200930810 九、發明說明： 本申請案主張2007^·日中請之美國臨時中請案第 6〇/991，201號之利益，該巾請案係以引用的方式併入本文 中。 【先前技術】 海藻之大量培養（Mass cultivation)已用於水處理及用於 製造營養補充劑、肥料及食品添加劑歷時幾十年。近年 來，亦已探索海藻之商業生長以產生生物學衍生之能量產 © 品，諸如生物柴油、生物乙醇及氫氣。當與可用於生物燃 料之陸地作物（諸如玉米、大豆及甘蔗）相比時，較之下一 最有效作物，海藻可生長快得多且每英畝可產生高達3〇倍 多之生物質。不同於具有根及葉之陸地植物，海藻生物質 一般較少特定化，且大多數或所有細胞均可用於向燃料之 轉化中。細胞物質之大分子組成可為自光合生物體獲得之 產品的數量及品質之重要決定因素。 舉例而言’為製造油或生物燃料’可需要自含有占總生 0 物質比例較大量之脂質的生物體收集有機化合物。亦可需 要將細胞物質之大分子組成改為更佳脂質概況，例如以製 造具有較大能量密度或較低黏度之油，其又可製造較高品 質之燃料。 先前研究已使用營養素缺乏（諸如N或Si受限生長）來誘 導諸如微藻類之植物細胞之脂質組成的改變（"A Look Back at the US . Dept of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae."NREL，1998)。儘管此方法成功地改 136481.doc 200930810 變了細胞之大分子組成，但因為所得海藻培養物在營養素 受限之條件中生長較緩慢，所以該方法一般並不能產生較 大生產力。 在不極大地犧牲細胞生長之總生產力的情況下誘導較有 . 利之大分子組成及細胞組成代表此項技術中之進步。 【發明内容】 在一態樣中，本發明提供改變光合細胞之大分子含量的 方法，其包含利用由自營性向異營性或混合營養生長條件 © 之轉移，藉此改變該光合細胞之該大分子含量。 在本發明之另一態樣中’提供改變在光合細胞中脂質之 量的方法，其包含利用由自營性向異營性或混合營養生長 • 條件之轉移’藉此改變在該光合細胞中脂質之量。在—實 施例中’在該光合細胞中脂質之量增加。 在一態樣中，提供改變脂質在光合細胞中之特性的方 法，其包含利用由自營性向異營性或混合營養生長條件之 ^ 轉移，藉此改變脂質在光合細胞中之特性。脂質之經改變 特性可為比自生長於自營性生長條件中之光合細胞的脂質 特性更需要之燃料或燃料前驅體。 • 光合細胞可為海藻細胞。在一實施例中，海藻細胞為綠 藻細胞。在另一實施例中，綠藻細胞為來自綠球藻屬 . (Chl〇rella)物種之細胞。 在本發明之一態樣中，提供使海藻細胞成熟之方法，其 包含將海藻細胞自第一生長條件移至第二生長條件，其中 該第一生長條件包含無有機碳來源之生長介質，且其中該 136481.doc 200930810 第二生長條件包含含有有機碳來源之生長介質。 在一實施例中，移動海藻細胞另外包含：a)自第一條件 移除該等海藻細胞；及b)將該等海藻細胞轉移至第二條 件。 :在另一實施例中，第二條件類似於該添加有機碳來源之 第一條件" 在一實施例中’使光合細胞成熟之方法可另外包含使該 海藻細胞之脂質成熟。 ® 以引用的方式併入 在本說明書中提及之所有公開案及專利申請案均以引用 的方式併入本文中，該引用程度就如同已特定地及個別地 將各個公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。 【實施方式】 儘管在本文中已展示且描述本發明之實施例，但對於熟 習此項技術者將顯而易見的係僅藉助於實例提供此等實施 _ 例❶在不脫離本發明之情況下，熟習此項技術者現將進行 眾多變化、改變及取代。應瞭解可將本文所述之本發明實 施例之各種替代用於實踐本發明。 本文描述藉由將培養基由自營性轉移至異營性或混合營 養條件來改變細胞之大分子組成的方法及系統。對於可生 長於自營性、異營性及混合營養條件之至少兩者中的任何 光合生物體而言，該等方法均可適用。在一實施例中光 合生物體為海藻物種。 在一態樣中，本文所揭示之方法及系統可增加脂質在光 I36481.doc 200930810 合細胞中之比例。在-實施财，該等方法及系統進一步 包含改良彼等月旨質之特性以使其對於使用包括燃料之生物 質油而言更佳。 可將自營性生物定義為自簡單無機分子及諸如光或無機 : &合物之化學反應的外部能源產生複雜有機化合物之生物 體1合生物體自日光獲㈣量且㈣被稱為光養生物 (或光自營性生物)。可將光合生物體之自營性生長定義為 僅使用日光作為能源將無機碳（諸如CQ2)轉化為有機化合 ❿物（諸如烴）之生物生長。-般而言，為使諸如海藻物種之 光自營性生物體生長，生長機制需要介質中之鹽（諸如， 硝酸鹽、碟酸鹽及少量金屬），及二氧化碳或溶解性無機 碳作為碳源。 可將異營性生物定義為需要有機基質作為碳源以供生長 及發育之生物體。可將異營性生長定義為使用有機分子作 為月匕源之生物生長。此等有機分子可源自植物或動物細胞 珍 <可制糖歧粉之形式。在—實施例中，海藻異營性生 I：使用葡萄糖作為能源。在一些實施例中，異營性生長介 質可類似於添加有約5%葡萄糖之自營性生長介質。在許 多情況下，生長於異營性條件中之細胞在無光下生長。因 為異營性細胞將糖用作能源，所以與將二氧化碳用作主要 碳源之自營性細胞相反，通常將自糖分解產生之碳產物用 作主要碳源。 可將混合營養生物描述為能夠自光合作用及自外部能源 (經常同時）取得代謝能量之生物體（通常為海藻或細菌）。 136481.doc 200930810 此等生物體可將光用作能源，或可吸收有機或無機化合 物。其可滲透式（藉由滲透營養（osmotrophy))或藉由吞沒 粒子（藉由吞噬作用或胞吞作用（myZ〇Cyt〇sis))來吸收簡單 化合物。混合營養生長可包括為生物體之生物生長提供光 能來源及有機碳來源。 本發明係關於可在自營性、異營性或混合營養條件之至 •丨兩者下生長之生物體。在一實施例中，生物體為綠藻物 種。可在自營性、異營性或混合營養條件之至少兩者下生 ❿ 長之物種的其他實例包括（但不限於）海藻（例如，綠藻及紅 藻）、維管植物（例如，煙草、芥菜屬（Arabid〇psis)、蕨類 植物）及原核藍藤細菌。在一實施例中，已將細胞或生物 體遺傳修飾。舉例而言，生物體可為已經遺傳修飾為光合 性之生物體、已經修飾以混合營養或異營性生長之生物體 或已經修飾以產生或改變並非由該生物體天然產生之物質 的生物體。 • 如本文中所用之光合生物體或生物質包括所有能夠光合 生長之生物體，諸如能夠在液相中生長之呈單細胞或多細 胞形式的植物細胞及微生物。此等術語亦可包括藉由自然 選擇、選擇育種、引導進化、合成組裝或遺傳操作修娜之 ，。儘管本文所揭示之申請案尤其適用於培養海藥， 但熟習此項技術者可認識到可利用其他光合生物體作為海 ^替代或除海藻外可利用其他光合生物體。 ^ :般而言’因為所有能量均源自太陽，所以當使可在自 S 、4營性或混合營養條件之至少兩者下生長之大量生 136481.doc 200930810 物體生長時，使生物體在純自營性條件下生長可為能量最 有效之方法及成本最有效之生長方法β然而，在自營性條 件下，大多數植物一般僅含有呈總細胞質量之百分比形式 的中等比例之脂質。相反地，異營性生長提供影響在生物 體細胞中產生之脂質的量及特性之不同脂質概況。在一些 環境中，此等優勢可足以抵消異營性生長所必需之供應碳 源的附加成本。脂質數量及特性在生物燃料製造中尤為重 要。
綠球藻屬為當在自營性條件下生長時與異營性條件相比 s有不同脂質概況的光合物種之一實例。如一般技術者將 瞭解，此實例意欲為說明性的且不必要限於綠球藻屬或海 藻，或甚至任何一個屬或類型之海藻。舉例而言，生長於 自營性條件中之綠球藻屬細胞含有總細胞質量之約丨4%脂 質’而異營性生長細胞含有總細胞質量之約5 5 %脂質，在 異營性生長條件中增加約四倍（"High yield bi〇 〇U production from fast pyrolysis by metabolic controlling 〇f Chlorella protothecoides"Miao 及 Wu， Journal 〇f
Biotechnology， 2004， 110: 85-93)。 亦已知在本文中視為脂質概況之脂質物理特徵及相對量 在自營性及異營性生長下不同。在許多方面，較之來自自 營性生長細胞之脂質，來自異營性生長細胞之脂質更緊密 近似於石油基柴油燃料之脂質。將幾個非限制性實例列於 表1中。 13648 丨.doc 200930810 表1 特性 自營性生長之 綠球藻屬 異營性生長之 綠球藻屬 石油衍生之 0.10 Pa-s 參 基於所產生脂質之量及特性，先前技術已提出培養海藤 以製造生物燃料之最佳方法為異營性生長。 本文中之方法及系統利用自營性生長（捕獲太陽能且將 二氧化碳抽出大氣）及異營性生長（產生更需要之脂質量及 特性）之優勢。組合兩種技術並不簡單地意謂使細胞混合 營：式生長(在具有糖之曰光中)。諸如海溪之光合生物體 當得到在混合營養生長中之選擇時，通常選擇將糖用作碳 源及能源。本發明提供依次利用自營性 來獲得如圖lt所示之兵呂改生長 ❹ 生長方法之優勢的方法及系
統0 J 在本發明之'態樣中，方法包含使光 能及大氣二氧化叙自 ^ «太％ 受"脂質成熟期”，其中添加右:中生長。接著將使細胞經 在無任何可得日光 ^碳之^此第二步驟可 (混合營養條件）進行下（異營性條件）或在日光存在下 細胞可在自營性條件下在透明生長腔 對數期，且可接著將其抽吸至無可得曰光之長至稠 可以約5%之濃度將糖 先之暗至中。接著 將糖（或其他有機糖或碳水化合物分子， 136481.doc -12- 200930810 諸如玉米或稻米糖粉，或衍生自海藻生物質之碳水化合 物）抽吸至腔室中，從而誘導細胞異營性生長。當實踐本 發明方法時，異營性生長在僅有限數目之細胞分裂後可引 起脂質組成改變。在一實施例中，最終結果為已自太陽取 得大部分能量、已自大氣獲得大部分碳且含有最適於生物 柴油製造及使用之脂質的稠培養物。 藉由使海藻在自營性條件中連續生長，所有產生之細胞 能量均源自無機碳’使得該方法極其節約能量及成本。然 β 而，細胞之所得脂質含量以總百分比計可較低且以特定所 需脂質之形式係較低的。異營性介質中之生長可增大所產 生脂質之總百分比且改變脂質之比率以有利於彼等所需形 式。然而，異營性介質中之生長需要糖輸入，從而增加此 專月曰質產物之製造成本。在本發明之方法中，可將上文兩 種生長條件串聯組合’使得首先生長於自營性條件中以最 優化輸入效率’且接著剛好在脂質萃取之前暫時轉移至異 D 營性條件以最優化總脂質產率及所需脂質含量。 另外’本發明之方法可對其他大分子之組成具有所需影 響。舉例而言’細胞可產生更多可適用作商業產品之複雜 糖分子。此係在本發明之範疇内且可視為本發明之實踐。 在本發明之一態樣中，提供用於使光合生物體在光存在 下生長且接著改變生長條件以向生物體提供有機碳來源之 系統。在一實施例中，可將光生物反應器（PBR)系統用以 改變生物體之生長條件。光合生物體可生長於任何合適生 長系，統中’包括（但不限於）開放池塘、經覆蓋之池塘、光 136481.doc •13· 200930810 生物反應器、生物反應l§、皮氏培養皿（Petri dish)、錐形 瓶或其他類似容器，及海洋。 在一實施例中，光合生物體可在對生長系統利用外部或 内部光源之自營性條件下生長。在特定時間段之後，可添 . 加有機碳來源’由此開始異營性生長及脂質成熟期。在一 實施例中，當將有機碳來源添加至PBR中時，仍向生物體 提供光能，其產生混合營養生長條件。或者，可自系統消 除光能，產生異營性生長條件。 ® 在一替代性實施例中，使光合生物體在自營性條件下在 系統中生長特定時間段，且接著將該生物體轉移至向生物 體提供有機碳來源之第二系統中。可使生物體異營性生長 於第二系統中且開始脂質成熟期。在一實施例中，仍向生 物體提供光能’藉此產生混合營養生長條件。或者，可自 系統消除光能，產生異營性生長條件。 在另一實施例中，使光合生物體生長於複數個在自營性 條件下之池塘、腔室、PBR中，且在特定時間之後，接著 β 將生物體轉移至提供異營性或混合營養生長條件之第二生 物反應器中。圖2說明本發明之例示性系統2〇〇。在該實例 中，使海藻生長於複數個在自營性條件下之模組pBR 2〇1 中。可將自營性生長之海藻轉移至為生物體提供異營性生 長條件之單一較大腔室202中。可以連續、半連續或連續 方式進行將海藻向脂質成熟腔室202之轉移。在另一段時 間之後，可自脂質成熟腔室2〇2收集海藻且可將脂質21〇收 集且用於各種製程，該等製程包括製造生物柴油或其他商 136481.doc •14· 200930810 業上適用產品。 可排列複數個諸如池塘或光生物反應器之自營性腔室以 形成用於光合生物質之生長及製造的系•统。如將對熟習此 項技術者顯而易見，在一些實施例中，光生物反應器系統 - 彳包含複數個平行、串聯或呈平行與串聯組態之組合而互 ❹ 連之相同或類似光生物反應器中之一者。舉例而言，此可 增大系統（例如，對於多個光生物反應器之平行組態而言） 之生產量《亦可將該複數個自營性腔室與提供異營性或混 合營養生長條件以改良生物質之脂質含量及/或特性的複 數個脂質成熟腔室或單一脂質成熟腔室轉接。在一實施例 中，不將生物質轉移至第二生物反應器中，而將有機碳來 源添加至該複數個PBR中以產生混合營養生長條件。pbr 亦可經覆蓋且不具備光能以為光合生物質製造異營性生長 條件。在本文中提供之本發明光生物反應器裝置之所有此 等組態及排列均在本發明之範疇内。 本發明之系統之各單元可獨立操作。該等單元可為模組 且必要時其可易於調換。舉例而言，若一個單元收到另一 海藻物種或其他生物體污染，則其可調換為不同單元。 儘管本發明之系統可意欲為模組及自含的，但可將收集 製程、介質再循環、水儲存、動力產生及其他製程集中且 分配至個別單兀。可以網路形式連接獨立單元，因此可中 樞協調介質之分散及生物質產物之收集。 在-些實施例中，將控制系統及方法用於系統操作中， 將其組態為能夠自動即時地最佳化及/或調節操作 136481.doc -15- 200930810 參數以達成由自營性向異營性（或混合營養）生長條件之轉 移。在又一態樣中，本發明包括針對光合生物體將隨後在 利用本發明之系統期間所暴露之特定環境及/或操作條件 來預選、改適及調節光合生物體之一或多個物種的方法及 系統。 實例1 本發明之一態樣包括在由自營性轉移至異營性生長後產 生比自純異營性（HT)或自營性（AT)生長所得之所需產物更 Φ 大量的"所需產物"（適用能量，或Ε* 。 因此，本發明之成功實踐將產生△hWAT—Η1>ΔΕ“ (HT—HT)，如圖3中之實例。在圖3中，將限定量之異營性 介質（X g糖）用於HT生長，產生15個任意單位（AU)之h用。 此歷經比較期產生比僅AT情況更多之總生長’及更大比例 之適用產物。然而，隨著HT轉移，X g糖燃料生長至15〇 AU，以及細胞之大分子組成自15% E“轉移至27% E“。 預期結果為在利用自AT轉移至HT生長的本發明方法之情 況下產生25 AU之Ei® «。因此’本發明之方法情況所用之 糖量產生比僅HT情況更大量之E適用。 當在以下情形時，出現此情況且可實踐本發明方法：異 營性生長介質不僅驅動新穎適用產物之合成，而且驅動以 下情況中之一者或兩者：昀與單獨之HT生長相比，適用產 物之不成比例合成’及b)不適用產物向適用產物之轉化。 可假設在異營性生長環境中，資源豐富，其將細胞向富能 量產物之儲存驅動’萬一稍後需要其。同時，在異營性生 136481.doc -16 - 200930810 長下’細胞並不需要繼續產生不再需要之光合蛋白質，亦 預期遠離蛋白質且向能量密集儲存產物之轉移。 實例2 如何在實驗環境中定義/量測E適用？ .可如上所述以實驗方式測試異營性轉移之益處。重要的 在於需要定義E* a之量且開發量測其之檢定。 在一實施例中，Ew可定義為脂質在培養物中之總量。 此可以多種方法得以檢定，包括： 參 Εϋ用=(#細胞）*(%脂質/細胞） 其中％脂質係由在顯微鏡下觀測之脂質小泡的數目及尺寸 來檢定，或
Ess a =(#細胞）*(%脂質/細胞） 其中°/◦脂質係藉由染色（例如，使用NILE紅）來檢定且藉由 在顯微鏡下觀測或使用分光光度計以量測染色來定量。 在一替代性實施例中’ Ea用可定義為在培養物中脂質（例 如最適用於燃料之脂質，諸如飽和脂肪酸）之子集。此可 ® 以如下多種方法來檢定，包括： E適《=(植物物質之毫克數）*(每毫克不飽和脂肪酸之量） 其中飽和脂肪酸之量係由質譜分析來定量，或
Ea « =(植物物質之毫克數）*(每毫克不飽和脂肪酸之量） : 其中飽和脂肪酸之量係藉由矽酸管柱經由差分溶離，接著 藉由Si凝膠薄層層析，根據Tornabene之方法（Tornabene等 人，1982，如在NREL第29頁中參考）來定量。 脂質之子集可藉由在實際應用中對其測試來定義為適用 136481.doc •17· 200930810 ， 的，諸如藉由獲得脂質產物之生物柴油認證來檢驗脂質含 量對於機械引擎中之生物柴油用途而言係經優化的。 【圖式簡單說明】 將藉由參考闞述說明性實施例（其中利用本發明之原理） :之以下實施方式，及隨附圖式來獲得對本發明之特徵及優 勢的更好理解，其中： 圖1說明依次利用自營性生長及異營性生長來獲得兩個 生長方法之優勢的方法及系統。 ® 圖2說明本發明之例示性系統，其中使海藻生長於複數 個在自營性條件下之模組PBR中且可將其轉移至為生物體 提供異營性生長條件之單一較大腔室中。 圖3說明用於異營性生長，從而產生15個任意單位之適 用能量的界定量之異營性介質。 【主要元件符號說明】 200 本發明之例示性系統
201 模組PBR _ 202 單一較大腔室/脂質成熟腔室 210 脂質 136481.doc