TW201102432A - Synthesis method of aromatic amino acid - Google Patents

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201102432 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於-種合成芳香族胺基酸的方法，特別係 關於-種可歡且簡易的合成同苯丙胺酸之方法。’ 【先前技術】 〜皿g㈣疋人類健康的—大威#。根據衛生署公布 的貧料，國人十大死因中，與高血壓相關疾病就佔了五項， 其中’腦血管及心臟疾病更分別高居第2及第3位。在美 國’約15%的人口有高血壓的問題，心血管疾病更是美國 j的第死亡職。由此可見，高血騎人類健康的 威脅已達不容忽視的程度；為了治療高血壓，心臟血管用 藥的需求居高不下。 血管收縮素轉化酶（ACE)是腎素_血管緊張素姻 _ (RAS)系統中的—個重要環節，該系統對血壓的調節 有著極重要的意義。ACE社要個是將血管收縮素旧 化為具有強烈收縮jk管作帛的血s收縮素π，促進血管收 縮並使血壓上降；此外ACE還能夠催化有促血管舒張作用 的，激（bradykinin)的水解，因此ACE的生理作用為使 血管收縮及血壓上降。^血管疾病㈣中，其中_類為血 官收縮素轉化酶抑制劑（Angi〇tensin C〇nverting

Inhibitor，ACEI) ’其藥理作用是抑制ACE活性，減少血 笞收縮素II的生成，減少緩激（bracjykinin)的水解，導致 金管舒張，血容量減少血塵下降。 同苯丙胺酸（homophenylalanine，ΗΡΑ)係合成該血管 201102432 收縮素轉化酶抑制劑（ 當高的經濟效益，同的郷’其具有相 兩胺酸仏跑、 構分類可分為D型同苯

型同笨_^及L型同苯丙胺酸α-ΗΡΑ)，由於D 於生物體内，蚀ί物體中的代謝緩慢，容易長時間的殘留 尚待評估.因卜仙型同苯丙胺酸的藥物動力學及安全性

Lisinnn t卜/如 E laiml、—_、QuinaPril 及 苯丙L朗奸麟作為藥物合成的原料。同 天然胺基酸，必須以人工的方式進行合成， 化合成學分割法、化學合成法及生 胺西，該光學分割法係利用有機溶劑萃取D型及L型同苯丙 ^上h〇moPhenylalanine) ’再藉由d型及乙型同苯 之讀度差異，進而分離出具有不同光學活性 T型同苯丙胺酸；然而，D型同苯丙胺酸在生物體中的 代=緩慢，容易長時間的殘留於生物體内，而不適用於做 、為口成該血官收縮素轉化酶抑糊（抗高血壓藥物）的原 料使得该化學切割法所合成的同苯丙胺酸之利用性受到 限制。 、化學合成法係目前製藥工業用以大量生產胺基酸之 方法其係將中間產物beta-benzoylacrylic acid與 1-arylethylamine進行還原反應以生產同苯丙胺酸，然而^ 所合成的同苯⑽酸係為D型及L卿苯碰酸的混合 物’因此必網外進行D型及L型同苯丙賴的分離動 作’使得該化學合成法之合成過程複#。再者，該化學合 201102432 學藥品 且具有 成法合成同苯丙職之過程中，必須使用不同的化 及大量的有機溶劑，使得該化學合成法的成本增加 環境物染的問題。 生化合成法’其係一種利用生物轉換 (bi0transf0rmati0n)的方式解決光學分割法之安全性不佳 的缺點，及化學合成法之步驟繁複且料造成環境污毕問 題’該生化合成法主要制用各_基_胺酶作為^物 觸酶（biocatalyst)，以選擇性的合成單一立體特異性胺基 酸（stereospedfic amino acids)，使得該生化合 = 行不同結構胺基酸分離之動作，而具有步驟簡便之優點， 且所使用的化學藥品劑量少，而具有低環境污染性之優 點。目前合成同苯丙胺酸之生化合成法係取一單一立體特 異性之私基酸’例如天門冬胺酸（ASpartate)作為胺基供 應者（amino donor)’並以 2-oxo-4-phenylbutyric acid (0PBA) 為胺基接受者（amino acceptor)，再利用基因工程選殖大 腸桿la的天門冬胺酸轉胺酶對該天門冬胺酸在37°c的環 境下進行轉胺反應，該轉胺反應所獲得的產物即為單一立 體特異性之同苯丙胺酸（即L型同苯丙胺酸）；然而該利 用大腸桿菌的天門冬胺酸轉胺酶合成同苯丙胺酸之生化合 成法仍具有下列缺點： 1、合成胺基酸之效率不佳：大腸桿菌的天門冬胺酸 轉胺酶在37°C以上的高溫中，其酵素活性容易失活，而無 法在高溫下合成胺基酸，即無法增加胺基供應者及胺基接 受者之溶解度，造成合成胺基酸所耗費的時間長，使得該 習用之大腸桿菌天門冬胺酸轉胺酶合成胺基酸的效率不 201102432 佳 β 2、合成胺基酸之成本高··在π以上姑 縛菌的天門冬胺酸#胺酶之酵素活 咖 ，桿菌天門冬胺酸轉胺酶具有不易保== 缺點，必_㈣買冷藏或冷綠備 运不便之 冬胺酸轉_之保存；再者，若 °Λ大腸桿菌天門 天門冬胺酸轉胺酶的酵素活性變 ^。成胺級之過程中則必須提高該大腸桿菌天門冬胺 =轉胺酶的添加量’使_f駿収 胺 轉胺酶合成胺基酸之成本高。 門、、岐 【發明内容】 本發明係提供一種合成芳香族胺 尚溫的環境下進行芳香族胺基酸之合成 為本發明之主要方香族胺基酸之效率，係 本發明係提供-種合成芳香族胺所 =^=胺酶之保存容易且活性高，使得二基= 為本發明之=目ί而降低合成芳香族胺基酸之成本，係 述發明目的，本發騎制之技 由該技術手段所能達到之功效包含有： 及猎 一種合成料翻麵之方法，其包含 門冬胺酸轉胺酶步驟、嗜熱8 反應·及胺基酸與，含酵素之胺 201102432 亥產‘耆熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟係藉由基因轉殖技術 抽取嗜熱菌之天門冬胺酸轉胺酶基因，並將該嗜熱菌天門 冬胺酸轉胺酶基因轉殖入一表現載體，進而利用一表現系 、’’先大塁表現該嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶。該嗜熱菌天門冬 胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟係取一胺基供應者及一胺基 接受者，藉由該嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶催化該胺基供應 者及該胺基接受者進行轉胺反應，以生成一胺基酸，且該 催化度係50C至80°C，催化反應之時間係3〇至90分 鐘。該胺基酸與沉澱後含酵素之上清液的回收步驟，係將 该嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟後之反應溶 液，進行冰浴使溫度降至，以沉澱析出產物胺基酸。 【實施方式】 為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯 易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式， 作詳細說明如下： 請參照第一圖所示，本發明之合成同苯丙胺酸之方法 包含有產製嗜熱菌之天門冬胺酸轉胺酶步驟S1、嗜熱菌天 門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟S2及胺基酸與沉澱後 含酵素之上清液的回收步驟S3。 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1 本發明係於食品工業發展研究所菌種保存及研究中 u 講貝嗜熱菌（)，並利用 Sambrook a!. (1989)的方法，進行嗜熱菌j^ermus ^erm〇冲如染 色體DNA的抽取（Isolation of Chromosome DNA)。進一 201102432 步針對嗜熱菌Γ/iermws i/iermop/ii/MS的Tt Asp AT基因設計 一 正 向 引 子 ： TtAspAT-1 (5 ’ -ACTTAGCATATGCGCGGCCTTTCCC-3 ’），及一反向 引 子 ： TtAspAT-2 (5’-CCCACGACCCCGCGCGGTTCGAACCCAA-3,），並 利用該正向引子及該反向引子針對該帶有TtAspAT基因的 染色體DNA進行聚合酶連鎖反應（p〇iymerase Chain I Reaction，PCR) ’以增幅放大該TtAspAT基因片段。進一 步將§亥PCR產物以壇S旨明膠電泳分析後，利用Gel Elution Kit (購自GeneMark)進行糝體中DNA片段的純化，以 大量純化出TtAspAT DNA片段。將該TtAspAT DNA片段 轉殖於pET21b質體中，且該pET21b質體含有六個組胺酸 標誌（6 X His-Tagged)的DNA序列，並將該帶有TtAspAT DNA的PET21b質體轉形到大腸桿菌BL21 U⑺// BL21) 中’進而大量培養該大腸桿菌BL21，使該大腸桿菌BL21 φ 大量表現嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶，其中該大腸桿菌BL21 係由食品工業發展研究所菌種保存及研究中心所購買。進 一步使用超音波震裂法破菌，於4它以I2,〇〇〇rpm的離心 速度離心數十分鐘後，吸取上清液置入鎳親和管柱層析進 彳于天門冬fee酸轉胺轉的純化，以大量產製嗜熱菌之天門冬 胺酸轉胺酶。 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1之實例一：嗜 熱菌Thermus thermophilus染色馥DNA的抽取 挑取⑽认erm印知7恥菌落，接種至1〇 w的 Thennus medium培養液之中，於6〇ΐ震盪培養ΐ2 _ ι6小 201102432 時’取1.5 ml菌液至1.5 mi微量離心管中，以14,⑻〇 rpm 離心30秒，倒去上層液。加入377W，50mMTris(pH8.0)， 震盪均勻。加入 2 μΐ proteinase K:(20 mg/ml)與 20 μ1_ 10% SDS ’混合均勻並放入37°C水浴槽中作用1小時。加入95 μΐ 4.1 MNaCl後混合均勻’接著加入55 μ1 1〇0/〇 CTAB混合 均勻，然後放入65°C水浴槽中作用1〇分鐘。加入6〇〇 μΐ飽 和酚溶液（saturated phenol)，混合均勻並離心5分鐘。取上 清液至另一新的微量離心管，加入6〇〇 μΐ酚-氯仿溶液 (phenol : chloroform=l : 1)，混合均勻並離心5分鐘。取 上清液至一新的微量離心管，加入330 μΐ異丙醇 (isopropanol) ’並來回輕輕遙動至白色絲狀DNA出現。播起 絲狀DNA，以70 %酒精沖洗DNA三次，真空乾燥後，溶 於50 μΐ去離子水’並加入2 μΐ 1 mg/mi R]^ase a以移除 RNA〇 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟SI之實例二：以 聚合酶連鎖反應增幅放大該TtAspAT基因片段 PCR之反應液共50 //1，包含5//1的聚合酶緩衝溶 液（10X buffer )、1 以 1 的 1〇 mM dNTP ( dATP、dCTP、 dGTP 及 dTTP)、l //1 帶有 TtAspAT 基因的質體 DNA、1 //lpmole/z/1 的 TtAspAT-Ι 正向引子、χ #lpm〇le///1 的 TtAspAT-2反向引子、1 聚合酶及4〇 的二次去離 子水。置於PCR反應器内進行TtAspAT基因片段的增幅反 應’其中該PCR的反應條件為，於94°C進行DNA變性作 用30秒、於60°C進行引子煉合作用45秒、再於72。(：進 行DNA延長作用1分鐘，且將該DNA變性作用、引子練 201102432 合作用及DNA延長作用重複40個循環數，再於72°c下反 應7分鐘’最後將該PCR產物保存於代下，該PCR產物 即為該TtAspAT基因片段。 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步称§1之實例三：勝 體中TtAspAT DNA的純化 將瓊酯明膠上的DNA片段切下’加入等體積的結合 溶液（Binding Solution) ’並置於60°C的水浴作用5至15 分鐘使瓊酯明膠溶解。將溶解後的液體放到離心管子中， 以11，000 rpm的離心速度離心1分鐘，取上層液加入5〇〇 //1結合溶液，並以11，000 rpm的離心速度離心1分鐘， 取上層液加入700 /zl的洗滌溶液（Washing s〇lmi〇n)， 再以11，000 rpm的離心速度離心1分鐘，取上層液加入3〇 至50 //1的沖提溶液（Elution Solution)，靜置1至2分 鐘後，再以11,000 rpm的離心速度離心1分鐘，去掉上清 液並將沉澱物烘乾’該沉澱物即為TtAspAT DNA片段，並 將該TtAspAT DNA片段溶於適量的二次去離子水。 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1之實例四： TtAspATDNA轉殖於pET21b質體中 取TtAspAT DNA片段加入1/1〇最終反應體積的十倍 濃度反應緩衝液、去離子水及#办1和限制酶，置 於37°C的水浴中反應2小時，以進行TtAspAT DNA之限 制酶切割作用《取5 μΐ經限制酶切割作用後的TtAspAT DNA片段’加入5 μΐ經相同限制酶切割好的質體pET21b (購自 Novagen 公司）、1.2 μΐ 的 1〇 倍 Ligation buffer 及 0.8 μΐ T4 DNALigase，並置於16°C的水浴中反應16小時； 一 11 一 201102432 進而將該TtAspATDNA片段接合於pET2ib質體尹。 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1之實例五·藉 由大腸桿菌BL21大量表現嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶 將帶有TtAspAT DNA的質體以電穿孔的方式送入大 腸桿菌BL21後，以含有100呢/㈤ampic仙n (抗生素） 的LB培養液培養該大腸桿菌BL21，且繼代培養至〇 值至0·6左右，然後加入IPTG至終濃度為i mM，繼續培 養18小時，以誘導天門冬胺酸轉胺酶大量表現，並於4 艺以7500 rpm的離心速度離心十分鐘，倒掉上清液，以 0.9 %氣化鈉（NaC1)懸浮菌體，再於4它以75〇〇rpm的 離心速度離心十分鐘’倒掉上清液留下大腸桿菌BL21之 菌塊’該大腸桿jg BL21之H塊則含有大量表現的嗜熱菌 天門冬胺酸轉胺酶。 產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1之實例六：嗜 熱菌天門冬胺酸轉胺酶的純化 使用超曰波震裂法破菌（超音波每震裂破菌30秒， 停止1分鐘，重複十四次），並於4°C以13,〇〇〇 rpm的離 心速度離心數十分鐘後，吸取上清㈣人舰和管柱層析 進盯天門冬胺酸轉胺酶的純化。該錄親和管柱層析係利用 本發明之PET2lb質體含有六個組胺酸標誌（6 χ

Tagged；^ DNA序列’因此該卿灿質體所表現的嗜 熱菌=Η冬魏轉_即帶有六她㈣(mstidine)，其可 與-的陽離子相螯和；因此，本發明係利用帶錄離 ^ )的親合力管柱純化出帶有六個組胺酸融合的嗜 熱囟天門冬胺酸轉胺酶。 —12 — 201102432

產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驛S1之實例七··邊 熱菌天門冬胺酸轉胺酶的活性分析 B 天門冬胺酸轉胺酶的酵素活性測定是採用蘋果酸去氫 酶偶合分析法(MDH-coupling assay)，以天門冬胺酸及酮戊二 酸為受質’經嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶（TtAspAT)反應生 成草醋酸（oxaloacetate)及糙胺酸，藉偶合蘋果酸去氫酶反應 將產物草醋酸轉變成蘋果酸，並伴隨使NADH氧化為 鲁 NAD+ ’測定NADH於波長340nm之吸光值下降速率。酵素 活性分析的反應液組成為2〇〇 mM天門冬胺酸，25 mM酮 戊二酸，0·15 mM NADH，5 U蘋果酸去氫酶(Malate dehydrogenase，MDH)，100 mM Tris buffer，pH 8.0，加入適量 的稀釋酵素液及蒸餾水，使最後反應液體積為i ml，將反應 液置於石英測光管中，用以恆溫水浴槽控制溫度的分光光度 儀，於固定的溫度下測量波長340 nm之吸光值的下降速率， 並換异出酵素活性。同時’採用Bradforcj法測定天門冬胺酸 • 轉胺酶的蛋白質濃度，再由公式計算出每個溫度下的比活 性。 嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟S2 取一胺基供應者（amino donor )及一胺基接受者 (amino acceptor)，再利用本發明之嗜熱菌天門冬胺酸轉 胺酶催化該胺基供應者及該胺基接受者進行轉胺反應，以 合成一胺基酸，該胺基供應者係為天門冬胺酸，而該胺基 接又者係可為酮戊二酸、同苯丙酮酸、苯丙酮酸、σ引p朵丙 酮酉文及羥笨基丙酮酸，而該胺基接受者酮戊二酸、同苯丙 鋼酸、笨丙酮酸、吲哚丙酮酸及羥苯基丙酮酸分別可藉由 ——13 一 201102432 該嗜熱g天門冬胺酸轉胺酶㈣化合 3、苯丙胺酸、色胺酸及路胺酸;且其中該催化溫= 至80 C，催化反應之時間係3〇至9〇分鐘，而該催 f交佳係抓。本發明之合成料赫級之方法之下： 實施例係選擇關苯__縣接受者，進—步藉由本 發明之嗜熱g天門冬贿轉麟催化天門冬麟及同苯丙 1進行轉胺反應，以合成可作為血管收縮素轉化酶抑制 劑原料的L型同苯丙胺酸。 嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟S2之實 例·嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶之最適催化溫度設計 、、取稀釋至適當濃度的酵素液，加至石英測光管中的反應 液^ ’於值溫水浴槽控制的分光光度儀中，從25。〇開始， =每-人增加5C的固定溫度測量酵素活性。酵素活性的測 里採用產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1之實例六之 頻果k去虱每偶合分析法(MDjj-coupling assay)進行，適當濃 度的酵素液G.l ml加人活性分析反應液，以分光光度儀測量 波長340 nm之吸光值的變化，並換算出酵素活性。同時，採 用Bradford法測定天門冬胺酸轉胺酶的蛋白質濃度，再由 公式計算出每個溫度下的比活性該最適催化溫度測試結果 如第2圖所示’由圖可得知，在70Ϊ：的溫度下，活性最高， 再加熱到75Ϊ時活性下降。由此得知，在70ΐ酵素催化反 應為最佳狀態。 201102432

嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟S2之實 例二：嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶於不同溫度的酵素穩定度 分析

取5管濃度為lmg/ml的嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶酵素 液，分別敌在37Ϊ：、50Ϊ、6(TC、7(TC、8CTC的水浴槽中進 行加熱處理（Heat treatment)。當酵素液加熱處理〇分鐘、3〇 分鐘、60分鐘、90分鐘時’分別從不同溫度加熱處理的酵素 液中取出20 μΐ，置於冰上停止加熱處理，接著對這些於不同 溫度中經過不同時間加熱處理的酵素液進行酵素活性分析。酵 素活性的測量採用產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟S1之 貫例六之療果酸去虱酶偶合分析法(MDH-coupling assay)進 行’適當濃度的酵素液0.1 ml加入活性分析反應液，於37°C —15 — 201102432 以分光光度儀測量波長34〇 nm之吸光值的變化並換算 素活性，再由公式計算出每個溫度下的比活性該 化 溫度測試結果如第3圖所示，由圖可得知，嗜孰菌天2 胺酸轉胺齡贼《下(含)的溫度，料敎度最高，將 溫度時，酵素失去活性的速度明： 快第3 ®中之鱗進行趨勢迴歸線分析，可獲得酵素 於不同溫度中之活性半衰期（halflife)如下： 、

結果顯示騎於7(rcuXT(含)的溫度相存減較久的時 間，亦即能有比較久_間進行酵铸㈣賴合成反應。 嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟 S2之實 例三：嗜祕天Η冬胺酸轉胺酶之最適催化時間純 、、取6管微量離心管’分別加入催化反應成份使反應液組 成為200 mM天門冬胺酸，μ壤同苯丙酮酸，測禮

Tns buffer, pH .8.0 ’加入5 U的續熱菌天門冬胺酸轉胺酶. (250 U/ml轉素取20 μΐ)，最後加人難水使最後反棘體. 積為1 m卜置於60。(：的水浴射進㈣素賴化反應。當反 應進行1小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時 的時候，分別從水浴槽中取出！管微量離心管，加入35μ1的 6NHC1終止酵素反應’接著以高效驗相層析賴微量離心 —16 ~ 201102432 管中的同苯丙胺酸進行計量分析，若濃度過高則以蒸餾水稀 釋後再進行分析，然後計算出原始同苯丙胺酸的濃度。催 化時間與合成同苯丙胺酸濃度的關係如第4圖所示，由圖 可得知嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶在進行催化合成反應6小 時後’同苯丙胺酸的合成量就明顯放緩。因此，以時間經 濟效應的觀點，在催化合成反應啟始6小時後，就可以進行 產物的沉澱分離，.收穫以酵素合成的同苯丙胺酸。 • ，胺基酸與沉澱後含酵素之上清液的回收步驟S3 根據先前技術合成同苯丙酮酸的方法，同苯丙胺酸於 25°C中的溶解度少於2 mg/1，於〇〇c冰浴中的溶解度幾乎 無法溶解(Lo 从，Biotechnol. Prog. 2005)。本發明利用高 溫環境進行催化合成反應，不但可以提高天門冬胺酸轉胺 酶酵素的催化活性(產製嗜熱g天門冬胺酸轉麟步驟si =實例-），也可以增加受肢產物的溶解度使反應更趨向 元正將該嗜熱g天門冬胺酸轉胺_進行轉胺反應步驟犯 籲之反應減進行-純化料’該純化程序係選擇為冰浴， 使溫度降至（TC，以沉澱析出同笨丙胺酸。此外，進行完 胺基酸回收步驟S3’作用後之上清液中的天門冬胺酸轉胺 酶三依據該嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟幻 之貝例-的间活性半衰期得知，該天門冬胺酸轉胺酶依然 具有相當高的活性，故能再重複至少使用2至3次，大量 減/酵素的生產成本。嘻熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺 反應步驟S2之產物胺基酸苯丙胺酸、色胺酸及絡胺酸，該 ，項胺基酸具有疏水特性，因此該三項胺基酸之純化程序 係選擇以有機溶劑將其析出，再透過碳18管柱層析和高效 —17 — 201102432 能液相層析儀分離純化可取得之。 如上所述’本發明之合絲香族胺基酸之方法可在^ 至80°C高溫中進行’增加胺基供應者及胺基接受者之溶解 度’進而大幅縮短合成芳香族胺基酸之時間，使得本發明 合成芳香族絲酸之方法具有提高合成芳錢胺基㈣率 之功效。再者’本發明所使㈣倾菌天門冬胺 ^溫中具有較高之酵素活性，使得該嗜_天門冬胺酸^ 胺酶八有谷易保存且運送方便之優點，無須額外轉買冷藏 或冷凉設備進行該嗜錢天門冬賴轉胺酶之保存；、再者 ’因該2熱g天π冬胺酸轉胺酶高溫中具有較高之酵素活 性’使得在合成芳香顧基酸之過程+，使用少量該嗜敎 菌天門冬f酸翻鱗可合成高產量之胺級，使得本發 明之合成料族胺級之方法具有低成本之功效。 雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用 以，定本發明’任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神 寿範圍之内’相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本 發明所保護之技術料，因此本發明之倾範圍當視後附 之申請專利範圍所界定者為準。 —18 — 201102432 【圖式簡單說明】 流程 第1圖：本發明之合成芳香族胺基酸 〜万法步驟 圖0 酶之最適催 第2圖：本發明之嗜熱菌天門冬胺酸轉胺 化溫度測試結果之線性圖。

第3圖：本發明之嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶於不同溫度 的酵素穩定度分析結果之線性圖。 第4圖：本發明之嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶之最適催化 時間測試結果之線性圖。 【主要元件符號說明】 S1產製嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶步驟 S2嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟 S3胺基酸與沉澱後含酵素之上清液的回收步驟 —19 —

Claims (1)

1. 201102432 七、申請專利範圍： 1、 一種合成芳香族胺基酸之方法，包含下列步驟： (X)產製嗜熱囷天門冬胺酸轉胺酶步驟，係藉由基因轉 殖技術大量產製該嗜熱菌天門冬胺酸轉胺酶；（b)嗜熱 菌天門冬胺酸轉胺酶進行轉胺反應步驟，取一 胺基供應者及一胺基接受者’藉由該嗜熱菌天門冬胺酸 轉胺酶催化該胺基供應者及該胺基接受者進行轉胺反 應，以生成一胺基酸，且該催化溫度係邓它至8〇t , 催化反應之時間係6小時；及 (c)胺基酸與沉澱後含酵素之上清液的回收步驟，將步 驟(b)之反應溶液經一純化程序取得產物胺基酸。 2、 依申請專利範圍第丨項所述之合成芳香族胺基酸之方 法’其中該步驟(b)之催化溫度係7〇°C。 3、 依_請專觀圍第1或2項所狀合成芳香族胺基酸之 方法，其中步驟(b)之胺基供應者係天門冬胺酸，該胺 基接受者係同苯丙酮酸，而該產物胺基酸係同苯丙胺 酸。 4、 依申請專利範圍第3項所述之合成芳香族胺基酸之方 法，其中該純化程序係將步驟(b)之反應溶液進行冰 浴，使溫度降至〇。〇，以沉澱析出同苯丙胺酸。 5、 依申請專利範圍第1或2項所述之合鮮香族胺基酸之 方法γ其中步驟(b)之胺基供應者係天門冬胺酸，該胺 基接又者係笨丙酮酸，而該產物胺基酸係苯丙胺酸。 6、 依巾請專利範圍第5項中之合成芳香族胺基酸之方法， 201102432 該產物胺基酸係苯丙胺酸，係將步驟⑻之反應溶液經 有機溶液、管柱層析法和高致能液相層析儀分離純化取 得。 7'依申4專利範圍第！或2項所述之合成芳香族胺基酸之 方法^其中步驟(b)之胺基供應者係天門冬胺酸，該胺 基接爻者係吲哚丙酮酸，而該產物胺基酸係色胺酸。 8、依申請專利範圍第7項中之合成芳香族胺基酸之方法， 該產物胺基酸係色胺酸，係將步驟(b)之反應溶液經有 機洛液、管柱層析法和高效能液相層析儀分離純化取 得。 9依申叫專利範圍第1或2項所述之合成芳香族胺基酸之 方法，其中步驟(b)之胺基供應者係天門冬胺酸，該胺 基接受者係對輕苯基丙酮酸，而該產物胺基酸係絡胺 酸。 10、依申請專利範圍第9項中所述之合成芳香族胺基酸之方 法，該產物胺基酸係酪胺酸，係將步驟（b)之反應溶液 經有機溶液、管柱層析法和高效能液相層析儀分離純化 取得。 —21