TW200902045A - Agents for preventing cardiac failure - Google Patents

Description

200902045 -九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係有關具有心臟壁肥厚抑制作用 ^ 分、包含該有效成分之心肥大預防劑及心不全2效成 及含有該有效成分之可期待心肥大及心不全、二，以 功能性食品。 、方效果的 此外，本發明係有關抑制心臟壁肥厚的方法。 本發明係有關於預防心肥大以及心不全的方法。再者 【先前技術】 病之=來：ίΓ，國家中具有被認為會引起心臟疾 ,… 壓、南血糖、高血脂症等危險因子的人變 夕，心农竭患者數有增加的傾向。此外，此等 :::人類:在狗、猶、其罐動物或寵物動：等= 類有氆切關係的動物也有增加的傾向。 料：:Γ:Γ、分類、過程係為各式各樣，而無法 間早地疋義，不過可大致區分為收縮期 t竭兩大類型’也有此2種同時發生的情形。收 :係由於心職變得無法正常地收縮而引起。心臟雖將錢 :入’但由於心肌變得衰弱，無法將充滿的血液充分地壓 ^其結果使送到全身與肺的血液量變少，而心臟 疋左心室變得肥大。另—士二 k /、 隔…方面，舒張期心衰竭係由於心臟 ^土^:硬Μ，心臟變得無法充分地儲存血液而發病。里 :果，血液積蓄在左心房内或肺的血管内，會引起營血:、 此’ -般所s胃之^朗係指由於^臟的泵功能衰竭而使 320069 5 200902045 心臟變得無法送出充分量的血液，並且，因心衰竭而會產 生血流量的減少、或血液滯留於肺中等令心臟功能更加下 降之其他變化。 就導致心衰竭之原發病症而言，可舉出例如因高血 [大動脈狹乍症等造成之壓力負載的增大以及瓣膜症等 造成之容量負载的增大等而造成的心臟壁肥厚之心肥大。 另:方面，作為在心肌梗塞發作後之損傷組織中的自動性 功能恢復反應’也有形成^臟壁肥大的情形。此外，若發 生。肌症等原因不明之心肌障礙也會造成心臟壁肥大。若 持續對心職之機械性負載則會造成^肌收縮力漸漸降低而 使心功能下降，從而導致心室性心律不整、心臟缺血、冠 狀動脈疾病、營血性心衰竭。 攸此等事實來看，具有心臟壁肥厚抑制作 … ，工/于彳ψ利 物’係在心肥大與心衰竭之預防及治療為有用。 就心臟壁肥厚改善的方法而言，例如，在由高血心 月m以時，有因治療其原因所在之高血屋而使心臟^ 劑:二=:情形’但其作用非可滿足者，而且有㈣

2〇)…、者（Am J Hypertens· 1997 Aug;l〇⑻:913 J 厚以:Hi即使在高域被改善時，也有許多心臟壁康 =文善的狀態而殘留的情形，在如此的情形下，係 ϋ有〜农竭發作的危險性。 管緊衰竭治療有效之藥劑而言，作為可阻礙從血 血轉換成具有升㈣用之血管緊縮素π的酵素 血官緊縮素轉換酵素；ACE)之物質、且且有降 320069 6 200902045 -塵作狀血管緊縮素㈣酵素抑㈣（acei) 出伊那拉普利（enaIapril)。此外，已有報告指出降^ 係在降低血壓的同時亦改善腎障礙之進展情形^ wst，77，1993_2_，1986)。可是在另一方面，對 ^ 各種原發疾病誘發之心衰竭，ACE抑制劑並非一斤= ，病症有效，相反地，被指出亦有伴隨降^造成 哀竭的危險，故必須慎重地投予（最新醫學，二： 1409, 1993 )。亦即，降厂㈣不僅在心衰竭的預防方面^ 不充分，反而還有誘發腎衰竭的可能性。 面為 另一方面，有報告指出源自酪蛋白（casein)等食。去从 之胜肽：有ACE抑制活性’此等具有血壓降低作：為 知，但未直接顯示是否具有心臟壁^ 專利第2782142號公報，T D ς . 作用（日本國 現△報，J. Dairy SC1. 1995, 78:777-78，Τ

Dalry Sci. 1995, 78:1253_1257 J· 64.767 77η Am* J· Clm. Nutr. 1996 . υ。此外，以ACE抑制而進行之心奢 ， 或治療之效果係如前述有 "預防 ACE抑制之疾病的= 因此’期望能有無關於 1利又疾病的預防或是治療。 【發明内容】 依據本發明，提供不依賴ACE抑制活性且 肥厚抑制作用的化合物或組成物。 臟壁 再者’依據本發明，提供包含上述 心哀竭預防劑。 π戎、、且成物之 此外’依據本發明，提供包含上述化合物或細占％ 且可期待心衰竭預防效果的功能性食品/物或組成物並 320069 7 200902045 投予象明’提供包含將上述化合物或組成物 卞對象者之抑制心臟壁肥厚的方法。 此外’依據本發明，提供包 投予於對象者之預防心衰竭的二:將上述化合物或組成物 藥時：上= =造用以抑制心臟壁肥厚的醫 造心肥大預防用:尤其，本發明係亦為在製 樂時㈣上述化合物或組成物。此外， ::::亦為在製造心衰竭預防用醫藥時使用上述化合物 本發明人等發現具有所謂Xaapr0 χ 天然胺基酸）之牿宏谌、生从—W 巧仕心的 特疋構k的二胜肽係具有心臟壁肥厚抑制 作用，而得以發明制_ # g 月對。哀竭之預防有功效的醫藥以及功能 t艮品。其具體的内容係如以下所述。 本發明係提供包含Xaa h Ρπ)作為有效成分之心臟 壁肥厚抑制劑。 此外’本發明係提供具備上述之Ί壁肥厚抑制作用 的心肥大預防劑。 j外’本發明係提供具備上述之心臟壁肥厚抑制作用 的心衰竭預防劑。 此外，本發明係提供包含上述之心臟壁肥厚抑制劑的 功能性食品。 v 本發明係提供包含將xaa Pr〇 ρΓ0或含有Xaa Pr〇卩⑺ 之組成物投予於對象者之抑制心臟壁肥厚的方法。 此外’本發明係亦提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa 8 320069 200902045 -Pro Pro之組成物投予於對象者之預防心肥大的方法。 此外，本發明係亦提供包含將Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物投予於對象者之預防心衰竭的方法。 再者，本發明係亦為在製造抑制心臟壁肥厚的醫藥時 使用Xaa Pro Pro或含有Xaa Pro Pro之組成物。尤其，本 發明係亦為在製造心肥大預防用醫藥時使用Xaa Pro Pro 或含有Xaa Pro Pro之組成物。此外’本發明係亦為在製造 心衰竭預防用醫藥時使用Xaa Pro Pro或含有xaa pro pro 之組成物。

Xaa Pro Pro 係宜為 Val Pro Pro 及/或 He Pro Pro。 在本發明之其他的態樣中，有效成分Xaa Pro Pro係 源自獸乳酪蛋白（casein)水解物或其濃縮物。 在本發明之另外的態樣中’有效成分Xaa Pro Pro係 源自令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌. (Lactobacillus helveticus)種之菌發酵戶斤得之發酵物。 屬於瑞士乳酸桿菌種之菌係宜為瑞士乳酸桿菌CM4 株（CCRC 910111 )。 【實施方式】 本發明之心臟壁肥厚抑制劑，係包含如Xaa pro pro 之構造的三胜肽作為有效成分。在此，所謂「劑」並非限 定為藥劑者，而是指例如醫藥組成物或食品組成物等組成 物、或者是例如食品添加劑等化合物。在本發明中，所謂 「心臟壁肥厚抑制劑」係指具有壓抑與阻止心臟壁肥厚病 變之進行的作用、或具有改善心臟壁肥厚病變的作用、或 9 320069 200902045 具有心臟壁肥厚症之預防效果的化合物或組成物。 本發明之有效成分Xaa Pr〇 Pr〇之Xaa，可為任意的天 然胺基酸。具體而言’可舉出Vai pro pro(纈胺酸_脯胺酸_ 膽胺酸）、lie Pro Pro(異白胺酸-脯胺酸_脯胺酸）、Ser Pr〇 Pro(絲私：胺酸-脯胺酸）、Leu pr〇 pr〇(白胺酸_脯胺酸_ 脯胺酸）等，宜為 ValProPro、IlePr〇Pr〇,較宜為 Valpr〇 Pro。此外’作為有效成分，亦可包含pr〇 pr〇及 Pro等1種以上的三胜肽Xaa Pr〇 pr〇之組合。 有效成分Xaa Pro Pro係可為有機化學性合成而成的 三胜肽，亦可為源自天然的三胜肽。 就二胜肽Xaa Prc) PrQ之有機化學性合成法而言，可 :吏用口相法(Boc法、Fm〇c法)或液相法等一般性的方法， :^楚亦可為使用島津製作所製之胜肽合成裝置（PSSM—8 =胜=合成裝置所合成者。關於胜肽合成之反應 或期心 者之技術常識，配合選擇的合成方法 件。、—㈣b ΡΚ)而任意地設定適當的反應條 或者是’就源自天麸去而士 解物或其濃縮物者，亦;為二：為源自獸乳酪蛋白水 由麴菌或乳酸菌箄心J 自令含有乳蛋白質之原料藉 次认园專菌類發酵所得之發酵物者。 在使用獸乳酪蛋白水解物 蛋白質之原料蕻i届妖 初及其，辰縮物、或是令含有乳 酵物時，除了本發酸^種之时_得之發 亦可包含游離胺基酸，再者於的二胜肽XaaPr〇h以外 ;上述胜肽以及游離胺基酸 320069 10 200902045 -之外，亦可包含市面販售之獸乳酪 =有的脂質、灰份、碳水化合心 部去卜除亦可因應需要而將此等中適當之成分的—部分或全 得到ί發:月之有效成分^ ΡΓ〇 Pr〇，係亦可為源自使用可 ，Pro(尤其是Val p……。㈣之酵 u令被乳酪蛋白水解的方法或令獸乳酪蛋白葬由 2囷發酵的方法而獲得之獸乳路蛋白水解物或其濃^物 …就獸乳路蛋白而言，可舉出例如牛乳、馬乳、 平乳等，路蛋白，尤其可適合使用牛乳路蛋白。 令獸乳酪蛋白水解或發酵時之路 :…但為了有效率地生產獸乳路蛋白蛋分2 重量0/〇為佳。 Η:述=群而言，可適宜舉出例如包含可切斷^ h序狀縣末端之Pn)Xaa殘 酵素群（X)。 级姆之 型蛋=群=以包含活性中心具有絲胺酸之絲胺酸 :蛋白H舌性中心具有金屬之金屬蛋白酶為佳。就金 屬蛋白酶而言’可舉出中性蛋白酶I、中性蛋白酶„、以 及白胺酸胺基胜肽料，從可令期望之 且=間内並更進一步以i階段反應獲得之二 -序列之胜肽酶而；，外^ M寺電點頦不為酸性區之酵素為 320069 11 200902045 - 佳。 狀麴酵素群或酵素群（X)而言，可舉出例如米粉 祕囷（ASperglllus oryzae)等源自麴菌的酵素群。如此 酵素I:::可舉出以適當的培養基培養菌體並將生產之 二水卒取而传的酵素群等，尤其是宜舉出源自米粉狀 麴囷之酵素群t之等電點顯示為酸性區的酵素群。 就源自米粉狀麴菌之酵素群而言，可利用市面販 商品，例如可舉出Sumizyme Fp、Lp、或脚（以上了八 新日本化學（股）製）；u_izyme(登錄商標且 nzyme(^)t ) , sternzyme B11024，PR〇HiDR〇xy η·(以上，商品名’樋口商會股份有限公司製）； nentase 0NS(登錄商標’阪急 bi〇i_stry(股' AP (登錄商標，長瀨生化學公司製）f ^以 ys_izymeFP (登錄商標，新曰本化學（股）製）為 在使肢等市面販售之酵素群時，通常設定為最 ^，但可因應所使用的酵素群而以可獲得上述路蛋白水解 =方式來適當變更條件(例如使用酵素量和反應時間等） 而進行。 y 在水解上述獸㈣蛋白時之酵素群的添 於溶解有獸乳酪蛋白之水溶液中 』如 為重量比在謂⑼以上，宜成=酵素群/獸乳酷蛋白成 成為在圆至㈣，更宜成^在1/1000至1/10,尤宜 量。 旯且成為在1M0至1/10之比例的 320069 12 200902045 反應i卞件係可因應所使用之酵素〜 之酪蛋白水解物的方式來適當選擇 ％獲侍目的 6〇t，宜為45至价 、擇，但溫度通常為25至 且马45至55c ;阳為3至ι〇 為5至8。此外，酵素反 ：為二，尤宜 7至15小時。 Μ為2至4Μ、時，宜為 酵素反應的結束，係可|^切 通常可在60至li(TC令酵辛 ”去，舌性來進行， 酵辛及則… 而使反應停止。 酵素反應V止後，較佳為因庫 心分離或各種過濾 '器處理來去除：而要而將沈殿物藉由離 此外，因應需要，可從所獲得 或臭味的胜肽。此等苦味成分或臭味成分之去二1苦味 =活性碳或疏水性樹脂等進行， ：:、：： Γ:，相對於已使用之-蛋白量添加活性碳 °/0，並反應1至1〇小時而每浐〇 厌上主20重置 係可藉由離心分離或膜處理Υ作等已使兵用^活性碳的去除， 以如此方式所得之包含口的方法進行。 ®暑犬扎路蛋白7欠經私j 物的反應液，可直接添加至 物或/、浪縮 处k A 料4液體製品而利用作盔从 犯性食品。此外，為了提高獸乳力 亦可在濃縮上述反應液後，予以乾“製心， 獸乳酷蛋白水解物或其濃縮物所含有之 九、。 的含有比例’係相對於獸乳路蛋白水解m、、r/〇 pr〇 胜肽以及游離胺基酸之合計量；：：縮物中之 Λ】5 S舌旦0/ .., <吊句1重I %以上，宜 ❹令該対tu稍為1重量上 可期待更高的功效。此外，m 里/。以上， 破搞蛋白水解物或其濃縮物 320069 13 200902045 中所δ有之lie Pro Pro或Val Pro Pro的含有比例，係相對 於獸乳酪蛋白水解物或其濃縮物中之胜肽以及游離胺基酸 之合計量’不論是各別單獨為〇3重量％以上，或IlePr〇p= X及Val Pro Pro之合計量為ο」重量％以上，皆可期待更 冋的功效。再者，在Ile Pro Pro以及Val Pro Pro分別含有 〇·3重量％以上時，可期待更高的功效。 _此外，本發明之有效成分XaaProPr〇，係可為源自令 含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之菌發酵户^ 得之發酵物者。 屬於瑞士乳酸桿菌種之菌，係以單獨使用瑞士乳酸桿 菌種於發酵為佳，但在不損及本發明之期望效果的範圍 内’亦可包含其他乳酸菌等。 就屬於玩士乳酸桿菌種之菌而言，以可大量生產Ik 加Pro及/或Val Pr〇 ρΓ〇之蛋白酶生產菌為佳。例如，宜 為根據以 Twining 等人之方法（Twining，S, Anal. Bi〇chem 143 3410 ( 1984))作為基礎之Yamam〇t〇等人之方法 j Yamamoto, N.等人 j.Biochem ( 1993 ) 114,74〇)而測 定之U/OD590的值顯示為4〇〇以上的菌株。 就此等適宜的菌株而言’可舉出例如瑞士乳酸桿菌 M4株（通商產業省工業技術院生命工學工業技術研究 曰本國茨城縣筑波市東1 丁目1们號、郵遞區號305 (現今為’產業技術總合研究所特許生物寄託中心，日本 國茨城縣筑波市I 1 1 &、士 + ,, 不果1_1_1巩波中心中央第ό，郵遞區號 3〇5_8566 )，寄存號碼：FERM ΒΡ-6060,寄存日 1997. 8. 15 ) 320069 14 2009〇2〇45 ’（中華民國87年9月μ 所，寄存號瑪CCRC91〇1曰寄存於食品工業發展研究 •⑽株係依據專利手Γ (以下稱為_株）。此 1⑽佩斯條約登錚上微生物寄存之國際性承認 令含有乳蛋白f二寄二就由碼屬於此瑞菌士株，，得專利。 菌發酵所得之恭缺此 丁十稭由屬於知士乳酸桿菌種之 添加含有屬：：t ;係二藉由在含有乳蛋白質之刪 (Starter)，並 ？酉夂#囷種之菌株的發酵乳菌元 (獲得。、'…擇發酵溫度等發酵條件予以發酵而 此外，亦可將以如此 由凍結乾焊、噴霧絷以式 發酵物的濃縮物等藉 ^贺霧乾耜等而作為粉末使用。 屬於瑞士乳酸捍菌種之菌，係 作為充分高活性之菌元 '預先進订剧培養而 109個左右。 4 °起始菌數係宜為1〇5至 ^令含有乳蛋白質之補藉由屬於瑞士乳❹1心 威發酵所才于囷種之 =所传之發酵物’例如，在利用 專功能性食品時，為了令味 保健用食 上述屬於瑞士乳酸桿菌種之菌：：性良好，亦可於 酵母的菌種並盔特別卩p宁.. 進订fx酵。 心".、特別限疋，例如，適合舉出啤

Csaccharomyces cerevisiae)等酵母菌屬 = 含有比例，係可因應其目的而適當選擇。.、、‘ =有乳蛋，質之原料而言，例如’可舉出牛乳、馬 〒 礼、山羊礼等動物乳；以及豆漿等植兔 此等乳類之加工乳的脫脂乳、 忒，還有為 遇原礼、奶粉、煉乳等，盆 320069 15 200902045 中以牛乳、豆漿、以及此等乳類之加工乳為佳，而以 或牛乳之加工乳為尤佳。 乳之固形物濃度並無特別限定，但例如在使用脫脂乳 的情形下之無脂乳固形物濃度係一般為3至15重量％左 右，就生產性而言以6至i 5重量％為佳。 上述發酵係通$藉由靜置或挽拌發酵，例如可藉由以 發酵溫度為25至45°C、宜為30至45t，發酵時間為3 至72小時、宜為12至36小時，在乳酸酸度變成以 上的時間點停止發酵的方法來進行。 +令含有乳蛋白質之原料藉由屬於瑞士乳酸桿菌種之 國發酵所得之發酵物中所含之XaaPr〇pr〇(宜為Ha。 Μ —的含有比例，係以在該發酵物之凍結 乾無物100g中換算為1〇 g以上為佳，較宜為在1 5mg以 上0 就本發明之 a — *壁肥厚抑制劑的投予量或攝取量而 二母1曰’在人的情形，為含有有效成分―。(宜 lmgl Γ 7及/或Vai Pro Pro)—般為10吨至log(宜為 f g、更宜為lg左右）的 數次投予或攝取。 里力J Κ 1 Η刀 心臟，肥厚抑制劑之投予或攝取期間，可考，投予或 攝取之人或動物的年齡、或老9 必 ^ 蝎危險因子的％境等進行各種 不 上，宜為7日至365日間。 例如-般可為1日以 此外，本發明之心衰竭 ' ^係'將上述之三胜肽作為 320069 16 200902045 '有效成分。 就本發明之心衰竭預防劑之投予量或攝取量而言，每 1曰’在人的情形，為含有有效成分^〜〜(宜為JJe 及/或ν〇ΡΓΟ)一般為1〇吨至呢（宜為_至 g更且為3mg至lg左右）的用量，亦可於1日分數次投 予或攝取。 =衰竭麟狀的錢取㈣，可考慮投予或攝取 t :動物的年齡、或者是相對於該人或動物之心衰竭危 =子的環境等進行各種㈣，例如—般可為1日以上， 宜為7曰至365曰間。 有效成分卜。本發明之心肥大預防劑係將上述之三胜肽作為 或攝防劑的投予量或攝取量、以及投予 次攝取的期間係與本發明之心衰竭預防劑相同。 ，竭：二之、臟壁肥厚抑制劑、心肥大預防劑、以及心 哀竭=的投予或攝取方法，係以經口方式為佳。 本每明之心臟壁肥厚抑制劑、心 心衣竭預防劑作為醫藥 頂防^以及 之製劑的妒能/時的形態’係可為經口投予用 膠囊劑、，微膠囊、散劑、粒劑、罐:]轉囊劑 在製造作為醫筚主 製藥上容許㈣體？’，可因應料的需要，使用 防腐劑、衫劑、結^ j uvant)、賦形劑、補形劑、 膠化劑、保存劑=:、阳調節劑、緩衝劑、增黏劑、 匕劑等，以在一般經承認之製劑投 320069 17 200902045 予所要求之單位用量形態進行製造。 、本發明之t品係含有本發明之心、臟壁肥厚抑制劑作 為有效成分，可作為具有例如心臟壁肥厚抑制作用、心肥 大之預防、以及心衰竭之預防等效能之特定 功能性食品。 哥 為了獲得如此功效之攝取量，食品（例如功能性食 品），若有鑑於日常性、連續性、或斷續性地長 人的情形’就Μ日之有效成分XaaProPr◦的量、或iiepf〇 Pro及/或Val Pr〇 Pr〇的量而言，一般為ι〇叫至1^、宜 ^邮至5g、更宜為3mg至lg左右，因應每i日的攝取 -人數，可能令食^(例如功能性食之每丨次的攝取量較 上述量更低。 在直接使用含有有效成分Xaa Pr〇 Pr〇之獸乳赵蛋白 :解物或其濃縮物時’在人的情形，们天一般以攝取該 水解物或其濃縮物lm“ 1〇〇g，尤以1〇〇邮至吻左右 為Y去。 ，直接使用含有有效成分Xaa pr。pr。之發酵物的康 :旦^物時’在人的情形’將該發酵物之;東結乾燥物就乾 木里而s ’每1天-般以攝取1至H)0g，尤以2至50g左 右為佳。 本發明之食品（例如功能性食品）之攝取期間係無特別 :疋’雖然以長期間攝取為佳，但為了獲得上述效能，例 如—般可為1日以上，宜為7日至365日間。 本發明之食品（例如功能性食品）係包含含有本發明之 320069 18 200902045 -有效成分xaaProPro(宜 , Pro Pro) 物，直接、式本θ制上 次3有礼蛋白質原料之發酵 中。此外，因雇 粉末狀或顆粒狀而添加於各種食品 質、脂質、維生素、礦物Γ ⑽糖類、蛋白 種碳水化合物、^ 加味劑（flav°r)、或例如各 ^ *曰貝維生素類、礦物質類、甜味料、香 科、色素、質地（texture)改進劑#、或曰 加物’以改善營養之均衡或風味等,·〜：添 本發明之食品(例如功能性食品)係可為 物、液狀物之任一形能，彳sli 勝狀 乳製口 m & 舉出乳酸菌飲料等發酵 劑Γ: 、乾燥粉末、旋劑、膠囊劑、粒 “’進—步地可為各誠料、優格、 糖％蒸煮袋食品(~〇、錠型糖果、=餅 蜂蜜蛋糕（_ia)、麵包、餅乾（⑽叫、 以下使用實施例更詳細地說明本發明，但 圍不限於實施例。 β的乾 (實施例） [胜肽合成例] 藉由以下所示之有機化學合成法（Fm〇c法） 本發明之有效成分Ile Pro Pro及Val Pr〇 :: 島津製作所製之胜肽自動合成裳置⑽…f = 19 320069 200902045 法進行。 就固相載體而言，使用為2-氯三苯甲基 (2-Chlorotdtyl )型之聚苯乙烯樹脂並結合有以苐基甲氧 羰基（以下簡稱為Fmoc )保護胺基之脯胺酸的樹脂5〇mg (島津製作所社製登錄商標SynProPep Resin )。依照上述 胺基酸序列’令以Fmoc基保護胺基之Fmoc_Ile、 Fmoc-Pro、以及Fmoc-Val各l〇〇pmo卜按照通常方法，依 照胜肽序列依序反應而獲得胜肽結合樹脂。 接著將此胜肽結合樹脂懸濁於1 ml之反應液A ( 1 〇容 量％乙酸、10容量％三氟乙醇、8〇容量％二氯甲烷），於 室溫反應30至60分鐘並將胜肽從樹脂切離後，以玻璃過 濾态過濾反應液A。減壓去除濾液的溶劑後，立刻添加} 的反應液B ( 82.5容量％三氟乙酸、3容量％乙基甲基硫化 物（ethyl methyl sulfide)、5容量％純水、5容量％苯基曱基 硫趟（thioanisole)、2.5容量％乙二硫醇、2容量％硫酚）， 於室溫反應6小時並去除側鏈保護基。於其中加入無水乙 峻10ml令胜肽沉殿，以3〇〇〇迴轉離心5分鐘進行分離。 以無水乙醚洗淨沉澱物數次後，噴吹氮氣而乾燥。將如此 獲知之未精製之合成胜肽，全部溶解於0.1N鹽酸水溶液 2ml後，以使用C18之逆層管柱的HPLC，依照以下條件 精製。 ” 泵.型號L6200智能泵（inteiHgent pUmp，日立製作 所）；檢測機：以型號L4000UV檢測器（曰立製作所）檢 測出215nm之紫外線吸收；管柱：#B〇ndasphere^ci8 320069 20 200902045 -(Waters公司製）；溶出液：a液為0.1重量％TFA水溶 液、B液為含有0.1重量％丁卩八之乙腈；（B/A+ Β )χ100% : 0—40% (60分鐘）；流速：imi/分鐘。分次取出顯示最大 吸收之溶出部分’藉由將其乾燥凍結而分別獲得5 7nig、 6.5mg的目的之合成胜肽pr〇 Pr〇及val pro pro。藉由 全自動蛋白質一級結構分析裝置（型號pPSQ_1()，島津製作 所製）’從胜肽的N末端開始分析該精製胜肽，進一步地 广以胺基酸分析裝置（型號800系列，日本分光公司製）分 a 析’可確認到結果係如設計.。 [獸乳酪蛋白水解物之調製例] 將源自牛乳之酪蛋白（日本NZMp公司製）lg加入至 經調整為約sot:之蒸餾水99g中並充分地攪拌後，添加in 氯氧化鋼（和光純藥公司製）溶液成為PH7.0,此外將溫 度調整為20°C，來調製基質溶液β.. 在所得之基質溶液中，以酵素墙蛋白之重量比成為 、的方式添加源自米粉狀麴菌之至少包含金屬蛋白酶、 蛋白酶中性蛋白酶j、中性蛋白酶π、以及 酉夂胺基胜肽酶的市售酵 ^ L ° 醇京（登錄商標「Siimizyme FP ,， 新曰本化學工業公司|y)， 以110丫、隹—“衣）於50 C反應14小時。接著， 冬m:丁分鐘的高崖爸處理，使酵素失去活性，獲 于-蛋白酵素分解物溶液。接著，使 液藉由噴錢燥器乾燥，調製成粉末。传料"解物溶 達(二成分之分析，質係以凱耳 ;去挪疋，胺基酸係以胺基酸分析裝置測定。 320069 21 200902045 •=外’將自該蛋白質量減去胺基酸的量作為胜肽量。再者， /刀別以酸分解法測定脂f、以直接灰化 以常愿加熱乾燥法測定水分。另外，將自1〇〇% = ^殘餘量作為碳水化合物量。其結果，__35 = :二胜：：Γ.7重量。，° ’水分為6.6重量％，月旨質為。·2 里0 Λ刀為4·1重量〇/〇 ,碳水化合物為7·6重量％。 <胜肽構成胺基酸之測定> 、使上述㈣的粉末溶解於適量的蒸餾水，使用自動胜 ，析機β品名PPSQ_1〇(股）島津製作所製）進行解 析’调查在粉末中之自N末端側依序有何種胺基酸。另外， 自動胜肽分析機不會檢測出游離胺基酸。 此外’第5殘基之胺基酸的合計為mpmo卜第 基之胺基酸的合料，福。依據此等結果，判明在上 ，私末中所含有之胜肽幾乎皆為二胜肽或三胜肽。此外， =2，基之胺基酸為pr〇之胜肽的比率係而為明顯 1二:者’第3殘基之胺基酸為ΡΓ。之胜肽的比率也 上这私末中大罝含有XaaPr〇Pr〇，可推 胜肽係對於生體內夕1t 详巧此寺 體内之蛋白酶所致的酵素分解作用為抵 咼的胜肽。 -u u 〈酵素分解物中所含有之胜肽的測定〉 對於上述酵素分解物之粉末，使用各種化學合 胜肽’依照通常方法，求得該粉末所含有之顯示於表^ 二胜肽量。將結果顯示於表1。 320069 22 200902045 [表i] 胜肽序列 粉末1 Omg/ml中之 三胜肽量g/ml) Ser Pro Pro 2.9 Val Pro Pro 29.5 lie Pro Pro 28.1 Phe Pro Pro 27.2 其他 Xaa Pro Pro 一1 __ 28.8 此外’在以蒸德水稀釋溶解有上述粉末之溶液中的胜 肽以及游離胺基酸量為8 l5mg/ml，胜肽量為4·57 mg/m卜 該胜肽中之XaaPro量為514 5|Ig，因此，相對於粉末中之 胜肽以及游離胺基酸的合計量，Xaa Pr〇的比率為6·3重量 %，再者，由於該胜肽中的XaaPr〇Pr〇量為116·5叫，故 相對於粉末中之胜肽以及游離胺基酸的合計量，ρ⑺ Pro的比率確認為1.4重量％。 [CM4發酵乳飼料之調製例]

使用藉由CM4株使含有乳蛋白質的原料發酵所得 發酵乳’調製含有本發明之右辞士、八v 料。 ㈣月之有效成分XaaPn>Pn>之動物飼 用r、、、鶴水以成為固形率9%(w/w)的 售之脫脂奶粉，以高壓㈣行i 解市面 殺菌後，冷卻至室溫，接種3〇/…刀1里的兩溫加 饮 j /〇 ( V/w )之 _ 液（菌數5xl08個/ml)，以3 士 4株菌兀發 其發酵㈣得CM4發酵乳。 、切在靜置狀態 將所得之CM4發酵乳進行8() 加溫至8〇t後立即降溫之般 4加溫殺菌（亦 奴圏方式）後’藉由凌結乾燥 320069 23 200902045 獲得粉末。將所得之凍結乾燥粉末與市面販售之粉末飼料 (商品名「CE-2」’日本CLEA股份有限公司製）以質量 比1〇: 90混合，製成固形飼料，並作為CM4發酵乳飼料。 在此飼料中，含有源自CM4發酵乳之Val Ργ〇 34.1mg/kg 以及 lie Pro Pro 17.1mg/kg。 [試驗1 : ValPro Pro ( VPP )之左心室壁的肥厚抑制效果] 針對三胜狀ValProPro (VPP)之左心室壁的肥厚抑 制效果進行試驗。 Γ 以9至12隻為-群共計3群的7週齡胸打系雄大 鼠（曰本SLC股份有限公司）進行試驗。在一週的訓化飼 養後’令此等大鼠在8週内自由攝取以lg/L之濃度溶解有 為-氧化氮合成抑制劑之NG•硝基心精胺酸甲醋鹽酸鹽 (L-NAME’ Sigma公司製）的飲用士八

表烟奴用水、分別以lg/L與〇.3g/L 之k度溶解有L-NAME與VPP的飲用水、以及分別Μ 與〇.5mg/L之濃度溶解有L_NAME與為血管緊縮素轉 ‘素（機制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉 普利之投藥量係設定為使1 ΑΓΡ如a丨 等。 便/、ACE抑制活性與VPP成為相 令大鼠於二乙_麻醉下放血 中性缓衝福馬林液固定。以包含―〜、後’以10〇/〇 心室、以及冠狀動脈的方式從缓2中隔（septal)、左 房下部，作成輪狀的組織片。將^的心臟水平地切斷心 片法_她my)進行薄切為30至^埋於石臘後藉由切 鼠製作2至5個切片。將經薄切·5μΠ1之厚度。對各大 刀片進行蘇木紫·伊紅染 320069 24 200902045 色（hematoxylin-eosin staining)，測定左心室壁的厚度。 心室壁厚度的測定’係藉由目鏡測微計（eyepiece micrometer)針對1切片在顯微鏡下被認為具有平均厚度之 複數點的厚度進行實際測量，將其平均厚度作為其切片之 測定值，進行統計處理。厚度之測定以及評價，係由不知 道各樣品名之病理學者進行。 f

將所得結果顯示於第i圖。與僅給予L_NAME的群集 相比，在給予L-NAME與VPP的群集中，左心室壁的厚 度減少’顯示因VPP抑制左心室壁的肥厚，而於心衰竭: 預防為有效。此外，在以使ACE抑制活性成為相等的方式 設定投藥量的伊那拉普利無法確認絲，因此可確認本效 果並非因抑制ACE而造成者。 [試驗2 : Val Pro Pr〇 ( vpp )之右心室壁的肥厚抑制效果] ^為了確認三胜肽ValProPro (VPP)之右心.室壁的肥 厚抑制效果，與試驗〗相同地進行試驗、測定以及評價。 將所得結果顯示於第2圖。與僅給予L_NAME的群集 相比，在給予L_NAME肖vpp的群集中，右心室壁的厚 度減少。因此，’顯*因vpp抑制右心、室壁的肥厚，而於I S的預防為有效。由於與試驗丨同樣地在伊那拉普利益 者。認效果’因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成、 [試驗3:IW(IPP)之左心室壁的肥厚抑制效果】 于一胜肽lie Pro Pro (IPP)之左心室壁 果進行試驗。 至土的肥厚抑制效 320069 25 200902045 ” Γ:=隻為一群共計3群的7週齡―系雄大 ㈣有限公司）進行試驗。在一週㈣_ LWlJeCS·叭在8週内自由攝取以1g/L之濃度溶解有 之公司製)的飲用水、分別尋與〇¥ =度：有L-NAME與Ipp的飲用水、以及分別 ===度溶解有_她與為血管緊縮素轉換酵 。二t劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊那拉 =之投樂量係設定為使其ACE抑制活性與IPP成為相 寺0 Μ 2鼠於二乙鍵麻醉下放血死亡，取出心臟後，以10% 衝福馬林液固定。以包含右心室、中隔、左心室、 :及=動脈的方式從經固㈣心臟水平地切斷心房下 逸杆笼心,Λ 織包埋於石臘後藉由切片法 丁厚刀為上0至3.5_之厚度。對各大鼠製作2至5個 ^的Π㈣切之切片進行蘇木紫•伊紅染色，測定左心室 心室壁厚度的測定，係藉由目鏡測微計針對） 微鏡下被認為具有平均厚度之複數點的厚度進行 測=將其平均厚度作為其切片之測定值，進行統計 ^進^定以及評價，係由不知道各樣品名之病理 將^寻結果顯示於第3圖。與僅給予的群隼 、、比’在給予L-NAME與IPP的群集中，左心 減少，顯示因Ipp抑制左 土子又 防為；^ ^ / 而於*衰竭的預 為有效。此外，在錢ACE抑㈣性錢㈣的方式設 320069 200902045 疋投樂量的伊那拉普利無法確認效&，因此匕可確認本效果 並非因抑制ace而造成者。 [試驗 4 · lie Pro pro f TPP、《V 丄 、 （）之右心至壁的肥厚抑制效果] 為了確認三胜肽lie Pro Pr〇 ( Ipp )之右心室壁的肥厚 抑制效果，與試驗3相㈣騎試驗、敎以及評價。

以9至12隻為-群共計3群的7週齡^如系雄大 =曰本SLC股份有限公司）進行試驗。在一週的訓化飼 ^ ’令此等大鼠在8週内自由攝取以收之濃度溶解有 NAME(叫聊公司製）的飲用水、分別以lg/L盘〇 3g/L ^度溶解有L-NAME與Ipp的飲用水、以及分別以！扒 :.5離之濃度溶解有L_NAME與為血f緊縮素轉換酵 素（ACE 抑制劑之伊那拉普利的飲用水。在此，伊 普利之投藥量係設定為使1 AC：E # 等。 巧UCE抑制活性與Ipp成為相 中性鼠厂醉下放血死亡’取出心臟後，以⑽ 中!·生㈣福馬林液固定。以包含右心室m 以及冠狀動脈的方式從經固定 至 部，作成輪狀的組織片。；水平地切斷心房下 進行薄切為於石月鼠後藉由切片法 仃4切為3.〇至3.5μιη之厚度。對各大 切月。將經薄切之切片進行蘇木、 的 壁的厚度壁厚度的敎，測定右心室 切片在顯微鏡下被認為具有平均測微計針對1 貫際測罝，將其平均厚度作為其 I又進仃 體之心室壁之厚度。厚度之測定以二:由Sr 320069 27 200902045 樣品名之病理學者進行。 心室壁之肥厚的判定，係測定不添加L-NAME而以一 般自來水飼養之同週齡大鼠6隻之心室壁的厚度，將其平 均作為基準值。令心室壁厚度較基準值大者為肥厚，相等 或未達基準值者為正常，並從肥厚與正常之大鼠的數量進 行依據概度比檢定（likelihood ratio test)之比較。將其結 果顯示於以下之表2。 [表2]大鼠右心室壁之肥厚的判定結果 投藥群 肥厚 正常 L-NAME 5隻 6隻 L-NAME以及 IPP(**) 〇隻 9隻 L-NAME以及 伊那拉普利 1隻 8隻 ** ： p < 0.01 從所得之結果判明，IPP亦能抑制右心室壁之肥厚， 而IPP於心衰竭的預防亦為有效。此外，在以使ACE抑制 ^ 活性成為相等的方式設定投藥量的伊那拉普利無法確認效 果，因此可確認本效果並非因抑制ACE而造成者。 [試驗5 : lie Pro Pro ( IPP )之心臟中隔壁的肥厚抑制效果] 為了確認三胜肽lie Pro Pro (IPP )之心臟中隔壁的肥 厚抑制效果，與試驗3相同地進行試驗、測定以及評價。 將所得結果顯示於第4圖。與僅給予L-NAME的群集 相比，在給予L-NAME與IPP的群集中，心臟中隔壁的厚 度減少，顯示因IPP抑制心臟中隔壁的肥厚，而於心衰竭 的預防為有效。此外，在以使ACE抑制活性成為相等的方 28 320069 200902045 藥量的伊那拉普利無法確認效杲，因此可嫁認本 效果並非因抑制ACE而造成者。 ，發明之心臟壁肥厚抑制劑，即使在無法確認血管緊 =轉換酵素（A㈤抑制劑之抑制作用的情形下亦顯示 有效性’因此可作為非因ACE抑制活性所引起之心肥大或 =哀竭的肋収/或治療用藥，尤其是料預防劑係極為 一用。此外，由於有效成分係源自於食品等之天然存在之 三胜版’故可期待能提供副作用的顧慮小且具有高效力之 藥物。 此外，提供一種功能性食品，其係藉由將本發明之心 臟壁肥厚抑制劑使用或添加於飲料或食品中，而可安全且 日常性地持續攝取，並可期待預防心、肥大以及心衰竭之效 果。 (參考文獻） 1. 曰本國特許第2782142號公報 2. Am J Hypertens· 1997 Aug;l〇⑻:913 至 20 3. J. Clin. Invest, 77, 1993-2000, 1986 4. 敢新醫學，48:1404 至 1409, 1993 5. J. Dairy Sci. 1995, 78:777-78 6. J. Dairy Sci. 1995, 78:1253-1257 7· Am, J. Clin. Nutr. 1996, 64:767-771 【圖式簡單說明】 第1圖係顯示對試驗1之Val pro Pro ( VPP )之大鼠 左^至壁的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以l_name投 29 320069 200902045 藥群為一群11隻、以l-ναμε以及伊那拉普利投藥群為 一系^ 9 隹、IV τ 、 又 乂 L-NAME以及VPP投藥群為一群12隻進行 =驗，圖表以平均值土標準誤差的方式表示。藉由單侧t_ 檢定=進行比較。圖中的記號（*)係表示顯著差（p<0.05)。 弟2圖係頌示對試驗2之Val Pro Pro ( VPP )之大氧 右至土的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以l-NAME验 藥 為—1 ’、’’’矸U隻、以L-ΝΑΜΕ以及伊那拉普利投藥群為 _ 又、以L_NAME以及VPP投藥群為一群丨2隻進行 圖表以平均值±標準誤差的方式表示。藉由單侧t_ 祆疋：進行比較。圖中的記號(”係表示顯著差(p < 0.05 )。 第3圖係顯示對試驗3之Ile pr〇 pr〇 ( jpp )之大鼠左 的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L_NAME投藥 9隹、、群9隻、以L_NAME以及伊那拉普利投藥群為一群 ς、、以L-NAME以及vpp投藥群為一群i i隻進行試驗， 扞二平均值士標準誤差的方式表示。藉由單側t-檢定而進 ^圖中的記號（# )係表示顯著差（p < 〇. 1 )。 臟中=圖係顯示對試驗5之IlePK)Pr°(IPP)之大鼠心 藥群^的肥厚抑制效果進行試驗的結果。以L_NAME投 群9 :-群9隻、以L_NAME以及伊那拉普利投藥群為一 驗又、以L-NAME以及VPP投藥群為一群u隻進行試 而進行二平均值士標準誤差的方式表示。藉由單側卜檢定 【主i 乂。圖中的記號（* )係表示顯著差（P < 0.05 )。 要疋件符號說明】 無。 320069 30

Claims (1)

1. 200902045 十、申請專利範圍： 1. 一種心臟壁肥厚抑制劑，係包含XaaPr〇p 占厶。 1卜馬有效 2·如申請專利範圍第1項之 肥与抑制劑，其中 3. 4. 5. 6. ^ ·* I ip'J ， Xaa Pr〇 Pro 係為 Val Pro Pro 及/或 lie Pr〇 Pr〇。 劑申：m第1項或第2項之心臟壁肥厚抑制 ::中—Wro係源自獸乳酿蛋白“ 物或其濃縮物者。 ；八解 ，申請專利範圍第3項之心、臟壁肥厚抑制劑， 被乳路蛋白水解物係令獸乳路蛋赌， 之發酵物。 日田麴囷發酵而得 如申請專利範圍第3項之心臟壁肥厚抑制劑 被乳酪蛋白水解物係令獸乳酪蛋 二， 素分解而得之請物。 自麴國之酵 二請士利範圍第5項之心臟壁肥厚抑制劑 “、麴菌之酵素係為源自米粉狀麴菌之酵素^ 如申請專利範圍第丨料第2項之辟。 =其中，^巧。〜。係源自令含有乳蛋: :專利竭7項之心臟壁肥厚 屬於^士乳酸桿菌種之菌係為瑞 厂中， (CCRC910111)。 孔馱才干囷cM4株 :種心肥大預防劑，係包含申 中任—項之心臟壁肥厚抑制劑作為有：成園:。1至8項 320069 31 9. 200902045 10· —種心哀竭預防劑，係包合 G 3申凊專利範圍第 中任一項之心臟壁肥厚永 至8項 子抑制劑作為有效成分。 U. 一種功能性食品’係、包含申請專利範圍第1至8項中 任一項之心臟壁肥厚抑制劑。 12.如申请專利範圍第丨丨項之功能性食品，係顯示用以預 防心衰竭的功能。

   32 320069 200902045 <110> <120> <130〉 <150> <15ί> <160〉 <170> >>>> 012 3 1— 1— 11 1» 2222 <220〉 <223〉 序列表 可爾必思股份有限公司 心衰竭之預防劑 ΟΡ08031-1 JP2007-81638 2007-03-27 1 Patent In version 3.3 1 4 PRT Artificial 胜肽之辨認序列 <220〉 <221> rnisc.feature <222〉 （1)..(1) ^ y <223> Xaa可為任意天然胺基酸 <220〉 <221> miscofeature <222〉 (4) (4) <223> Xaa可為任意天然胺基酸 <400〉 1 Xaa Pro Pro Xaa l 320069序列表