图像来自动评价球状体状态的技术，当前的现状为凭借熟练者主观进行判断。

解决问题的技术方案

本发明是鉴于上述问题而提出的，其目的在于提供能够根据拍摄有球状体的图像客观且稳定地评价该球状体的损坏度的技术。

本发明一种方式为根据拍摄有球状体的图像评价该球状体的损坏度的球状体评价方法，包括：确定包括所述球状体及所述球状体的周围区域在内的所述图像中的所述球状体所占的球状体区域的工序；根据所述球状体区域的图像密度求出所述球状体的光密度的平均值以及该光密度在所述球状体内的偏差的大小的工序；根据所述球状体区域的轮廓求出所述球状体的圆度的工序；根据所述球状体及所述球状体的周围区域的图像密度求出所述球状体的清晰度的工序；以及将所述光密度的平均值、所述光密度的偏差的大小、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度代入规定的运算公式来求出所述球状体的损坏度的工序。

另外，本发明的其它方式为球状体评价装置，根据拍摄有球状体的图像判定该球状体的损坏度，具有：图像取得单元，其取得包含所述球状体及所述球状体的周围区域在内的图像；图像处理单元，其确定所述图像中的所述球状体所占的球状体区域，根据所述球状体区域的图像密度求出所述球状体的光密度的平均值以及该光密度在所述球状体内的偏差的大小，且根据所述球状体区域的轮廓求出所述球状体的圆度，根据所述球状体及所述球状体的周围区域的图像密度求出所述球状体的清晰度；以及损坏度计算单元，其基于所述光密度的平均值、所述光密度的偏差的大小、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度，求出所述球状体的损坏度。

活性高的球状体具有在培养基内多个细胞结合而接近球形的形状。相对于此，在衰变的细胞中，丧失球状体形成能力，细胞间的结合变弱，球状体损坏。即，不能够维持球状体的形状。因此，若能够定量地表示其损坏的程度则方便。以往，例如通过显微镜等直接观察球状体，或者，熟练者基于从某个方向拍摄有球状体的图像，主观判断因添加化合物而球状体的状态变化即损坏度。

另一方面，这些发明根据拍摄有球状体的图像将该球状体的损坏度自动地定量化，由此能够客观且稳定地评价球状体的损坏度。具体地说，针对根据图像确定的球状体区域，求出其光密度的平均值、偏差的大小、圆度以及清晰度，基于这些信息求出球状体的损坏度。

在由活性高的细胞形成的球状体中，其轮廓接近圆形且清晰。相对于此，在损坏持续发展的球状体中，形状变形，轮廓也变得不清晰。另外，相对于活细胞具有比较淡且均匀的颜色，在死亡的细胞中颜色变深。因此，在包含死亡的细胞的球状体中，光密度整体变为高密度，其偏差也变大。

表示球状体状态的这些指标能够根据图像进行定量化地求出，通过基于这些值的运算，求出球状体的损坏度，在本发明中，能够对球状体的状态进行客观且稳定地评价。

发明效果

根据本发明，基于能够根据球状体的图像机械性地导出的信息评价球状体的损坏度。因此，能够不依赖于利用者的主观判断，而客观且稳定地进行评价。

一边参照附图一边阅读如下详细说明，能够更加完全地明确本发明的所述以及其它的目的和新的特征。但是，附图仅用于说明，不限定本发明的范围。

附图说明

图1是表示本发明的球状体评价装置的一个实施方式的概略结构的图。

图2A是示意性表示球状体的外观的第一图。

图2B是示意性表示球状体的外观的第二图。

图2C是示意性表示球状体的外观的第三图。

图3是表示该实施方式的球状体的评价处理的流程图。

图4是表示损坏度的计算公式的概念的图。

图5是表示确定球状体损坏度的计算公式的处理的流程图。

图6A是表示损坏度的正态化的原理的第一图。

图6B是表示损坏度的正态化的原理的第二图。

具体实施方式

图1是表示本发明的球状体评价装置(以下，简称为“评价装置”)的一个实施方式的概略结构的图。该评价装置1是如下装置，即，拍摄在液体中培养的球状体(细胞聚集块)，评价其损坏度，该液体注入孔板(well plate)WP的上表面上所形成的称为孔W的凹部中。以下，为了统一表示各图中的方向，如图1那样设定XYZ正交坐标轴。在此，XY平面表示水平面，Z轴表示铅垂轴。更详细地说，+Z方向表示铅垂朝上的方向。

孔板WP是在药物研究和生物科学领域中通常使用的设备，在平板状的板的上表面设置有多个截面为大致圆形筒状且底面透明的平坦的孔W。一个孔板WP中的孔W的数量是任意的，但是例如能够使用96个(12×8的矩阵排列)孔的孔板。具有代表性地，各孔W的直径以及深度为几mm左右。此外，以该评价装置1为对象的孔板的尺寸和孔的数量不限于此，可以为任意值，例如能够使用384个孔的孔板。

在孔板WP的各孔W中注入规定量的作为培养基的液体。在该液体中以规定的培养条件培养出的球状体成为该拍摄装置1的拍摄对象。培养基可以为添加有适当的试剂而形成的培养基，或者可以为以液态投入孔W中后凝胶化而形成的培养基。常用的通常液量为50至200微升左右。如后所述，在该评价装置1中，例如，能够将在孔W的内底面培养出的球状体作为拍摄对象。

评价装置1具有对孔板WP进行保持的保持架11、配置在保持架11的上方的照明部12、配置在保持架11的下方的拍摄部13以及具有对这些各部分的动作进行控制的CPU141的控制部14。保持架11与在各孔W中承载有液体和样品的孔板WP的下表面周缘部当接，将孔板WP保持为大致水平姿态。

照明部12朝向被保持架11保持的孔板WP出射适宜的漫射光(例如白色光)。更具体地说，例如能够将作为光源的白色LED(Light Emitting Diode)光源与漫反射板的组合用作照明部12。通过照明部12，从上方对设置于孔板WP上的孔W内的球状体进行照明。

在被保持架11保持的孔板WP的下方设置有拍摄部13。拍摄部13在孔板WP的正下方位置配置有省略了图示的拍摄光学系统，拍摄光学系统的光轴朝向铅垂方向(Z方向)。

通过拍摄部13拍摄孔W内的球状体。具体地说，从照明部12出射且从孔W的上方入射至液体的光对拍摄对象物进行照明，从孔W底面向下方透过的光经由拍摄光学系统入射至未图示的拍摄元件的受光面。拍摄对象物的通过拍摄光学系统在拍摄元件的受光面上成像的像，由拍摄元件拍摄。作为拍摄元件能够使用例如CCD(Charge Coupled Device：电偶和器件)传感器或CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor：互补金属氧化物半导体)传感器，并且可以是二维图像传感器或一维图像传感器。

拍摄部13能够借助设置在控制部14上的机械式控制部146在XYZ方向移动。具体地说，机械式控制部146基于来自CPU141的控制指令，使拍摄部13在X方向以及Y方向上移动，由此使拍摄部13相对于孔W在水平方向上移动。另外，通过在Z方向上移动，来进行调焦。在拍摄一个孔W内的拍摄对象物时，机械式控制部146以使拍摄光学系统的光轴与该孔W的中心一致的方式在水平方向上定位拍摄部13。在拍摄部13的拍摄元件为一维图像传感器的情况下，通过使拍摄部13在与图像传感器的长度方向垂直的方向上扫描，能够拍摄二维图像。在这样的拍摄方法中，能够以非接触、非破坏且非侵入的方式对作为拍摄对象的球状体进行拍摄，能够抑制拍摄对球状体的损伤。

另外，在图中如虚线箭头所示，机械式控制部146在使拍摄部13在XY方向上移动时，使照明部12与拍摄部13一起在XY方向上移动。即，照明部12被配置为其光中心与拍摄光学系统的光轴大致一致，在拍摄部13在XY方向上移动时，照明部12与其联动在XY方向上移动。由此，不论拍摄哪个孔W，该孔W的中心以及照明部12的光中心都始终位于拍摄光学系统的光轴上。结果，能够使针对各孔W的照明条件恒定，良好地维持拍摄条件。

从拍摄部13的拍摄元件输出的图像信号被发送至控制部14。即，图像信号输入设置在控制部14中的AD转换器(A/D)143，而转换为数字图像数据。CPU141基于所接收的图像数据适当地进行图像处理。控制部14还具有用于存储图像数据的图像存储器144和用于存储CPU141应该执行的程序或由CPU141生成的数据的存储器145，但是这些存储器可以形成一体。CPU141通过执行存储在存储器145中的控制程序，进行后述的各种运算处理。

另外，在控制部14中设置有接口(IF)部142。接口部142接受来自用户的操作输入，向用户提示处理结果等信息，还与经由通信电路连接的外部装置之间进行数据交换。此外，控制部14可以是具有上述硬件的专用装置，也可以是在个人电脑或工作站等通用处理装置中安装用于实现后述的处理功能的控制程序后的装置。在使用通用处理装置作为控制部14时，只要在评价装置1中具有能够使拍摄部13等各部分动作的最小限度的控制功能即可。

上述那样构成的评价装置1用于评价在孔W内培养的球状体的状态，更具体地说评价球状体的生存力(生存能力)。例如在药物研究筛查领域中，将作为候选药剂的化合物投入癌细胞等靶细胞中，观察其变化。尤其，近年来需要利用接近生物体内的细胞状态的球状体(细胞聚集块)而进行的筛查(screening)。本实施方式的评价装置1能够优选用于这样的用途。

化合物对细胞显示何种药效，能够由抑制细胞所需的化合物的深度即抑制深度(Inhibitory Concentration：IC)定量表示。通常，能够通过对投入有化合物的细胞中的50％的细胞进行抑制的深度即半数抑制深度(IC50)表示该化合物的药效。为了达到这样的目的，需要求出投入化合物后的细胞的成活率的技术。

在被二维培养的细胞中，成活的细胞进行繁殖使细胞菌落成长，另一方面，死亡的细胞不形成菌落。因此，若使化合物进行作用的细胞形成菌落则表示该细胞成活。以往进行的筛查方法即“菌落形成法”为利用该原理，通过计算菌落的形成数量，来估计细胞成活率的技术。

相对于此，在多个细胞聚集而形成立体结构的球状体中，即使细胞因药效而死亡，球状体的数量也不一定减少。此时，因细胞的球状体形成能力减弱而引起球状体损坏。因此，为了求出细胞成活率，需要定量地评价球状体损坏的程度。

图2A至图2C是示意性表示球状体的外观的图。图2A所示的球状体Sp1是由生存力高的细胞构成的例子。如图所示，颜色比较浅的细胞C1形成接近球形的形状。因此，在拍摄有球状体Sp1的二维图像中，球状体Sp1的轮廓为大致圆形。这样的球状体Sp1的损坏度低。

另一方面，在构成球状体的一部分细胞死亡时，如图2B所示的球状体Sp2那样，衰弱或死亡的细胞C2的颜色变深。另外，细胞间的结合力变弱，球状体Sp2的轮廓变为不定形。这样的球状体Sp2比球状体Sp1的损坏度高。进而，若继续损坏，则如图2C所示的球状体Sp3那样，细胞逐渐从球状体表面脱离，脱离后的细胞C3逐渐堆积在球状体Sp3的周围。因此，球状体Sp3的轮廓自身变得不清晰。这样状态的球状体Sp3的损坏度比球状体Sp2高。

这样，通过观察球状体的颜色以及形状等外观变化，能够在某种程度上推定球状体的损坏度。但是，损坏的表现方式因细胞种类和投入的物质的种类等的样品制作条件而不同，另外，即使在同一样品制作条件下，也会产生偏差。因此，为了可靠地评价损坏度，需要综合判断这些外观变化。这样的判断基准至今没有确立，当前停留在通过熟练的判断者以目视观察来主观判定损坏度的方式。因此，对判断者的负荷大，另外，不能避免判定结果的偏差。

本评价装置1的目的在于，基于根据球状体的图像定量地求出的球状体的特征量来求出球状体的损坏度，由此排除因判断者的主观因素而产生的偏差，定量且稳定地评价球状体的状态。以下，说明利用本评价装置1的球状体的评价处理。

图3是表示本实施方式的球状体的评价处理的流程图。在本处理中，拍摄在孔板WP的孔W内培养的球状体，基于根据其图像求出的特征量，定量地求出球状体的损坏度。设置在控制部14中的CPU141基于预先设定的控制程序使装置的各部分进行动作，由此执行本处理。

在本处理中，首先，在孔板WP的各孔中播种作为评价对象的细胞(步骤S101)。具体地说，向孔板WP的各孔W中注入适当的培养基，在培养基中播种细胞。孔板WP例如在未图示的培养单元(incubator unit)内被保持为规定的培养条件，在各孔W内培养球状体(步骤S102)。在将筛查作为候选药剂的化合物作为目的情况下，在规定的时刻，将化合物添加至各孔W中。这样作成包含成为评价对象的球状体的样品。

承载所作成的样品的孔板WP在需要的时刻被载置在评价装置1的保持架11上(步骤S103)。然后，通过拍摄部13拍摄被各孔W承载的球状体(步骤S104)。在本实施方式中，从孔W的上方入射照明光，拍摄部13接受从孔W底面透过的光来进行拍摄。但是，拍摄方法不限于此，为任意方法。

这样，拍摄孔W内的球状体。接着，从所拍摄的图像提取与球状体对应的区域(步骤S105)。能够基于图像所包含的球状体与其周边的背景区域之间的图像密度差确定球状体区域。具体地说，求出整个图像的平均图像密度或者能够推定为整个图像中的背景部分的区域的平均图像密度。将图像内的各像素中的图像密度与平均图像密度之间的差值为规定阈值以上的区域视为球状体区域。相当于球状体的背景的培养基通常无色或具有比构成球状体的细胞的颜色浅的颜色。因此，通过这样提取颜色比较深的区域，能够从背景部分分离确定球状体区域。

此外，因为需要提取球状体的轮廓部分，所以优选球状体的图像完全处于拍摄有球状体的图像的视场内。即，优选拍摄图像包括整个球状体和包围其周围的背景区域。

在这样确定的图像内的球状体区域中，求出该区域的光密度和其偏差(具体地说是光密度的标准偏差)(步骤S106)。如上所述，衰弱的细胞变得比活细胞的颜色更深，因此，在球状体区域内存在光密度高的区域表示构成球状体的细胞衰弱。这样的密度变化有时显现在整个球状体区域，有时显现在局部。因此，作为表示球状体区域的密度的特征量求出整个该区域的光密度的平均值和对该球状体区域内的偏差进行标示的标准偏差。

整个球状体的光密度(Optical Density)的平均值OD例如根据球状体内部的各像素的亮度平均值I1和球状体周围的背景区域内的各像素的亮度平均值I2按照下式求出。

OD＝log₁₀(I2/I1)

另外，对于光密度的标准偏差SD(Standard Deviation)，例如，能够求出球状体区域中的周缘部以外的区域(例如面积为球状体区域的面积的50％的球状体中央区域)内的各像素的亮度值分布中的标准偏差的值。在球状体的周缘部区域，在拍摄原理上，密度偏差不可避免地大，因此优选在除去这样区域的中央区域求出标准偏差。

另外，作为表示图像中的球状体的轮廓形状的特征量，分别计算球状体区域的轮廓的圆度以及清晰度(步骤S107、S108)。对于球状体的圆度Cr，例如在将图像中的球状体区域的面积设定为S，将其轮廓的周长设定为L时，通过下式求出。

Cr＝4πS/L²

另外，若球状体的轮廓清晰，则认为直到球状体区域内的周缘部为止都具有与中央部相同的密度。另一方面，若周缘部密度降低，则轮廓变得不清晰。因此，例如能够通过球状体整体的光密度与其周缘部的光密度之间的比值表示清晰度Sh。具体地说，能够通过下式表示清晰度Sh。

Sh＝ODp/OD

在此，值ODp是球状体周缘部的光密度，能够根据球状体的周缘区域具体地说例如从球状体的轮廓起的规定范围(例如与直径的10％相当的宽度)内的球状体内部区域的亮度平均值I3和背景区域的亮度平均值I2，通过下式表示。

ODp＝log₁₀(I2/I3)

另外，清晰度Sh可以如下那样利用球状体的轮廓的边缘强度(edge intensity)进行定义。认为若球状体具有清晰的轮廓，则在其图像中球状体的内部与外部之间的边界即轮廓的边缘强度高。因此，能够通过将轮廓的边缘强度适当正态化的值表示清晰度。例如，如下所述，假设存在具有与轮廓的边缘强度对应的像素值的像素，能够将该像素的像素值所表示的光密度的值用作表示清晰度的值。

首先，提取球状体的轮廓。具体地说，通过适当的图像处理，确定构成图像的像素中的位于球状体的轮廓部分的像素(以下，称为“轮廓像素”)。作为用于提取轮廓的图像处理存在各种公知技术，因此在此省略详细的说明。此外，轮廓像素是位于球状体的内部与外部之间的边界的像素，且该像素本身属于球状体的内侧。换而言之，将图像中的与球状体的轮廓部分相接触且处于球状体内部的像素确定为轮廓像素。

接着，针对这样求出的轮廓像素计算边缘强度。作为求出边缘强度的处理能够应用各种边缘检测滤波处理。例如优选应用索贝尔(Sobel)滤波、差值滤波、普鲁伊特(Prewitt)滤波、罗伯茨(Roberts)滤波、拉普拉斯滤波等的各种滤波处理。在此，作为边缘检测滤波器的例子，说明应用索贝尔滤波运算的情况。

对于所确定的各轮廓像素的亮度值进行(3×3)的索贝尔滤波运算。图像的水平方向(x方向)以及垂直方向(y方向)上的索贝尔滤波运算的系数矩阵能够分别由下式表示。

x方向：，y方向：

另外，在将针对每个轮廓像素求出的x方向上的滤波运算结果由Sx表示，y方向上的运算结果由Sy表示时，对于该轮廓像素的边缘强度Se能够由下式表示。

这样求出的值Se是相对地表示该轮廓像素相对于其他像素的边缘强度的数值。对于计算原理，在值Se中亮度值的比例(scale)被增加4倍。因此，通过将边缘强度Se的值除以4，能够得到在与像素的亮度值同一比例的数值范围内被正态化的边缘强度。若将属于一个球状体的各个轮廓像素的边缘强度Se的平均值设定为Sa，则值(Sa/4)表示一个球状体的轮廓具有的平均正态化边缘强度，这是对该球状体的轮廓的清晰度进行标示的值。

但是，有时需要排除包围球状体轮廓的背景区域的浓度和照明条件的偏差(阴影：shading)带来的影响。因此，在考虑假想的图像时，该假想的图像为将轮廓像素置换为上述那样求出的正态化边缘强度(Sa/4)作为亮度值的像素的图像，将该图像的轮廓像素的光密度定义为该球状体的清晰度Sh。即，通过下式定义清晰度Sh。

Sh＝log₁₀[Is/(Is-Sa/4)]

在此，值Is为球状体的背景区域的亮度平均值，与之前的亮度平均值I2相同。通过以加入背景区域的亮度后的光密度的维度进行表示，能够排除球状体的背景区域和照明偏差的影响，能够客观地表示各球状体的清晰度Sh。由此，能够将清晰度Sh的值表现为在不同的球状体间能够比较的数值。

根据本发明人的见解确认出，在这样定义了球状体轮廓的清晰度Sh时，对于在图像中能够清楚地依靠视觉识别轮廓的球状体，清晰度Sh为大的值，另一方面，外表轮廓的不清晰程度越大，清晰度Sh越接近0的值。即，通过上述定义，能够定量地且以与熟练判断者的判定结果具有高相关性的高精度表现球状体轮廓的清晰度。

如上所述，作为表示所拍摄的图像中的球状体区域的外形特征的特征量，分别求出球状体区域的光密度的标准偏差SD、光密度的平均值OD、球状体轮廓的圆度Cr以及球状体轮廓的清晰度Sh。根据这样求出的各个数值算出球状体的损坏度(步骤S109)。后面描述其计算方法。

针对已经拍摄以及已经算出损坏度的样品，判断是否继续培养(步骤S110)。若需要培养，则将样品(具体地说，承载样品的孔板WP)返回培养单元，在规定的培养环境下继续培养(步骤S102)。若不需要继续进行培养，则处理结束。

在本评价装置1中，通过拍摄部13检测对样品照射的照明光的透过光，来拍摄样品(球状体)的光学图像。在这样的拍摄方法中，能够非侵入地拍摄样品，对样品造成的损伤小。因此，能够进一步培养供拍摄的样品，观察球状体的形状随时间的变化。因此，能够每隔规定时间对球状体的变化进行拍摄，即能够进行所谓的定时拍摄，并且能够基于结果对球状体进行评价。

接着，说明根据上述特征量求出球状体的损坏度的方法。如上所述，对于如何将球状体损坏度定量化，还没有明确的定义，依赖于熟练者的主观判定。因此，在本实施方式中，将上述那样求出的各特征量(光密度的标准偏差SD、光密度的平均值OD、圆度Cr以及清晰度Sh)作为独立变量，定义能够示出与熟练者的判定结果高度相关的计算公式(函数)。另外，能够利用该计算公式，针对任意的球状体计算其损坏度。

图4是表示损坏度的计算公式的概念的图。利用将上述各特征量(光密度的标准偏差SD、平均值OD、圆度Cr以及清晰度Sh)作为独立变量的函数F0，以下式表示球状体的损坏度H。

H＝F0(SD，OD，Cr，Sh)……(公式1)

其中，在本实施方式中，在将各特征量的值比例缩放至规定的数值范围内后用于计算公式。这是为了避免因各特征量的数值范围各不相同而引起计算变得复杂，误差增大。

具体地说，如图4所示，引入用于比例缩放的函数F1、F2、F3、F4和将比例缩放后的特征量作为独立变量的函数F5，通过下式表示损坏度。

H1＝F5(F1(SD)，F2(OD)，F3(Cr)，F4(Sh))……(公式2)

此外，详细内容后面描述，但在公式2的右边赋予的值为对球状体的损坏度进行标示的值，但是在本实施方式中与最终想要求得的损坏度H不同。在此意义上，在此用附图标记H1表示损坏度。就各特征量的缩放比例而言，能够以各细胞的活性高且没有损坏的球状体，其数值为1，随着损坏程度发展，数值变大的方式适当定义。

对于与光密度的标准偏差SD对应的缩放比例函数F1，例如能够如下进行确定。首先，假设存在没有损坏的理想球状体，考虑该假设球状体的光密度的标准偏差。由于细胞的光密度不均匀，所以该标准偏差为比0大的有限的值，但是在理想的球状体中，细胞间的光密度的偏差极其小。因此，其标准偏差也为小的值。另一方面，在实际的球状体中，考虑到标准偏差的值变得更大。在此意义上，认为光密度的标准偏差SD在上述的假设球状体中最小。因此，用附图标记SDmin表示该假设球状体的光密度的标准偏差。

对于应用于实际的球状体的缩放比例函数F1，只要是如下那样的计算公式即可，即，球状体越接近理想状态而光密度的偏差越小，值越接近1，偏差越大，值越大。例如，能够利用参数i、p通过下式表示。

F1(SD)＝[i×(SD-SDmin)+1]^p……(公式3)

由此，将根据光密度的偏差的观点的球状体的损坏度数值化。

接着，与光密度的平均值OD对应的缩放比例函数F2，例如，在用附图标记ODmax表示没有损坏且光密度最高的球状体的光密度的情况下，能够利用参数j、q通过下式表示。

F2(OD)＝[j×(OD/ODmax-1)+1]^q……(公式4)

但是，对于光密度的平均值OD为ODmax以下的球状体一律为F2(OD)＝1。

这样定义的意义如下。对于光密度的平均值OD为ODmax以下即光密度比规定值低的球状体，从光密度的观点出发，能够视为细胞的活性高且没有损坏的细胞。因此，将比例缩放后的数值设定为1。光密度比上述规定值高的球状体很可能包含死亡的细胞，光密度越高(公式4)，表现的值越大。由此，将根据光密度(平均值)的观点而得到的球状体的损坏度数值化。

针对与球状体的圆度Cr对应的缩放比例函数F3，对于圆度为某个阈值m以上的球状体，返回值1，另一方面，对于圆度比阈值m小的球状体，能够利用参数k、r定义以下式表示的函数。

F3(Cr)＝[k×(m-Cr)+1)^r……(公式5)

对于与球状体的清晰度Sh对应的缩放比例函数F4也相同，对于清晰度为某个阈值n以上的球状体，返回值1，另一方面，对于清晰度小于阈值n的球状体，能够利用参数l、s定义以下式表示的函数。

F4(Sh)＝[l×(n-Sh)+1)^s……(公式6)

作为根据如上述那样被比例缩放的特征量求出损坏度的函数F5，例如，考虑使比例缩放后的各特征量相乘，或者适当地加权然后相加。即，能够利用如下的任意公式。

F5＝[F1(SD)×F2(OD)×F3(Cr)×F4(Sh)]^t……(公式7)

F5＝[a×F1(SD)+b×F2(OD)+c×F3(Cr)+d×F4(Sh)]^t……(公式8)

此外，指数t是为了调整数值的上升斜度而引入的参数。在此，虽然使用公式8，但是可以按照细胞种类和培养基的状态灵活使用公式7以及公式8。

在用函数F0表示损坏度H时，需要决定上述的参数a、b、c、d、i、j、k、l、m、n、p、q、r、s、t。至今尚未确定理论上和唯一决定这些参数的方法。因此，在本实施方式中，以使通过上述原理根据球状体的图像求出的损坏度H和由熟练者判定的该球状体的损坏度的判定结果之间的相关性尽量高的方式，决定各参数。具体地说，如下进行决定。

图5是表示确定球状体损坏度的计算公式的处理的流程图。首先，收集损坏度各不相同的多个球状体图像(步骤S201)。为了提高计算公式的精度，优选收集尽量多的图像。为了达到该目的，例如，向具有多个孔W的孔板WP的各孔W中注入同种培养基，播种同种细胞，预先培养球状体，利用拍摄有所培养的球状体的图像。可以在一个孔W中各培养一个球状体，对各个球状体进行拍摄，或者也可以在一个孔W中培养多个球状体，分别单独对它们进行拍摄。另外，可以收集过去对同一细胞种类、同一培养基拍摄的球状体的图像。

另外，针对所收集的图像的球状体，通过熟练者的判定赋予损坏度(步骤S202)。对于损坏度，例如能够形成0、1、2、3这样的4个等级，对于判断为没有发生损坏的球状体损坏度赋予0，另一方面，损坏的程度越发大，赋予越大的数值。此外，损坏度不限于分为4个等级可以为任意值。

根据所收集的图像，求出各球状体的特征量，即光密度的标准偏差SD、光密度的平均值OD、圆度Cr和清晰度Sh(步骤S203)。并且，以使将所算出的各特征量SD、OD、Cr、Sh代入公式8而求出的函数F5的值即损坏度H与在步骤S202中被赋予的值尽量一致的方式，求出上式的各参数。例如，通过进行如下的回归分析(步骤S204)能够决定上式中的各参数，在该回归分析(步骤S204)中，将针对多个图像中的各个图像分别求出的特征量SD、OD、Cr、Sh作为因变量，将所赋予的损坏度作为自变量。对于回归分析公知各种方法，由于在本实施方式中也能够使用这些公知技术，所以省略说明。另外，可以基于各种机械学习技术确定计算公式。

这样，决定表示损坏度H的计算公式的参数a、b、c，d、i、j、k、l、m、n、p、q、r、s、t。这样，对于没有判定损坏度的球状体，在原理上能够基于该球状体的特征量和计算公式算出损坏度。但是，在本实施方式中还如下调整计算公式(步骤S205)。

为了使通过计算求出的损坏度H的数值与熟练者的判定结果一致，需要以0至3的数值范围表示损坏度H。但是，作为评价对象物的球状体具有比较大的个体偏差，在步骤S202中，在判断者对球状体赋予损坏度时，判定结果也可能产生偏差。因此，在包含这些偏差的状态下求出的计算公式的结果的数值范围有时未必在0至3以内。从而需要用于对其修正的正态化步骤。

图6A以及图6B是表示损坏度的正态化的原理的图。将判断者对多个球状体图像赋予的球状体的损坏度设定为H0，将根据回归分析所确定的计算公式(函数F5)求出的该球状体的损坏度设定为H1，在H0-H1的空间中进行制图。这样，如图6A所示，使用同一计算公式针对外形特征不同的球状体求出的损坏度H1具有某种程度的偏差。在使该损坏度H1正态化来求出最终的损坏度H时，在原理上，将通过计算而得到的损坏度的最大值H1max与损坏度H＝3对应，将最小值H1min与损坏度H＝0对应，来进行正态化即可。

但是，在这样针对各球状体计算出的H1的值中包含因图像噪音或判断者的误判而变为异常的值。因此，在本实施方式中，如图6B所示，将针对多个球状体算出的损坏度H1中的从大的值起依次进入规定的范围(例如排在前面的10％)的值都置换为排在次位的值H2max。对于损坏度H1中的小的值也相同，例如将排在后面的10％的值置换为排在后面的值H2min。即，若用附图标记H2表示置换后的损坏度，则如下那样分情况进行表示。

在H1＞H2max时，H2＝H2max

在H1＜H2min时，H2＝H2min

在H2min≤H1≤H2max时，H2＝H1

并且，将置换后的损坏度的最大值H2max与损坏度H＝3对应，将最小值H2min与损坏度H＝0对应。通过这样正态化，能够在0至3的数值范围内表示所有球状体的损坏度H，而且，能够避免因值突出的数据而使计算精度降低的情况。

在针对任意的球状体计算损坏度H时，针对该球状体求出特征量SD、OD、Cr、Sh，基于这些值和决定了参数的函数F1～F5，计算值H1。另外，在计算值H1超过H2max时以及小于H2min时，分别使值变为H2max以及H2min，来求出值H2。

通过将该值H2代入根据图6B的关系得到的下式来最终求出损坏度H。

H＝3×(H2-H2min)/(H2max-H2min)……(公式9)

在此，右边的常数3是为了通过0至3的值表示损坏度H的正态化系数。在本实施方式中，与判断者以0至3这样的4个等级判定损坏度相对应，正态化系数为3。

在更加通常的情况下，在以过z个等级表示损坏度时，能够通过下式求出0至(z-1)的值的损坏度H。

H＝(z-1)×(H2-H2min)/(H2max-H2min)……(公式10)

在此，值H2是通过将球状体的特征量SD、OD、Cr、Sh的值代入所述公式1至公式8而求得的值，公式10的右边只能是将特征量SD、OD、Cr、Sh作为独立变量的函数F0。

根据上述的理论可知，根据公式10，球状体的光密度的偏差越大，损坏度的值越大，另外，球状体的光密度的平均值越高，损坏度的值越大。另外，球状体轮廓的圆度越低，损坏度的值越大，球状体轮廓的清晰度越低，损坏度的值越大。

此外，因细胞种类和培养基的状态的不同，球状体的外观特征也不同。因此，需要按照各个细胞种类和各个培养基的状态确定基于上述的球状体的特征量的计算公式。这样按照各个细胞种类和培养基的状态确定的计算公式能够用于在同一条件(细胞种类以及培养基)下培养的球状体。因此，能够不受判断者的主观影响而客观且稳定地根据球状体的特征量求出其损坏度。此外，在定义不同的计算公式时，能够考虑在形式上相同的计算公式中改变参数的方法，和使计算公式的形式本身不同的方法。

如以上说明，在上述实施方式的球状体评价装置1中，保持架11作为本发明的“保持部”发挥功能，另外，拍摄部13作为本发明的“拍摄部”发挥功能，这些一体作为本发明的“图像取得单元”发挥功能。另外，CPU141具有本发明的“图像处理单元”以及“损坏度计算单元”的功能。

如上所述，针对在本发明中用于求出损坏度的运算公式，能够通过执行如下的回归分析求出参数，在该回归分析中，例如，收集多个赋予了对损坏度进行标示的数值后的球状体的图像，将针对所收集的图像分别求出的球状体的光密度的平均值、光密度的偏差的大小、球状体的圆度以及球状体的清晰度作为因变量，将该图像的损坏度的数值作为自变量。

对于球状体的损坏度需要从各种观点进行综合判断，当前难于仅根据客观数值唯一地确定损坏度本身。另一方面，熟练者能够通过对球状体图像的目视观察，以比较高的再现性判定损坏度。因此，只要导出如下的运算公式即可，在该运算公式中，针对多个球状体图像，使各图像与例如由熟练者预先判定的损坏度对应关联，以高几率使通过如下的运算求出的损坏度的值和与该图像对应关联的损坏度的值一致，在上述运算中基于根据各图像求出的球状体的光密度的平均值、光密度的偏差的大小、球状体的圆度以及球状体的清晰度的数值来进行。

作为确定这样的运算公式的方法公知有回归分析法。具体地说，通过进行将球状体的光密度的平均值、光密度的偏差、球状体的圆度、球状体的清晰度作为因变量且将与图像对应关联的损坏度的值作为自变量的回归分析，能够确定将因变量和自变量对应关联的运算公式。以往就研究回归分析的方法，通过使用该方法决定运算公式，能够不依赖于主观判断地得到与熟练者的判断相关性高的评价结果。

基于上述的球状体的光学特征，优选在运算公式中，球状体的光密度的平均值越高，损坏度越高，并且优选球状体的光密度的偏差越大，损坏度越高，并且优选球状体的圆度越低，损坏度越高，而且还优选球状体的清晰度越低，损坏度越高。这些是用于将与球状体的损坏相关的科学见解反应至运算结果的条件。此外，对于在将损坏度的高低以数值表现时赋予怎样的值，没有特别限定。例如，可以对越是不断损坏的球状体，赋予损坏度越大的数值，也可以相反。另外，可以通过离散的数值等阶梯性地表现损坏度。

另外，对于球状体的清晰度，例如能够定义为球状体的周缘部的光密度与球状体整体的光密度的比值。在轮廓清晰的球状体中，直到球状体的周缘部都维持与其中央部同程度的光密度，但是在轮廓不清晰的即球状体与周围区域之间的边界不清晰的球状体中，周缘部的光密度变得比中央部低。因此，球状体的周缘部的光密度与球状体整体的光密度的比值越接近1轮廓越清晰，值越小越不清晰。

另外，对于球状体的清晰度，例如可以定义为，球状体区域的轮廓中的具有与边缘强度对应的像素值的像素的光密度。更具体地说，将针对与球状体区域的轮廓对应的各像素基于像素的亮度值通过边缘检测滤波运算分别求出的边缘强度的平均值设定为Sa，将球状体的周围区域的像素的亮度平均值设定为Is时，可以将清晰度定义为下式的左边Sh。

Sh＝log₁₀[Is/(Is-Sa/4)]

如上所述，通过导入基于这样的定义而得出的清晰度，能够更加高精度地评价球状体的损坏度。

另外，例如，运算公式可以根据形成球状体的细胞种类的不同而不同。由于根据细胞种类的不同，其颜色、球状体的形状以及伴随损坏而产生的变化的特征等不同，所以难于针对各个细胞种类定义一个运算公式。如果能够定义对应于细胞种类的不同而不同的运算公式，则能够应对多个细胞种类。另外，可以针对每个细胞的培养方法而定义不同的运算公式。

另外，在本发明的球状体评价装置中，例如，图像取得单元可以具有：保持部，其保持对包含球状体的培养基进行承载的容器；以及拍摄部，其对被保持部保持的容器内的球状体进行拍摄来取得图像。根据这样的结构，能够通过一个装置拍摄球状体和评价其损坏度。

此时，优选拍摄部以非侵入的方式拍摄球状体。根据这样的结构，能够对拍摄后的样品(球状体)继续进行培养，例如，能够对同一球状体随时间如何变化进行评价。

另外，例如，图像取得单元可以是取得由外部的拍摄装置拍摄的或者存储在外部的存储装置中的球状体的图像数据的结构。即，本发明的球状体评价装置不限于自身具有拍摄功能，可以仅基于从外部给予的图像数据进行评价。根据这样的结构，例如，通过与现有的拍摄装置组合，能够赋予上述的评价功能。

此外，本发明不限于上述的实施方式，只要不脱离其宗旨，除了上述的技术方案还能够进行各种变更。例如，上述的计算公式示出能够应用于本发明的技术思想的计算方法的一个例子，所应用的计算公式不限于上述公式，可以为任意公式。

另外，在上述实施方式中，损坏度的高低由数值的大小表示，以球状体越损坏，损坏度的数值越大的方式，定义损坏度。但是，可以相反，通过随着损坏越严重数值越来越小的指标，表示损坏度。

另外，在上述实施方式中，损坏度不限于离散的数值，能够以对应于球状体的状态取连续值的方式定义损坏度。这样，例如，即使是离散的损坏度相同的球状体，也能够定量地区分损坏度更高的球状体和损坏度更低的球状体。但是，可以与判断者的判定相同，以通过计算而求出的损坏度取离散的多级的数值的方式，定义计算公式。为了能够实现这样的计算公式，例如，可以以将通过计算求出的损坏度的数值四舍五入，或仅将整数部分作为结果的方式，调整计算公式。

另外，在上述实施方式中，从保持为水平姿态的孔板WP的上方向孔W入射照明光，通过拍摄部13接受从孔W底面透过的光，来进行拍摄。但是，本发明的所拍摄的球状体的图像的处理上具有特征，图像的拍摄原理不限于上述内容，可以是任意的。但是，优选明视场拍摄。

另外，例如，在上述实施方式中，作为本发明的“图像取得单元”使用拍摄部13。但是，本发明的球状体评价装置自身不必具有拍摄功能。即，可以是接受外部的拍摄装置所拍摄的图像数据或存储在外部的存储装置中的图像数据，而仅进行图像处理的方式。此时，从外部接受图像数据的接口部142发挥本发明的“图像取得单元”的功能。

此时，作为拍摄装置能够利用已经商品化的设备。因此，例如能够将向通用的个人电脑中安装用于执行本发明的处理的控制程序的设备与拍摄装置组合，来构成本发明的球状体评价装置。因此，本发明除了能够以上述实施方式那样的完整的装置的方式实施，还能够提供向与拍摄装置组合的个人电脑安装的控制程序。

另外，在上述实施方式中，其目的在于确定与熟练者的主观判定结果一致的损坏度的计算公式。但是，其他评价方法，例如可以求出与ATP试验、MTT试验等的评价结果之间具有高相关性的计算公式。

以上，按照确定的实施例说明发明，但是不是解释为该说明具有限定的意义。参照发明内容不符，与本发明的其他实施方式相同，公开的实施方式的各种变形例对于精通该技术的人来说是显而易见的。因此，附上的权利要求书，在不脱离发明的真正范围的范围内，包含该变形例或实施方式。

工业实用性

本发明能够适用于对所培养的球状体的损坏度进行定量评价。例如，能够在对以药物研究筛查为目而作用于球状体的化合物的药效进行定量地评价时使用。

附图标记说明

1 球状体评价装置

11 保持架(保持部)

13 拍摄部(拍摄部、图像取得单元)

141 CPU(图像处理单元、损坏度计算单元)

142 接口部

Sp1、Sp2、Sp3 球状体

W 孔

WP 孔板(容器)

Claims (15)

1.一种根据拍摄有作为细胞聚集块的球状体的图像评价该球状体的损坏度的球状体评价方法，其中，

包括：

确定包括所述球状体及所述球状体的周围区域在内的所述图像中的所述球状体所占的球状体区域的工序；

根据所述球状体区域的图像密度求出所述球状体的光密度的平均值以及该光密度在所述球状体内的偏差的大小的工序；

根据所述球状体区域的轮廓求出所述球状体的圆度的工序；

根据所述球状体及所述球状体的周围区域的图像密度求出所述球状体的清晰度的工序；以及

将所述光密度的平均值、所述光密度的偏差的大小、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度代入规定的运算公式来求出所述球状体的损坏度的工序。

2.根据权利要求1所述的球状体评价方法，其中，

收集多个球状体的图像，该多个球状体的图像赋予有对损坏度进行标示的数值，

通过进行回归分析，求出所述运算公式，

在该回归分析中，将针对所收集的图像分别求出的球状体的光密度的平均值、光密度的偏差、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度作为因变量，将该图像的损坏度的数值作为自变量。

3.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，在利用所述运算公式的运算中，所述球状体的光密度的平均值越高，损坏度越高。

4.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，在利用所述运算公式的运算中，所述球状体的光密度的偏差越大，损坏度越高。

5.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，在利用所述运算公式的运算中，所述球状体的圆度越低，损坏度越高。

6.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，在所述运算公式的运算中，所述球状体的清晰度越低，损坏度越高。

7.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，所述球状体的清晰度被定义为：所述球状体的周缘部的光密度与所述球状体整体的光密度的比值。

8.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，所述球状体的清晰度被定义为：所述球状体区域的轮廓中的具有与边缘强度对应的像素值的像素的光密度。

9.根据权利要求8所述的球状体评价方法，其中，

将针对与所述球状体区域的轮廓对应的各像素通过边缘检测滤波运算基于像素的亮度值分别求出的边缘强度的平均值设定为Sa，将所述球状体的周围区域的像素的亮度平均值设定为Is时，所述球状体的清晰度定义为下式的左边Sh，

Sh＝log₁₀[Is/(Is-Sa/4)]。

10.根据权利要求1或2所述的球状体评价方法，其中，按照用于形成所述球状体的细胞种类，使所述运算公式不同。

11.一种根据拍摄有作为细胞聚集块的球状体的图像判定该球状体的损坏度的球状体评价装置，其中，

具有：

图像取得单元，其取得包含所述球状体及所述球状体的周围区域在内的图像；

图像处理单元，其确定所述图像中的所述球状体所占的球状体区域，根据所述球状体区域的图像密度求出所述球状体的光密度的平均值以及该光密度在所述球状体内的偏差的大小，且根据所述球状体区域的轮廓求出所述球状体的圆度，根据所述球状体及所述球状体的周围区域的图像密度求出所述球状体的清晰度；以及

损坏度计算单元，其基于所述光密度的平均值、所述光密度的偏差的大小、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度，求出所述球状体的损坏度。

12.根据权利要求11所述的球状体评价装置，其中，

所述损坏度计算单元，针对所述球状体与对该球状体的损坏度进行标示的数值对应关联的多个图像分别进行回归分析，在该回归分析中将球状体的光密度的平均值、光密度的偏差的大小、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度作为因变量，将该图像的损坏度的数值作为自变量，

所述损坏度计算单元根据基于该回归分析的结果而求出的运算公式、所述光密度的平均值、所述光密度的偏差、所述球状体的圆度以及所述球状体的清晰度，求出所述球状体的损坏度。

13.根据权利要求11或12所述的球状体评价装置，其中，所述图像取得单元具有：

保持部，其保持对包括所述球状体的培养基进行承载的容器；以及

拍摄部，其拍摄被所述保持部保持的所述容器内的所述球状体，取得所述图像。

14.根据权利要求13所述的球状体评价装置，其中，所述拍摄部以非侵入的方式拍摄所述球状体。

15.根据权利要求11或12所述的球状体评价装置，其中，所述图像取得单元接受由外部的拍摄装置拍摄的或存储在外部的存储装置中的所述球状体的图像数据。