TW200904977A - Method for production of polypeptide - Google Patents

Description

200904977 九、發明說明 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關多肽的製造方法，更詳細而言，係關於 使用大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，製造多肽之方法 【先前技術】 使用基因重組技術生產適用爲醫藥的蛋白質時，因使 用動物細胞使原核細胞無法進行的複雜的轉譯後修飾及摺 疊變爲可能，遂使動物細胞廣泛用於爲生產重組蛋白質的 宿主細胞。 近年來，雖然許多抗體及具生理活性的蛋白質等生技 藥品被排除，但可使動物細胞有效率地生產重組蛋白質之 技術，與生技藥品降低成本有關，承諾對患者安定的供給 0 因此，尋求更高生產效率的蛋白質製造方法。 /3 -丙胺酸單獨使用具有pH緩衝作用，具有抗氧化作 用，亦爲更強的肌肽（非專利文件1 )之前驅物。 另外，已知Θ -丙胺酸爲訊號肽’具有有機滲透分子 (非專利文件2、3 )之功能’及藉由伴娘蛋白般的活性 而保持酵素活性（非專利文件4 ) ° 但目前全然未知細胞內Θ -丙胺酸的濃度增加’會對 提高培養細胞內所期待的重組蛋白質之產生有所貢獻。 於腦內Θ -丙胺酸合成酵素已知爲麩胺酸脫羧酶（ -5- 200904977

Glutamate Decarboxylase ( GAD ) ( EC4.1.1.15 )(非專 利文件5 ) ) ，GAD亦爲具亞牛磺酸及牛磺酸合成活性之 脫羧酵素。一般做爲由半胱胺酸等含硫合成牛磺酸時之酵 素（非專利文件6、7 )，已知有半胱亞磺酸脫羧酶（ Cysteine Sulfinic Acid Decarboxylase (CSAD) ( EC4.1_1.29 ))及半腕;胺酸雙加氧酶（Cysteine Dioxygenase ( CDO )(EC1. 13.1 1.20 ))，但以往並未得知於CHO細胞內， 使半胱亞磺酸脫羧酶大量表現時，會使；8-丙胺酸大量地 生成。另外，對於倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶以及倉鼠半胱胺 酸雙加氧酶亦無所知。 非專利文件 1 : Babizhayev, M.A_, Biochim. Biophys. Acta (1989) 1004, 363-371 非專利文件 2 : Hammer, M.A., Baltz, J. M·，Mol. Reprod. Dev.(20 03 ) 6 6 (2), 1 5 3 -6 1 非專利文件 3 : Mariapia，V·, et. al. Biochim. Biophys. Acta (2002) 1587, 83-91 非專利文件 4: Mehta, A.D·，Seidler, N. W·，Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry (2 005 ) 2 0 (2), 199-203 非專利文件 5 : Kelly, C., Carter, N. D_, Johnstone, A. P. and Nussey, S. S·, Lancet ( 1 99 1 ) 3 3 8 (87 80), 1 468 - 1469 非專利文件 6: M. L. Tappaz, Neurochemical Research, V o 1. 2 9 , No. 1, January 2004, pp.83-96 200904977 非專利文件 7: Ian Henry Lambert, Neurochemical Research, Vol. 29, No. 1, January 2004, pp.27-63 【發明內容】 本發明係以提供可以高產量製造天然型蛋白質或重組 蛋白質之方法爲目的。 本發明之發明者們’爲解決上述課題專心硏究後’發 現藉由使用可大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，可使所 期望的多肽的產生量增加，本發明遂至完成。進而，藉由 使用同時表現半胱亞磺酸脫羧酶與牛磺酸轉運蛋白的細胞 ，可使所期望的多肽的產生量更加增加。進而本發明之發 明者們發現大量表現半胱亞磺酸脫羧酶的細胞，其/3-丙 胺酸的產生有顯著地增加。/3 -丙胺酸可藉由其抗氧化能 力’中和疲勞物質的乳酸，因推測其可與細胞內多餘的糖 分相結合而被排出體外，而認爲細胞中之Θ -丙胺酸濃度 的上升，對所期望的多肽的產生量增加有所貢獻。另外， 本發明之發明者們進行檢討後，即便將0 -丙胺酸添加於 培養細胞用之培養基中’亦未見-丙胺酸的細胞內濃度 增加，故僅於培養基中添加点-丙胺酸並不充分。 本發明之要旨如下所述。 (1) 一種多狀的製造方法，其係包含培養已導入編 碼所期望之多肽的DNA且可大量產生沒-丙胺酸之細胞’ 及使其產生所期望的多肽。 (2) 如（1)之製造方法，其中可大量產生丙胺 200904977 酸之細胞，係已導入編碼具有自天冬胺酸合成/5-丙胺酸 之酵素活性的蛋白質的DNA之細胞。 (3) 如（1)之製造方法，其中可大量產生-丙胺 酸之細胞，係已導入編碼半胱亞磺酸脫羧酶、麩胺酸脫羧 酶或該等酶之突變體的DNA之細胞。 (4) 如（1)〜（3)中任一項之製造方法，其中可 大量產生/3 -丙胺酸之細胞，係相對於開始培養時-丙胺 酸的細胞內濃度’培養第6天以後$ -丙胺酸的細胞內濃 度之比變爲2以上之細胞。 (5 )如（1 )〜（3 )中任一項之製造方法，其中可 大量產生/3-丙胺酸之細胞，係可使培養液中之丙胺酸 濃度於培養第6天以後增加50 /Z Μ以上之細胞。 (6 ) —種培養細胞’其係相對於開始培養時yg -丙胺 酸的細胞內濃度’培養第6天以後/3 -丙胺酸的細胞內濃 度之比變爲2以上。 (7 ) —種培養細胞，其係可使培養液中之Θ -丙胺酸 濃度於培養第6天以後增加5 〇 # μ以上。 (8 ) —種多肽的製造方法，其係包含培養可大量表 現半胱亞磺酸脫羧酶，且已導入編碼所期望多肽的DNA 之細胞，並使其產生所期望的多肽。 (9) 如（8)之製造方法，其中可大量表現半胱亞磺 酸脫羧酶之細胞，係已導入編碼半胱亞磺酸脫羧酶的 DNA之細胞。 (10) 如（8)或（9)之製造方法，其中可大量表現 -8- 200904977 半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，進而可大量表現牛磺酸轉運蛋 白。 (Π)如（10)之製造方法，其中可大量表現牛磺酸 轉運蛋白之細胞’係已導入編碼牛磺酸轉運蛋白的DNA ' 之細胞。 (I2)如（9)或（11)之製造方法，其中該細胞係 中國倉鼠卵巢細胞。 (1 3 )如（8 )〜（12 )中任一項之製造方法，其中 所期望的多肽係抗體。 (14)如（9)〜（13)中任一項之製造方法，其中 編碼半胱亞磺酸脫羧酶的DNA係以下（a)〜（e)之任 —種，（Ο可編碼具序列編號2、4、6或8之胺基酸序 列的多肽，（b )編碼於序列編號2.、4、6或8之胺基酸 序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、付加及 /或被插入的胺基酸序列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性 的多肽之DN A， （c)編碼具有與序列編號2、4、6或8 \ 之胺基酸序列70%以上相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶 活性的多肽之DNA，（ d )具有序列編號1、3、5或7之 鹼基序列之DN A ’ （ e )於具有序列編號1、3、5或7之 鹼基序列之DNA上，與互補DNA以高度嚴格的條件下進 _ 行雜交，且編碼具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之 DNA。 (1 5 )—種編碼半胱亞磺酸脫羧酶之DNA，其係以 下（a )〜（e )之任一種（但除具序列編號3、5及7之 -9- 200904977 鹼基序列之DNA以外），（a )編碼具序列編號2之胺基 酸序列的多肽之DNA，（ b )編碼於序列編號2之胺基酸 序列中，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、付加及 /或被插入的胺基酸序列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性 的多肽之DN A，（C)編碼具有與序列編號2之胺基酸序 列9 7%以上相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽 之DNA， （d)具有序列編號1之鹼基序列之DNA， ( e )於具有序列編號1之鹼基序列之DNA上’與互補DNA 以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有半胱亞磺酸脫 羧酶活性的多肽之DNA。 (1 6 ) —種多肽，其係以下（A )〜（E )之任一種 (但除具序列編號4、6及8之胺基酸序列之多肽以外） ，（A )具序列編號2之胺基酸序列之多肽，（B )於序 列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複數個胺基酸被取 代、缺失、付加及/或被插入的胺基酸序列’且具有半胱 亞磺酸脫羧酶活性之多肽，（C)具有與序列編號2之胺 基酸序列97%以上相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性 之多肽，（D )藉由具序列編號1之鹼基序列之DNA而進 行編碼之多肽，（E )藉由於具有序列編號1之鹼基序列 之DNA上，與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交， 且編碼具有半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽之DNA進行編 碼之多肽。 (1 7 ) —種重組載體，其係包含如（1 5 )之DN A。 (1 8 )—種細胞，其係已導入如（1 5 )之DN A。 -10- 200904977 (1 9 ) 一種細胞，其係已導入編碼半胱亞磺酸脫羧酶 之DNA與編碼所期望的多肽之DNA。 (20 )如（1 9 )之細胞，其係進而導入編碼牛磺酸轉 運蛋白之DNA。 (2 1 ) —種細胞，其係已導入編碼半晄亞磺酸脫羧酶 之DNA與編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。 (22 ) —種大量產生/3 -丙胺酸的細胞，其可經導入 編碼半胱亞磺酸脫羧酶之DNA而得。 (2 3 )如（2 2 )之大量產生；5 ·丙胺酸的細胞，其係 已導入編碼所期望多肽之DNA。 根據本發明，可使所期望的多肽的生產量增加。 本說明書係包含爲本申請案優先權基礎之日本專利申 請、案號2007-66 1 72之說明書以及/或圖面所記載之內 容。 以下針對本發明之實施方式更詳細地加以說明。 本發明係包含培養可大量表現半晄亞磺酸脫羧酶，且 已導入編碼所期望之多肽的DNA之細胞，並使其產生所 期望之多肽，提供多肽的製造方法。 本發明之方法中，細胞爲可產生所期望之多肽的天然 細胞，亦可爲導入編碼所期望之多肽的DNA之轉化細胞 ’但以導入編碼所期望之多肽的DNA之轉化細胞爲佳。 本發明之方法中，並未特別限定所期望之多肽，可爲 抗體（例如抗IL-6受體抗體、抗IL-6抗體、抗聚醣蛋白_3 抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GP Π b/ III a抗體 -11 - 200904977 、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2 /neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體 、抗IgE抗體、抗CDlla、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體 等），及生理活性蛋白質（顆粒細胞生長激素（G-CSF) 、巨噬細胞生長激素（GM-CSF)、紅血球生成素、干擾 素、IL-1及IL-6等干擾素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白 、血液凝固因子、PTH等）等各種多肽，但以抗體特佳。 抗體可爲天然抗體、Fab、scFv、sc(Fv)2等低分子化抗體 、嵌合體抗體、人類化抗體等任一種抗體。 藉由使用可大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，可使 細胞多肽的產生量增加。 已知半胱亞磺酸脫羧酶原本是將3 -亞磺酸丙胺酸轉 變爲亞牛磺酸之酵素，但藉由使其於CHO細胞內大量表 現，使/3 -丙胺酸可以過剩量合成。 大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，若爲與天然細胞 相比，半胱亞磺酸脫羧酶的表現量爲增加之細胞，則無特 別限定，例如可舉出CHO細胞等製造重組蛋白時用爲宿 主細胞之細胞。 大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，可舉出例如經人 爲導入半胱亞磺酸脫羧酶基因之細胞。經人爲導入半胱亞 磺酸脫羧酶基因之細胞，可根據該領域業者周知之方法製 作，例如可將半胱亞磺酸脫羧酶之基因插入載體，再以該 載體使細胞成爲轉化細胞而進行製作。進而’於本說明書 中，根據基因活化技術（例如參照國際公開第W094/ -12- 200904977 1 2650號冊子），使內源性半胱亞磺酸脫羧酶基因被活化 ，其結果包含大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞及經人爲 導入半胱亞磺酸脫羧酶基因之細胞。 使細胞大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之基因，並未特別 限定爲來自何種生物之半胱亞磺酸脫羧酶。具體可舉出來 自人類，小鼠、大鼠、倉鼠等嚅齒類，河豚類的虎豚，海 鞘類的玻璃海鞘等生物之半胱亞磺酸脫羧酶，以來自人類 、囌齒類或與宿主細胞相同種來源的半胱亞磺酸脫羧酶爲 佳，例如大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之中國倉鼠卵巢細胞 (C Η Ο細胞），以使用來自人類或倉鼠之半胱亞磺酸脫 竣酶爲佳。 進而本發明之半胱亞磺酸脫羧酶基因，可舉出下列（ a)〜（e)之任一種DNA。

(a) 可編碼具序列編號2、4、6或8之胺基酸序列 的多肽之DNA

(b) 編碼於序列編號2、4、6或8之胺基酸序列中 ，具有1個或複數個（例如有數個）胺基酸被取代、缺失 、付加及/或被插入的胺基酸序列，且具有半胱亞磺酸脫 羧酶活性的多肽之DNA

(c) 編碼具有與序列編號2、4、6或8之胺基酸序 列70%以上相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽 之DNA

(d )具有序列編號1、3、5或7之鹼基序列之DNA (e)於具有序列編號1、3、5或7之鹼基序列之 -13- 200904977

DNA上，與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且 編碼具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DNA 大量表現半胱亞磺酸脫羧酶之細胞可爲動物細胞、植 物細胞、酵母等真核細胞；大腸桿菌、枯草桿菌等原核細 胞之任一種細胞，以CHO細胞、COS細胞等動物細胞爲 佳，CH0細胞特佳。另外，爲製造所期望的多肽，以使 用CHOdhfr-細胞等適合導入所期望的基因之細胞爲佳。 大量表現本發明之半胱亞磺酸脫羧酶之細胞，爲製造 所期望的多肽，以進而大量表現牛磺酸轉運蛋白爲佳。藉 由於相關細胞中導入編碼所期望的多肽之基因，再將該細 胞於培養基中進行培養，可製造更大量的所期望的多肽。 使用經人爲導入半胱亞磺酸脫羧酶基因之細胞製造所 期望的多肽時，並未特別限制半胱亞磺酸脫羧酶基因與編 碼所期望的多肽之基因導入的順序，可於導入半胱亞磺酸 脫羧酶基因後，再導入編碼所期望的多肽之基因，亦可於 導入編碼所期望的多肽之基因後，再導入半胱亞磺酸脫羧 酶基因。另外，可同時導入半胱亞磺酸脫羧酶基因與編碼 所期望的多肽之基因。 半胱亞磺酸脫羧酶基因及編碼所期望的多肽之基因之 導入，可藉由單一載體同時進行導入，亦可使用複數個載 體分別進行導入。 藉由使用除了半胱亞磺酸脫羧酶之外亦大量表現牛磺 酸轉運蛋白之細胞，可抑制細胞內氨濃度。 牛磺酸轉運蛋白可使牛磺酸、/3-丙胺酸及各種胺基 -14- 200904977 酸進入細胞內，爲一種具滲透壓調節功能的膜蛋 大量表現牛磺酸轉運蛋白的細胞，若爲與天 相比爲牛磺酸轉運蛋白的表現量增加之細胞則無 未限定爲天然的細胞，例如可舉出CHO細胞等 蛋白質時使用爲宿主之細胞。 大量表現牛磺酸轉運蛋白之細胞，可舉出例 導入牛磺酸轉運蛋白基因的細胞。可根據相關業 方法，製作經人爲導入牛磺酸轉運蛋白基因的細 可藉由將牛磺酸轉運蛋白之基因插入載體，再以 細胞成爲轉化細胞而進行製作。 使細胞大量表現牛磺酸轉運蛋白基因，並未 爲來自何種生物之牛磺酸轉運蛋白。具體可舉出 ，小鼠、大鼠、倉鼠等囑齒類之來自生物的牛磺 白，以來自人類、嚼齒類或與宿主細胞相同種來 酸轉運蛋白爲佳，例如使細胞大量表現牛磺酸轉 中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞），以來自人類 牛磺酸轉運蛋白爲佳。 進而使細胞大量表現牛磺酸轉運蛋白基因， 碼牛磺酸轉運蛋白之下列（a)〜（e)之任一種

(a) 可編碼具序列編號20、22、24或26 序列的多肽之DNA (b) 編碼於序列編號20、22、24或26之 列中，具有1個或複數個（例如有數個）胺基酸 缺失、付加及/或被插入的胺基酸序列，且具有 白。 然的細胞 特限定。 製造重組 如經人爲 者周知之 胞，例如 該載體使 特別限定 來自人類 酸轉運蛋 源的牛磺 運蛋白之 或倉鼠之 可舉出編 DNA。 之胺基酸 胺基酸序 被取代、 牛磺酸轉 -15- 200904977 運蛋白活性的多肽之dna

(c) 編碼具有與序列編號20、22、24或26之胺基 酸序列7 0 %以上相同性，且具有牛磺酸轉運蛋白活性的多 肽之DNA (d) 具有序列編號19、21、23或25之鹼基序列之

DN A

(e )於具有序列編號1 9、2 1、2 3或2 5之鹼基序列 之DNA上，與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交， 且編碼具有牛磺酸轉運蛋白活性的多肽之DNA 爲製造所期望的多肽，於大量表現牛磺酸轉運蛋白與 半胱亞磺酸脫羧酶基因之細胞中’導入編碼所期望的多肽 之基因，再藉由於培養基中培養該細胞而可進行製造。進 而，於本說明書中，根據基因活化技術（例如參照國際公 開第W ◦ 9 4 / 1 2 6 5 0號冊子），藉由使該細胞內源性的基 因被活化，使用可產生所期望的多肽之細胞’而可製造所 期望的多肽。 使用經人爲導入牛磺酸轉運蛋白基因與半胱亞磺酸脫 羧酶基因之細胞而製造所期望的多肽時’並未特別限制牛 磺酸轉運蛋白基因與半胱亞磺酸脫羧酶基因與編碼所期望 的多肽之基因導入的順序’可於導入牛磺酸轉運蛋白基因 與半胱亞磺酸脫羧酶基因後’再導入編碼所期望的多肽之 基因，亦可於導入編碼所期望的多肽之基因後，再導入牛 磺酸轉運蛋白基因與半胱亞磺酸脫羧酶基因。另外，可同 時導入牛磺酸轉運蛋白基因與半胱亞磺酸脫羧酶基因與編 -16- 200904977 碼所期望的多肽之基因。 牛磺酸轉運蛋白基因，半胱亞磺酸脫羧酶基因及編碼 所期望的多肽之基因之導入，可藉由單一載體同時進行導 入，亦可使用複數個載體分別進行導入。 培養大量表現半胱亞磺酸脫羧酶（亦可大量表現牛磺 酸轉運蛋白）時，可使用於培養一般的細胞（動物細胞爲 佳）時所使用的培養基。一般於該等培養基中包含胺基酸 、維他命類、脂質因子、能量來源、滲透壓調節劑、鐵質 來源、pH緩衝劑。該等成分的含量一般適當的範圍在胺 基酸爲0.05-1500mg/L、維他命類O.OOl-lOmg/L、脂質 因子0-200mg/ L、能量來源l-20g/ L、滲透壓調節劑 0.1-10000mg/L、鐵質來源 0.l-500mg/L、pH 緩衝劑 1-1 0000mg/L、微量金屬元素〇.〇〇〇〇l-200mg/L、界面活 性劑0-5000mg/L、增殖輔助因子0.05-lOOOOyg/L以 及核苷酸〇.〇〇l-50mg/L，但並未限定在此範圍，可根據 培養的細胞種類、期望的多狀種類等而適宜地決定。 除上述成分外，亦可添加微量金屬元素、界面活性劑 、增殖輔助因子、核苷酸等。 具體而言可舉例爲含有L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天 門冬醯胺、L-天門冬胺酸' L-半胱胺酸、L-胱胺酸、L-麩 醯胺、L-麩胺酸、甘胺酸、L-組胺酸、L-異白胺酸、L-白 胺酸、L -離胺酸、L -甲硫胺酸、L -鳥胺酸、L -苯丙胺酸、 L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-羥丁胺酸、L-色胺酸、L-酪胺酸 、L-纈胺酸等’以L-丙胺酸、L-精胺酸、L-天門冬醯胺、 -17- 200904977 L-天門冬胺酸、L -胱胺酸、L -麩醯胺、L-鍵胺酸、甘胺酸 、L -組胺酸、L -異白胺酸、L -白胺酸、L -離胺酸、L -甲硫 胺酸、L-苯丙胺酸、L-脯胺酸、L-絲胺酸、L-羥丁胺酸、 L-色胺酸、L-酪胺酸、L-纈胺酸等胺基酸類爲佳；i-肌醇 、生物素、葉酸、硫辛酸、薛鹼胺、薛驗酸、對胺基安息 香酸、泛酸錦、α多醛鹽酸鹽、維他命B6、維他命B2、維 他命Β1、維他命Β12、抗壞血酸等’以生物素、葉酸、 硫辛酸、菸鹼胺、泛酸鈣、哆醛鹽酸鹽、維他命Β2、維 他命Β1、維他命Β12、抗壞血酸等維他命類爲佳；氯化 膽鹼、酒石酸膽鹼、亞麻油酸、油酸、膽固醇等’以氯化 膽鹼等脂質因子爲佳；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等 ，以葡萄糖等能量來源爲佳；氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等 ，以氯化鈉等滲透壓調節劑爲佳；EDTA鐵、檸檬酸鐵、 氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等’以氯 化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵質來源爲佳；碳酸氫鈉、 氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等，以碳酸氫鈉等 pH緩衝劑的培養基爲佳。 除上述成分外，亦可添加例如硫酸銅、硫酸錳、硫酸 鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞矽酸鈉等，以 硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素爲佳；Tween80 、Pluronic F68等界面活性劑；以及重組型胰島素、重組 型IGF-1、重組型EGF、重組型FGF、重組型PDGF、重 組型TGF-α、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、維他命A酸、鹽 酸四甲烯二胺等’以亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型 -18- 200904977 IGF-1、鹽酸四甲烯二胺等增殖輔助因子爲佳；去氧腺苷 、去氧胞苷、去氧鳥糞嘌呤、腺苷酸、胞嘧啶、鳥糞嘌呤 '尿嘧啶等核苷酸。於適合上述培養基之例中，含有鏈黴 素、苄青黴素鉀以及紫黴素等抗生素，及酚紅等pH指示 劑亦可。 培養基的pH依培養細胞而有所不同，但一般爲 pH6.8〜7.6，大部分以PH7.0〜7.4爲適當。 培養基係市售之動物細胞培養用培養基，亦可使用例 如 D-MEM ( Dulbecco's Modified Eagle Medium) 、D-MEM/ F-12 1:1 Mixture ( Dulbecco’s Modified Eagle

Medium ： Nutrient Mixture F-12) 、PRMI 1 640、CHO-S- S F Μ Π ( I n v i t r o g e n 公司）、C Η O - S F ( S i gm a - A1 d r i c h 公 司）、EX-CELL 301 ( JRH b i o s c i e n c e s 公司）、C D - C Η O (Invitrogen 公司）、I S C H 0 - V ( I r v i n e S c i e n t i f i c 公司 )、PF-ACF-CHO ( Sigma-Aldrich 公司）等培養基。 培養基亦可爲無血清培養基。 大量表現半胱亞磺酸脫羧酶細胞（大量表現牛磺酸轉 運蛋白亦可）爲C Η Ο細胞時，C Η Ο細胞之培養可使用相 關業者周知之方法進行培養。例如一般可於氣相C 02濃度 〇-40%，2-10%爲佳，以3 0-3 9 t，37°C爲佳之下進行培養 〇 自下述之實施例可明確得知於大量表現半胱亞磺酸脫 羧酶細胞，可抑制細胞生長阻礙物質之乳酸等老舊廢物的 產生。其結果，細胞呈現維持高生存率，可培養2 0天以 -19- 200904977 上，30天以上，進而更佳爲2個月或以上更長期的培養 〇 進而使培養細胞產生抗體等所期望的多肽時，於培養 後期細胞變爲相當高密度的狀態（約1 X 1 07 c e 11 s / m L )， 乳酸等老舊廢物的影響變爲極高。若藉由大量表現半胱亞 磺酸脫羧酶細胞製造所期望的多肽，於培養後期亦可維持 高生存率，亦可期待所期望的多狀的生產量增加。 爲使用大量表現半胱亞磺酸脫羧酶細胞產生所期望的 多肽，適當的培養期間一般爲1天〜3個月，以1天〜2 個月爲佳，1〜1個月更佳。 可使用動物細胞培養用的各種培養裝置，例如發酵槽 型桶狀培養裝置、air lift型培養裝置、培養瓶型培養裝 置、攪拌式反應瓶型培養裝置、微載體型培養裝置、流動 層型培養裝置、中空纖維型培養裝置、旋轉瓶型培養裝置 、充塡槽型培養裝置等進行培養。 培養時可使用批次培養（batch culture )、饋料批次 培養（fed-batch culture)、連續培養（continuous culture )等任一種方法，但以饋料批次培養或連續培養爲佳，饋 料批次培養更佳。 培養大量表現半胱亞磺酸脫羧酶的細胞（亦可大量表 現牛磺酸轉運蛋白）時，爲增進細胞攝取牛磺酸，可於培 養中添加牛磺酸。 本發明係提供下述（A)〜（E)之任一種新穎的多 肽（但除具序列編號4、6及8之胺基酸序列之多肽以外 -20- 200904977 (A )具序列編號2之胺基酸序列之多肽， (B)於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複 數個（例如有數個）胺基酸被取代、缺失、付加及/或被 插入的胺基酸序列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽 j (C )具有與序列編號2之胺基酸序列97%以上相同 性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽， (D )藉由具序列編號1之鹼基序列之DNA而進行編 碼之多肽， (E )藉由於具有序列編號1之鹼基序列之DNA上， 與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有 半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽之DNA進行編碼之多肽。 本發明之新穎的多肽係倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶以及與 其具同等功能之多肽。本發明中，與半胱亞磺酸脫羧酶具 同等功能係指自3-丙胺亞磺酸合成亞牛磺酸之酵素活性 ，自半胱胺酸合成牛磺酸的酵素活性，如同麩胺酸脫羧酶 般，自天門冬胺酸合成Θ -丙胺酸之酵素活性等，與倉鼠 半胱亞磺酸脫羧酶所具有的相同的脫羧酸活性。此類的多 肽，包含例如倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶的異型體。 爲調製具有與某些多肽同等功能的多肽，已知相關業 者周知之方法有對多肽導入變異之方法。例如相關業者可 使用特定部位的誘發變異法（Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1 995 ) Gene 1 5 2, 27 1 -275 ' Zoller, MJ, and Smith, M.( -21 - 200904977 1 9 8 3 ) Methods Enzymol. 1 00, 46 8- 5 00、Kramer, W. e t al. (1 984 ) Nucleic Acids Res. 1 2, 944 1 -9456 ' Kramer W, and Fritz HJ ( 1 9 8 7 ) Methods. Enzymol. 1 54, 3 5 0-367 ' Kunkel, T A ( 1 9 8 5 ) Pro c Natl Acad Sci USA. 82, 488-492 、Kunkel ( 1988) Methods Enzymol. 85，2763-2766 )等， 藉由適當地對倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之胺基酸導入突變， 可調製與倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶相同功能的多肽。另外， 胺基酸之突變於自然界亦會產生。如此，於本發明之倉鼠 半胱亞磺酸脫羧酶之胺基酸序列中，具有1個或複數個經 突變後之胺基酸序列，包含具有與倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶 相同功能的多肽，或本發明之新穎的多肽。 具與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶同等功能之多肽 ，具體而言，可舉出倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之胺基酸序列 中，具有1個或2個以上，以1個以上30個以下爲佳，1 個以上10個以下更佳之胺基酸爲缺失者，倉鼠半胱亞磺 酸脫羧酶之胺基酸序列中，具有1個或2個以上，以1個 以上3 0個以下爲佳，1個以上1 0個以下更佳之胺基酸爲 付加者，倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之胺基酸序列中，具有1 個或2個以上，以1個以上3 0個以下爲佳，1個以上10 個以下更佳之胺基酸爲被其他胺基酸所取代者等。

突變的胺基酸殘基並未特別加以限定，但希望是保存 胺基酸支鏈性質而突變爲其他胺基酸。胺基酸支鏈性質可 舉出例如爲疏水性胺基酸（A、I、L、Μ、F、P、W、Y、 V )，親水性胺基酸（R、D、N、C、E、Q、G、Η、K、S -22- 200904977 、T)，具有脂肪族支鏈之胺基酸（G、Α、V、L、I、Ρ) ，具含羥基支鏈之胺基酸（S、T、Y)，具含硫磺原子支 鏈之胺基酸（C、M)，具含有碳酸及醯胺之胺基酸（D、 N、E、Q)，具含鹼基支鏈之胺基酸（R、K、Η)，具含 芳香族支鏈之胺基酸（H、F、Y、W)(括弧內係表示各 胺基酸之縮寫）。 對某些胺基酸，具有藉由1個或複數個胺基酸殘基之 缺失、付加及/或以其他胺基酸取代修飾後之胺基酸序列 之多肽，已知其如何維持生物學上的活性（Mark, D . F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 984 ) 8 1, 5 662- 5 666 ' Zoller, M. J. & Smith, M. Nucleic Acids Research ( 1 982 ) 10，64 8 7-6 5 00、Wang, A. et al., Science 224，1 43 1 - 1 43 3 ' Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 982 ) 79, 6409-64 1 3 )。 於本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶經付加1個或複數 個胺基酸殘基後之多肽，可舉出例如含倉鼠半胱亞磺酸脫 羧酶之融合多肽。融合多肽係本發明之蛋白質倉鼠半胱亞 磺酸脫羧酶’與其他多肽進行融合後者，包含於本發明。 製作融合多肽之方法’可使編碼本發明之倉鼠半胱亞磺酸 脫羧酶之基因與編碼其他多狀之基因之框架一致而進行連 結’再將其導入表現載體’於宿主內使其表現，可使用相 關業者周知之方法。並未特別限定與本發明之多狀進行融 合所附加的其他多肽。 與本發明之多肽進行融合所附加的其他多肽可舉出例 -23- 200904977 如 FLAG ( Hopp，T . P . e t a 1., B i ο T e c hn o 1 o g y ( 1 98 8 ) 6, 1 204-1 2 1 0 )、由6個His (組胺酸）殘基所構成之6x His 、l〇xHis、流感病毒血凝素（HA)、人類c-myc片段、 VSV-GP 片段、pi 8HIV 片段、T7-tag、HSV-tag、E-tag、 S V 4 0 T 抗原片段、lck tag、α-tubulin 片段、B-tag、 Protein C片段、GST (麩胺基硫轉移酶）、HA (流感病 毒血凝素）、免疫球蛋白恆定區、/3-半乳糖苷酶、MBP (麥芽糖結合蛋白）等。 使市售之編碼該等多肽之基因，與編碼本發明之多肽 之基因進行融合，藉由使該等經調製後之融合基因進行表 現，而可調製融合多肽。 相關業者熟知之調製與某些多肽具同等功能之多肽之 方法，可舉出利用雜交技術（Sambrook, J. et al. Molecular Cloning， 2nd ed.， 9.47-9.5 8, Cold Spring Harbor Lab. Press，1 9 8 9 )之方法。亦即，相關業者一般會進行以編碼 本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之DNA序列或其一部分 爲基礎，分離出與其相似性高之DNA，再自該DNA中分 離出與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶同等功能之多肽。 如此，與編碼本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之DNA ’ 或由其一部分所構成之DNA進行雜交之DNA所編碼之多 肽，爲具有與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶具同等功能 之多肽，亦包含於本發明之多肽。 爲分離出編碼具有與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶 具同等功能之多狀之DNA，進行雜交之條件，相關業者 -24- 200904977 可適當地加以選擇。雜交的條件可舉出例如低限制條件。 低限制條件係可舉出例如於 4 2 °C，2 X S S C，0.1 % S D S，以 5〇°C，2xSSC，0.1%SDS爲佳。更佳者可舉出高度嚴格的 條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65°C，2xSSC，0.1% SDS。於該等條件，降低溫度程度，不僅可獲得具有高相 似性的DNA，亦可獲得僅具有低相似的DNA。反之，升 高溫度，可期待僅獲得具有高相似性的DNA。然而，影 響雜交嚴格條件的要素認爲除溫度之外，尙有鹽濃度等複 數個要素，相關業者可適宜地藉由選擇該等要素，而可實 現相同的嚴格條件。 藉由該等雜交技術分離之DNA所編碼的多狀，一般 具有與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶高相似性的胺基酸 序列。本發明之多肽，與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶 具同等功能，亦包含具有與本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧 酶之胺基酸序列具高相似性的多肽。高相似性一般係指具 有97%以上之相似性，98%以上之相似性更佳，99%以上 之相似性最佳。決定多肽之相似性係以遵循文獻（Wilbur W.J, and Lipman D. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 9 8 3 ) 8 0, 72 6-730 )所記載之規則系統爲佳。 本發明之多肽，可藉由下述之生產細胞及宿主，或是 純化方法，分別獲得胺基酸序列、分子量、等電點或有無 糖鏈及型態等。然而所得之多肽不限於與本發明之倉鼠半 胱亞磺酸脫羧酶具同等功能，亦包含本發明。例如使用原 核細胞例如大腸桿菌表現本發明之多肽時，於原本的多肽 -25- 200904977 之胺基酸序列N端末端上付加甲硫胺酸殘基。另外，以 真核細胞例如哺乳動物細胞進行表現時，N端末端之訊息 序列會被除去。本發明之多肽亦包含該等多肽。 本發明之多肽可根據相關業者周知之方法，調製爲重 組多肽或天然多肽。若爲重組多肽，可將編碼本發明之多 肽之DNA，插入可適宜地表現之載體中，再將其導入適 當的宿主細胞後，回收所得之轉化體，而在獲得萃取物後 ，藉由離子交換、逆相、膠體過濾等色層分析，或通過將 對抗本發明多肽的抗體固定於管柱後之親和性色層分析， 甚或藉由組合複數個管柱而進行純化、調製。 將麩胺基硫轉移酶多肽與本發明之多肽融合後之多肽 ，或付加上複數個組胺酸之重組多肽於宿主細胞（例如動 物細胞及大腸桿菌等）內進行表現時，可藉由麩胺基硫管 柱或鎳管柱而純化使表現之重組多肽。 於純化融合多肽後，可因應需要將融合多肽中目標多 肽以外之區域，以凝血蛋白酵素或Xa因子進行切斷、去 除。 天然之多肽可根據相關業者周知之方法，例如對於表 現本發明多肽之組織及細胞萃取物，使其與下述之與倉鼠 半胱亞磺酸脫羧酶結合之抗體進行結合後之親和性管柱進 行作用後，再藉由純化而可進行分離。抗體可爲多株抗體 ，亦可爲單株抗體。 本發明係提供以下（a )〜（e )之任一種編碼半胱亞 磺酸脫羧酶之新穎的DNA (但除具序列編號3、5及7之 -26- 200904977 驗基序列之DNA以外）。

(a )編碼具序列編號2之胺基酸序列的多肽之DN A (b )編碼於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個 或複數個（例如有數個）胺基酸被取代、缺失、付加及/ 或被插入的胺基酸序列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的 多肽之DNA

(c )編碼具有與序列編號2之胺基酸序列97%以上 相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DN A (d )具有序列編號1之鹼基序列之DNA (e )於具有序列編號1之鹼基序列之DNA上，與互 補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有半胱 亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DN A 本發明之新穎的DNA，藉由使用於大量表現倉鼠半 胱亞磺酸脫羧酶之細胞的製作流程，而可利用於如上所述 之所期望的多肽於in vivo及in vitro之生產。本發明之 新穎的DNA，若爲可編碼具半胱亞磺酸脫羧酶活性的多 肽者，可爲任何一種型態。亦即，不限制爲自mRNA所合 成之cDNA、染色體DNA，或是化學合成DNA。另外，可 編碼本發明之多肽，包含具有以基因密碼之退化程度爲基 礎之任意鹼基序列之DNA。 本發明之DNA可根據相關業者周知之方法進行調製 。例如以表現具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之細胞製 作cDNA庫，再將本發明之DNA序列（例如序列編號1 ) 之一部分做爲探針，藉由進行雜交而可調製。cDNA庫可 -27- 200904977 根據例如 Sambrook，J. et al. Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)記載之方法進行 調製，亦可使用市售之基因庫。藉由表現具有半胱亞磺酸 脫羧酶活性的多肽之細胞製作RNA，再以本發明之DNA 序列（例如序列編號1 )爲基礎而合成寡DNA，再將其使 用爲引子進行PCR反應，藉由使編碼半胱亞磺酸脫羧酶 之cDNA增幅而可進行調製。 藉由決定所得之cDN A之鹼基序列，可決定編碼其之 轉譯區域，而可獲得本發明之多肽的胺基酸序列。藉由將 所得之cDNA做爲探針篩選染色體DNA庫，可分離出染 色體DNA。 具體以如下所述爲佳。首先，自表現本發明之多肽的 細胞、組織等分離出mRNA。mRNA之分離方法可使用周 知之方法，例如胍超離心法（C h i r g w i η，J · Μ · e t a 1., Biochemistry ( 1979 ) 1 8, 5294-5299 ) 、AGPC 法(Chomczynski, P. and Sacchi, N., Anal. Biochem. ( 1 9 87 ) 1 62, 1 56- 1 59 ) 等而調製全 RNA，再使用 mRNA Purification Kit ( Pharmacia)等自全RNA中純化mRNA。另外，亦可藉由 使用 QuickPrep mRNA Purification Kit ( Pharmacia)而直 接調製m R N A。 使用逆轉錄酵素自所得之mRNA合成cDNA。cDNA 之合成可使用 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化學工業）而進行。另外，使用 引子等，遵循使用了 5’-Ampli FINDER RACE Kit ( Clontech -28- 200904977 製）以及聚合酶連鎖反應（polymerase chain reaction : PCR)之 5’-RACE 法（Frohman，Μ· A·, et al·，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ( 1 9 8 8 ) 8 5，8998 〜9002; Belyavsky, A et al., Nucleic Acids Res. ( 1 9 8 9 ) 1 7, 2 9 1 9 - 2 9 3 2 )，可進 行cDNA之合成以及增幅。 自所得之PCR產物調製目標之DNA片段，再與載體 DNA進行連結。進而，再根據製作重組載體，導入大腸 桿菌後選擇菌落後，可調製所期望的重組載體。目標 DNA之鹼基序列可根據周知之方法例如雙去氧核醣核酸 鏈停止法而加以確認。 本發明之DNA中，考慮表現時所使用之宿主之密碼 子使用頻度，可設計更高表現效率之鹼基序列（Grantham, R. et a 1., Nucelic Acids Research ( 1981) 9, r43-74 )。 本發明之DNA可根據市售之試劑組及周知之方法而改變 。改變係可舉出藉由限制酶進行消化、合成寡核苷酸及插 入適當的DNA質體，連結子之付加，起始密碼子（ATG )以及/或終止密碼子（TAA、TGA或 TAG )之插入等 〇 本發明之DNA，爲與具有序列編號1之鹼基序列之 DNA於高度嚴格條件下進行雜交之DNA ’且包含可編碼 具與半胱亞磺酸脫羧酶同等功能的多肽之DN A。 高度嚴格的條件，相關業者可適當地選擇’可舉出例 如低限制條件。低限制條件可舉出例如42°C ’ 2xSSC ’ 0.1%SDS，50。(：，2xSSC，0.1%SDS 爲佳。更佳者可舉出 -29- 200904977 高度嚴格的條件。高度嚴格的條件可舉出例如於65 °C，2 xSSC，0.1%SDS。於該等條件中，溫度上升愈高，可獲得 具有高相似性的DNA。上述進行雜交之DNA以天然來源 之DNA爲佳，例如cDNA或染色體DNA。 該等因雜交技術而被分離之DNA，一般具有與編碼 本發明之倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之DNA於鹼基序列具有 高相似性。本發明之DNA，可編碼與本發明之倉鼠半胱 亞磺酸脫羧酶具同等功能之多肽，亦包含與編碼本發明之 倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶之DNA具有高相似性的DNA。高 相似性一般係指具有9 6 %以上之相似性，9 8 %以上之相似 性更佳，99%以上之相似性最佳。鹼基序列之相似性係可 根據 Karlin and Altschul 之規則系統 BLAST ( Proc. Natl. Acad· Sci_ USA 90: 5873-5877，1993)而加以決定。以該 規則系統爲基礎，開發了稱作BLASTN及BLASTX之軟 體（Altschul et al_，J. Mol. Biol., 2 15： 403 -4 1 0, 1 990 ) 。根據以BLAST爲基礎之BLASTN解析鹼基序列時，參 數爲例如 score=100，wordlngth=12。該等解析方法之具 體步驟可見於網頁（http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。 本發明係提供插入本發明DNA之載體。本發明之載 體係於宿主細胞內担載本發明之DNA，爲適用於使本發 明之多肽（亦即，倉鼠半胱亞磺酸脫羧酶以及與其具同等 功能之多肽）進行表現者。另外，亦適於使宿主細胞大量 表現半胱亞磺酸脫羧酶。藉由使宿主細胞大量表現半胱亞 磺酸脫羧酶，可增加藉由宿主細胞之所期望多肽之生產量 -30- 200904977 所使用之載體，於例如以大腸桿菌做爲宿主時，爲使 以大腸桿菌（例如 JM109、DH5a、HB101、XLlBlue) 等大量增幅且大量調製載體，於大腸桿菌中具有爲進行增 幅之「〇ri」，進而以具有轉化後大腸桿菌選擇基因（例如 可藉由某些藥劑（氨比西林及四環黴素、克耐黴素、氯絲 菌素）而可進行判別之耐藥劑性基因）者爲佳。載體可舉 出 M13 系載體、pUC 系載體、pBR322、pBUescript、 pCR-Script等。另外以cDNA之次擇殖、切出爲目的時， 除上述載體之外，可舉出例如pGEM-T、pDIRECT、pT7 等。於生產本發明多肽此一目的而使用載體時，特別適合 表現載體。表現載體爲例如以於大腸桿菌進行表現爲目的 時，載體除了具有如可使大腸桿菌進行增幅之上述特徵， 以 JM109、DH5a、ΗΒ101、XLl-Blue 等做爲宿主時，以 具有可使大腸桿菌以高效率表現之啓動子，例如lacZ啓 動子（Ward 等人，Nature ( 1 98 9 ) 3 4 1，544-5 46 ; FASEB J. ( 1 992 ) 6，2422-2427 ) 、araB 啓動子（Better 等人，

Science ( 1 98 8 ) 240，1 04 1 - 1 043 )或 T7 啓動子等爲佳。 該等載體除上述載體外可舉出PGEX-5 X-1 ( Pharmacia公 司製）、「QIAexpress system」（Qiagen 公司製）、pEGFP 或pET (此時宿主爲表現T7 RNA聚合酶之BL21爲佳） 等。 於載體亦可含有爲分泌多肽之訊息序列。爲分泌多肽 之訊息序列，於使大腸桿菌之胞質週緣區生產時，可使用 -31 - 200904977 pelB 訊息序列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. ( 1987) 169, 43 79 )。對宿主細胞導入載體時，可使用氯化鈣法，電穿 孔法進行。 於使用大腸桿菌爲宿主之外時，例如爲製造本發明之 多狀所使用之載體，可舉出來自哺乳動物之表現載體（例 如 pcDNA3(Invitrogen 公司製），及 pEGF-BOS( Nucleic Acids. Res. 1 990，18(17)，p5 3 22 )，pEF, pCDM8 )，來自 昆蟲細胞之表現載體（例如「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（GIBCO BRL 公司製，pBacPAK8)， 來自植物之表現載體（例如p Μ H 1，p Μ H 2 )，來自動物病 毒之表現載體（例如pHSV，pMV，pAdexLcw)，來自輪 狀病毒之表現載體（例如pZIpneo )，來自酵母菌之表現 載體（例如「Pichia Expression Kit」（Invitrogen 公司製 )，pNVl 1，SP_Q01 )，來自枯草桿菌之表現載體（例如 pPL60 8，pKTH50 )等。 以於C Η Ο細胞、C Ο S細胞、NIΗ 3 T 3細胞等動物細胞 進行表現爲目的時、爲使於細胞內進行表現所必須的啓動 子以具有例如SV40啓動子（Mulligan等人，Nature ( 1979) 277，108 ) 、MMLV-LTR 啓動子、EF1 α 啓動子（Mizushima 等人，Nucleic Acids Res. ( 1 990 ) 1 8，5322 ) 、CMV 啓動 子等爲佳’以具有選殖轉化細胞之基因（例如藉由藥劑（ 紐奧黴素、G4 1 8等）可判別之耐藥劑性基因）爲佳。具 有該特性之載體’可舉出例如pMAM、pDR2、pBK-RSV 、pBK-CMV、pOPRSV、p〇P13 等。 -32- 200904977 進而爲使基因安定地進行表現，並且，以使細胞內之 基因拷貝數增加爲目的時，可舉出於核酸合成路徑缺損之 CHO細胞，導入具有可與其互補之DHFR基因之載體（例 如pCHOI )，藉由滅殺除癌錠（MTX )使其增幅之方法。 另外，以使基因短暫表現爲目的時，可舉出使用於染色體 上具有表現SV40 T抗原基因之COS細胞，以具有SV40 複製起點之載體（pcD等）進行轉化之方法。複製起點可 使用來自多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒（BPV )等者 。進而爲於宿主細胞系增幅基因之拷貝數，表現載體之選 擇標記爲可含有胺基糖磷酸轉移酶（ΑΡΗ )基因、胸腺核 苷激酶（ΤΚ)基因、大腸桿菌（Ecogpt)基因、二氫葉酸 還原酶（dhrf)基因等。 本發明亦提供導入本發明之DNA (可爲已插入載體 者）之宿主細胞。導入本發明之DNA (可爲已插入載體 者）之宿主細胞並無特別限制，可使用例如大腸桿菌等各 種動物細胞。本發明之宿主細胞，可使用例如爲製造及表 現本發明之多肽之生產系。將可編碼所期望之多肽之 DNA導入本發明之宿主細胞中，本發明之宿主細胞可大 量表現半胱亞磺酸脫羧酶，可增加所期望之多肽之生產。 亦可於本發明之宿主細胞中進而導入可編碼牛磺酸轉運蛋 白之DNA (可爲已插入載體者）。藉由於本發明之宿主 細胞中，導入編碼所期望之多肽之DNA與編碼牛磺酸轉 運蛋白之DNA，可增加所期望之多肽之生產量。爲製造 多肽之生產系有in vitro及in vivo之生產系。in vitro之 -33- 200904977 生產系可舉出使用真核細胞之生產系及使用原核細胞之生 產系。 本發明亦提供已導入可編碼半胱亞磺酸脫羧酶之 DN A與可編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA之細胞。 使用真核細胞時，可使用動物細胞、植物細胞、真菌 細胞做爲宿主。動物細胞已知有哺乳動物細胞例如CHO (J. Exp. Med. ( 1995) 1 08, 945 ) 、COS、3T3、骨髓瘤 細胞、BHK(baby hamster kidney ) 、HeLa、Vero、兩棲 類細胞例如非洲爪蛙卵母細胞（V a 11 e , e t a 1., N a t u r e ( 1 98 1 ) 2 9 1，3 40-3 5 8 )、或昆蟲細胞例如 Sf9、Sf21、Tn5 。CH◦細胞則特別適合使用有DHFR基因缺損之CHO細 胞 dhfr_CHO ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 980 ) 77, 42 1 6-4220 )及 CHO K-1 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA ( 1 96 8 ) 60，1 2 75 )。動物細胞中，以大量表現爲目的時以 CHO細胞細胞爲特佳。對宿主細胞導入DNA (可爲已插 入載體者）時可使用例如磷酸鈣法，DEAE葡聚醣法，陽 離子脂質體 DPTAP(Boehringer-mannheim公司製）之方 法，電穿孔法，微脂粒感染等方法進行。 植物細胞已知有例如來自薛草（Nicotiana tabacum ) 之細胞做爲多肽之生產系，可將其進行癒創組織培養。真 菌細胞之酵母菌，已知有例如酵母菌（Saccharomyces ) 屬，例如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、線狀菌 ，例如麹菌（Aspergillus)屬，例如黑麴菌（Aspergillus n i g er) ° -34- 200904977 使用原核細胞時有使用細菌細胞之生產系。細菌細胞 可舉出大腸桿菌（E. coli)，例如 JM109、DH5a 、 HB 1 0 1等，其他已知有枯草桿菌。 該等細胞藉由目標之基因進行轉化，經進行轉化後之 細胞可藉由in vivo培養’而得編碼目標基因之多肽。培 養係可遵循周知之方法。例如動物細胞之培養液可使用例 如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。此時可倂用牛胎兒 血清（FCS)等血清輔助液，亦可爲無血清培養。培養時 之p Η以約6〜8爲佳。培養一般於約3 0〜4 0 °C下進行1 5 〜2 0 0小時，可根據需要加入更換培養液、通氣、攪拌。 另外，於in vivo多肽之生產系可舉出例如使用動物 之生產系及使用植物之生產系。將目標之基因導入該等動 物或植物中，於動物或植物體內使多肽產生，再進行回收 。於本發明中「宿主」係包含該等動物、植物。 使用動物時有使用哺乳類動物、昆蟲之生產系。哺乳 類動物可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛（Vicki Glaser， SPECTRUM Biotechnology Applications, 1 9 9 3 )。使用哺 乳動物時可使用基因轉殖動物。 例如，將目標之基因，調製爲與可編碼如山羊/3 -酪 蛋白般於乳汁中原本會產生之多肽之基因之融合基因。其 次，將含有該融合基因之基因片段注入山羊之胚胎中，再 將該胚胎移植入雌山羊體內。自接受胚胎隻山羊所產出之 轉殖山羊或其後代所生產的乳汁中，可獲得目標之多肽。 爲增加自轉殖山羊所生產的含有多肽之乳汁量，亦可適當 -35- 200904977 地對轉殖山羊使用荷爾蒙（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1 994 ) 1 2, 699-702 ) ° 昆蟲可使用例如蠶。使用蠶時可藉由使蠶感染已插入 可編碼目標多肽之基因之桿狀病毒，而可自該蠶肢體液中 獲得目標之多肽（Susumu，M. et al.，Nature ( 1985) 315, 592-594)。 進而，使用植物時可使用例如菸草。使用菸草時，將 可編碼目標多肽之基因插入植物表現用載體，例如pMON 530，再將該載體導入如農桿菌 （Agrobacterium tumefaciens)般之細菌中。使該細菌感染蘇草，例如菸草 (Nicotiana tabacum)，可自該菸草之葉子獲得所期望之 多狀（Julian K.-C. Ma et al.，Eur. J. Immunol, ( 1994) 24, 131-138) ° 如此所得之多肽可自宿主細胞內或細胞外（培養基等 )分離出來，可純化爲實質的純粹且均一的多肽。多肽之 分離與純化一般係可使用用於多肽純化時之分離、純化方 法，並無任何特別的限定。例如可適宜地選擇層析管柱、 過濾器、超過濾、鹽析、溶媒沉澱、溶媒萃取、蒸餾、免 疫沉降、SDS-聚丙烯胺膠體電泳、等電點電泳、透析、再 結晶等，亦可將其組合而進行多肽之分離與純化。 層析法可舉出例如親和性層析、離子交換層析、疏水 性層析、凝膠過爐、逆相層析、吸附層析等（S t r a t e g i e s for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., -36- 200904977

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 方法中，可使用液相層析例如HPLC、 而進行。本發明使用該等純化方法，亦 多肽。 可藉由於多肽純化前或純化後，使 素進行作用，而除去任意地加上修飾之 修飾酵素可使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、 白激酶、葡萄糖苷酶等。 本發明提供與本發明之多肽結合之 體的形態並無特別限制，除多株抗體之 體。另外亦包含以本發明之抗體使兔子 疫反應所得之抗體血清，各種多株抗體 使用爲致敏抗原之多狀，可爲完整 肽之部分胜肽。部分胜肽可舉出例如I 末端片段及羧基（C )端末端片段。於: 係意指對多肽之全長或片段產生反應之 將編碼本發明之多肽或其片段之基 載體，藉由該載體使本說明書中所述之 ，再自該宿主細胞內外已周知的方法獲 片段，可將其做爲致敏抗原。另外亦可 之細胞或其溶解物，或是經化學合成之 致敏抗原。 以致敏抗原進行免疫反應之哺乳動 定，但以考慮使用於細胞融合與母細胞 1 996 )。該等層析 FPLC等液相層析 包含經高度純化之 適當的多肽修飾酵 部分的多肽。多肽 離胺基內切酶、蛋 抗體。本發明之抗 外，亦包含單株抗 等免疫動物產生免 以及單株抗體。 的多肽，亦可爲多 '肽之胺基（N )端 g說明書中「抗體」 抗體。 因插入周知的表現 宿主細胞進行轉化 得目標的多肽或其 將表現本發明多肽 本發明之多肽做爲 物並未有特別之限 的合適性而選擇爲 -37- 200904977 佳。一般而言’可使用囈齒類、兔目、靈長目。 囈齒類的動物使用例如小鼠、大鼠、倉鼠等。兔目可 使用例如兔子。靈長目的動物可使用例如猴子。猴子可使 用狹鼻下目的猴子（舊世界猴）例如獼猴、恆河猴、狒狒 、猩猩等。 以致敏抗原使動物免疫可遵循周知之方法而進行。一 般的方法係將致敏抗原注射於哺乳動物的腹腔內或皮下。 具體而 Η 將致敏抗原於 PBS ( Phosphate-Buffered Saline )及生理食鹽水等以適當量進行稀釋、懸濁後，根據需求 與一般的佐劑例如佛氏完全佐劑適量地混合、乳化後，投 予哺乳動物。且，其後，佛氏不完全佐劑適量地混合後之 致敏抗原，以4〜2 1日間進行每日數次投予爲佳。另外， 以致敏抗原進行免疫時可使用適當的抗體。以前述方法進 行免疫後，可根據常用方法確認血清中所期望的抗體濃度 的上升。 爲獲得相對於本發明多肽之多株抗體，於確認血清中 所期望的抗體濃度的上升後，取出經抗原致敏的哺乳動物 血液。自該血液以周知之方法分離血清。多株抗體可使用 含多株抗體之血清，可因應需要自該血清中分離出含多株 抗體的部分再使用。使用親和性管柱而獲得僅認識本發明 之多肽之劃分，進而藉由利用蛋白質A或蛋白質G將該 劃分進行純化，可調製免疫球蛋白G或Μ。 爲獲得單株抗體，於確認以前述抗體致敏後的哺乳動 物之血清中所期望的抗體濃度的上升後，自哺乳動物取出 -38- 200904977 免疫細胞’再進行細胞融合。此時於細胞融合時所使用之 最佳的免疫細胞特別可舉出脾細胞。與前述之免疫細胞進 行融合的其他母細胞以哺乳動物的骨髓瘤細胞爲佳，更佳 者可舉出獲得可根據藥劑而鑑別之特性之骨髓瘤細胞。 前述之免疫細胞與骨髓瘤細胞之細胞融合基本上可以 周知之方法，例如Milstein等人之方法（Galfre, G. and M i 1 s t e i η，C .，M e t h o d s E n z y m ο 1. ( 1 9 8 1 ) 7 3，3 - 4 6 )爲準而 進行。 藉由細胞融合而得之融合瘤，可以例如HAT培養液 (含次黃嘌呤、胺喋呤、胸腺嘧碇之培養液）進行培養。 該HAT培養液會殺死目標的融合瘤以外之細胞（非融合 瘤細胞），可持續使用充分的時間一般爲數日•數週。其 次，實施一般的限數稀釋法，以進行篩選及選殖產生目標 抗體的融合瘤。 其次，將所得之融合瘤移植入小鼠的腹腔內，回收同 一小鼠之腹水，將所得之單株抗體以例如硫胺沉澱、蛋白 質A、蛋白質G管柱、DEAE離子交換層析、以本發明之 多肽製作之親和性管柱等進行純化而調製。本發明之抗體 可用於純化、檢出本發明之多肽。 如此所得之單株抗體可使用基因重組技術而生產重組 型抗體（例如參照 Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W.，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1 990 )。重組型抗體，自融合瘤或產生抗體之致敏 -39- 200904977 淋巴球等免疫細胞中選殖出編碼其之基因，再插入適當的 載體，將其導入宿主而使其生產。本發明包含該重組型抗 體。 本發明之抗體只要與本發明之多肽結合，可爲其抗體 片段及抗體修飾物。抗體片段有例如可舉出Fab、F(ab’）2 、Fv或將Η鏈與L鏈之Fv以適當的連接子連結之單鏈 Fv(scFv) ( Histon, J. S. et a 1., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. ( 1988) 85, 5879〜5883)。具體而言將抗體以酵素 例如木瓜酶、胃蛋白晦處理而使抗體片段產生，或是構築 編碼該等抗體片段之基因，將其導入表現載體後，以適當 的宿主細胞使其表現（例如參照 Co，M. S. et al.，J. Immunol. ( 1 994 ) 152, 2968-2976 ； Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. ( 1 9 8 9 ) 1 78, 476-496 ； Pluckthun, A. and Skerra，A., Methods Enzymol. ( 1 9 8 9 ) 1 7 8, 497-5 15； Lamoy i, E., Methods Enzymol. ( 1986) 1 2 1，652-663 ; Rousseaux, J. et al·，Methods Enzymol. ( 1 9 8 6 ) 1 2 1，663-669 ；Bird, R. E. and Walker, B. W., Trends Biotechnol. ( 1991) 9， 132-137) ° 抗體修飾物可使用與聚乙烯醇（PEG )等各種分子結 合後之抗體。本發明之「抗體」液包含該等抗體修飾物。 爲獲得該抗體修飾物，可藉由對所得之抗體施以化學性的 修飾而可得。該等方法已於該領域中被確立。 如前所述所得之抗體，可進行純化至一致。於本發明 中所使用之抗體之分離、純化，可使用一般於多肽所使用 -40- 200904977 之分離、純化方法。例如可適當地選擇組合親和性層析等 層析管柱、過濾器、超過濾、鹽析、透析、SDS-聚丙烯胺 膠體電泳、等電點電泳等，而可進行抗體之分離、純化（ Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)，但並未限 定於這些方法。於上述所得之抗體之濃度測定可根據吸光 度之測定或酵素結合免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay ； ELISA )等而進行。 使用親和性層析之管柱可舉出蛋白質A管柱，蛋白 質G管柱。例如可舉出使用蛋白質A之管柱Hyper D, POROS, Sepharose F. F. ( Pharmacia)等。 親和性層析之層析可舉出例如離子交換層析、疏水性 層析、凝膠過濾、逆相層析、吸附層析等（Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory

Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al·, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 996 )。該等層析方法中，可使 用HPLC、FPLC等液相層析而進行。 測定本發明之抗體的抗原結合活性之方法可使用例如 吸光度之測定、酵素結合免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay ； ELISA ) 、EIA (酵素免疫測定法 )、RIA (放射免疫測定法）或螢光抗體法。使用ELISA 時’於本發明之抗體經固相化後之分析微量盤上，添加本 發明之多肽，其次加入含目標之抗體的試樣例如產生抗體 細胞之培養上清液及純化抗體。添加酵素例如可辨識鹼性 -41 - 200904977 磷酸酶等經標幟之抗體之二次抗體，再將分析微量盤進行 孵育，接著於洗淨後，加入對硝基苯等酵素基質，再以測 定析光度而可評價其抗原結合活性。多肽可使用多肽片段 例如自c端末端所形成之片段或N端末端所形成之片段 。評價本發明之抗體之活性時可使用BIAcore ( Pharmacia 製）。 本發明另外一個目標係培養經導入所期望之多肽之大 量產生/3-丙胺酸之細胞，於培養時藉由提高細胞內；5-丙 胺酸之濃度，而可提供以使所期望之多肽生產增加爲特徵 之製造所期望之多肽之方法。 此處所指之大量產生/3 -丙胺酸之細胞，係相對於開 始培養時/3 -丙胺酸的細胞內濃度，培養第6天以後/3 -丙 胺酸的細胞內濃度之比爲2以上之細胞，以變爲5以上爲 佳，或培養液中之Θ -丙胺酸濃度於培養第6天以後增加 5〇 μ Μ以上爲佳，增加1 00 μ Μ以上更佳之細胞。 召-丙胺酸的細胞內濃度之測定方法可舉出下述之方 法。自1L之瓶中饋料批次培養槽中，適當地取出使含細 胞之培養液之每一試樣之細胞數爲50〜500xl05個，100 〜450χ105個爲佳，200xl05個最佳之試樣，進行離心， 將做爲下述測定培養液中胺基酸用之試樣之培養上清液分 取後’於細胞沉澱物中加入經溶解蛋白酶阻礙劑（ C 〇 m p 1 e t e M i n i，R 〇 c h e D i a g η 〇 s t i c s 公司，p r 〇 t e a s e i n h i b i t o r cocktail tablets)之冷卻滅菌水lmL，於冰上使用超音波 細胞破碎機（MISONIX ASTRASON MODEL XL2020 )， -42 - 200904977 以脈衝輸送5秒操作後，休止5秒爲一個循環，共計} 2 個循環進行反覆處理，使細胞完全破碎。將處理後之溶液 全量加入微量離心濃縮管，調製爲分子量5 000以下之濾 液’做爲細胞內胺基酸測定用試樣。各試樣再進而使用寧 海德林（ninhydrin)試液-L8 500組（和光純藥工業）以 及曰立製全自動胺基酸分析裝置（L_8 500 )之改良型，檢 出、比較於570mm之吸光度，並求出試樣中各種胺基酸 濃度。培養液中万-丙胺酸之濃度爲直接測定之値，並未 進行〆Μ層次之濃度比較，另外，細胞內沒-丙胺酸之濃 度係規定將細胞沉澱物中加入冷卻滅菌水1 mL，進行超音 波細胞破碎後，開始培養時來自CSAD大量表現株之細胞 內/3 -丙胺酸之濃度檢出値爲1，與各大量表現株之開始 培養時、第6天、第12天之檢出値相比較而求出其比。 上述之培養以初始爲1〜10xl05cells/ mL進行爲佳。培 養液中；8 -丙胺酸濃度之測定方法可舉一例爲於培養初始 以約2xl05cells/mL之條件以1L瓶中饋料批次培養槽進 行培養，可於一段時間後測定培養液中/3 -丙胺酸之濃度 〇 同樣的，培養液中Θ -丙胺酸之濃度如上所述’可將 培養上清液以胺基酸分析裝置進行測定。 爲提高培養細胞中之/5-丙胺酸之生產量，可藉由例 如使具有可蓄積於具自天門冬胺酸合成丙胺酸之酵素 活性之蛋白質等之細胞內之Θ -丙胺酸的多肽基因大量表 現，以藉由導入編碼該DNA之基因於細胞中而實施爲佳 -43- 200904977 具自天門冬胺酸合成/3 -丙胺酸之酵素活性之蛋白質 包含半胱亞磺酸脫羧酶、麩胺酸脫羧酶（Glutamate Decarboxylase ( GAD ) ( EC 4.1.1.15))、天門冬胺酸-1-脫 羧酶（EC 4· 1 . 1 · 1 )等。 /3 -丙胺酸之細胞內增高濃度之細胞，係可舉出經導 入編碼半胱亞磺酸脫竣酶、整胺酸脫翔酶（Glutamate Decarboxylase ( GAD ))、天門冬胺酸-1-脫竣酶（EC 4·1.1.1 )或其異型體之DNA之細胞。 本發明之大量產生/3 -丙胺酸之細胞可舉出一例爲於 以下述實施例相同之測定法進行測定後，相對於開始培養 時/5 -丙胺酸的細胞內濃度，培養第6天以後/3 -丙胺酸的 細胞內濃度之比爲2以上，或培養1 2天以後爲5以上之 細胞。 本發明之大量產生/5-丙胺酸之細胞可舉出另一個具 體例爲於以下述實施例相同之測定法進行測定後’培養液 中之yS -丙胺酸濃度於培養第6天以後增加5 0 β Μ以上爲 佳，增加1 〇 〇 # Μ以上更佳之細胞。 本發明另一個目標係提供相對於開始培養時Θ -丙胺 酸的細胞內濃度，培養第6天以後Θ -丙胺酸的細胞內濃 度之比爲2以上之培養細胞。 進而本發明另一個目標係提供培養液中之/3 -丙胺酸 濃度可於培養第6天以後增加5 0 β Μ以上爲佳，增加1 0 0 # Μ以上更佳之細胞。 -44- 200904977 本發明中「經導入DN A之細胞」包含以基因重組技術 將外來性DNA納入細胞之外，根據基因活化技術（例如 參照國際公開第W094/ 1 2650號冊子），使內源性之 DNA被活化’其結果包含開始或增加了表現對應相關 DNA之蛋白質或相關DNA之轉錄之細胞此槪念。 【實施方式】 實施例 以下根據實施例具體說明本發明。且該等實施例係爲 說明本發明，並未限定本發明之範圍。 [實施例U 選殖來自CHO細胞之倉鼠Cysteine sulfinic acid decarboxylase ( CSAD)以及 Cysteine Dioxygenase, type I (CDOl)基因 自經導入IL-6接受器抗體基因之抗IL-6接受器抗體 產生細胞（特開平8-99902號公報）之CHO DXB1 1細胞 ，進行萃取total RNA後，合成依賴Poly A之cDNA。以 經 Sal I 、Xho I 、EcoR I三種限制酶進行片段化後之 cDNA爲鑄型，藉由PCR獲得Hamster CSAD以及CDOl 基因。PCR引子使用已知之設計Rat與Mouse被保存的基 因序列之含有3’，5’者。決定被選殖之基因之鹼基序列’ 自與已知之生物種的CSAD以及CD01之相同性’確認編 碼 Hamster CSAD (圖 1)或 Hamster CDO1 (圖 2 )。 Hamster CSAD 爲 Mouse ( 96% Identity ) 、Rat ( 96% Identity ) -45- 200904977 、Human ( 9 1% Identity ) ，Hamster C D Ο 1 爲 Μouse ( 9 9 6% Identity ) 、Rat ( 98% Identity ) 、Human ( 93 %

Identity )，相對於已知之胺基酸序列具高相似性’預測 爲具同樣活性之酵素。倉鼠、小鼠、大鼠及人類之C S A D 鹼基序列分別示於序列編號1、3、5以及7。倉鼠、小鼠 、大鼠及人類之CSAD胺基酸序列分別示於序列編號2、 4、6以及8。倉鼠、小鼠、大鼠及人類之CDO1鹼基序列 分別示於序列編號9、1 1、1 3以及1 5。倉鼠、小鼠、大 鼠及人類之C S AD胺基酸序列分別示於序列編號1 〇、1 2 、1 4以及1 6。牛之C D Ο 1鹼基序列及胺基酸序列分別示 於序列編號1 7以及1 8。 [實施例2]藉由導入倉鼠CSAD而使抗體產生量增加、 抑制乳酸產生量以及維持生存率

藉由實施例1之選殖取得之Hamster CSAD (以下稱 做CSAD)以及Hamster CD01 (以下稱做CD01)基因中 加入Kozak序列，構築CMV啓動子表現質體pHyg/ CSAD (圖 3 ) ，pHyg/CD01 (圖 4) 。ff每 pHyg/ CSAD 或pHyg/ CD01以電穿孔法導入做爲母株之抗磷酸葡萄糖 肌醇糖蛋白-3抗體產生細胞之CHO細胞（參照國際公開 第 W02006/ 006693 號冊子）。於 Hygromycin ( 20 # g/ mL )存在下選擇發現質體導入細胞後，安定後增殖之細 胞株均擴大（pHyg/CSAD: 7 株，pHyg/CDOl : 6 株） 。CSAD以及CD01之mRNA表現量根據TaqMan法進行 -46- 200904977 定量’確認較母株有優勢表現（cs AD及CD01均爲母株 之2 00倍以上）。前述之細胞以初始爲2xl05cel丨s/ mL， 進行5 OmL搖動饋料批次培養，並比較培養後期第1 4天 之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量。pHyg/ C SAD 導入細胞之抗體產生量相對於pHyg/CD01導入細胞爲佳 (t檢定P<〇.〇5)(圖5)。以上結果顯示藉由人爲地使 Hamster CSAD表現可獲得大量產生抗體株。其次，構築 期望 CSAD導入與TauT導入產生相乘效果之pPur/ CSAD (圖 6)，再以電穿孔法導入於參考例2調製之 PHyg/ TauT 導入細胞（T10)。於 Puromycin ( 6# g / m’l )存在下選擇後，安定增殖之4株擴大（pHyg/TauT + pPur/CSAD: TauT + CSAD 導入株）。4 株 TauT 以及 CSAD，之mRNA表現量根據TaqMan法進行定量，確認 全株均大量表現TauT以及CSAD (相對於母株之TauT導 入株 TauT mRNA 約爲 1 倍，CSAD mRNA 爲 130-580 倍） 。TauT導入株及TauT+CSAD導入株，藉由初始爲2xl05 cells/mL，進行50mL搖動饋料批次培養，進行培養硏究 。於培養後期第14天之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體 之產生量（圖 7 )，相對於TauT導入株（1 122mg/ L ) ，TauT+CSAD導入株之平均抗體產生量（ 1343mg/L) 爲高，進而抑制乳酸產生（圖8)，生存率之維持（圖9 )，TauT + CSAD導入株亦顯示較高的潛能。進而爲確認 於抗體產生量潛能的程度，將於圖9中生存率最高之 TauT + CSAD導入株與TauT株進行1L瓶中饋料批次培養 -47- 200904977 (圖10)。於培養第31天抗體產生量，TauT導入株： 2050mg/L，TauT+CSAD 導入株：3383mg/L，可發現 其顯著之差異。CSAD導入株爲2170mg/L，另外由於未 導入二基因株於培養後期之生存率低，抗體產生量之最大 値爲培養第14天之2006mg/L。 爲探究大量表現CSAD株之效果，進行相異的基因導 入株（4種）之1L瓶中饋料批次培養槽，以初始爲2x1 05 cells/ mL之條件進行培養，並適時地採取培養液（母株 爲TauT導入株，自CSAD導入株每次採450xl05細胞， TauT + CSAD導入株採2 0 0 χ 1 0 5細胞，其結果與細胞內濃 度有關者僅TauT + CSAD導入株之測定値，使用補正 2 · 2 5倍之値），再藉由離心，將做爲下述測定培養液中胺 基酸用之試樣之培養上清液取出後，於細胞沉澱物中加入 經溶解蛋白酶阻礙劑（Complete Mini, Roche Diagnostics 公司，Protease inhibitor cocktail tablets)之冷卻滅菌水 lmL，於冰上使用超音波細胞破碎機（MISONIX ASTRASON MODEL XL2020 )，以脈衝輸送5秒操作後，休止5秒爲 一個循環，共計1 2個循環進行反覆處理，使細胞完全破 碎。將處理後之溶液全量加入微量離心濃縮管，調製爲分 子量5000以下之濾液，做爲細胞內胺基酸測定用試樣。 各試樣再進而使用寧海德林試液-L8 5 00組（和光純藥工 業）以及日立製全自動胺基酸分析裝置（L-8 5 00 )之改良 型，檢出、比較於5 70mm之吸光度，並求出試樣中各種 胺基酸濃度。培養液中各種胺基酸以及氨之濃度爲直接測 -48- 200904977 定之値，並未進行# Μ層次之濃度比較’另外’細胞內濃 度係於細胞沉澱物中加入冷卻滅菌水1 m L ’進行超音波細 胞破碎後，將各種胺基酸以及氨等之測定値換算爲每細胞 之値’再進行其比較（圖11’圖13)。圖11中S女基酸之 濃度比規定爲1 L瓶中饋料批次培養開始時每4 5 0 X 1 05之 來自大量表現CSAD之細胞內jS-丙胺酸之檢出値爲1’與 各大量表現株開始培養時，第6天，第12天之檢出値進 行比較，再求出比，圖13中氨濃度比規定爲1L瓶中饋料 批次培養開始時每4 5 0 X 1 05之母株之氨檢出値爲1 ’與各 大量表現株開始培養時，第6天，第1 2天，第1 8天之檢 出値進行比較，再求出比。另外，培養液中之丙胺酸與 /3 -丙胺酸之濃度經時變化亦爲來自前述胺基酸分析之測 定値。 其結果，針對細胞內胺基酸濃度於導入各基因株間幾 乎並未發現胺基酸濃度有顯著的差異，但僅有大量表現 CSAD株之pHyg/CSAD不含培養基且大量產生卢-丙胺 酸。該結果亦明確得知測定培養時培養液中之/3 -丙胺酸 及丙胺酸濃度’於大量表現CSAD株培養液中万-丙胺酸 濃度顯著的增加（讀1 1 -1 ) 。Θ -丙胺酸係具調節滲透壓 作用之Organic Osmolyte，同時具有可單獨緩衝pH之作 用’抗氧化作用。另外，爲具有更強抗氧化作用之肌肽（ β-alanyl-histidine)之前驅物，藉由其抗氧化能力，可中 和爲疲勞物質之乳酸。於圖8抑制乳酸產生量爲考慮石_ 丙胺酸效果。大量表現C S A D株之々-丙胺酸效果於1 L瓶 -49- 200904977 中饋料批次培養之生存率中顯著（圖12)。進而於TauT + CSAD導入株之細胞內氨被維持於低濃度（圖1 3 ) ’認 爲對大量產生抗體有所貢獻。 本發明可應用於全部產生抗體細胞。 [實施例3] /3 -丙胺酸存在下之維持生存率效果 將母株及CSAD導入株於点-丙胺酸（25mM)存在、 不存在下，進行初始2xl05ceIls/mL之5〇mL搖動饋料批 次培養，並比較其生存率。如圖14所示，大量生產/S-丙 胺酸之CSAD導入株，相對於未存在/3 -丙胺酸（OmM) 下培養第6天仍維持生存率，不會產生/3-丙胺酸之母株 ，於未存在/5-丙胺酸下培養第6天的生存率極低。由母 株於存在/3 -丙胺酸（25mM)下培養第6天仍維持生存率 ，可顯示藉由添加；5-丙胺酸具維持生存率效果。但自培 養第7天之CSAD導入株的生存率，於細胞內可大量產生 /3 -丙胺酸之株即便於未存在万-丙胺酸（OmM )下，仍較 於培養基中添加25mM 泠-丙胺酸之母株，維持更高的生 存率。進而如圖15所示，TauT導入株中共同導入C SAD ，使/3 -丙胺酸可於細胞內合成時相同，仍可發現於未存 在；8 -丙胺酸下（〇mM )培養第6天維持生存率。另外， 共同導入CSAD前之TauT單獨導入株，與圖14之母株相 同，可見於/3-丙胺酸（25mM)存在下培養第6天仍維持 生存率。以上結果顯示於細胞內作用之Θ -丙胺酸具維持 生存率效果較僅於細胞培養用之培養基中添加0 -丙胺酸 -50- 200904977 ，以培養之大量產生/3 -丙胺酸細胞，顯示具維持細胞之 生存率或增加所期望地多肽之生產量之優勢。因此，本發 明之大量生產Θ -丙胺酸細胞可有效地做爲抗體、具生理 活性之蛋白質等各種多肽之生產細胞。 [參考例1 ]選殖來自CHO細胞之倉鼠牛磺酸轉運蛋白基 因 自經導入IL-6接受器抗體基因之抗IL-6接受器抗體 產生細胞（特開平8 -99902號公報）之CHO DXB1 1細胞 ，進行萃取total RNA後，合成依賴Poly A之cDNA。以 經 Sal I 、Xho I 、EcoR I三種限制酶進行片段化後之 cDNA爲鑄型，藉由PCR獲得Hamster牛磺酸轉運蛋白（ TauT)基因。PCR引子使用已知之設計Rat/Mouse TauT 被保存的基因序列之含有3’，5’者。決定被選殖之基因之 鹼基序列，自與已知之生物種的TauT之相同性，確認編 碼 Hamster TauT (圖 16) 。Hamster TauT 胺基酸序列爲

Mouse ( 96% Identity) 、Rat ( 96% Identity) 、Human ( 93% Identity)，對TauT具高相似性，預測具12之膜貫 通區域之轉運子（圖17)。 [參考例2]藉由導入倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因而使生存 細胞密度增加、抑制乳酸產生量以及增加抗體產生量 藉由實施例1之選殖取得之Hamster TauT (以下稱做 TauT )基因中加入Kozak序列，構築CMV啓動子表現質 -51 - 200904977 體 pHyg/TauT (圖 18)。將除了 pHyg/TauT 或 TauT 基因之控制質體pHyg以電穿孔法導入做爲母株之抗磷酸 葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生細胞之CHO細胞（參照國 際公開第 W02006/ 006693 號冊子）。於 Hygromycin( 40 0 /z g/ mL )存在下選擇發現質體導入細胞後，安定後 增殖之細胞株均擴大（pHyg/TauT: 8株，pHyg: 7株） 。調製TauT之mRNA後根據TaqMan法，可確認相對於 母株具優勢表現之7株做爲pHyg/ TauT導入細胞。導入 細胞（7株），之mRNA平均表現量爲控制（7株）之約 40倍。將共計14株之細胞以以初始爲2x1 05 cells/ mL， 進行50mL之震盪瓶之批次（batch )培養以及饋料批次（ Fed-batch)培養。並比較培養後期第 7天之生存細胞密 度，乳酸產生量，抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生 量。批次培養中伴隨細胞增殖，於培養液中蓄積乳酸等阻 礙生長物質，使增殖被抑制，但PHyg/TauT導入細胞之 生存細胞密度（圖1 9 )以及乳酸產生量（圖20 )，相對 於pHyg導入細胞爲優勢（t檢定Ρ<〇·〇5)。關於抗磷酸 葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體之生產量，pHyg/TauT導入細 胞之7株中有4株爲，pHyg導入細胞之最高値以上（圖 21 ) 。pHyg/ TauT導入細胞之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3 抗體之生產量之優勢性（t檢定Ρ<〇.〇1 ’圖22)可自饋料 批次培養明確反應，上述4株中增殖能最高之pHyg/ TauT導入細胞（T10)與母株，進行1L之瓶中饋料批次 培養後，T10於培養第32天亦維持80%以上之生存率（ -52- 200904977 圖2 3 )且抑制乳酸產生。其結果，抗磷酸葡萄糖肌 蛋白-3抗體之生產量於培養第35天達成2.9 g/L (丨 )°TauT導入之T10細胞於其細胞膜上表現TauT分 以流式細胞儀分析（圖2 5 )而確認。上述結果，顯 由經人爲地使Hamster TauT表現可提高產生抗體細 潛能，可獲得大量產生抗株。 該做法可應用於全部產生抗體細胞。 由進行批次培養亦可抗體生產量高之細胞此一事 認爲藉由大量表現TauT，不僅牛磺酸，可非特異性 取/3 -丙胺酸等各種胺基酸。如牛磺酸般可調節細胞 壓之Organic Osmolyte，可預測存在游離胺基酸之； 胺酸、丙胺酸、甘胺酸、脯胺酸、麩胺酸、麩醯胺、 冬胺酸等，可藉由人爲地使該等轉運子強制表現而獲 產生抗體細胞。 本說明書所引用之全部刊物，係直接參考專利或 申請而加入本說明書中。 本發明可利用於多肽之生產。 序列表之非關鍵文字 <序列編號1 >序列編號1係編碼倉鼠半胱亞磺 羧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號2 >序列編號2係倉鼠半胱亞磺酸脫 之胺基酸序列。 <序列編號3 >序列編號3係編碼小鼠半胱亞磺 醇糖 | 24 子係 不藉 胞之 實， 地攝 滲透 3 -丙 天門 得局 專利 酸脫 羧酶 酸脫 -53- 200904977 羧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號4 >序列編號4係小鼠半胱亞磺酸脫羧酶 之胺基酸序列。 <序列編號5 >序列編號 羧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號6 >序列編號 之胺基酸序列。 <序列編號7 >序列編號 羧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號8 >序列編號 之胺基酸序列。 <序列編號9 >序列編號 氧酶之基因之鹼基序列。 〈序列編號1 〇 >序列編號 酶之胺基酸序列。 <序列編號1 1 >序列編號 加氧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號1 2 >序列編號 酶之胺基酸序列。 <序列編號1 3 >序列編號 加氧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號1 4 >序列編號 酶之胺基酸序列。 <序列編號1 5 >序列編號 5係編碼大鼠半胱亞磺酸脫 6係大鼠半胱亞磺酸脫羧酶 7係編碼人類半胱亞磺酸脫 8係人類半胱亞磺酸脫羧酶 9係編碼倉鼠半胱胺酸雙加 1 0係倉鼠半胱胺酸雙加氧 π係編碼小鼠半胱胺酸雙 1 2係小鼠半胱胺酸雙加氧 1 3係編碼大鼠半胱胺酸雙 1 4係大鼠半胱胺酸雙加氧 15係編碼人類半胱胺酸雙 -54 - 200904977 加氧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號1 6 >序列編號1 6係人類半胱胺酸雙加氧 酶之胺基酸序列。 <序列編號1 7 >序列編號1 7係編碼牛半胱胺酸雙加 氧酶之基因之鹼基序列。 <序列編號1 8 >序列編號1 8係牛半胱胺酸雙加氧酶 之胺基酸序列。 <序列編號1 9 >序列編號1 9係編碼倉鼠牛磺酸轉運 蛋白之基因之鹼基序列。 <序列編號20 >序列編號20係倉鼠牛磺酸轉運蛋白 之胺基酸序列。 <序列編號2 1 >序列編號2 1係編碼小鼠牛擴酸轉運 蛋白之基因之鹼基序列。 <序列編號22 >序列編號22係小鼠牛磺酸轉運蛋白 之胺基酸序列。 <序列編號23>序列編號23係編碼大鼠牛磺酸轉運 蛋白之基因之鹼基序列。 <序列編號24 >序列編號24係大鼠牛磺酸轉運蛋白 之胺基酸序列。 <序列編號2 5 >序列編號2 5係編碼人類牛磺酸轉運 蛋白之基因之鹼基序列。 <序列編號2 6 >序列編號2 6係人類牛磺酸轉運蛋白 之胺基酸序列。 -55- 200904977 【圖式簡單說明】 [圖1 ]圖1係表示新穎地被複製之源自C Η 0細胞之倉 鼠CSAD基因之鹼基序列以及胺基酸序列。 [圖2]圖2係表示新穎地被複製之源自CHO細胞之倉 鼠CDO 1基因之鹼基序列以及胺基酸序列。 [圖3]圖3係使Hamster CSAD( 493個胺基酸）表現 之質體。 [圖4]圖4係使Hamster CD01 ( 200個胺基酸）表現 之質體。 [圖5]圖5係於50ml之搖瓶Fed-Batch培養第14天 之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。 [圖6]圖6係於大量表現TauT細胞株，使Hamster CSAD (493個胺基酸）表現之質體。 [圖7]圖7係表示導入pPur/CSAD之大量表現TauT 細胞株4株，與母株之大量表現TauT細胞株，於50ml 搖瓶饋料批次培養之抗體產生量圖。 [圖8 ]圖8係表示於5 0 m 1搖瓶饋料批次培養，乳酸產 生量圖。可發現於導入pPur/CSAD之大量表現TauT細 胞內，乳酸產生被抑制。 ’ [圖9 ]圖9係表不於5 0 m 1搖瓶饋料批次培養細胞生存 率圖。可發現於導入pPur/CSAD之大量表現TauT細胞 維持生存率。 [圖10]圖10係表示圖9中生存率最高之導入pPur/ CSAD之大量表現TauT細胞，於1 L瓶中饋料批次培養抗 -56- 200904977 體產生量圖。 [圖1 1 ]圖1 1係表不1 L·瓶中饋料批次培養中細胞內丙 胺酸以及細胞內点-丙胺酸含量（濃度比）圖。 [圖1 1 -1 ]圖1 1 -1係表示1 L瓶中饋料批次培養液中之 丙胺酸以及Θ -丙胺酸濃度圖。 [圖1 2 ]圖1 2係表示1 L瓶中饋料批次培養細胞時細胞 的生存率。可發現導入pPur/ C SAD之細胞維持與母株非 常不同之生存率。 [圖13]圖13係表示1L瓶中饋料批次培養中細胞內氨 含量（濃度比）之圖。與母株非常不同，導入pPur/ CSAD之大量表現TauT株出現顯著的氨抑制。 [圖14]圖14係表示於50ml搖瓶批次培養細胞生存率 圖。藉由對母株添加/3-丙胺酸（25mM)，與大量產生 /3 -丙胺酸之導入CSAD株維持相同程度的生存率。 [圖15]圖15係表示於50ml搖瓶批次培養第6天細胞 生存率圖。藉由對導入TauT株添加石-丙胺酸（25mM) ，與大量產生/5-丙胺酸之導入TauT + CSAD株維持相同 程度的生存率。 [圖1 6 ]圖1 6係表示被複製之源自C Η Ο細胞之倉鼠牛 磺酸轉運蛋白基因之鹼基序列以及胺基酸序列。 [圖17]圖17係表示新穎地被複製之源自CHO細胞之 牛磺酸轉運蛋白膜局部解剖圖。 [圖18]圖18係使Hamster TauT ( 622個胺基酸）表 現之質體。 -57- 200904977 [圖19]圖19係表示於50ml搖瓶批次培養第7天活細 胞密度圖。導入pHyg/ TauT細胞之活細胞密度’相對於 導入：pHyg細胞較佔優勢。 [圖20]圖20係表示於50ml搖瓶批次培養第7天乳酸 產生量圖。導入pHyg/TauT細胞乳酸產生量低，相對於 導入pHyg細胞較佔優勢。 [圖21]圖21係表示於50ml搖瓶批次培養第7天抗磷 酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。導入pHyg/TauT 細胞7株中有4株，具有導入pHyg細胞之最高値以上之 抗體產生量。 [圖22]圖22係表示於50ml搖瓶批次培養第7天抗磷 酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體產生量圖。導入PHyg/TauT 細胞之抗磷酸葡萄糖肌醇糖蛋白-3抗體，相對於導入 PHyg細胞較佔優勢。 [圖23]圖23係表示增殖能較高之導入pHyg/TauT 細胞之T 1 0，於1 L瓶中饋料批次培養的生存率圖。T 1 0 之生存率於培養第32天仍有8 0%以上。 [圖24]圖24係表示於靜置培養之擴大步驟增殖能較 咼之導入pHyg/TauT細胞之T10，於1L瓶中饋料批次 培養的抗體產生量圖。於培養第35天，抗磷酸葡萄糖肌 醇糖蛋白-3抗體產生量爲2.9 g/L。 [圖25]圖25係表示導入TauT之T10細胞，於細胞 膜上表現T a u T分子之流式細胞儀分析結果圖。 -58- 200904977 序列表 <110〉中外製藥股份有限公司 <120〉多肽的製造方法

<130> FP-100PCT <150> JP P2007-066172 <151〉 2007-03-15 <160〉 26 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211〉 1482 <212〉 DNA <213〉中國倉鼠 <400> 1 atggctgact caaaaccact caatgccctg gatggggacc ctgtggctgt ggagtcctta 60 ctccgggatg tgtttgggat tgttgtagat gaggccattc ggaaagggac cagtgcctcg 120 gagaaggttt gtgaatggaa ggagcctgaa gagctcaagc atctgctgga tttggagctg 180 cagagccagg gcgagtctca agagcagatt ctagagcgct gccgggctgt gattcactac 240 agtgtcaaga ctggtcaccc ccggttcttc aaccagctct tctcagggtt agacccccat 300 gctctggctg ggcgcatcat cacagaaagc ctcaacacca gccagtacac atatgagatt 360 gcccctgtgt ttgtcctcat ggaagaggag gtgctgaaga aactccgtgc cctggtgggc 420 tggaactctg gggatggggt cttctgtcct ggtggctcca tctcgaacat gtatgccatg 480 aacctggccc gctatcagcg ctacccagac tgcaagcaaa gaggcctccg ggccctgccg 540 cccttggctc tcttcacttc aaaggagtgt cactactcca tcagtaaggg agctgctttt 600 ctgggacttg gcactgacag tgtccgagtg gtcaaggctg atgagagagg gaaaatgatc 660 cctgaggatc tggagaggca gatcagtctg gctgaggcag agggctctgt gccatttctg 720 gtcagtacca cctctggtac caccgtgcta ggggcctttg accccctgga tgcaattgct 780 gatgtttgcc agcgtcacgg attatggtta cacgtggatg ccgcctgggg tgggagcgtc 840 900 200904977 ctgctgtccc ggacacacag gcatctcctg gatgggatcc agagggctga ctctgtggcc tggaaccctc acaagcttct cggtgcaggg ctgcagtgct ctgctcttct tctccgggac acctcgaacc tgctcaagcg ctgccatggg tcccaggcca gctacctgtt ccagcaggac aaattctatg acgtggctct tgacactgga gacaaggtgg tgcagtgtgg ccgccgtgtg gactgtctga agttgtggct catgtggaag gcacagggtg ggcaaggact ggagcggcgc atcgaccagg cctttgctct cacccggtac ctggtggagg agataaaaaa gcgggaagga tttgagttgg tcatggagcc tgagtttgtc aatgtgtgct tctggtttgt gcctcccagc ctgcggggga agaaagagag tccagattac agcaaaaggc tgtctcaggt ggcgcctgta ctcaaggagc gcatggtgaa gaagggctcc atgatgattg gctaccagcc ccatgggacc cgggccaact tcttccggat ggtggtggcc aaccccacac tgacccaggc tgatatagac ttccttctgg gcgagctgga gcgtctgggc caggacctgt ga <210> 2 <211> 493 <212〉 PRT <213〉中國倉鼠 <400〉 2

Met Ala Asp Ser Lys Pro Leu Asn Ala Leu Asp Gly Asp Pro Val Ala 15 10 15

Val GIu Ser Leu Leu Arg Asp Val Phe Gly lie Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 lie Arg Lys Gly Thr Ser Ala Ser Glu Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45

Pro Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Asp Leu Glu Leu Gin Ser Gin Gly 50 55 60

Glu Ser 6ln Glu 6ln lie Leu Glu Arg Cys Arg Ala Val lie His Tyr 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1482 -2- 200904977 65 70 75 80

Ser Val Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gin Leu Phe Ser Gly 85 90 95

Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg lie lie Thr 6lu Ser Leu Asn 100 105 110

Thr Ser Gin Tyr Thr Tyr Glu Me Ala Pro Val Phe Val Leu Met Glu 115 120 125

Glu Glu Val Leu Lys Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Asn Ser Gly 130 135 140

Asp Gly Val Phe Cys Pro Gly Gly Ser lie Ser Asn Met Tyr Ala Met 145 150 155 160

Asn Leu Ala Arg Tyr Gin Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gin Arg Gly Leu 165 170 175

Arg Ala Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190

Ser lie Ser Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205

Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Gly Lys Met lie Pro Glu Asp Leu 210 215 220

Glu Arg Gin lie Ser Leu Ala Glu Ala Glu Gly Ser Val Pro Phe Leu 225 230 235 240

Val Ser Thr Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255

Asp Ala Me Ala Asp Val Cys 6ln Arg His Gly Leu Trp Leu His Val 200904977 260 265 270

Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Arg Thr His Arg His 275 280 285

Leu Leu Asp Gly Me Gin Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His 290 295 300

Lys Leu Leu Gly Ala Gly Leu Gin Cys Ser Ala Leu Leu Leu Arg Asp 305 310 315 320

Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gin Ala Ser Tyr Leu 325 330 335

Phe Gin Gin Asp Lys Phe Tyr Asp Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350

Val Val Gin Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365

Trp Lys Ala Gin Gly Gly Gin Gly Leu Glu Arg Arg Me Asp Gin Ala 370 375 380

Phe Ala Leu Thr Arg Tyr Leu Val Glu Glu Me Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400

Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415

Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Lys Glu Ser Pro Asp Tyr Ser Lys 420 425 430

Arg Leu Ser Gin Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Lys 435 440 445

Gly Ser Met Met lie Gly Tyr Gin Pro His Gly Thr Arg Ala Asn Phe -4- 200904977 450 455 460

Phe Arg Met Val Val Ala Asn Pro Thr Leu Thr 6ln Ala Asp lie Asp 465 470 475 480

Phe Leu Leu Gly Glu Leu Glu Arg Leu Gly Gin Asp Leu 485 490 <210> 3 <211〉 1482 <212> ONA <213〉溝鼠 <400〉 3 atggctgact caaaaccact ctccgggacg tgtttgggat gagaaggtct gcgaatggaa cagagccagg gcgagtctag agtgtcaaga ctggtcaccc gctctggccg ggcgcatcat gcccccgtgt ttgtgctcat tggaacactg gggatggggt aacctggccc gctttcagcg cccttggccc tcttcacttc ctgggacttg gcaccgacag cctgaggatc tggagaggca gtcagtgcca cctctggtac gatgtttgcc agcgtcacgg ctgctgtccc ggacacacag tggaaccctc acaagcttct cagaaccctg gatggggacc ctgtggctgt ggaggctttg 60 tgtcgtagat gaggccattc ggaaggggac caatgcctct 120 ggagcctgaa gagctcaagc agctgctgga cttggagctg 180 ggagcggatc ctggagcgct gccgggctgt gattcattac 240 ccggttcttc aaccagctct tctcaggatt agatccccat 300 tacggagagc ctcaatacca gccagtacac atatgagatt 360 ggaagaggag gtgctgaaga aactccgtgc ccttgtgggc 420 cttctgtcct ggtggttcca tctctaacat gtacgccata 480 ctacccagac tgcaagcaga ggggcctccg ggccctgcca 540 aaaggagtgc cactactcca tcaccaaggg agctgctttt 600 tgtccgagtg gtcaaggctg atgagagagg gaagatgatc 660 gatcagtctg gcagaggctg agggctcggt gccatttctg 720 caccgtgcta ggggcctttg accccctgga tgcaattgcc 780 gctgtggtta cacgtggatg ccgcctgggg tgggagcgtc 840 gcatctcctg gatgggatcc agagggctga ctccgtggcc 900 cgccgcgggg ctgcagtgct ctgctcttct tctccgggac 960 1020 200904977 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1482 acctcgaacc tgctcaagcg ctgccacggg tcccaggcca gctacctctt ccagcaagac aagttctaca acgtggctct ggacaccgga gacaaggtgg tgcagtgtgg ccgccgcgtg gactgtctga agctgtggct catgtggaag gcgcagggtg ggcaagggct ggagtggcgc atcgaccagg cctttgctct cactcggtac ttggtggagg agataaaaaa gcgggaagga tttgagttgg tcatggagcc cgagttcgtc aacgtgtgct tctggtttgt gcctcccagc ctgcggggga agaaggagag cccagattac agccagaggc tgtctcaggt ggcccctgtg ctcaaggagc gcatggtgaa gaagggaacc atgatgatcg gctaccagcc ccatgggacc cgggccaact tcttccgaat ggtggtggcc aaccccatac tggtccaggc cgatatagac ttccttctgg gcgagctgga gcgtctgggc caggacctgt ga <210〉 4 <211> 493 <212〉 PRT <213〉觀 <400〉 4

Met Ala Asp Ser Lys Pro Leu Arg Thr Leu Asp Gly Asp Pro Val Ala 1 5 10 15

Val Glu Ala Leu Leu Arg Asp Val Phe Gly He Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 lie Arg Lys Gly Thr Asn Ala Ser Glu Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45

Pro Glu Glu Leu Lys Gin Leu Leu Asp Leu Glu Leu Gin Ser Gin Gly 50 55 60

Glu Ser Arg Glu Arg Me Leu Glu Arg Cys Arg Ala Val lie His Tyr 65 70 75 80

Ser Val Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn 6ln Leu Phe Ser Gly -6- 200904977 85 90 95

Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg Me Me Thr Glu Ser Leu Asn 100 105 110

Thr Ser Gin Tyr Thr Tyr Glu lie Ala Pro Vai Phe Val Leu Met Glu 115 120 125

Glu Glu Val Leu Lys Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Asn Thr Gly 130 135 140

Asp Gly Val Phe Cys Pro Gly Gly Ser lie Ser Asn Met Tyr Ala lie 145 150 155 160

Asn Leu Ala Arg Phe Gin Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gin Arg Gly Leu 165 170 175

Arg Ala Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190

Ser lie Thr Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205

Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Gly Lys Met lie Pro Glu Asp Leu 210 215 220

Glu Arg Gin lie Ser Leu Ala Glu Ala Glu Gly Ser Val Pro Phe Leu 225 230 235 240

Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255

Asp Ala lie Ala Asp Val Cys Gin Arg His Gly Leu Trp Leu His Val 260 265 270

Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Arg Thr His Arg His 200904977 275 280 285

Leu Leu Asp 6ly lie Gin Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His 290 295 300

Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gin Cys Ser Ala Leu Leu Leu Arg Asp 305 310 315 320

Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gin Ala Ser Tyr Leu 325 330 335

Phe Gin Gin Asp Lys Phe Tyr Asn Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350

Val Val Gin Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365

Trp Lys Ala Gin Gly Gly Gin Gly Leu Glu Trp Arg lie Asp Gin Ala 370 375 380

Phe Ala Leu Thr Arg Tyr Leu Val Glu Glu lie Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400

Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415

Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Lys Glu Ser Pro Asp Tyr Ser Gin 420 425 430

Arg Leu Ser Gin Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Lys 435 440 445

Gly Thr Met Met lie Gly Tyr Gin Pro His Gly Thr Arg Ala Asn Phe 450 455 460

Phe Arg Met Val Val Ala Asn Pro lie Leu Val Gin Ala Asp lie Asp 200904977 465 470 475 480

Phe Leu Leu Gly Glu Leu Glu Arg Leu Gly Gin Asp Leu 485 490 <210> 5 <211〉 1482 <212〉 DNA <213〉野生小家鼠 <400〉 5 atggctgact caaaaccact caggaccctg gatggggacc ccgtggctgt ggaggccttg 60 ctccaggacg tgtttgggat tgttgtagat gaggccattc tgaaggggac cagtgcctct 120 gagaaggtct gcgaatggaa ggagcctgaa gaactcaagc agctgctgga cttggagctg 180 cagagccagg gcgagtcccg ggagcagatc ctggagcgct gccggactgt gattcactac 240 agtgtcaaga ctggtcaccc ccggttcttc aaccagctct tctcagggtt agatccccat 300 gctctggctg ggcgcatcat cacggagagc ctcaacacta gccagtacac atatgagatt 360 gcccccgtgt ttgtgctcat ggaagaggag gtgctgaaga aactccgtgc cctggtgggc 420 tggaactctg gggatggggt cttctgtcct ggtggctcca tctccaacat gtacgccatg 480 aacctggccc gctttcagcg ctacccagac tgcaagcaga ggggcctccg ggccctgccg 540 cccttggctc tcttcacttc aaaggagtgt cactactcca tcaccaaggg agctgctttt 600 ctgggacttg gcaccgacag tgtccgagtg gtcaaggctg atgagagagg gaggatgatc 660 cctgaggacc tggagaggca gatcattctg gcagaggctg agggctctgt gccatttctg 720 gtcagtgcca cctctggtac caccgtgcta ggggcctttg accccctgga tgcaattgcc 780 gatgtttgcc agcgacacgg actgtggttc catgtggatg ctgcctgggg tgggagcgtc 840 ctgctgtctc ggacacacag gcatctcctg gatgggatcc agagggctga ctctgtggcc 900 tggaaccctc acaagcttct cgccgcaggg ctgcagtgct ccgctcttct tctccgggac 960 acctcgaacc tgctcaagcg ctgccatgga tcccaggcca gctacctctt ccagcaagac 1020 aagttctacg atgtggctct ggacaccgga gacaaagtgg tgcagtgtgg ccgccgcgtg 1080 1140 200904977 1200 1260 1320 1380 1440 1482 gactgtctga agctatggct catgtggaag gcacagggtg ggcaggggtt ggagcggcgc atcgaccagg cctttgctct cacccggtac ttggtggagg agattaaaaa gcgggaagga tttgagttgg taatggagcc cgagttcgtc aacgtgtgct tctggtttgt gcctccaagc cttcggggga agaaggagag tccagattac agccaaaggc tgtctcaggt ggcccctgtg ctcaaggagc gcatggtgaa gaaggggacc atgatgattg gctaccagcc ccatgggacc cgggccaact tcttccgaat ggtggtggcc aaccccatac tggcccaggc cgatatagat ttccttctgg gcgagctgga gctcctgggc caggacctgt ga <210〉 6 <211> 493 <212〉 PRT <213〉野生小家鼠 <400〉 6

Met Ala Asp Ser Lys Pro Leu Arg Thr Leu Asp 6ly Asp Pro Val Ala 15 10 15

Val Glu Ala Leu Leu Gin Asp Val Phe Gly lie Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 lie Leu Lys Gly Thr Ser Ala Ser Glu Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45

Pro Glu Glu Leu Lys Gin Leu Leu Asp Leu Glu Leu Gin Ser Gin Gly 50 55 60

Glu Ser Arg Glu Gin lie Leu Glu Arg Cys Arg Thr Val lie His Tyr 65 70 75 80

Ser Vai Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn 6ln Leu Phe Ser Gly 85 90 95

Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg lie Me Thr Glu Ser Leu Asn -10- 200904977 100 105 110

Thr Ser Gin Tyr Thr Tyr Glu Me Ala Pro Val Phe Val Leu Met 6lu 115 120 125

Glu Glu Val Leu Lys Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Asn Ser Gly 130 135 140

Asp Gly Val Phe Cys Pro Gly Gly Ser Me Ser Asn Met Tyr Ala Met 145 150 155 160

Asn Leu Ala Arg Phe Gin Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gin Arg Gly Leu 165 170 175

Arg Ala Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190

Ser lie Thr Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205

Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Giy Arg Met lie Pro Glu Asp Leu 210 215 220

Glu Arg Gin He lie Leu Ala Glu Ala Glu Gly Ser Val Pro Phe Leu 225 230 235 240

Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255

Asp Ala lie Ala Asp Val Cys Gin Arg His Gly Leu Trp Phe His Val 260 265 270

Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Arg Thr His Arg His 275 280 285

Leu Leu Asp Gly lie Gin Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His -11 - 200904977 290 295 300

Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gin Cys Ser Ala Leu Leu Leu Arg Asp 305 310 315 320

Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gin Ala Ser Tyr Leu 325 330 335

Phe Gin Gin Asp Lys Phe Tyr Asp Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350

Val Val Gin Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365

Trp Lys Ala Gin Gly Gly Gin Gly Leu Glu Arg Arg Me Asp Gin Ala 370 375 380

Phe Ala Leu Thr Arg Tyr Leu Val Glu Glu Me Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400

Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415

Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Lys Glu Ser Pro Asp Tyr Ser Gin 420 425 430

Arg Leu Ser Gin Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Lys 435 440 445

Gly Thr Met Met lie Gly Tyr Gin Pro His Gly Thr Arg Ala Asn Phe 450 455 460

Phe Arg Met Val Val Ala Asn Pro lie Leu Ala Gin Ala Asp lie Asp 465 470 475 480

Phe Leu Leu Gly Glu Leu Glu Leu Leu Gly Gin Asp Leu -12- 200904977 <210> 7 <211> 1482 <212> DNA <213〉現代智人 <400> 7 atggctgact cagaagcact cccctccctt gctggggacc cagtggctgt ggaagccttg 60 ctccgggccg tgtttggggt tgttgtggat gaggccattc agaaaggaac cagtgtctcc 120 cagaaggtct gtgagtggaa ggagcctgag gagctgaagc agctgctgga tttggagctg 180 cggagccagg gcgagtcaca gaagcagatc ctggagcggt gtcgggctgt gattcgctac 240 agtgtcaaga ctggtcaccc tcggttcttc aaccagctct tctctgggtt ggatccccat 300 gctctggccg ggcgcattat cactgagagc ctcaacacca gccagtacac atatgaaatc 360 gcccccgtgt ttgtgctcat ggaagaggag gtgctgagga aactgcgggc cctggtgggc 420 tggagctctg gggacggaat cttctgccct ggtggctcca tctccaacat gtatgctgta 480 aatctggccc gctatcagcg ctacccggat tgcaagcaga ggggcctccg cacactgccg 540 cccctggccc tattcacatc gaaggagtgt cactactcca tccagaaggg agctgcgttt 600 ctgggacttg gcaccgacag tgtccgagtg gtcaaggctg atgagagagg gaaaatggtc 660 cccgaggatc tggagaggca gattggtatg gccgaggctg agggtgctgt gccgttcctg 720 gtcagtgcca cctctggcac cactgtgcta ggggcctttg accccctgga ggcaattgct 780 gatgtgtgcc agcgtcatgg gctatggctg catgtggatg ctgcctgggg tgggagcgtc 840 ctgctgtcac agacacacag gcatctcctg gatgggatcc agagggctga ctctgtggcc 900 tggaatcccc acaagctcct cgcagcaggc ctgcaatgct ctgcacttct tctccaggat 960 acctcgaacc tgctcaagcg ctgccatggg tcccaggcca gctacctttt ccagcaggac 1020 aagttctacg atgtggctct ggacacggga gacaaggtgg tgcagtgtgg ccgccgtgtg 1080 gactgtctga agctgtggct catgtggaag gcacagggcg atcaagggct ggagcggcgc 1140 atcgaccagg cctttgtcct tgcccggtac ctggtggagg aaatgaagaa gcgggaaggg 1200 -13- 1260 200904977 1320 1380 1440 1482 tttgagctag tcatggagcc tgagtttgtc aatgtgtgtt tctggttcgt accccccagc ctgcgaggga agcaggagag tccagattac cacgaaaggc tgtcaaaggt ggcccccgtg ctcaaggagc gcatggtgaa ggagggctcc atgatgattg gctaccagcc ccacgggacc cggggcaact tcttccgtgt ggttgtggcc aactctgcac tgacctgtgc tgatatggac ttcctcctca acgagctgga gcggctaggc caggacctgt ga <210> 8 <211〉 493 <212〉 PRT <213〉現代智人 <400〉 8

Met Ala Asp Ser Glu Ala Leu Pro Ser Leu Ala Gly Asp Pro Val Ala 15 10 15

Val Glu Ala Leu Leu Arg Ala Val Phe Gly Val Val Val Asp Glu Ala 20 25 30 lie Gin Lys Gly Thr Ser Val Ser Gin Lys Val Cys Glu Trp Lys Glu 35 40 45

Pro Glu Glu Leu Lys Gin Leu Leu Asp Leu Glu Leu Arg Ser Gin Gly 50 55 60

Giu Ser Gin Lys Gin lie Leu Glu Arg Cys Arg Ala Val He Arg Tyr 65 70 75 80

Ser Val Lys Thr Gly His Pro Arg Phe Phe Asn Gin Leu Phe Ser Gly 85 90 95

Leu Asp Pro His Ala Leu Ala Gly Arg He lie Thr Glu Ser Leu Asn 100 105 110

Thr Ser Gin Tyr Thr Tyr Glu lie Ala Pro Val Phe Val Leu Met Glu -14- 200904977 120 125

Glu Glu Val Leu Arg Lys Leu Arg Ala Leu Val Gly Trp Ser Ser Gly 130 135 140

Asp Gly lie Phe Cys Pro Gly Gly Ser lie Ser Asn Met Tyr Ala Val 145 150 155 160

Asn Leu Ala Arg Tyr Gin Arg Tyr Pro Asp Cys Lys Gin Arg Gly Leu 165 170 175

Arg Thr Leu Pro Pro Leu Ala Leu Phe Thr Ser Lys Glu Cys His Tyr 180 185 190

Ser lie Gin Lys Gly Ala Ala Phe Leu Gly Leu Gly Thr Asp Ser Val 195 200 205

Arg Val Val Lys Ala Asp Glu Arg Gly Lys Met Val Pro Glu Asp Leu 210 215 220

Glu Arg Gin lie Gly Met Ala Glu Ala Glu Gly Ala Val Pro Phe Leu 225 230 235 240

Val Ser Ala Thr Ser Gly Thr Thr Val Leu Gly Ala Phe Asp Pro Leu 245 250 255

Glu Ala lie Ala Asp Val Cys Gin Arg His Gly Leu Trp Leu His Val 260 265 270

Asp Ala Ala Trp Gly Gly Ser Val Leu Leu Ser Gin Thr His Arg His 275 280 285

Leu Leu Asp Gly Me Gin Arg Ala Asp Ser Val Ala Trp Asn Pro His 290 295 300

Lys Leu Leu Ala Ala Gly Leu Gin Cys Ser Ala Leu Leu Leu Gin Asp -15- 200904977 305 310 315 320

Thr Ser Asn Leu Leu Lys Arg Cys His Gly Ser Gin Ala Ser Tyr Leu 325 330 335

Phe 6ln Gin Asp Lys Phe Tyr Asp Val Ala Leu Asp Thr Gly Asp Lys 340 345 350

Val Val Gin Cys Gly Arg Arg Val Asp Cys Leu Lys Leu Trp Leu Met 355 360 365

Trp Lys Ala Gin Gly Asp 6ln Gly Leu Glu Arg Arg lie Asp Gin Ala 370 375 380

Phe Val Leu Ala Arg Tyr Leu Val Glu Glu Met Lys Lys Arg Glu Gly 385 390 395 400

Phe Glu Leu Val Met Glu Pro Glu Phe Val Asn Val Cys Phe Trp Phe 405 410 415

Val Pro Pro Ser Leu Arg Gly Lys Gin Glu Ser Pro Asp Tyr His Glu 420 425 430

Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Leu Lys Glu Arg Met Val Lys Glu 435 440 445

Gly Ser Met Met lie Gly Tyr Gin Pro His Gly Thr Arg Gly Asn Phe 450 455 460

Phe Arg Val Val Val Ala Asn Ser Ala Leu Thr Cys Ala Asp Met Asp 465 470 475 480

Phe Leu Leu Asn Glu Leu Glu Arg Leu Gly Gin Asp Leu 485 490 <210〉 9 -16- 200904977 <211〉 603 <212〉 DNA <213〉中國倉鼠 <400〉 9 atggaacgga ccgagctgct gaagccgcgg accctggccg acctcatccg catcttgcat 60 gagctcttcg cgggcgacga ggtcaacgta gaggaggtgc aggctgtact ggaagcctac 120 gagagcaatc cagccgagtg ggctttgtac gccaaattcg accagtacag gtatactcga 180 aatcttgtgg atcaaggaaa tgggaagttt aatctgatga ttctgtgctg gggtgaagga 240 catggcagca gtattcacga tcacacggac tcccactgct ttttgaagat gctgcaagga 300 aacctaaagg agacattgtt tgcctggcct gacaaaaaat caaatgagat gatcaagaag 360 tcagaaagga ccttaaggga aaaccagtgt gcctacatta atgattccat tgggttacat 420 cgagtagaga atgtcagcca cacggagcct gctgtgagcc ttcacttgta cagtccacct 480 ttcgatacat gccatgcctt tgatcaaaga acgggacaca aaaacaaagt caccatgaca 540 ttccacagca aatttggaat caggactcca tttccaactt caggttcact ggagaacaac 600 taa 603 <210〉 10 <211〉 200 <212> PRT <213〉中國倉鼠 <400> 10

Met 6lu Arg Thr Glu Leu Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu lie 15 10 15

Arg lie Leu His Glu Leu Phe Ala Gly Asp Glu Val Asn Val Glu Glu 20 25 30

Val Gin Ala Val Leu Glu Ala Tyr Glu Ser Asn Pro Ala Glu Trp Ala 35 40 45

Leu Tyr Ala Lys Phe Asp Gin Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp -17- 200904977 50 55 60

Gin Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met lie Leu Cys Trp Gly Glu Gly 65 70 75 80

His Gly Ser Ser lie His Asp His Thr Asp Ser His Cys Phe Leu Lys 85 90 95

Met Leu Gin Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Ala Trp Pro Asp Lys 100 105 110

Lys Ser Asn Glu Met Me Lys Lys Ser Glu Arg Thr Leu Arg Glu Asn 115 120 125

Gin Cys Ala Tyr lie Asn Asp Ser lie Gly Leu His Arg Val Glu Asn 130 135 140

Val Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro 145 150 155 160

Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gin Arg Thr Gly His Lys Asn Lys 165 170 175

Val Thr Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly lie Arg Thr Pro Phe Pro 180 185 190

Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn 195 200 <210〉 11 <211> 603 <212> DNA <213〉溝鼠 <400> 11 60 120 atggaacgga ccgagctgct gaagccccgg accctggccg acctcatccg aatcttgcat gagctcttcg ccggggacga agtcaatgtg gaggaggtgc aggctgtgct ggaagcctac -18- 200904977 gagagcaatc ctgccgagtg ggctttgtat gccaaattcg atcaatacag gtatactcga 180 aaccttgtgg atcaaggaaa tgggaagttt aatctgatga ttctgtgctg gggtgaaggg 240 catggcagca gtattcacga tcactcggac tcccactgct ttttgaagct gctgcaagga 300 aatctaaagg agacattgtt tgactggcct gacaagaaat ccaacgagat gatcaagaag 360 tctgaaagaa ctttgaggga aaatcagtgt gcctacatta atgattctat tggcttacat 420 cgagtagaga acgtcagcca cacagagcct gctgtgagcc ttcacttgta cagtccacct 480 ttcgatacat gccatgcctt tgaccaacga acagggcata aaaacaaagt caccatgaca 540 ttccacagca aatttggaat cagaactcca tttacaactt caggttcact ggagaacaac 600 taa 603 <210〉 12 <211> 200 <212〉 PRT <213〉溝鼠 <400> 12

Met Glu Arg Thr 6lu Leu Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu lie 1 5 10 15

Arg lie Leu His Glu Leu Phe Ala Gly Asp Glu Val Asn Val Glu Glu 20 25 30

Val 6ln Ala Val Leu Glu Ala Tyr Glu Ser Asn Pro Ala Glu Trp Ala 35 40 45

Leu Tyr Ala Lys Phe Asp Gin Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp 50 55 60

Gin Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met lie Leu Cys Trp Gly Glu Gly 65 70 75 80

His Gly Ser Ser lie His Asp His Ser Asp Ser His Cys Phe Leu Lys -19- 200904977 90 95

Leu Leu Gin Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Asp Trp Pro Asp Lys 100 105 110

Lys Ser Asn Glu Met lie Lys Lys Ser Glu Arg Thr Leu Arg Glu Asn 115 120 125

Gin Cys Ala Tyr lie Asn Asp Ser lie Gly Leu,His Arg Val Glu Asn 130 135 140

Val Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro 145 150 155 160

Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gin Arg Thr Gly His Lys Asn Lys 165 170 175

Val Thr Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly lie Arg Thr Pro Phe Thr 180 185 190

Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn 195 200 <210> 13 <211〉 603 <212> DNA <213〉野生小家鼠 <400> 13 atggaacgga ccgagctgct gaagccccgg accctggcgg acctcatccg catcttacat gagctcttcg cgggggacga agtcaacgtg gaggaggtgc aggctgtact ggaagcctac gagagcaatc ccgccgagtg ggctttgtat gccaaattcg atcaatacag gtatactcga aatcttgtgg atcaaggaad tgggaagttt aatctgatga ttctgtgctg gggtgaaggg cacggcagca gtattcatga tcacacggac tcccactgct ttctgaagct gctgcaagga aatctaaagg agacattgtt tgactggcct gacaaaaaat ccaacgagat gatcaagaag -20- 420 200904977 480 540 600 603 tctgaaagaa ccctgaggga aaaccagtgt gcctacatta atgattccat tggcttacac cgagtagaga acgtcagcca cacagagcct gccgtgagcc tccacttgta cagtccaccc ttcgatacat gccacgcttt tgaccagaga acagggcata aaaacaaagt caccatgaca ttccacagca agtttggaat caggactcca tttacaactt cagggtcact ggagaacaac tag <210> 14 <211> 200 <212> PRT <213〉野生小家鼠 <400> 14

Met Glu Arg Thr Glu Leu Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu lie 15 10 15

Arg lie Leu His Glu Leu Phe Ala Gly Asp Glu Val Asn Val Glu Glu 20 25 30

Val Gin Ala Val Leu Glu Ala Tyr Glu Ser Asn Pro Ala Glu Trp Ala 35 40 45

Leu Tyr Ala Lys Phe Asp Gin Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp 50 55 60

Gin Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met lie Leu Cys Trp Gly Glu Gly 65 70 75 80

His Gly Ser Ser lie His Asp His Thr Asp Ser His Cys Phe Leu Lys 85 90 95

Leu Leu Gin Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Asp Trp Pro Asp Lys 100 105 110

Lys Ser Asn Glu Met lie Lys Lys Ser Glu Arg Thr Leu Arg Glu Asn -21 - 200904977 115 120 125

Gin Cys Ala Tyr lie Asn Asp Ser lie Gly Leu His Arg Val Glu Asn 130 135 140

Val Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro 145 150 155 160

Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gin Arg Thr Gly His Lys Asn Lys 165 170 175

Val Thr Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly Me Arg Thr Pro Phe Thr 180 185 190

Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn 195 200 <210> 15 <211〉 603 <212〉 DNA <213>現代智人 <400> 15 atggaacaga ccgaagtgct gaagccacgg accctggctg atctgatccg catcctgcac 60 cagctctttg ccggcgatga ggtcaatgta gaggaggtgc aggccatcat ggaagcctac 120 gagagcgacc ccaccgagtg ggcaatgtac gccaagttcg accagtacag gtatacccga 180 aatcttgtgg atcaaggaaa tggaaaattt aatctgatga ttctctgttg gggtgaagga 240 catggcagca gtattcatga tcataccaac tcccactgct ttctgaagat gctacaggga 300 aatctaaagg agacattatt tgcctggcct gacaaaaaat ccaatgagat ggtcaagaag 360 tctgaaagag tcttgaggga aaaccagtgt gcctacatca atgattccat tggcttacat 420 cgagtagaga acatcagcca tacggaacct gctgtgagcc ttcacttgta cagtccacct 480 tttgatacat gccatgcctt tgatcaaaga acaggacata daaacaaagt cacaatgaca 540 ttccatagta aatttggaat cagaactcca aatgcaactt cgggctcgct ggagaacaac 600 -22- 603 603200904977 taa <210〉 16 <211〉 200 <212〉 PRT <213〉現代智人 <400> 16

Met 6lu Gin Thr Glu Val Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu Me 15 10 15

Arg lie Leu His 6ln Leu Phe Ala Gly Asp Glu Val Asn Val Glu Glu 20 25 30

Val Gin Ala lie Met Glu Ala Tyr Glu Ser Asp Pro Thr Glu Trp Ala 35 40 45

Met Tyr Ala Lys Phe Asp Gin Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp 50 55 60

Gin Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met lie Leu Cys Trp Gly Glu Gly 65 70 75 80

His Gly Ser Ser lie His Asp His Thr Asn Ser His Cys Phe Leu Lys 85 90 95

Met Leu Gin Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Ala Trp Pro Asp Lys 100 105 110

Lys Ser Asn Glu Met Val Lys Lys Ser Glu Arg Val Leu Arg Glu Asn 115 120 125

Gin Cys Ala Tyr Me Asn Asp Ser Ile Gly Leu His Arg Val Glu Asn 130 135 140 lie Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro -23- 200904977 145 150 155 160

Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gin Arg Thr Gly His Lys Asn Lys 165 170 175

Val Thr Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly lie Arg Thr Pro Asn Ala 180 185 190

Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn 195 200 <210〉 17 <211> 603 <212> DNA <213〉家牛 <400> 17 atggagcgga ccgaggtgct aaagccccgc accctggccg atctgatccg cgtcctgcac 60 cagctcttcg ccggcgagga gatcaacgtg gaggaagtgc aggccgtcat ggaagcctat 120 gagagcaacc ccgccgagtg ggcagtgtac gccaagttcg accagtacag gtatactcga 180 aatcttgtgg atcaaggaaa tggaaagttt aatctcatga ttctatgctg gggtgaagga 240 catggcagca gtatccatga tcacaccgac tcccactgct ttctgaagat gctgcaggga 300 aatctaaagg agacattgtt tgcctggcct gacaagaaat ccaatgagat gatcaagaag 360 tctgaaagaa tcttgaggga aaaccagtgt gcctacatca atgattccat tggcttacat 420 cgagtagaga atattagcca tacagagcct gccgtgagcc ttcacttgta tagtccgcct 480 tttgacacat gccacgcctt tgatcaadga acaggacata aaaacaaagt catcatgaca 540 ttccatagca aatttggaat caagactcca tttacaactt caggatccct ggagaacaac 600 taa 603 <210〉 18 <211〉 200 <212〉 PRT <213〉家牛 -24- 200904977 <400> 18

Met Glu Arg Thr Glu Val Leu Lys Pro Arg Thr Leu Ala Asp Leu lie 1 5 10 15

Arg Val Leu His Gin Leu Phe Ala Gly Glu Glu Me Asn Val Glu Glu 20 25 30

Val Gin Ala Val Met Glu Ala Tyr Glu Ser Asn Pro Ala Glu Trp Ala 35 40 45

Val Tyr Ala Lys Phe Asp Gin Tyr Arg Tyr Thr Arg Asn Leu Val Asp 50 55 60

Gin Gly Asn Gly Lys Phe Asn Leu Met lie Leu Cys Trp Gly Glu Gly 65 70 75 80

His Gly Ser Ser lie His Asp His Thr Asp Ser His Cys Phe Leu Lys 85 90 95

Met Leu Gin Gly Asn Leu Lys Glu Thr Leu Phe Ala Trp Pro Asp Lys 100 105 110

Lys Ser Asn Glu Met Me Lys Lys Ser Glu Arg Me Leu Arg Glu Asn 115 120 125 6ln Cys Ala Tyr lie Asn Asp Ser lie Gly Leu His Arg Val Glu Asn 130 135 140 lie Ser His Thr Glu Pro Ala Val Ser Leu His Leu Tyr Ser Pro Pro 145 150 155 160

Phe Asp Thr Cys His Ala Phe Asp Gin Arg Thr Gly His Lys Asn Lys 165 170 175

Val lie Met Thr Phe His Ser Lys Phe Gly Me Lys Thr Pro Phe Thr -25- 200904977 180 185 190

Thr Ser Gly Ser Leu Glu Asn Asn 195 200 <210> 19 <211> 1869 <212〉 DNA <213〉中國倉鼠 <400> 19 atggccacca aggagaagct gcagtgtctg aaagacttcc acaaagacat cctgaagcct 60 tctccaggga agagcccagg cacacggcct gaggatgagg ctgaggggaa gccccctcag 120 agggagaagt ggtccagcaa gattgacttt gtgctgtctg tggccggagg cttcgtgggt 180 ttgggcaacg tttggcgttt cccgtacctc tgctacaaaa atggtggagg tgctttcctc 240 ataccgtatt ttattttcct gtttgggagt ggcctgcctg tgtttttcct ggaggtcata 300 ataggccagt acacctcaga agggggaatc acctgctggg agaagatctg ccccttgttc 360 tctggcattg gctacgcatc catcgtcatc gtgtccctcc tgaatgtgta ctacattgtc 420 atcctggcct gggccacata ctacctattt cactccttcc agacagagct tccctgggcc 480 cactgcaacc acagctggaa cacaccacat tgcatggagg acaccctgcg taggaatgag 540 agtctctggg tctcccttag cgcctccaac ttcacctcgc ctgtcatcga gttctgggag 600 cgcaatgtac tcagcctgtc ttccggaatc gacgaaccag gcgctctgaa atgggacctt 660 gcgctctgcc tcctcttagt ctggcttgtc tgttttttct gcatatggaa gggtgttcga 720 tccacaggca aggttgtcta cttcaccgcc actttcccgt ttgccatgct tctggtgctg 780 ctggtccgtg gactgaccct gccgggtgct ggcgaaggca tcaaattcta cctgtaccct 840 gacatcagcc gccttgagga cccacaggtg tggatcgacg ccggaaccca gatattcttt 900 tcctatgcca tctgcctggg ggccatgacc tcactgggaa gctacaacaa gtacaagtat 960 aactcgtaca gggactgtat gctgctggga tgcctgaaca gtggtaccag ttttgtgtct 1020 ggcttcgcag ttttttccat cctgggcttc atggcacaag agcaaggggt ggacattgct 1080 -26- 1140200904977 gatgtggctg agtcaggtcc tggcttggcc ttcattgcct atccaaaagc tgtgactatg atgccgctgc ccaccttttg gtccattctg ttttttatta tgctcctctt gcttggactg gacagccagt ttgttgaagt cgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccgtcc ttcctaagga agggttatcg tcgggaagtc ttcatcgcca tcctgtgtag catcagctac ctgctggggc tgtcgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcaact ctttgactac tatgcagcta gtggtgtatg ccttttgtgg gttgcattct ttgaatgttt tgttattgcc tggatatatg gtggtgataa cttatatgac ggtattgagg acatgattgg ctatcggcct gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtc atcactccag ttctctgtgc tggatgtttc atcttctctc ttgtcaagta tgtacccctg acctacaaca aagtctacgt gtatcctgat tgggcaattg ggctgggctg gggcctggcc ctatcctcca tggtgtgtat ccccttggtc attgccatcc tcctctgccg gacggaggga ccgttccgcg tgagaatcca atacctgata acccccaggg agcccaaccg ctgggctgtg gagcgtgagg gggccacacc cttccactcc cgcacaagcc tcgtcatgaa cggcgcactc atgaaaccca gtcacgtcat tgtggagacc atgatgtga 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1869 <210〉 20 <211〉 622 <212〉 PRT <213〉中國倉鼠 <400〉 20 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gin Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 15 10 15 lie Leu Lys Pro Ser 20

Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 25 30

Glu Ala Glu Gly Lys 35

Pro Pro Gin Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys lie 40 45 -27- 200904977

Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60

Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 lie Pro Tyr Phe lie Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95

Leu Glu Val lie Me Gly Gin Tyr Thr Ser Glu Gly Gly lie Thr Cys 100 105 110

Trp Glu Lys Me Cys Pro Leu Phe Ser Gly Me Gly Tyr Ala Ser lie 115 120 125

Val Me Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr lie Val Me Leu Ala Trp 130 135 140

Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe His Ser Phe Gin Thr Glu Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160

His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr Leu 165 170 175

Arg Arg Asn Glu Ser Leu Trp Val Ser Leu Ser Ala Ser Asn Phe Thr 180 185 190

Ser Pro Val lie Glu Phe Trp Glu Arg Asn Vai Leu Ser Leu Ser Ser 195 200 205

Gly lie Asp Glu Pro Gly Ala Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220

Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys lie Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240 -28- 200904977

Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255

Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Glu 260 265 270

Gly lie Lys Phe Tyr Leu Tyr Fro Asp He Ser Arg Leu Glu Asp Pro 275 280 285

Gin Val Trp lie Asp Ala Gly Thr Gin He Phe Phe Ser Tyr Ala Me 290 295 300

Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320

Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser Gly Thr 325 330 335

Ser Phe Val Ser Gly Phe Ala Val Phe Ser lie Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350

Gin Glu Gin Gly Val Asp lie Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365

Leu Ala Phe lie Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380

Thr Phe Trp Ser lie Leu Phe Phe lie Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400

Asp Ser Gin Phe Val Glu Val Glu Gly Gin lie Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415

Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu Val Phe lie 420 425 430 -29- 200904977

Ala lie Leu Cys Ser lie Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Ser Met Val Thr 435 440 445

Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gin Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser 450 455 460

Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val lie Ala 465 470 475 480

Trp lie Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Giy lie Glu Asp Met lie 485 490 495

Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val lie Thr 500 505 510

Pro Val Leu Cys Ala Gly Cys Phe lie Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525

Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Val Tyr Val Tyr Pro Asp Trp Ala lie Gly 530 535 540

Leu Gly Trp Gly Leu Ala Leu Ser Ser Met Val Cys lie Pro Leu Val 545 550 555 560

Me Ala lie Leu Leu Cys Arg Thr Glu Gly Pro Phe Arg Val Arg lie 565 570 575

Gin Tyr Leu lie Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590

Glu Gly Ala Thr Pro Phe His Ser Arg Thr Ser Leu Val Met Asn Gly 595 600 605

Ala Leu Met Lys Pro Ser His Val lie Val Giu Thr Met Met 610 615 620 -30- 200904977 <210> 21 <211〉 1866 <212〉 DNA <213〉溝鼠 <400> 21 atggccacca aggagaagct tcaatgtctg aaagacttcc acaaagacat cctgaagcct 60 tctccaggga agagcccagg cacgcggcct gaggatgagg ctgatgggaa gccccctcag 120 agggagaagt ggtccagcaa gatcgacttt gtgctgtctg tggccggagg cttcgtgggt 180 ttgggcaatg tctggcgttt cccgtacctc tgctacaaaa atggtggagg tgcattcctc 240 ataccgtatt ttattttcct gtttgggagc ggcctgcctg tgtttttcct ggaggtcatc 300 ataggccagt acacctcaga agggggcatc acctgctggg agaagatctg ccccttgttc 360 tctggcattg gctacgcgtc catcgtcatc gtgtccctcc tgaatgtgta ctacatcgtc 420 atcctggcct gggccacata ctacctattc cagtctttcc agaaggatct tccctgggcc 480 cactgcaacc atagctggaa cacgccacag tgcatggagg acaccctgcg taggaacgag 540 agtcactggg tctcccttag cgccgccaac ttcacttcgc ctgtgatcga gttctgggag 600 cgcaacgtgc tcagcctgtc ctccggaatc gaccacccag gcagtctgaa atgggacctc 660 gcgctctgcc tcctcttagt ctggctcgtc tgttttttct gcatctggaa gggtgttcgg 720 tccacaggca aggttgtcta cttcactgct actttcccgt ttgccatgct tctggtgctg 780 ctggtccgtg gactgaccct gccaggtgct ggtgaaggca tcaaattcta cctgtaccct 840 aacatcagcc gccttgagga cccacaggtg tggatcgacg ctggaactca gatattcttt 900 tcctacgcta tctgcctggg ggccatgacc tcactgggaa gctataacaa gtacaagtat 960 aactcgtaca gggactgtat gctgctggga tgcctgaaca gtggtaccag ttttgtgtct 1020 ggcttcgcaa ttttttccat cctgggcttc atggcacaag agcaaggggt ggacattgct 1080 gatgtggctg agtcaggtcc tggcttggcc ttcattgcct acccaaaagc tgtgaccatg 1140 atgccgctgc ccaccttttg gtccattctg ttttttatta tgctcctctt gcttggactg 1200 gacagccagt ttgttgaagt cgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccgtcc 1260 -31 - 1320 200904977 ttcctaagga agggttatcg tcgggaaatc ttcattgcca tcgtgtgcag catcagctac ctgctggggc tgacgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcaact ctttgactac tatgcagcta gtggtgtatg ccttttgtgg gtcgcattct ttgaatgttt tgttattgcc tggatatatg gcggtgataa cttatatgac ggtattgagg acatgatcgg ctatcggcct ggaccctgga tgaagtacag ctgggctgtc atcactccag ctctctgtgt tggatgtttc atcttctctc tcgtcaagta tgtacccctg acctacaaca aagtctaccg gtaccctgat tgggcaatcg ggctgggctg gggcctggcc ctttcctcca tggtgtgtat ccccttggtc attgtcatcc tcctctgccg gacggaggga ccgctccgcg tgagaatcaa atacctgata acccccaggg agcccaaccg ctgggctgtg gagcgtgaag gggctacgcc ctttcactcc agagcaaccc tcatgaacgg tgcactcatg aaacccagtc acgtcattgt ggagaccatg atgtga <210〉 22 <211〉 621 <212〉 PRT <213〉溝鼠 <400> 22

Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gin Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp IS 10 15 lie Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30

Glu Ala Asp Gly Lys Pro Pro Gin Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys lie 35 40 45

Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60

Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1866 -32- 200904977 65 70 75 80 lie Pro Tyr Phe lie Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95

Leu Glu Val lie lie Gly Gin Tyr Thr Ser Glu Gly 6iy Me Thr Cys 100 105 110

Trp Glu Lys lie Cys Pro Leu Phe Ser Gly Me Gly Tyr Ala Ser He 115 120 125

Val lie Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Me Val lie Leu Ala Trp 130 135 140

Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Gin Ser Phe Gin Lys Asp Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160

His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro Gin Cys Met Glu Asp Thr Leu 165 170 175

Arg Arg Asn Glu Ser His Trp Val Ser Leu Ser Ala Ala Asn Phe Thr 180 185 190

Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Ser 195 200 205

Gly lie Asp His Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220

Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys lie Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240

Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255

Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Glu -33- 200904977 260 265 270

Gly lie Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asn lie Ser Arg Leu Glu Asp Pro 275 280 285 6ln Val Trp Me Asp Ala Gly Thr Gin Me Phe Phe Ser Tyr Ala lie 290 295 300

Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320

Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser Gly Thr 325 330 335

Ser Phe Val Ser Gly Phe Ala Me Phe Ser Me Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350

Gin Glu Gin Gly Val Asp Me Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365

Leu Ala Phe Me Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380

Thr Phe Trp Ser lie Leu Phe Phe lie Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400

Asp Ser Gin Phe Val Glu Val Glu Gly Gin lie Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415

Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu Me Phe Me 420 425 430

Ala lie Val Cys Ser lie Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Thr Met Val Thr 435 440 445

Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gin Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser -34- 200904977 450 455 460

Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val lie Ala 465 470 475 480

Trp lie Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Gly lie Glu Asp Met lie 485 490 495

Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val Me Thr 500 505 510

Pro Ala Leu Cys Val Gly Cys Phe lie Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525

Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Val Tyr Arg Tyr Pro Asp Trp Ala lie Gly 530 535 540

Leu Gly Trp Gly Leu Ala Leu Ser Ser Met Val Cys lie Pro Leu Val 545 550 555 560 lie Val lie Leu Leu Cys Arg Thr Glu Gly Pro Leu Arg Val Arg lie 565 570 575

Lys Tyr Leu Ile Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590

Glu Gly Ala Thr Pro Phe His Ser Arg Ala Thr Leu Met Asn Gly Ala 595 600 605

Leu Met Lys Pro Ser His Val Me Val Glu Thr Met Met 610 615 620 <210〉 23 <211> 1866 <212> DNA <213〉野生小家鼠 -35- 200904977 <400〉 23 atggccacga aggagaagct gcaatgtctg aaagacttcc acaaagacat cctgaagcct 60 tctccaggga agagcccagg cacacggcct gaagatgagg cggacgggaa gccccctcag 120 agggagaagt ggtccagcaa gatcgacttt gtgctgtctg tggccggagg cttcgtgggt 180 ttgggcaacg tctggcgttt cccgtacctc tgctacaaaa atggtggagg tgcgttcctc 240 ataccgtatt ttattttcct gtttgggagc ggcctgcctg tgtttttctt ggaggtcatc 300 ataggccagt acacatcaga agggggcatc acctgctggg agaagatctg tcctttgttc 360 tctggcattg gctacgcatc catcgtcatt gtgtccctcc tgaacgtgta ctacatcgtc 420 atcctggcct gggccacata ctacctattc cactctttcc agaaggatct tccctgggcc 480 cactgcaacc atagctggaa cacaccacag tgcatggagg acaccctgcg taggaacgag 540 agtcactggg tctcccttag cactgccaac ttcacctcac ccgtcatcga gttctgggag 600 cgcaatgtgc tcagcctgtc ctccggaatc gacaacccag gcagtctgaa atgggacctc 660 gcgctctgcc tcctcttagt ctggctcgtc tgttttttct gcatctggaa gggtgttcga 720 tccacaggca aggttgtcta cttcaccgct actttcccgt ttgccatgct tctggtgctg 780 ctggtccgtg gactgaccct gccaggtgct ggtgaaggca tcaaattcta cctgtaccct 840 gacatcagcc gccttgggga cccacaggtg tggatcgacg ctggaactca gatattcttt 900 tcctacgcaa tctgcctggg ggccatgacc tcactgggaa gctataacaa gtacaagtat 960 aactcgtaca gggactgtat gctgctggga tgcctgaaca gtggtaccag ttttgtgtct 1020 ggcttcgcaa ttttttccat cctgggcttc atggcacaag agcaaggggt ggacattgct 1080 gatgtggctg agtcaggtcc tggcttggcc ttcattgcct acccaaaagc tgtaaccatg 1140 atgccgctgc ccaccttttg gtctattctg tttttcatta tgctcctctt gcttggactg 1200 gacagccagt ttgttgaagt cgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccgtcc 1260 ttcctaagga agggttatcg tcgggaaatc ttcatagcca tcttgtgtag catcagctac 1320 ctgctggggc tgacgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcaact ctttgactac 1380 tatgcagcta gtggtgtatg ccttttgtgg gttgcattct ttgaatgttt tgttattgcc 1440 -36- 1500 200904977 1560 1620 1680 1740 1800 I860 1866 tggatatatg gcggtgataa cttatatgac ggtattgagg acatgattgg ctatcggcct gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtc atcactccag ctctttgtgt tggatgtttc gtcttctcgc ttgtcaagta tgtacccctg acctacaaca aagtgtaccg gtacccggat tgggcaattg ggctgggctg gggcctggcc ctttcctcca tgctgtgtat ccccttggtc attgtcatcc tcctctgccg gacggaggga ccgctccgcg tgagaatcaa atacctgata acccccaggg agcccaaccg ctgggctgtg gagcgtgaag gggccacacc ctttcactcc cgagtaaccc tcatgaacgg cgcactcatg aaacccagtc acgtcattgt ggagaccatg atgtga <210〉 24 <211> 621 <212> PRT <213〉野生小家鼠 <400> 24

Met Ala Thr Lys 6lu Lys Leu Gin Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 15 10 15

Me Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro 6ly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30

Glu Ala Asp Gly Lys Pro Pro Gin Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys He 35 40 45

Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60

Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80

Me Pro Tyr Phe lie Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95 -37- 200904977

Leu Glu Vai Me lie Gly Gin Tyr Thr Ser GIu Gly Gly Me Thr Cys 100 105 110

Trp Glu Lys lie Cys Pro Leu Phe Ser Gly lie Gly Tyr Ala Ser lie 115 120 125

Val Me Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr lie Val Me Leu Ala Trp 130 135 140

Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe His Ser Phe Gin Lys Asp Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160

His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro Gin Cys Met Glu Asp Thr Leu 165 170 175

Arg Arg Asn Glu Ser His Trp Val Ser Leu Ser Thr Ala Asn Phe Thr 180 185 190

Ser Pro Val lie Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Ser 195 200 205

Gly lie Asp Asn Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220

Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Me Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240

Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255

Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Glu 260 265 270

Gly Me Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp Me Ser Arg Leu Gly Asp Pro 275 280 285 -38- 200904977

Gin Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gin Ile Phe Phe Ser Tyr Ala I le 290 295 300

Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320

Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser Gly Thr 325 330 335

Ser Phe Val Ser Gly Phe Ala lie Phe Ser lie Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350

Gin Glu Gin Gly Val Asp Me Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365

Leu Ala Phe lie Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380

Thr Phe Trp Ser lie Leu Phe Phe lie Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400

Asp Ser 6ln Phe Val Glu Val Glu Gly Gin lie Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415

Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu lie Phe Me 420 425 430

Ala Me Leu Cys Ser Me Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Thr Met Val Thr 435 440 445

Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gin Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser 450 455 460

Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val lie Ala 465 470 475 480 -39- 200904977

Trp lie Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Gly lie Glu Asp Met lie 485 490 495

Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val lie Thr 500 505 510

Pro Ala Leu Cys Val Gly Cys Phe Val Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525

Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Val Tyr Arg Tyr Pro Asp Trp Ala lie Gly 530 535 540

Leu Gly Trp Gly Leu Ala Leu Ser Ser Met Leu Cys lie Pro Leu Val 545 550 555 560 lie Val lie Leu Leu Cys Arg Thr Glu Gly Pro Leu Arg Val Arg lie 565 570 575

Lys Tyr Leu lie Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590

Glu Gly Ala Thr Pro Phe His Ser Arg Val Thr Leu Met Asn Gly Ala 595 600 605

Leu Met Lys Pro Ser His Val lie Val Glu Thr Met Met 610 615 620 <210〉 25 <211〉 1863 <212> DNA <213〉現代智人 <400> 25 60 120 atggccacca aggagaagct gcagtgtctg aaagatttcc acaaggacat cctgaagccc tcaccaggga agagcccagg cacgcggcct gaggacgagg ctgagggaaa acctccgcag agggagaagt ggtctagcaa gatcgacttt gtgctctctg tggctggcgg cttcgtgggc -40- 180 200904977 ttgggcaacg tctggcgctt cccgtacctc tgctacaaga atggtggagg tgcgtttctc 240 ataccgtatt ttattttcct gtttgggagc ggcctgcctg tgtttttctt ggagatcatc 300 ataggccagt acacctctga agggggcatc acctgctggg aaaagatctg ccccttgttc 360 tctggtatcg gctatgcctc cgttgtaatt gtgtccctcc tgaatgtcta ctacatcgtc 420 atcctggcct gggccacata ctacctgttc cagtccttcc agaaggagct gccctgggca 480 cactgcaacc acagctggaa cacacctcac tgcatggagg acaccatgcg caagaacaag 540 agtgtctgga tcaccatcag ctccaccaac ttcacctccc ctgtcatcga gttctgggag 600 cgcaacgtgc tgagcttgtc ccctggaatc gaccacccag gctctctgaa atgggacctc 660 gctctctgcc ttcttttagt ctggctagtg tgtttcttct gcatctggaa gggcgtcagg 720 tccactggga aggtcgtcta cttcacagcc acttttccat tcgccatgct cctggtgctg 780 ctggtccgag ggctgacgct gccgggcgcg ggcgcaggca tcaagttcta tctgtatcct 840 gacatcaccc gcettgagga cccacaggtg tggattgacg ctgggactca gatattcttc 900 tcttatgcca tctgcctggg ggctatgacc tcgctgggga gctacaacaa gtacaagtat 960 aactcgtaca gggactgtat gctgctggga tgcctgaaca gtggtaccag ttttgtgtct 1020 ggcttcgcaa ttttttccat cctgggcttc atggcacaag agcaaggggt ggacattgct 1080 gatgtggctg agtcaggtcc tggcctggcc ttcattgcct acccaaaagc tgtgacaatg 1140 atgccgctgc ccacattttg gtccattctt ttttttatta tgcttctctt gcttggactg 1200 gatagccagt ttgttgaagt tgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccatcc 1260 ttcctaagga agggttatcg tcgggaaatc ttcatcgcct tcgtgtgtag catcagctac 1320 ctgctggggc tgacgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcagct ctttgactac 1380 tatgcagcta gcggtgtatg ccttttgtgg gttgcattct ttgaatgttt tgttattgcc 1440 tggatatatg gaggtgataa cctttatgat ggtattgagg acatgattgg ctatcggccc 1500 gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtg atcactccag ttctctgtgt tggatgtttc 1560 atcttctcgc tcgtcaagta cgtacccctg acctacaaca aaacatacgt gtaccccaac 1620 -41 - 200904977 1680 1740 1800 1860 1863 tgggccattg ggctgggctg gagcctggcc ctttcctcca tgctctgcgt tcccttggtc atcgtcatcc gcctctgcca gactgagggg ccgttccttg tgagagtcaa gtacctgctg accccaaggg aacccaaccg ctgggctgtg gagcgcgagg gagccacacc ttacaactct cgcaccgtca tgaacggcgc tctcgtgaaa ccgacccaca tcattgtgga gaccatgatg tga <210〉 26 <211> 620 <212> PRT <213〉現代智人 <400> 26

Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gin Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 15 10 15

Ile Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30

Glu Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gin Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys lie 35 40 45

Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60

Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 lie Pro Tyr Phe lie Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95

Leu Glu He lie lie Gly Gin Tyr Thr Ser Glu Gly Gly lie Thr Cys 100 105 110

Trp Glu Lys lie Cys Pro Leu Phe Ser Gly lie Gly Tyr Ala Ser Val 200904977 115 120 125

Val lie Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr lie Val lie Leu Ala Trp 130 135 140

Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe Gin Ser Phe Gin Lys Glu Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160

His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr Met 165 170 175

Arg Lys Asn Lys Ser Val Trp lie Thr Me Ser Ser Thr Asn Phe Thr 180 185 190

Ser Pro Val lie Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Pro 195 200 205

Gly Me Asp His Pro Gly Ser Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220

Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Me Trp Lys Gly Vai Arg 225 230 235 240

Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255 k.

Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Ala 260 265 270

Gly lie Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp lie Thr Arg Leu Glu Asp Pro 275 280 285

Gin Val Trp Me Asp Ala Gly Thr Gin lie Phe Phe Ser Tyr Ala lie 290 295 300

Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr -43- 200904977 305 310 315 320

Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser 6ly Thr 325 330 335

Ser Phe Val Ser Gly Fhe Ala lie Phe Ser lie Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350

Gin Glu Gin Gly Val Asp lie Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365

Leu Ala Phe lie Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380

Thr Phe Trp Ser lie Leu Phe Phe Me Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400

Asp Ser Gin Phe Val Glu Val Glu Gly Gin lie Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415

Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu lie Phe lie 420 425 430

Ala Phe Val Cys Ser Me Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Thr Met Val Thr 435 440 445

Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gin Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser 450 455 460

Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val lie Ala 465 470 475 480

Trp lie Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Gly lie Glu Asp Met lie 485 490 495

Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val lie Thr -44 - 200904977 500 505 510

Pro Val Leu Cys Val Gly Cys Phe lie Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525

Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Thr Tyr Val Tyr Pro Asn Trp Ala lie Gly 530 535 540

Leu Gly Trp Ser Leu Ala Leu Ser Ser Met Leu Cys Val Pro Leu Val 545 550 555 560

He Val lie Arg Leu Cys Gin Thr Glu Gly Pro Phe Leu Val Arg Val 565 570 575

Lys Tyr Leu Leu Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590

Glu Gly Ala Thr Pro Tyr Asn Ser Arg Thr Val Met Asn Gly Ala Leu 595 600 605

Val Lys Pro Thr His lie lie Val Glu Thr Met Met 610 615 620 -45-

Claims (1)

1. 200904977 十、申請專利範圍 1. 一種多肽的製造方法，其係包含培養已導入編碼所 期望之多肽的DNA且可大量產生丙胺酸之細胞，及使 其產生所期望的多肽。 2. 如申請專利範圍第1項之製造方法，其中可大量產 生/3 -丙胺酸之細胞，係已導入編碼具有自天冬胺酸合成 /3 -丙胺酸之酵素活性的蛋白質的DN A之細胞。 3 ·如申請專利範圍第1項之製造方法，其中可大量產 生丙胺酸之細胞，係已導入編碼半胱亞磺酸脫羧酶、 麩胺酸脫羧酶或該等酶之突變體的DNA之細胞。 4 ·如申請專利範圍第1〜3項中任一項之製造方法， 其中可大量產生yS -丙胺酸之細胞，係相對於開始培養時 /3 -丙胺酸的細胞內濃度，培養第6天以後Θ -丙胺酸的細 胞內濃度之比變爲2以上之細胞。 5 .如申g靑專利範圍第1〜3項中任一項之製造方法， 其中可大量產生丙胺酸之細胞，係可使培養液中之冷_ 丙胺酸濃度於培養第6天以後增加5 0 /i Μ以上之細胞。 6. —種培養細胞’其係相對於開始培養時-丙胺酸 的細胞內濃度’培養第6天以後yS -丙胺酸的細胞內濃度 之比變爲2以上。 7 . —種培養細胞’其係可使培養液中之/3 -丙胺酸濃 度於培養第6天以後增加5 0 // Μ以上。 8.—種多肽的製造方法，其係包含培養可大量表現半 胱亞磺酸脫羧酶，且已導入編碼所期望多肽的DNA之細 200904977 胞，並使其產生所期望的多肽。 9.如申請專利範圍第8項之製造方法，其中可大量表 現半胱亞擴酸脫竣酶之細胞’係已導入編碼半眺亞摘酸脫 羧酶的DNA之細胞。 1〇_如申請專利範圍第8或9項之製造方法，其中可 大量表現半腕亞磺酸脫竣酶之細胞，進而可大量表現牛擴 酸轉運蛋白。 11 ·如申請專利範圍第1 〇項之製造方法，其中可大量 表現牛磺酸轉運蛋白之細胞，係已導入編碼牛擴酸轉運蛋 白的DNA之細胞。 1 2 .如申請專利範圍第9或1 1項之製造方法，其中該 細胞係中國倉鼠卵巢細胞。 1 3 _如申請專利範圍第8〜1 2項中任一項之製造方法 ，其中所期望的多肽係抗體。 1 4 ·如申請專利範圍第9〜1 3項中任一項之製造方法 ，其中編碼半胱亞磺酸脫羧酶的DN A係以下（a )〜（e )之任一種， (a )可編碼具序列編號2、4、6或8之胺基酸序列 的多肽之DNA， (b )編碼於序列編號2、4、6或8之胺基酸序列中 ，具有1個或複數個胺基酸被取代、缺失、付加及/或被 插入的胺基酸序列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽 之 DNA， (c )編碼具有與序列編號2、4、6或8之胺基酸序 -2- 200904977 列7 0 %以上相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽 之 DNA， (d )具有序列編號1、3、5或7之鹼基序列之DNA (e )於具有序列編號1、3、5或7之鹼基序列之 DNA上，與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且 編碼具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DNA。 1 5 . —種編碼半胱亞磺酸脫羧酶之DN A，其係以下（a )〜（e )之任一種（但除具序列編號3、5及7之鹼基序 列之DNA以外）， (a )編碼具序列編號2之胺基酸序列的多肽之DN A (b) 編碼於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個 或複數個胺基酸被取代、缺失、付加及/或被插入的胺基 酸序列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DN A， (c) 編碼具有與序列編號2之胺基酸序列97%以上 相同性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DN A， (d )具有序列編號1之鹼基序列之DNA， (e)於具有序列編號1之鹼基序列之DNA上，與互 補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有半胱 亞磺酸脫羧酶活性的多肽之DN A。 1 6 . —種多肽，其係以下（A )〜（E )之任一種（但 除具序列編號4、6及8之胺基酸序列之多肽以外）， (A )具序列編號2之胺基酸序列之多肽， -3- 200904977 (B)於序列編號2之胺基酸序列中，具有1個或複 數個胺基酸被取代、缺失、付加及/或被插入的胺基酸序 列，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽， (C )具有與序列編號2之胺基酸序列97%以上相同 性，且具有半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽， (D)藉由具序列編號1之鹼基序列之DNA而進行編 碼之多肽， (E )藉由於具有序列編號1之鹼基序列之DNA上， 與互補DNA以高度嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有 半胱亞磺酸脫羧酶活性之多肽之DNA進行編碼之多狀。 1 7 · —種重組載體，其係包含如申請專利範圍第1 5項 之 DNA。 1 8 . —種細胞，其係已導入如申請專利範圍第1 5項之 DNA。 1 9. 一種細胞，其係已導入編碼半胱亞磺酸脫羧酶之 DNA與編碼所期望的多肽之DNA。 20. 如申請專利範圍第19項之細胞，其係進而導入編 碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。 21. —種細胞，其係已導入編碼半胱亞磺酸脫羧酶之 DNA與編碼牛磺酸轉運蛋白之DNA。 2 2 . —種大量產生/3 -丙胺酸的細胞，其可經導入編碼 半胱亞磺酸脫羧酶之DNA而得。 2 3 ·如申請專利範圍第2 2項之大量產生/3 -丙胺酸的 細胞，其係已導入編碼所期望多肽之DNA。