TW200816990A - Identification and characterization of HCV replicon variants with reduced susceptibility to HCV-796, and methods related thereto - Google Patents

Identification and characterization of HCV replicon variants with reduced susceptibility to HCV-796, and methods related thereto Download PDF

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Anita Y M Howe
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Description

200816990 九、發明說明： 【智^明月^屬挂:糊 此申請案主張2006年8月25日提申之美國臨時專利申 請案案號60/840,353的優先權，其之内容係藉此以其之全體 5 被併入至本文中做為參考資料。 發明領域 本發明係關於一種抗治療的c型肝炎病毒感染以及C 型肝炎病毒RNA依賴型RNA聚合酶NS5B(RdRp)的抑制 劑’特別地是NS5B的苯〜并吱喃抑制劑，更特別地5_環丙基 10 -2-(4-氟苯基)-6-[(2-經乙基)（甲磺醯）胺基]-N-甲基-1-苯并 呋喃 _3_ 甲醯胺（5_cydopropyl-2-(4-fliioroplienyl)-6-[(2-hydroxyethyl)(methylsulfonyl)amino]-N-methyl-1 -benzof uran-3-carboxamide) (HCV-796)。 15 發明背景 C型肝炎是一種能導致慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭，以 及肝細胞癌之常見的病毒感染。感染C型肝炎病毒(HCV)於 至少85%的病例中導致慢性肝炎，是肝移植的主要原因， 以及是美國每年至少1〇,〇〇〇件死亡的原因（(1997) 20 Hepatology 26:2S-10S)。 C型肝炎病毒是黃病毒科家族的一員，以及HCV的基 因組是一種正股的單股直線形RNA(Purcell (1997) 26:11S-14S)。HCV顯示基因的異質性；至少6 5 200816990 種基因型和多於50種亞型已經被鑑定出（w〇ng和Lee (2006) Canadian Med. Assoc. J, 174:649-59) 〇 沒有任何現在可得的疫苗來預防HCV感染。用於HCv 感染的當前的療法包括以干擾素-a(INF-a)的單一療法治 5 療，或是由INF-ot與核苷類似物雷巴威林(ribavirin)—起構 成的一種組合的療法(Bartenschlager (1997) CT^m. 8:281-301)。然而，即使使用組合治療，許多的病 人無法發展出一種持續的病毒反應(Wong和Lee，在前）。一 釋治療反應係取決於，尤其，病毒的基因型，例如，HCV 10 基因型lb對於IFN的療法比基因型2和3(zU)是更抵抗的。 HCV的基因組含有一些非結構蛋白：NS2、NS3、 NS4A、NS4B、NS5A，和 NS5B(Bartenschlager和 Lohmann (2000)/· (7肌 Fz>o/· 81:1631-48)。NS5B(RdRp)是一種對於 病毒的複製是必要的之RNA依賴型RNA聚合酶。以前，一 15 種關於NS5B之校讀性質尚未被鑑定。校讀機轉的缺乏以 及強健的病毒生產（每天〜lxl〇12病毒粒子）導致HCV内之 ΗΓ4至10_5突變/核苷酸的高突變比率(Patel和Preston (1994) 尸roc. jcad 5W. m 91:549-53; Preston等人（1988) ⑼ce 242:1168-71)。結果，類物種病毒變異體已經於HCV 20 感染的病人體内被發現（Cabot等人（2000) /· P7ro/. 74:805-11; Davis (1999) dm. /· Med. 107:21S-26S; Farci和 Purcell (2000) Sem· 20:103-26) o NS5B RdRp是HCV複製的一種主要的催化酶，其代表 抗HCV療法一種可實行的標的(Walker和Hong (2002) Cwrr· 6 200816990 P/mm· 2:534-40)。最近的研究努力已經導致特異地 把NS5B作為目標的抑制劑的發現，以及把其他的HCV病毒 蛋白作為目標之療法（Carroll等人（2003) /·所〇/· CAem. 278:11979-84; Dhanak 等人（2002) «/. Biol. Chem· 5 277:38322-27; Howe等人(2004)如dge尬 CTzemo· 48:4813-21; Love等人(2003) J· Fz>〇/. 77:7575-81; Shim等人 (2003) 及烈· 58:243-51; Summa等人（2004) J· MM. C7^m. 47:14-17; Olsen 等人（2004) 处⑼以 C/ze·. 48:3944-53; Nguyen 等人（2003) 10 处己論 CAe歸· 47:3525-30; Ludmerer 等人（2005)
Antimicrobial Agents Chemo· 49:2059-69; Mo 等人(2005) Antimicrobial Agents Chemo. 49: 4305-14； Lu 等人（2004) Antimicrobial Agents Chemo. 48:2260-66; Ji ^ ^ |f 案案號· 60/735，190和60/735，191 (2者揭示苯并吱喃衍生 !5物），美國專利案案说6,964,979(揭不σ底喃巧丨I?朵(pyr抓〇ind〇ie) 衍生物），美國專利公開案案说· 2006/0063821 (揭示爾σ坐 (arbazole)和環戊吲哚衍生物），2004/0162318(揭示苯并吱喃 衍生物）’以及2004/0082643(揭示®底喃叫卜采衍生物）。 【發明内容3 20 發明概要 在迄今報導的NS5B聚合酶抑制劑之中，苯并吱喃化合 物HCV-796代表於活體外和活體内為最有效力和選擇性的 抗病毒劑的其中一種。然而，由於發生在HCV複製的期間 之南的錯誤率，累積於NS5B的犬變有時導致對於聚 7 200816990 合酶抑制劑之減低的敏感性。此等突變能導致抗治療的c 型肝炎病毒感染的出現。事實上，在化療的期間，現在病 , 毒複製之高的比率以及高的突變的頻率導致抗藥性病毒粒 子的快速產生。於人類免疫不全病毒(HIV)和B型肝炎病毒 5 (HBV)的例子中，很多的突變已經於以蛋白酶抑制劑，以及 - 核普和非核苷反轉錄酶抑制劑予以處理的病人體内鑑定 • 到。抗性病毒的出現係被預期為發展對抗HCV感染之有效 的抗病毒療法中最大的挑戰之一。因此，對於鑑定位於 ® NS5B聚合酶之内導致抗治療的C型肝炎病毒感染的突變位 10 址有一需要。一旦被鑑定，此等位址將作用為監測一種用 於發展對於NS5B聚合酶抑制劑（例如，苯并呋喃，如 . HCV-796)之一種增加的抵抗性之抗c型肝炎療法的過程之 標誌，鐘定對一種抗C型肝炎病毒療法具有一種減低的反應 μ 可能性之個體的標誌，以及以監測且預後一種C型肝炎病毒 15 感染的標誌。此資訊對於最佳化第二代c型肝炎病毒抑制劑 或是HCV抑制劑組合，其等對於由此等位址的突變所造成 的抗性展現出顯著降低的、最小的，或是沒有敏感性，是 * 額外地有用的。 本發明提供減低一種抗治療的c型肝炎病毒感染之出 20 現的頻率，降低一種抗治療的C型肝炎病毒感染之抗性的位 準，以及延遲一種抗治療的C型肝炎病毒感染的出現的方 法，其係藉由投藥，不是以組合式就是以連續式的，C型肝 炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的一種抑制劑，例如，一種 苯并吱喃，如5-環丙基-2_(4-氟苯基)-6-[(2_輕乙基)（甲石黃醯) 8 200816990
胺基]_N•甲基小苯并呋喃-3-甲醯胺(HCV-796)，以及至少一 種額外的抗C型肝炎劑，例如，一種雷巴威林的產物或一種 免疫調節劑，如一種干擾素產物，至一個主體體内。此外， 本發明係關於監測一種C型肝炎病毒感染的治療之進程的 5方法，監測且預後一種C型肝炎病毒感染的方法，以及鑑定 對一種抗C型肝炎病毒療法具有一種減低的反應可能性之 個體的方法。本發明亦提供最佳化第二代抗C型肝炎劑之 有用的資也和有關的方法，例如，最佳化於一個主體體内 之用於治療，例如，一種抗苯并呋喃治療的C型肝炎病毒感 0 “之第二代抗C型肝炎劑的鐘定和化學合成。 15 因此，於至少一個實施例中，本發明提供一種減低一 種抗治療的c型肝炎病毒感染出現的頻率之方法，其包含投 樂—種c型肝炎病毒的—種苯并吱喃抑制劑與至少一種額 外的抗C型肝炎病毒劑的組合至—個需要其之主體體内。於 至少-個其他的實施财’本發明提供—種延遲一種抗治 療的C型肝炎病毒感染的出現的方法，其包含投藥一種㈣ 肝炎病毒的-種笨并吱喃抑制劑與至卜種額外的抗㈣ 肝炎病毒劑的組合至一個需要其之主體體内。於至少一個 其他的實施例中’本發明提供—種降低—種抗治療的c型肝 ^毒感染之抗性位準的方法，其包含投藥—種c型肝炎病 :的—種苯并咬喃抑制劑與至少-種額外的抗C型肝炎病 ，的組合至-個需要其之主體體内。於—些實施例中， 至少-種猶眺c型肝炎病毒較—種免疫調節劑及/或 20 200816990 一種雷巴威林的產物。於一些實施例中，一種c型肝炎病毒 的苯并呋喃抑制劑是HCV-796。 於至少一個實施例中，本發明提供一種減低一種抗 HCV-796的C型肝炎病毒感染的出現的方法，其包含投藥 5 HCV_796與至少一種額外的抗C型肝炎病毒劑的組合至一 個舄要其之主體體内。於至少一個其他的實施例中，本發 明提供一種減低一種抗HC V-7 96的C型肝炎病毒感染的出 現的方法，其包含，不是在至少一種額外的抗C型肝炎病毒 劑的投藥之前就是在之後，投藥HCV-796至一個需要其之 10 主體體内。於一些實施例中，至少一種額外的抗C型肝炎病 毒劑是一種免疫調節劑及/或一種雷巴威林的產物。 於至少一個實施例中，本發明提供一種鑑定對一種抗C 型肝炎病毒療法具有一種減低的反應可能性之一個體的方 法，其包含：決定在一第一個時間點之來自該個體的一種 15 樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796 結合袋之胺基酸序列或結構；以及決定在一第二個時間點 之來自該個體的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構，其中在 該第二個時間點之來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依 20 賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或 結構的一種變化，與在該第一個時間點之來自該個體的C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之 胺基酸序列或結構相比，係指示該個體會對一種抗C型肝炎 病毒療法予以反應之一種減低的可能性。 10 200816990 於至少一個實施例中，本發明提供一種鑑定對一種抗c 型肝炎病毒療法具有一種減低的反應可能性之一個體的方 法的方法鑑定，其包含··決定來自該個體的一種樣本中之C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之 5 胺基酸序列或結構；以及比較來自該個體的樣本中之C型肝 炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基 酸序列或結構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結 構，其中來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA 10 聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構的一 種變化，與該參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比，係指示 該個體會對一種抗C型肝炎病毒療法予以反應之一種減低 的可能性。 15 於至少一個實施例中’本發明提供一種於一個主體體 内之用於監測、診斷，或預後一種抗治療的c型肝炎病毒感 染的方法，其包含:決定來自該主體的一種樣本中之C型肝 炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的一種苯并咳喃結合袋的 胺基酸序列或結構；投樂一^重苯弁咬喃化合物至該主體； 20 以及決定在該苯并呋喃的投藥至該主體之後的來自該主體 的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的一 種苯并咬喃結合袋的胺基酸序列或結構，其中在該苯并咬 喃的投藥至該主體之後的來自該主體的一種樣本中之〇型 肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該笨并吱喃結合袋的 11 200816990 胺基酸序列或結構的一種變化，與在該苯并呋喃的投藥之 鈾的來自該主體的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA 聚合酶NS5B的該苯并呋喃結合袋的胺基酸序列或結構比 較，係提供於該主體體内之C型肝炎病毒感染的治療之效力 5 的一種負指示。 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於監測一個 主體體内之一種C型肝炎病毒感染的治療之進程的方法，其 包含：決定來自該主體的一種樣本中的C型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796之胺基酸序列或結構；投藥 10 HCV-796至該主體；以及決定在HCV-796的投藥至該主體 之後的來自該主體的一種樣本中之C型肝炎rn A依賴型 RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋的胺基酸序列或結 構，其中在HCV-796的投藥之後的來自該主體的一種樣本 中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該JJCV-796結 I5 合袋的fe基酸序列或結構的一種變化，與在HCV-796的投 藥之箣的來自该主體的一種樣本中之C型肝炎rna依賴型 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋的胺基酸序列或結 構比較，係提供於該主體體内之C型肝炎病毒感染的治療之 效力的一種負指示。 20 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於監測一個 主體體内之一種C型肝炎病毒感染的治療之進程的方法，其 包含··決定來自該主體的一種樣本中的〇型肝炎^^八依賴型 RNA?長合酶NS5B的該HCV-796之胺基酸糊或結構；投藥 HCV-796和至少一種額外的抗C型肝炎劑至該主體；以及決 12 200816990 定在HCV-796和至少一種額外的抗c型肝炎劑的投藥至該 主體之後的來自該主體的一種樣本中之c型肝炎11>1八依賴 型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋的胺基酸序列或結 構，其中在HCV-796和至少一種額外的抗c型肝炎劑的投藥 5之後的來自該主體的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋的胺基酸序列或結 構的一種變化，與在HCV-796和至少一種額外的抗c型肝炎 劑的投藥之gil的來自該主體的一種樣本中之C型肝炎rnA 依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋的胺基酸序 10 列或結構比較，係提供於該主體體内之C型肝炎病毒感染的 治療之效力的一種負指示。於一些實施例中，該至少一種 額外的抗C型肝炎病毒劑是一種免疫調節劑及/或一種雷巴 威林的產物。 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於預後一個 15 主體體内之一種抗治療的C型肝炎病毒感染的發展之方 法，其包含：在一第一個時間點決定來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結 合袋之胺基酸序列或結構；以及在一第二個時間點決定來 自該個體的一種、樣本中之C型肝炎RN A依賴型RN A聚合酶 20 NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構，其中在該第 二個時間點之來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構 的一種變化，與在該第一個時間點之來自該個體的C型肝炎 RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸 13 200816990 序列或結構相比’係指示該個體會發展一種抗治療的c型肝 炎病毒感染的增加的可能性。 w 於至少個貝施例中’本發明提供一種用於預後一個 主體體内之一種抗治療的C型肝炎病毒感染的發展之方 5法’其包含·決定來自邊個體的一種樣本中之c型肝炎RNA ‘ 依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列 • 或結構，以及比較來自该個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結 • 構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型rNA聚合酶 10 NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構，其中來自該 個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的 β HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構的一種變化，與該參 考樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比，係指示該個體 15 會發展一種抗治療的C型肝炎病毒感染的增加的可能性。 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於監測一個 ® ’ 主體體内之一種C型肝炎病毒感染的方法，其包含：決定在 • 一第一個時間點之來自該個體的一種樣本中之c型肝炎 RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸 20 序列或結構；以及決定在一第二個時間點之來自該個體的 一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構，其中在該第二個時 間點之來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型rnA聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構的一種 14 200816990 變化，與在該第一個時間點之來自該個體的c型肝炎^^八 依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構相比’係提供該C型肝炎病毒感染已經於嚴重性上改 變的一種指示。 5 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於監測一個 主體體内之一種C型肝炎病毒感染的方法，其包含：決定來 自該個體的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構；以及比較來 自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B 10的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構與一種參考樣本中 之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋 之胺基酸序列或結構，其中來自該個體的樣本中之C型肝炎 RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸 序列或結構的一種變化，與該參考樣本中之C型肝炎RNA 15 依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構相比，係提供該C型肝炎病毒感染已經於嚴重性上改 變的一種指不。 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於診斷一個 主體體内之一種抗治療的C型肝炎病毒感染的發展之方 20 法，其包含··決定在一第一個時間點之來自該個體的一種 樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796 結合袋之胺基酸序列或結構；以及決定在一第二個時間點 之來自該個體的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構’其中在 15 200816990 該第二個時間點之來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依 賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或 結構的一種變化，與在該第一個時間點之來自該個體的C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之 5 胺基酸序列或結構相比，係表示一種該主體已經發展或是 將發展一種抗治療的C型肝炎病毒感染之增加的可能性。 於至少一個實施例中，本發明提供一種用於診斷一個 主體體内之一種抗治療的C型肝炎病毒感染的發展之方 法，其包含：決定來自該個體的一種樣本中之C型肝炎RNA 10 依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構；以及比較來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結 構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構，其中來自該 15 個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構的一種變化，與該參 考樣本中之C型肝炎RNa依賴型RNA聚合酶NS5B的 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比，係表示一種該 主體已經發展或是將發展一種抗治療的C型肝炎病毒感染 20 之增加的可能性。 於本發明所提供的至少一些以上的實施例中，該C型肝 炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV_796結合袋包含 該C型肝炎RNA依賴型!^八聚合酶NS5B的大約胺基酸殘基 120至450。於一些實施例中，於該HCV-796結合袋的胺基 16 200816990 酸序列或結構上的變化是一種選自於表2B中提出的那些所 構成的群組之胺基酸改變。於一些另外的實施例中，於該 HCV-796結合袋的胺基酸序列或結構上的變化是發生在胺 基酸殘基314、316、363、365、368、414或是445。於一 5 些另外的實施例中，於該HCV-796結合袋的胺基酸序列或 結構上的變化是一種選自於以下所構成的群組之胺基酸變 化·· L314F，C316F，C316Y，C316S，C316N，I363V, S365A， S365T，S368F，M414I，和M414V。於一些另外的實施例中， 該C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B係衍生自一種選自 10 於以下所構成的群組之C型肝炎病毒基因型··基因型ia、基 因型lb、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5,和基因 型6 〇 圖式簡單說明 第1圖顯示以HCV-796之純系A細胞的多重的處理。純 15 系A細胞係以配於含有2% FCS和0.5% DMSO的DMEM培養 基（沒有G418)中之0.1 μΜ和1 μΜ的HCV-796予以處理。細 胞分裝部分中之HCV RNA和rRNA的量係利用一種定量的 雙重的TAQMA# RT-PCR予以估計。Y轴表示每吨的總細 胞RNA之HCV複本(利用rRNA作為一種定量的標諸)。各數 20 據點表示3個複製品之一平均值。（第1A圖）HCV-796對於 HCV RNA的效力。（第 1B圖）HCV-796對於GAPDH RNA的 效力。 第2圖顯示HCV-796對於藉由HCV 796選擇的變異體細 胞的效力。純系A和796R細胞係以每井7000個細胞予以播 17 200816990 種於一種96井組織培養皿内，以及在缺少G418的情況下、 以漸增濃度的Hey·?%予以處理。來自培養物之HCV RNA 的位準係被表達為％ HCV RNA相關於對照。各點表示的4 個複製品一平均。於含有複製子的細胞内之抑制5〇%的 5 HCVRNA的位準(EC5G)之有效的濃度係被指示。 第3圖顯示HCV-796關聯的胺基酸突變之結晶結構。該 蛋白係以一種理想化的帶狀物予以表示。HCV-796係被描 晝為一種凡得瓦爾表面。（第3A圖）與HCV-796交互作用的 NS5B之結構組份。含有抗性突變的nS5B之結構組份係被 10指出（α-螺旋G，活化位址環，酪胺酸448環，α-螺旋μ，以及 半胱胺酸366(富含絲胺酸)環）。（第3Β圖)於C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋之内的胺基酸，於該 處藉由HCV-796選擇的複製子變異體内之取代係被觀察。 苯并呋喃的甲基-乙醯胺基團係被指出。 15 第4圖顯示介於HCV-796和C型肝炎RN Α依賴型RNA聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋内的胺基酸之間的交互作用， 以及突變C316F與HCV-796如何抵觸。（第4A圖）介於 HCV-796和該HCV-796結合袋内的胺基酸之間的交互作 用。HCV-796係被顯示為一種分子表面。於一種5A球體之 20内的全部的殘基係被顯示為棒狀物。於抗性複製子菌株内 之突變的殘基係以粗鍵顯示。（第4B圖）突變C316F與 HCV-796抵觸。重疊凡得瓦爾表面（箭頭)指出介kHCV-796 和抗性的突變C316F之一種假設的模型之間的衝突。 t實施方式2 18 200816990 較佳實施例之詳細說明 在缺少一種有效的有感染力的HCV之組織培養的情況 下，病毒的抗性可以於HCV複製子系統内予以研究(BHght 等人（2000)如⑼ce 290:1972-74; Lohmamx 等人（2003) 乂 5 η>〇/· 77:3007-19)。一種複製子是一種次基因組ΙΙΝΛ，其含 有複製需要的全部必要的要素和基因，在缺少結構基因的 情況下。HCV複製子亦含有一種編碼一種可選擇藥物的標 誌（新黴素磷酸轉移酶）之外來的基因以允許含有一種功能 性複製子的細胞之G418(新黴素）的選擇。複製子的轉 1〇染進入至人類肝癌細胞（Huh-7)導致一種自主的HCV複 製。本發明提供用於對於HCV_796有較低敏感性的複製子 變異體的選擇和特性化之方法。衍生自該等複製子變異 體、由忒NS5B基因予以編碼的胺基酸之改變的作圖顯示出 多數突變係座落於HCV-796藥物結合袋（一種苯并呋喃結合 15 ‘）之内。此專犬&係被顯示為是於以該等單一的突變予以 分子上设计的重組型複製子和酶内之對KHCV_796有較低 敏感性的原由。此外，該等複製子變異體的藥物敏感性係 於抗病毒劑的-小組中予以評價，包括聚乙稀二醇化干擾 素(pegylated interferonXPeglFN)和雷巴威林(RBV)。對於 20 Peg丽、丽，以及其他的HCV專一性抑制劑的相似的敏 感性係被偵測。 利用C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B(在下文中 NS5B )或是NS5B的一部分（例如，c型肝炎RNA依賴蜇 RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋）的序列及/或結構，本 19 200816990 發明因而提供監測一種c型肝炎病毒感染的治療進程的方 法，診斷一種抗治療的c型肝炎病毒感染之發展的方法，監 測和預後一種C型肝炎病毒感染的方法，以及鏗定對一種抗 C型肝炎病毒療法具有一種減低的反應可能性之一個體的 5 方法。 如本文中使用的，“C型肝炎病毒”，“C型肝炎”， “ncv”，與類似物意指c型肝炎之全部的基因型（例如，c 型肝炎la、lb、2、3，和4)，以及全部的亞型和其等之分 離株（參見’例如，Wong 和Lee (2006) Med 10 J· 174:649-59)。 如本文中使用的，“抗C型肝炎病毒療法，，與類似物意指 HCV感染之任何的治療(例如，一種製劑的投藥）或是治療的 過程。此等療法包括一種製劑單獨地投藥，例如，一種抗c 型肝炎病毒劑的投藥，如一種免疫調節劑(例如，一種干捧 15素產物），或是組合式的製劑投藥，例如，不是並存地就= 以連續式的與-種雷巴威林的產物一起之一種免疫調節劍 的投藥。因而一種單一的或是持續的治療的任一種，其可 以是單獨地一種製劑或與至少一種額外的製劑組合，係$ 包括於抗C型肝炎病毒療法”與類似物的意義之内。' 2〇 如本文中使用的，“抗C型肝炎病毒劑，，與類似物意h 以被利用來治療HCV感染的任何製劑，例如，干擾^曰可 和其他的免疫調節劑，雷巴威林的產物，HCV酶的^制, 抗纖維化劑，等等。此等製劑包括於以下中揭示的那=， 例如，Carroll等人，在前；Dhanak等人，在前， 20 200816990 人，在前；Love等人，在前；Shim等人，在前；Summa等 人，在前；Olsen等人，在前；Nguyen等人，在前；Ludmerer 等人，在前；Mo等人，在前；Lu等人，在前；Leyssen 等人(2000) C/z>2. 7^ν· 13:67-82 ; Oguz等人(2005)
5 ff. J. GaWrc^Wero/· 11:580-83 ;美國臨時專利申請案案號： 60/735，190和60/735,191;美國專利案案號6,964,979;美國 專利公開案案號：2006/0063821，2004/0162318, 2006/0040944, 2006/0035848, 2005/0159345, 2005/0075309, 2005/0059647, 2005/0049204, 2005/0048062, 2005/0031588, 10 2004/0266723, 2004/0209823, 2004/0077587, 2004/0067877, 2004/0028754和2004/0082643 ;以及 PCT公開案案號WO 2001/032153。此等製劑的實例包括VIRAMIDINE® (Valeant Pharmaceuticals)， MERIMEPODIB® (Vertex Pharmaceuticals)，霉紛酸（mycophenolic acid) (Roche)，金 15 鋼銨（amantadine)，ACTILON® (Coley), BILN-2061 (Boehringer Ingelheim)，Sch-6 (Schering)，VX-950 (Vertex Pharmaceuticals)， VALOPICITABINE® (Idenix
Pharmaceuticals); JDK-003 (Akros Pharmaceuticals); HCV-896 (Wyeth/ViroPharma)9 ISIS-14803 (Isis 20 Pharmaceuticals), ENBREL® (Wyeth); IP-501 (Indevus Pharmaceuticals), ID-6556 (Idun Pharmaceuticals), RITUXIMAB® (Genentech)，XLT-6865 (XTL)，ANA-971 (Anadys)， ANA-245 (Anadys)以及 TARVACIN ⑧ (Peregrine)。額外的抗C型肝炎病毒劑包括免疫調節劑，例 21 200816990 如’干擾素(例如，IFN a, β，和γ)以及干擾素產物(例如， ♦乙細一醇化干擾素和白蛋白干擾素），其係包括天然的和 重組型或是經修飾的干擾素2者。干擾素產物的實例包括， 但不限於，ALBUFERON® (Human Genome Sciences), 5 MULTIFERON® (Vimgen)，PEG-ALFACON® (Inter-Mune)， OMEGA INTERFERON® (Biomedicines)，INTRON® A (Schering)，ROFERON® A (Roche)，INFERGEN® (Amgen)， PEG-INTRON⑧（Schering)，PEGASYS® (Roclie)，MEDUSA INTERFERON® (Flamel Technologies)，REBIF® (Ares 10 Serono)， ORAL INTERFERON ALFA ⑧（Amarillo Biosciences)，一致性干擾素（CIFN) (Aladag 等人（2006) 7^灸·丄紿ro/· 17(1):35-39，以及白蛋白·干擾素·阿 戈（a) (Balan等人(2006) dni/Wr. 77?er. 11:35-45) 〇 如本文中使用的，“免疫調節劑”與類似物意指能夠調 15 節於一個主體體内之一種免疫反應或是一種免疫反應的一 部分之任何製劑。實例包括，但不限於，可以調節T-細胞 功能的製劑（例如’胸腺素 alfa-1，ZADAXIN® (Sci-Clone))，提高免疫細胞的IFN活化的製劑（例如，組織 胺二鹽酸鹽，CEPLEME® (Maxim Pharmaceutical))，以及干 20 擾素產物。 額外的抗C型肝炎病毒劑包括抗病毒劑(例如，核苷類 似物），如雷巴威林的產物。如本文中使用的，“雷巴威林 的產物”與類似物意指含有雷巴威林（Ι-β-D-呋喃核糖基 _1H-1，2,4-三唑-3-甲醯胺）的任何製劑。此等雷巴威林的產 22 200816990 物的實例包括：COPEGUS® (Roche); RIBASPHERE⑧ (Three Rivers Pharmaceuticals); VIRAZOLE® (Valeant Pharmaceuticals);以及REBETOL® (Schering) 〇 如本文中使用的，“HCV-796”與類似物意指5-環丙基 5 -2-(4-氣苯基)-6-[(2-經乙基)（甲石黃酿）胺基]-N-甲基-1-苯并
呋喃-3-甲醯胺，其係於以下中被揭示，例如，美國專利申 請案案號1〇/699,336 (換言之，美國公開專利申請案案號： 2004/0162318)以及美國臨時專利申請案案號：60/735,190 和60/735,191，其等之全部内文係藉此以其等之全體被併入 10 至本文中以做為參考資料。 如本文中使用的，“C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B，’，“NS5B”，“RdRp”與類似物意指來自任何C型肝炎 病毒之RNA依賴型RNA聚合酶(換言之，任何HCV基因型或 任何亞型或是其等之分離株）。如本文中使用的，“C型肝炎 15 RNA依賴型RNA聚合酶NS5B基因”與類似物意指一種編碼 一種C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B之核酸。來自各 種各樣的C型肝炎基因型和分離株之多核苷酸和多肽序列 (包括NS5B序列）可以於文獻中發現，例如，HCV基因型lb 分離株包括GenBank 寄存編號：AB049091.1; AB049088.1; 20 AB049101.1; AB049093J; AF165059.1; AF165060.1; AB049099.1; AB049090.1; AB049097.1; AB049098.1; AF165062; AF165061.1; AF165049.1; AB049095.1; AJ238799.1; D50485.1; D50481.1; AB049087.1; AF165050.1; AF165057.1; AF165051.1； AF165058.1; 23 200816990 U45476.1; AF165052.1; AF176573.1; AF139594.2; AB049089.1; AF165055.1; AB049096.1; AF165054.1; D89872.1; AB049100.1; AJ132996.1; AJ238800.1; AF356827.1; AF165056.1; AF165063.1; AF165064.1; AF483269.1; AB049094.1; AF165053.1; D50480.1; D50483.1; D50482.1; AB049092.1; D50484.1; AB031322.1; U14286.1; U14320.1; U14284.1; U14282.1; U14287.1; U14281.1; UI4283.1; U143i6.1; U14318.1; U14292.1; U14290.1; AY003962.1; AY003965.1; U14291.1; 10 AY003963.1; AY003966.1; AY003969.1; AY003977.1; AY003978.1; U14285.1; AY003967.1; AY003968.1; AY003979.1; U14289.1; AY003964.1; AY003953.1; AY003954.1; AY003959.1; U14295.1; AY003955.1; AY003956.1; AY003958.1; AY004032.1; AY003960.1; 15 AY004034.1; AY004035.1; AY003957.1; AY003961.1; AY004033.1; U14304.1; L38356.1; L38360.1; L38372.1; AJ291248J; AF071973.1; U14297.1; L29575.1; U14310.1: AB001040.1; AF071978.1; U14308.1; AJ291273.1: U14307.1; U14305.1; AF071962.1; AF107041.1; U14302.1: 20 U14309.1; AF071987.1; AF071977.1; U14296.1; AF071976.1; X91416.1; AF071956.1; L23442.1; L23445.1: AJ231477.1; U14298.1; AJ231475.1; AF149894.1; AF149895.1; AJ231480.1; L23443.1; L23444.1; AJ231473.1: AJ231474.1; AJ231476.1; AY149711.1; AF149898.1: 24 200816990 AF149901.1; AF149903.1; AF149904.1; AJ231472.1; AJ231478.1; AF149899.1; AF149900.1; AJ231469.1; AJ23147L1; AF149897.1; AF071957.I; AF149896.1; AF149902.1; AJ231470.1; AY149693.1; AY149708.1; 5 AY149709.1; AF462285.1; AF462296.1; AF462283.1; AF462287.1; AF462295.1; AF462286J; AF462294.1; S79604.1; AF462284.1; AF462291.1; AF462292.1; AF462288.1;以及 AF042790.1 〇 HCV基因型la分離株包括，例如：GenBank寄存編號 10 NC_004102.1 ;AY100171.1; AF516387.1; AY100128.1; AY100114.1; AF516389.1; AY100185.1; AF516391.1; AY100136.1; AY100132.1; AY100133.1; AY100179.1; AY100120.1; AY100135.1; AY100173.1; AY100118.1; AY100147.1; AY100176.1; AY100181.1; AY100193.1; 15 AY100124.1; AF516388.1; AY100139.1; AY100161.1; AY100115.1; AY100122.1; AY100129.1; AY100131.1; AY100146.1; AY100166.1; AY100169.1; AY100130.1; AF516386.1; AY100183.1; AY100151.1; AY100145.1; AY100160.1; AY100172.1; AF516395.1; AY100134.1; 20 AY100143.1; AY100144.1; AY100137.1; AY100155.1; AF516383.1; AY100119.1; AY100138.1; AY100154.1; AY100180.1; AY100162.1; AF516394.1; AY100123.1; AY100186.1; AY100152.1; AY100164.1; AY100167.1; AY100187.1; AY100141.1; AY100159.1; AY100188.1; 25 200816990 15 20 AY100116.1; AY100121.1; ΑΥ100125.1; AYi00163,l; AY100178.1; AF516392.1; AY100140.1; AY100189.1; AY100142.1; AY100149.1; ΑΥ100191.1; AY100I27J; AY100156.1; AY100184.1; AF516390.1; AF516393.1; AF516384.1; AY100168.1; AYI00148J; AY100170.1; AY100157.1; AY100174.1; ΑΥ100153.1; AY100126.1; AF516385.1; AY100117.1; ΑΥ100150.1; AY100165.1; AY100177.1; AY100182.1; ΑΥ100158.1; AF516382.1; AY100190.1; AY100175.1; ΑΥ100192.1; AF009071.1; S82227.1; AY003951.1; ΑΥ003947.1; AY003948.1; AY003949.1; AY003950.1; U14303.1; AY003952.1; AY004021.1; AY004022.1; ΑΥ004020.1; AY004019.1; AY004023.1; L38359.1; U14299.1; U14300.1; AF071960.1; AF071961.1; AF071983.1|; AJ291260.1; AF071959.1; AF071963.1; AJ291247.1; Z99042.1; AF071982.1; Z99040.1; Z99043.1; AF071953.1; AF071975.1; Z99041.1; AF071984.1; AF071985.1; AF071986.1; ΑΥ149700.1; AF071965.1; AF071974.1; AF071958.1; AF071979.1; AF071981.1; AF071968.1; AF071980.1; ΑΥ149698.1; L23435.1; L23436.1; AF071966.1; ΑΥ149701.1; AY149704.1; AF071955.1; AF071964.1; ΑΥ149692.1; L23437.1; L23440.1; AJ231490.1; AJ231491.1; L23439.1; L23438.1; L23441.1; AJ231489.1; AF009073.1; AF462276.1; AF009072.1; AF462279.1; AF462278.1; AF462281.1; 26 200816990 AF009069 · 1; AF462277.1; AF462280· 1; AF009070.1; AF462275.1; AF462282.1; AJ231493.1;以及AJ231494」。 HCV基因型2分離株包括，例如：GenBank寄存編號 AX057088.1; AX057090.1; AX057092.1; AX057094.1； D31973.1; D50409.1; AF238486.1; AB030907.1; U14293.1; 10 15 U14294.1; AF238481.1; IAF238485.1; AF238484.1; U14288.1; AF238482.1; AF169002.1; AF169005.1; AF238483.1; AX057086.1; AF169003.1; AF169004.1; AY004014.1; AY004015.1; AY004016.1; AY004017.1； AY004024.1; AY004025.1; AY004026.1; AY004027.1; AY004028.1; AY004029.1; AY004030.1; AY004031.1;以及 AF107040.1 〇 HCV基因型3b分離株包括，例如：GenBank寄存編 號 D49374.1; D17763.1; D10585.1; AF046866.1; AY100061.1; AY100033.1; AY100080.1; AY100088.1; AY100036.1; AF516379.1; AY100064.1; AY100059.1; AY100062.1; AY100065.1; AY100078.1; AF516374.1; AY100090.1; AY100042.1; AY100075.1; AF516369.1; AY100067.1; AY100045.1; AF516377.1; AY100058.1; AF516378.1; AY100026.1; AY100044.1; AY100055.1; AY100056.1; AY100092.1; AY100097.1; AY100047.1; AY100029.1; AY100028.1; AY100091.1; AF516368.1; AY100087.1; AYI00052.1; AF516376.1; AY100027.1; AY100066.1; AY100101.1; AF516373.1; AF516375.1; 27 200816990
AY100057.1; AYi 00032.1; AY100038.1; AY100069.1; AY100082.1; AY100083.1; AY100098.1; AF516370.1; AY100040.1; AY100093.1; AY100035.1; AY100046.1; AY100049.1; AY100050.1; AY100070.1; AY100073.1; 5 AY100077.1; AY100085.1; AF516380.1; AY100084.1; AY100030.1; AY100109.1; AYlOOllLl; AY100041.1; AY100053.1; AY100095.1; AF516367.1; AF516372.1; AY100039.1; AY100043.1; AY100060.1; AY100063.1; AY100068.1; AY100072.1; AY100100.1; AY100113.1; 10 AY100071.1; AY100076.1; AY100102.1; AY100031.1; AY100048.1; AY100108.1; AF516371.1; AY100037.1; AY100074.1; AY100096.1; AY100110.1; AY100024.1; AY100051.1; AY100079.1; AY100086.1; AY100103.1; AY100105.1; AY100107.1; AY100099.1; AF516381.1; 15 AY100089.1; AY100094.1; AY100104.1; AY100025.1; AY100054.1; AY100081.1; AY100106.1; AY100112.1; U143I5.1; U14317.1; U14313.1; AY003970.1; U14314.1; U14319.1; X91303.1; AY003975.1; AY003976.1; AY003974.1; AY004018.1; AF216791.1; U14301.1; 20 AY003971.1; AY003973.1; AF388454.1; U14312.1; AY003972.1; 以及 L23466.1。 HCV基因型4分離株包括 ，例如：GenBank寄存編號 Y11604.1; AF271807.1; AF271800; AJ291255.1; AJ291293.1; AJ291258.1; AJ291291.1; AJ291282.1; 28 200816990 AJ291284.1; AJ291263.1; AJ291286.1; AJ291272.1; AJ291275.1; AJ291271.1; AF271814.1|AF271814; ^ AJ291254.1; AJ291289.1; AJ291288.1|; AJ291249.1; L38370.1; AF388477.1;以及AF271815.：l。 5 HCV基因型5分離株包括，例如·· GenBank寄存編號 Y13184.1; AJ291281.1; L23472.1;以及L23471.；l。 HCV基因型6分離株包括，例如：GenBank寄存編號 Y12083.1; L38379.1; L23475.1;以及L38339.1。 _ 如本文中使用的，“NS5B基因產物”與類似物意指 10 NS5B多核苦酸和多肽以及其之片段(例如，mRNA、RNA、 rRNA、cDNA、蛋白、肽以及其之片段）。 . 如本文中使用的，“胺基酸編碼改變”與類似物意指於 如本文中揭示的或是以其他方面與HCV關聯的一種C型肝 炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B(例如，一種來自基因型 15 lb、2、3，和4的C型肝炎之RNA依賴型RNA聚合酶NS5B) 或是其之一部分(例如，一種C型肝炎RNA依賴型RNA聚合 _ 酶NS5B的HCV-796結合袋）内之一規定的位置上的胺基酸
• 殘基之偏差。片語“胺基酸編碼改變”與類似物意指於一種C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B序列内或是介於序列 20 之間或是在序列之中的單一的和多重的變化或差異2者。 如本文中使用的，“HCV-796結合袋，，與類似物意指一 種與HCV-796交互作用的C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的部分。舉例而言，來自HCV基因型lb的NS5B之 HCV-796結合袋係被包含於大約胺基酸殘基12〇至450内。 29 200816990 如第3圖中顯示的，來自HCV基因型lb’以及其他的HCV基 因型，的NS5B之HCV-796結合袋係由5種主要的結構要素 構成：一種活化位址環，一種富含絲胺酸環(Cys366loop)， α-螺旋Μ環，α-螺旋G環，以及Tyr448環。 5 關於本文中揭示的，決定“C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋的胺基酸序列或結構”與類似 物的方法包括，但不限於：（1)決定C型肝炎RNA依賴型RNA 聚合酶NS5B的HCV-796結合袋或是其之一部分的胺基酸 序列；（2)決定C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的 10 HCV-796結合袋或是其之一部分的胺基酸結構；以及(3)決 定編碼C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結 合袋或是其之一部分的核酸序列。此等方法可以使用例行 的核普酸定序、例行的蛋白定序，或是結構變化的抗體的 福測。 15 另外’本發明預期減低一種抗治療的C型肝炎病毒感染 出現的頻率，降低一種抗治療的C型肝炎病毒感染之抗性的 位準，以及延遲一種抗治療的c型肝炎病毒感染的出現的方 法，其係藉由投藥至一個主體體内，不是以組合式就是以 連續式的，一種C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的抑 制背丨（例如，一種苯并呋喃，如HCV-796)以及至少一種額外 ^抗㈣肝炎劑(例如，—種雷巴威林的產物或-種免疫調 即^，如一種干擾素產物）。如本文中討論的，2種或多種 抗C型肝炎病毒劑的投藥(例如，HCV-796與一種干擾素產 30 200816990 物及/或一種雷巴威林的產物）可以是同時發生的或是以連 續式的。 如於本文中更加詳盡地說明的，對於減低一種抗治療 的c型肝炎病毒感染出現的頻率，降低一種抗治療的c型肝 5 炎病毒感染之抗性的位準，以及延遲一種抗治療的c型肝炎 病毒感染的出現之有用的例示的製劑包括：把c型肝炎RNA 依賴型RNA聚合酶NS5B作為目標的製劑，例如，苯并呋喃 化合物。此等化合物係被揭示於，例如，美國臨時專利申 請案案號·· 60/735，190和60/735,191，以及美國專利公開案 10案號，其等之揭示係藉此被併入以做為參考 資料。於本發明的一個實施例中，苯并呋喃化合物是5_環 丙基-2-(4-氟苯基)-6-[(2-羥乙基)（甲磺醯）胺基]_N_甲基 本弁ϋ夫喃-3-曱胺(HCV-796)。因此，如本文中使用的“一 種C型肝炎病毒的苯并呋喃抑制劑，，與類似物係意指一種苯 15 并呋喃抗C型肝炎病毒劑。 如本文中使用的，“延遲出現，，與類似物意指延遲，例 如，具有對於一種選擇的抗c型肝炎病毒療法的抗性之一種 C型肝炎病t的發展，例如，一種苯并呋喃抗c型肝炎病毒 療法(如：一種使用HCV-796之苯并呋喃為主的抗c型肝炎 2〇病毒療法）。因此，“延遲出現”和類似物可以關聯於相關於 一種參考樣本(例如，於一種參考族群中之一種抗治療的c 型肝炎病毒的發展之一種參考平均或中位速率）而延遲一 種抗⑺療的C型肝炎病毒感染的發展。此延期可以相差至少 10%，20%，30%，4〇%，50%，60%，70%，80%，90%,或 100%， 31 200816990 或疋本技藝中所知道的評估抗性出現的 一延遲之任何其他 的方法。 如本文中使用的，“減低出現的頻率之，，與類似物意指 降低例如，具有對於一種選擇的抗c型肝炎病毒療法的抗 5性之:種c型肝炎病毒的發展之發生率。因此，“延遲出現 的須率和類似物可以關聯於相關於一種參考樣本之一種 抗/口療的C型肝炎病毒感染的發生率之降低(例如，於一種 蒼考族群中之一種抗治療的c型肝炎病毒的發生之一種參 考平均或中位的比率）。此降低可以相差至少肌，聽， 30%, 4〇%? 5〇〇/0? 60〇/〇5 7〇〇/〇? 8〇0/〇^ 9〇〇/〇^1〇〇0/〇 , 中所知道的評估抗性出現的頻率之減低之任何其他的方 法。 如本文中使用的’“降低抗性的位準”與類似物意指降 低处種C型肝炎病毒反抗一種抗c型肝炎病毒療法的力量 或月匕力□此，p务低抗性的位準，，和類似物可以關聯於相 關於—種參考樣本之一種⑽肝炎病毒反抗-種抗C型肝 炎病毒療法的力量或能力的降低(例如，於—種參考族群中 之一種反抗一種抗C型肝炎病毒療法的參考平均或中位的 能力）。此降低可以相差至少10%，聽，30%，魏，50% 20 60%，70%，80%，90%，或是1_，或是本技藝中所知道的呼 估抗性位準的降低之任何其他的方法。 如本文中使用的，“抗治療的c型肝炎病毒感染”與類似 物意指-種對於-種抗C型肝炎病毒療法顯示—種麼除的 反應之C型肝炎病毒感染(例如，對於治療之一種的 32 200816990 缺少）反應，或是於c型肝炎病毒量上對於治療的反應之一 種變少的（換言之，廢除的）的降低）。於本發明的一個實施 例中，抗治療的C型肝炎病毒感染是一種抗苯并呋喃的c型 肝炎病毒感染，特別地一種抗11(:¥_796的(::型肝炎病毒感 5 染。 苓照如本文中提出的一種核苷酸序列或多核苷酸係包 含一種具有明確的序列（或其之一種互補物）的1)1^八分子(例
如，一種CDNA分子），以及包含一種具有明確的序列之RNA 分子(例如，一種mRNA或是一種rRNA分子），其中u被用來 1〇替代T，除非上下文以其他方式要求。此等多核苷酸和核酸 額外地包括揭示的多核苷酸之對偶基因的變異體，例如，c 型肝炎病毒基因型的各種各樣的亞型之多核芽酸和核酸。 對偶基因的變異體係揭示的多核普酸之天然存在的任擇形 式，其係編碼由揭示的多核苷酸所編碼的多肽完全相同的 15或是具有顯著的相似性之多肽。較佳地，對偶基因的變異 體具有與揭示的多核苷酸至少9〇〇/0的序列同一性（更佳地， 至少95%的同一性；最佳地，至少99%的同一性）。任擇地， 當該等核酸段在選擇性雜交條件(例如，高度嚴苛的雜交條 件）之下的會雜交至揭示的多核普酸時，顯著的相似性: 2〇 在。 此等多核苷酸和核酸額外地包括具有編螞與揭示的多 核苷酸同源性的多肽之序列的DNA。此等同系物是自—種 與揭示的多肽和多核苷酸不同的物種單離的多核苷酸和多 肽，或是於相同的物種之内，但是與揭示的多核苷酸和多 33 200816990 月太具有顯著的序列相似性。較佳地，多核普酸同系物具有 ㈣不的夕核苷酸至少50%的序列同-性(更佳地，至少 7 5 %的同一性·田 ’取佳地，至少90%的同一性），然而多肽同 系物具有與揭示的多肽至少30%的序列同-性（更佳地，至 5 少45%的同一柚· η ^ 1王，攻佳地，至少60%的同一性）。較佳地， 揭不的夕核普酸和多肽之同系物係自嗜乳動物物種單離的 那些。 "於2種序列之間的“同源性(homology)，，或是“序列同 -性”的計算係n由本技藝巾具有技藝者的那些人所熟知 10的手4又予以執行。舉例而言，一種肖於計算序列同一性之 -般的手段係被朗以下。該等序列係為了最佳的比較的 目的而被排列(例如，間隔能為了最佳的排列而被導入至一 個第一和一個第二胺基酸或核酸序列的一個或2個中，以及 非同系的序列能為了比較的目的而被忽視）。於一個較佳的 15實靶例中，一種為了比較的目的而排列的參考序列的長度 疋參考序列的長度之至少3〇%，較佳地至少4〇%，更佳地至 少50%，還要更佳地至少6〇%，以及甚至更佳地至少7〇%， 80%，90%，1〇〇%。在對應的胺基酸位置或核苷酸位置之 胺基酸殘基或核苷酸接而被比較。當於第一序列内的一個 20位置係被如同第二序列内的對應的位置之相同的胺基酸殘 基或核普酸佔據時’那麼在該位置的分子是同一的。介於2 種序列之間的百分比同一性是由序列所分享之同一的位置 之數目的函數，考慮到間隔的數目，以及各間隔的長度， 其等為了 2種序列之最佳的排列係需要被導入的。 34 200816990 序列的比較以及介於2種序列之間的百分比序列同一 性的決定可以利用一種數學演算法予以完成。於一個例示 實施例中，介於2個胺基酸序列之間的百分比同一性係利 用尼德曼(Needleman)和旺許(Wunsch) ((1970) /•从厂 5 48:444-53)演异法予以決定’其已經被整合成為於gcg軟體 包中之GAP程式（於www.gcg.com可取得），利用一種
Blossum62矩陣或一種PAM250矩陣，以及 16，14 12 10 8 6,或4的一間隔權重(gap weight)和1，2, 3, 4, 5,或6的一長度 權重(length weight)。於又一個實施例中，介於2個核苷酸 10 序列之間的百分比同一性係利用GCG軟體包中之GAP程 式（於www.gcg.com可取得）予以決定，利用一種 NWSgapdna.CMP矩陣以及 40, 50, 60, 70,或80的一間隔權 重和1，2, 3, 4, 5,或6的一長度權重。一組例示的參數是一種 Blossum 62記分矩陣，具有12的一個間隔罰分，4的一個間 15 隔延長罰分，以及5的一個架構位移間隔處罰。介於2個胺 基酸或核苷酸序列之間的百分比同一性也能利用梅爾 (Meyers)和米勒（Miller)演算法（(1989) 4:11-17)予 以決定，其已經被整合成為至ALIGN程式（版本2.0)，利用 一種PAM120權重殘基表，12的一種間隔長度處罰以及4的 20 一種間隔處罰。 抗C型肝炎病毒劑包括，例如··多核苷酸、蛋白生物製 品、抗體和小分子。術語“小分子”係提及不是巨分子的化 合物（參見，如，Karp (2000) ⑴ 16:269-85; Verkman (2004) A/P-CW/御如/· 286:465-74)。 35 200816990 5 因此，小分子通常被認為是，例如，少於1千道爾頓(Dalton) 的化合物（例如，Voet和Voet，ed，ed. N. Rose，Wiley和Sons，New York，14 (1995))。舉例而言，戴維 司（Davis)等人（2005) Proc· Natl· Acad· Sci· USA 102:5981-86，使用片語小分子來指出葉酸、甲氨蝶呤 (Methotrexate)，和神經肽，然而哈爾品（Halpin)和哈貝利 (Harbury) (2004)凡仍叹y 2:1022-30，使用片語來指出 小分子基因產物，例如，DNA、RNA和肽。天然的和合成 馨 的小分子實例包括，但不限於，膽固醇、神經傳導素、 10 siRNA，以及被歹ij於很多的商業上可得的小分子資料庫中之 各種各樣的化學品，例如，FCD(細微的化學品資料庫）、 SMID (小分子交互作用資料庫）、ChEBI (生物學關注的化 學實體（Chemical Entities of Biological Interest))，以及 CSD(劍橋結構的資料庫）（參見，例如，Alfarano等人(2005) 15 Nuc· Acids Res· Database Issue 。 術語“藥學組成物”意指含有至少一種的治療或生物活 性劑(例如，（一種)抗C型肝炎病毒劑，如HCV-796，一種雷 巴威林的產物，或是一種干擾素產物)之任何組成物以及係 合適用於投藥至一個主體體内。藥學組成物和其等之合適 20 的配方能藉由本技藝中熟知且接受的方法予以製備。參 免，舉例而言，Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Ed.? (ed. A.R. Gennaro), Lippincott Williams & Wilkins，Baltimore，MD (2005)。 36 200816990 於本發明的全部態樣中’被分析為該等揭示的方法之 部分之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B可以是與一 種本文中提出的NS5B序列不同之一種變異體的多肽。此種 變異可以發生於NS5B之一個不相關的位址，例如，hcv 796 5 結合領域的外部。此等NS5B多肽於目前的方法中是被預期 為有用的’因為此等方法係依靠來自一個感染Hcv的個體 的一種NS5B多肽之序列或結構上的一個變化之鑑定（關於 時間，換言之，介於一第一個與第二個時間點之間的，或 是相關於一種參考樣本）。一般而言，病毒的突變可以取 代形成NS5B蛋白三級結構之殘基，但有條件是使用執行 一種相似的功能的殘基。於其他的例子中，殘基的類型可 以疋完全不相關的，設若一種改變係發生於一個非關鍵區 内。因此，本發明進一步使用顯示實質的nmb-類型的生 物活性之NS5B變異體。此等變異體包括删除、插入、反 置重複，以及取代的類型（舉例而言，以一個親水性殘 基取代另個，但不是以一個強烈親水性殘基取代一種強 、、齪水〖生玟基）。小的變化或是“中性的，，胺基酸取代通常對 於蛋白功能會有不多的影響(Taylor (1986) 乂 W)寸恆性取代可以包括，但不限於，在脂族胺 ^之中的取代，介於醯胺殘基之間的取代，鹼性殘基的 = /、，以及芳族殘基之中的取代。關於何種胺基酸編碼改 夂，可阢疋表現型地靜默（換言之，是不可能顯著地影響 力此）之進一步的指導能被發現於Bowie等人（1990) 5W⑼π 37 200816990 247:1306-10 和 Zvelebil 等人（1987) /· Mol. Biol· 195:957-61，之中。 用於監測一種C型肝炎病毒感染的治療之進程的方法，用於 監測和預後一種C型肝炎病毒感染的方法，以及用於診斷一 5 種抗治療的c型肝炎病毒感染的發展的方法 本發明提供的方法用於箪測一種C型肝炎病毒感染的 治療之進程的方法，用於監測和預後一種抗治療的c型肝炎 病毒感染的發展的方法，以及用於診斷一種抗治療的c型肝 炎病毒感染的發展的方法，其等係藉由，例如，決定於來 10自該主體之一種樣本中之(一種)NS5B基因產物或其之一部 分(例如，NS5B的HCV-796結合袋，或是NS5]^hcv_796 結合袋之内的特定的胺基酸，例如，一種NS5B的胺基酸殘 基314, 316, 363, 365, 368, 414或445)的序列或結構，以及比 較來自該主體的樣本中之該（等）NS5B基因產物或是其之 15 (一）部分的序列或結構與一種參考樣本中之(一種)NS5B基 因產物或其之(一）部分的序列或結構。任擇地，此等方法可 以包括決定在第一個時間點、自一個主體取得的生物樣本 中之（-種)NS5B基因產物或其之㈠部分的一種測試序列 或結構，以及比較該（等)NS5B基因產物或是其之部分的序 2〇列或結構與在帛二個時間點、自一個主體取得的—種生物 樣本中之(一種)NS5B基因產物或其之部分的序列或結構。 舉例而言’本發明提供於來自感染主體之 -種樣本中之診斷，難和監測的方法，其係，例如，藉 由決定來自感染HCV的一個主體之一種樣本中之（二 38 200816990 種)NS5B基因產物或其之(一)部分(例如，腦⑽hw796 結合袋，或是廳㈣卿-796結合袋之内的特定的胺基 酉文例如’一觀細的胺基酸殘基叫，316, 363, 365，偏， 4M或秘)的序列或結構之變化。（—種师π基因產物或其
5之（刀的序列或結構也可以於一種有興趣的參考細胞 或是樣本中予以測量以生產或獲得，或是此參考序列或結 構可以、、工由其他的方法獲得，或是可以是本技藝中具有技 ^者的個人通常知道的。另外，該（等卿B基因產物或 疋八之（）up刀的序列或結構可以在_第—個時間點、自一 1〇個主體獲得，以及與在一第二個時間點來自-個主體的該 (等)NS5B基因產物或其之部分的序列或結構比較以鑑定於 (種)NS5B基因產物或其之(一）部分的胺基酸編碼改變的 t展。此等时法可以藉由，例如，制預先包裝的診斷 套組予以執行，其包含—種多核㈣(或其之部分，例如， 15 (-種)NS5狀序探針或(―種)赐崎交探針），或是一種對 抗一種NS5B多肽的抗體（或其之一部分）的至少一種，其可 以方便地被使用於，舉例而言，—種臨床的裝置中。 “診斷的，，或是“診斷，，意指鐘定—種病理的病況的存在 或缺少，例如，診斷_個主體體内之—種抗治療的c型肝炎 病毒感㈣健。輯財法包括，但不限於，制舰 20 依賴型RNA聚合酶NS5B的序列或結構之變化，其係藉由決 定來自感染HCV的—個主體(例如，人類或非人類哺乳日動物) 之-種生物樣本中之(―種)NS5B基因產物或其之㈠部分 (例如，NS5B的HCV-796結合袋，或是於⑽沾的職损 39 200816990 結合袋之内的特定的胺基酸，例如，一觀別的胺基酸殘 基3M，316, 363, 365, 368, 4M或44S)的序列或結構，以及比 較該測試序列或結構與，例如，一種正常的（或相對正常 的)NS5B基因產物序列或結構(例如，在一起始的第一個時 5間點、來自於-種參考樣本或來自該主體之-種ns5b序列 或結構）。儘管-種特定的診斷的方法可能不會提供一種抗 治療的C型肝炎病毒感染的發展之—種決定性的診斷，其係 足夠的，設若該方法提供有助於診斷的一種正指示。 本發明亦提供用於預後一個主體體内之一種抗治療的 10 C型肝炎病毒感染的發展之方法，其係藉由決定，舉例而 言，來自感染HCV的一個主體（例如，人類或非人類哺乳 動物）之一種生物樣本中之(一種)NS5B*因產物或其之(一） 部分（例如’ NS5B的HCV-796結合袋，或是nS5b的 HCV-796結合袋之内的特定的胺基酸，例如，一種]^56的 15胺基酸殘基314, 316, 363, 365, 368, 414或445)的序列或結 構。預後的或疋預後”意指預料一種病理的病況之彳艮可 能的發展及/或嚴重性。預後的方法包括：決定來自於一 個主體的一種生物樣本中之（一種)NS5B*因產物或其之 (一）部分的序列或結構，以及比較該（等)NS5B基因產物咬 20其之部分的序列或結構與該（等)NS5B基因產物或其之部八 的種預後的序列或結構(例如，來自於一種參考樣本的 一種NS5B的序列或結構)。任擇地，預後的方法可以包括 決定在第一個時間點、自一個主體取得的一種生物樣本中 之（一種)NS5B基因產物或其之（一）部分的一種測試的序列 40 200816990 或結構，以及比較該（等)NS5B基因產物或其之部分的序列 或結構與在第二個時間點、自一個主體取得的一種生物樣 本中之(一種)NS5B基因產物或其之部分的序列或結構。於 (一）特定部分(例如，一種NS5B的HCV-796結合袋）或是_ 5種NS5B基因產物之胺基酸殘基(例如，一種]的胺基酸 殘基314, 316, 363, 365, 368, 414或445)的變化係與一種抗 治療的C型肝炎病毒感染的發展之預後一致。 本發明亦提供用於監測一個主體體内之一種C型肝炎 病毒感染的方法，其係藉由決定，舉例而言，來自於一種 ίο人類或非人類哺乳動物的主體的生物樣本中之（一種)NS5B 基因產物或其之(一）部分(例如，：^856的11〇又_796結合袋， 或是NS5B的HCV_796結合袋之内的特定的胺基酸，例 如，一種NS5B的胺基酸殘基314, 316, 363, 365, 368, 414或 445)的序列或結構。監測的方法包括：在—第—個時間 is點、自-個主體取得的_種生物樣本中之卜種爬沌基因 產物或其之部分的-種測試的序列或結構，以及比較該 (等)NS5B基因產物或其之部分的序列或結構與在一第二個 時間點、自-個主體取得的一種生物樣本中之(一種)ns5b 基因產物或其之部分的序列或結構。任擇地，監測的方法 2〇可以包括比較該測試序列或結構與，例如，卜種卿b基 因產物或其之部分的一種正常的序列或結構(例如，來自 :種參考樣柄-種嶋序料結構）。於介於第一與第 -個時間點之間的（或介於該_樣本和該參考樣本之間 的X-種)職基因產物或其之部分的序列或結構中之一 41 200816990 種變化係指出該c型肝炎病毒感染於嚴重性上已經增加。 此等監測分析也對於評價於被治療c型肝炎感染的病人體 内之一種特定的抗C型肝炎病毒劑或是一種抗c型肝炎病 毒療法的效力是有用的，換言之，監測一個主體體内之一 5種HCV感染的治療進程，例如，一種HCV_796的治療（不是 單獨就是組合（連續地或相繼地）以一種額外的抗C塑肝炎 病毒劑）。 鑑定對於一種抗C型肝炎病毒療法具有一種減低的反應可 能性之一個體的方法 10 本發明亦提供用於鑑定對一種抗C型肝炎病毒療法具 有一種減低的反應可能性之一個體的方法，其包含：決定 (一種）NS5B基因產物或其之（一）部分（例如，NS5b的 HCV_796結合袋，或是NS5B的HCV-796結合袋之内的特定 的胺基酸，例如，一種NS5B的胺基酸殘基314, 316, 363, 365, 15 368, 414或445)的序列或結構，以及比較該測試序列或結構 與，例如，一種正常的NS5B基因產物序列或結構(例如，來 自於種參考樣本之一種Nmb序列或結構）。任擇地，鑑定 對種抗C型肝炎病毒療法具有一種減低的反應可能性之 4口體了以包括·決定在一第一個時間點、自一個主體取 20传的-種生物樣本中之(一種)ns5b基因產物或其之部分的 種測減的序列或結構，以及比較該（等)NS5B基因產物或 /、之邛刀的序列或結構與在一第二個時間點、自一個主體 取传的一種生物樣本中之(一種)NS5B基因產物或其之部分 的序列或結構。於（一）特定部分（例如，一種NS5B的 42 200816990 HCV-796結合袋）或是一種NS5B基因產物之胺基酸殘基(例 如，一種NS5B的胺基酸殘基314, 316, 363, 365, 368, 414或 - 445)的變化係與該個體會對一種抗C型肝炎病毒療法予以 反應之減低的可能性一致。決定是否一個體很可能會對一 5種具有很少或沒有抗性的抗C型肝炎病毒療法予以反應之 < 緊密關聯的方法也被預期。 、 第二代抗C型肝炎病毒劑 關於C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B變異體，其 ^ 專係對HCV感染的苯并吱喃（例如，HCV-796)的治療反應而 10出現，的序列和結構之資訊對於最佳化第二代抗c型肝炎劑 (例如’ C型肝炎病毒抑制劑或HCV抑制劑組合，其等係對 • 於由於此等變異體内之突變所造成的抗性展現出顯著降低 • 的、隶小的，或是無敏感性)是額外地有用的。另外，此資 訊在選擇具有加成或協同作用之，例如，抗C型肝炎劑及/ 15或第二代抗c型肝炎劑的組合的方法上是有用的，以降低對 φ , 於由於C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B内之此等突 變所造成之抗性的敏感性。 舉例而言，利用對Hcv的苯并吱嚼治療予以反應而產 生的HCV變異體（其等可以是如本文中說明的一種組合性 20療法的-部分，例如，HCV_796與組合一種雷巴威林的產 物及/或-種干擾素產物），—個人可以篩選，例如，利用高 7產量_(HTS)，對於治療—種抗苯并妈治療的c型肝 炎病毒感染有用的新穎的抗C型肝炎劑，以及因而最佳化第 二代抗C型肝炎劑的蚊和化學合成。另外，利用本文中揭 43 200816990 5 參 示的方法，一個人可以鑑定於一個主體體内、對Hcv的苯 并咬喃治療反應而產生的C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B之苯并呋喃（例如，HCV_796)結合袋的胺基酸序列或 結構之一種變化，以及接而投藥一種最佳化的第二代抗c 型肝炎劑以治療該主體體内之抗苯并呋喃治療的c型肝炎 病毒感染。 決定（一種)NS5B基因產物或是其之(一）部分的序列或結構 決定揭示的方法中使用的（一種)NS5B基因產物或是其 之（一)部分（例如，NS5B的HCV-796結合袋，或是NS5B的 10 HCV-796結合袋之内的特定的胺基酸，例如，胺基酸殘基 314, 316, 363, 365, 368, 414或445)的序列或結構可以於種 種生物樣本内測量，包括：體液(例如，全血、血漿，和尿)， 細胞(例如，全細胞，細胞部分，和細胞萃取物），以及其他 的組織。生物樣本也包括組織的切片，如為了組織學的目 15 • _ 的而取得的活體切片和冷凍切片。較佳的生物樣本包括血 液、血漿淋巴液，和肝組織活體切片。可以明瞭一種生物 樣本的分析不一定需要來自該主體之細胞或組織的移除。 舉例而言，與一種NS5B的HCV-796結合袋交互作用或是與 一種NS5B的HCV-796結合袋之内的特定的胺基酸（或編碼 20 某些胺基酸之核苷酸)交互作用，例如，胺基酸殘基314, 316, 363, 365, 368, 414或445，之適當地標誌的製劑(例如，抗 體、核酸)可以被投藥至一主體以及利用標準的成像技術(例 如，CAT、NMR(MRI)，和ΡΈΤ)予以顯現（當結合至該標的 時）〇 44 200816990 ;本^月的診斷、預後，和監測分析與方法中， 種）腦基因產物或是其之㈠部分（例如，讎的 HCV 796釔合袋，或是NS5B的HCV-796結合袋之内的特定 的胺基酸，例‘ 5 10 15 20 ，胺基酸殘基314, 316, 363, 365, 368, 414 =)的序列或結構係被決定以產生一種測試的序列或 二構該'則式的序列或結構接而係與，例如，-種基線/正 系的NS5B的序料結構？以比較。 \同的HCV基因型、亞型，和分離株之NS5B基因 3是"之（）部分的正常的序列或結構可以被決定任 物本類型和族群。一般而言’（―種)NS5B基因產 2是其之(―)部分的基線(例如，正常的）的序列或結構係 精由決疋（-種）參考的NS5B基因產物或是其之㈠部分， 、係來自對於抗C型肝炎病毒療法或感興趣的抗C型肝炎 =毒細如，Hcv_796)不是抵抗性的_種對觸HCV基因 及/或亞型（或分離株），的序列或結構而予以判定。任擇 =期職基因產物或是其之(―)部分的基線(正常的） t列或結構可以藉由決定(一種)參考的獅基因產物或 疋之㈠部分，其係來自於在1抗C型肝炎病毒療法的 ，始或是感興趣的抗c型肝炎病，(例如，Hcv_796)的投 樂之前自該主體取得的—個樣本，的序職結構予以確定。 可以明瞭本發明的方法不必然地要求決定（-種)c型 肝炎卿基因產物的整個序列或結構，因蚊(-種)C型肝 炎NS5B基因產物的-部分之序⑽結構對於此等方法的 許多應用是充分的。 45 200816990 一種NS5B基因產物内的一種序列或結構變化之特徵化 本發明的方法涉及決定（一種）c型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B基因產物或是其之部分的序列或結構，例 如’一種NS5B多核苷酸或多肽的序列（或其之片段，例如， 5 一種NS5B的HCV-796結合袋或是存在於，例如，一種NS5B 的胺基酸位置314, 316, 363, 365, 368, 414或445之殘基）。 (一種)C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS 5 B基因產物或是 其之部分的序列或結構能利用本技藝中具有技藝者的那些 人熟知的方法，於實施例節中說明的那些（例如，RT-PCR 10 和結晶學），以及本文中所說明的額外的技術予以測量。 一個人可以藉由以下方式決定c型肝炎RNA依賴型 RNA的HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構的變化：(1)決 定C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋 或是其之一部分的胺基酸序列；（2)決定C型肝炎RNA依賴 15 型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋或是其之一部分的 胺基酸結構；及/或(3)決定編碼C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋或是其之一部分的核酸序列。 一種NS5B中之（一種）序列及/或結構的變化的決定可 以使用本技藝中熟知的各種各樣的方法，例如，例行的核 20 苷酸定序（換言之，該NS5B基因或其之一部分(例如，編碼 HCV-796結合袋之NS5B基因的部分）的定序），PCR的擴 增，北方墨點法，例行的蛋白定序(換言之，NS5B多肽的或 其之一部分(例如，負責與HCV-796交互作用的NS5B多肽的 部分）的定序），等電聚焦，光譜學或抗體為主的結構變化的 46 200816990 偵測。 NS5B mRNA能被單離且反轉錄成cDNA，以及接而直
• 接地藉由各種各樣熟知的方法予以定序，或是任擇地係被 探測某些胺基酸編碼序列的存在或缺少。任擇地，NS5B 5 mRNA其本身可以利用根據雜交的分析而被探測某些編碼 、 序列的胺基酸，如北方雜交，原位雜交，點和狹縫墨點， . 以及募核苷酸陣列。根據雜交的分析係關聯於一種探針核 酸被雜交至一種標的核酸之分析法。於一些安排中，標的， ® 探針，或是2者均被固定。被固定的核酸可以是DNA、RNA， 10或是另一種寡核苷酸或多核苷酸，以及可以包含天然或非 天然存在的核苷酸、核苷酸類似物，或是骨幹。選擇供用 ♦ 於本發明中的核酸探針序列的方法(例如，以一種NS5B為基 礎的核酸序列）是本技藝中熟知的，以及能以，例如，序列 辨識編號：1和序列辨識編號：2，其等係於野生型基因型 15 lb(BB7)複製子中的NS5B之核酸和胺基酸序列（各別地），中 提出的該專序列為基礎而容易地決定。 鲁_ 任擇地，mRNA可以在定序及/或探測的之前予以擴 ' 增。此等的根據擴增的技術是本技藝中熟知的，以及包括： 聚合酶連鎖反應(PCR)，反轉錄PCR(RT-PCR)，PCR-酵素連 2〇 結免疫吸附分析（PCR-ELISA)，以及連接酶連鎖反應 (LCR)。用於生產和偵測擴增的NS5B基因產物(例如，mRNA 或cDNA)之引子和探針可以由本技藝中具有技藝者的那些 人、以NS5B基因的核酸序列為基礎、不需過度實驗而容易 地被設計和生產。擴增的NS5B基因產物可以直接地被分 47 200816990 析舉例而3•藉由限制酶水解接著凝膠電泳；藉由雜交 種探針核酸；藉由定序；藉由-種螢光、磷光，或放 射ί生L號的偵測，或是藉由種種熟知的方法的任何一種。 卜用於^曰加籍由標的核酸序列的擴增而生產的信號的 5方法是本技藝中具有技藝者的那些人所知道的。 關於NS5B多肽結構的分析，NS5B多核苷酸(例如，自 病毒的RNΑ反轉錄的N s 5 B cDNΑ)可以被可操作地連接至 一種表現對照序列，如揭示於考夫曼（Kaufman)等人（1991) 施c· dci心及队19:4485-90，的pMT2或pED表現載體，俾 10 以生產用於進一步地的分析之NS5B多肽。許多合適的表現 對照序列是本技藝中所知道的。表現重組型蛋白之一般的 方法也是知道的以及被例示於考夫曼（Kaufman) (1990) MeiA. 185:537-66，中。如本文中定義的“可操作地 連接，，係意指被酵素地或化學地連接以於一種經單離的 15 NS5B多核苷酸和表現對照序列之間形成一種共價鍵，以此 一種方式NS5B多肽係由已經以被連接的多核苷酸/表現對 照序列予以轉形的（轉染的）一種宿主細胞予以表現。 術語“載體，，，如本文中使用的，係打算關聯於一種能 夠運送另一種核酸至其已經被連接的核酸分子。一種類蜇 20的載體是一種“質體”，其係提及一種環形雙股的DNA環， 額外的DNA段可以被連接至其内。另一種類型的載體是一 種病毒載體，其中額外的DNA段可以被連接進入病毒的基 因組。某些載體能夠於一種其等被導入的宿主細胞中自主 的複製(例如，具有一種細菌複製來源之細菌載體以及附加 48 200816990 體甫礼動物的载體）。其他的載體(例如，非附加體哺乳動物 的載體）能在當導入至該宿主細胞時被整合至一種宿主細 胞的基因組，以及與宿主的基因組一起被複製。並且，某 些载體能夠指揮其等被操作地連接之表現基因。本文中此 5等载體係被提及為“重組型表現載體，，(或簡明地，“表現載 " 叙而5，於重組DNA技術中有用的表現載體通常 疋以質體的形式。於本說明書中，“質體”和“載體，，可以可 交換地利用，因f體是最常使用的載體形式。然而，本發 月係打异包括表現載體之其他的形式，如病毒載體(例如， 複衣缺陷性反轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒），其等係提 供相等的功能。 本發明的重組型表現建構物可以攜帶額外的序列，如 调節序列(換言之，調節載體的複製，例如，複製來源，編 碼感興趣的多肽(或肽)之核酸序列的轉錄，或是編碼的多肽 15之表現的序列），如組胺酸之標誌序列，以及可選擇的標誌 基口。術语調節序列”係打算包括啟動子、增強子和控制 轉錄、複製或轉譯之任何其他的表現控制要素(例如，聚腺 苷酸化信息、轉錄剪接位址）。此等調節序列係被所說明 於，舉例而言，Goeddel，. Gene办户⑽幻·⑼7^以〇/〇处·· 20 Methods in Enzym〇l〇gyf Academic Press, San Diego, CA (1990)内。本技藝中具有技藝者的那些人可以明瞭，表現 載體的設計，包括調節序列的選擇，將取決於各種各樣的 因素，包括宿主細胞的選擇以及所欲的蛋白表達的位準。 於哺乳動物的宿主細胞中之用於蛋白表現的較佳的調節序 49 200816990 列包括··指示蛋白表現的高位準之病毒的要素，如啟動子 及/或增強子’其等係衍生自FF-la啟動子和BGH聚A，細胞 巨大病毒(CMV)(例如，CMV啟動子/增強子），猿猴病毒 40(SV40)(例如，SV40啟動子/增強子），腺病毒（例如，腺 5病毒主要晚期啟動子(AdMLP))，以及多瘤病毒。病毒的調 卽要素，以及其之序列係被說明於，例如，美國專利案案 號5，168,062 ; 4,510,245 ;和 4,968,615。 本發明的重組型表現載體可以攜帶額外的序列，如調 節該載體於宿主細胞内之複製的序列（例如，複製來源和終 10止子序列）以及可選擇的標誌基因。可選擇的標誌基因幫助 該載體已經被導入的宿主細胞的選擇（參見，例如，美國專 利案案號4,399,216, 4,634,665和5，179,017，全部係由 Axel 等人）。舉例而言，典型地可選擇的標誌基因賦予以該可選 擇的標誌予以轉染或轉形的宿主細胞對於化合物，如： 15 G418(遺傳黴素(genetidn))、濕黴素或甲氨蝶呤，的抗性。 較佳的可選擇的標諸基因包括二氫葉酸還原酶(D H F R)基 因（供用於具有曱氨蝶呤選擇/擴增之dhfr_宿主細胞）、邮〇基 因（用於G418選擇），以及賦予四環素及/或胺苄青黴素的抗 性給細菌之基因。 20 合適的載體，其等係含有合適的調節序列，包括啟動 子序列，終止子序列，聚腺苦酸化序列，增強子序列，標 誌基因和其他合適的序列，可以被選擇或是被建構。可誘 導的蛋白表現，藉由使用具有可誘導的啟動子序列之載體 而達到，如四環素可誘導的載體，例如，pTet_〇nTM* 50 200816990 5 pTet-Off™ (Clontech，Palo Alto, CA)，也可以被使用於揭示 的方法中。關於有關表現載體之進一步的細節，參見，舉 例而言 ’ Sambrook，J·，E.F. Fritsch，and T· Maniatis，1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。用於核酸 的操作之許多已知的技術和規則，舉例而言，核酸建構物 的製備，致突變，定序，DNA的導入至細胞，基因表現， 以及蛋白的分析，也被詳盡地說明於Sambrook等人，在 前，之内。 10 一些類型的細胞可以作為NS5B多肽或多核苷酸的表 現之合適的宿主細胞。合適的哺乳動物的宿主細胞包括， 例如：猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、人類腎293 細胞、人類表皮A431細胞、人類C〇1〇205細胞、3T3細胞、 CV-1細胞、其他的轉形的靈長類動物細胞株、正常的二倍 15 • < 體細胞、衍生自原始組織的活體外培養之細胞株、原始培 植體、HeLa細胞、小鼠 L細胞、BHK、ΗΙ^60、U937、HaK、 C3H10T1/2、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、Mix或 C2C12細胞。 20 合適的用於NS5BcDNA之選殖和擴增的細菌細胞包括 各種各樣的大腸桿菌菌株，例如，JM109, XJ Autolysis™ (Zymo Research，Orange，CA)，BL21，和 One Shot™ (Invitrogen，Carlsbad，CA)。常見的選殖載體包括pUC19、 pGEX，和pBR322 〇此等載體可以被利用於選殖的插入物 之PCR的擴增或是NS5B多核苷酸之直接定序。 51 200816990 NS5B多肽也可以藉由可操作地連接本發明的經單離 的多核苷酸至一或多種昆蟲表現載體内之合適的對照序列 而予以生產，以及使用一種昆蟲表現系統。供用於竿狀病 毒/Sf9表現系統的材料與方法係為以套組形式之商業上可 5 知的（例如 ’ kit，Invitrogen，Carlsbad，CA)。該等 本文中說明的多肽之可溶的形式也可以利用以上說明的合 適的單離的多核苷酸而於昆蟲細胞中生產。 任擇地，NS5B多肽可以於較低等的真核生物，如：酵 母，或是於原核生物，如：細菌，内生產。合適的酵母菌 ίο株包括··酒酵母、粟酒裂殖酵母 户⑽㈣ '克魯維酵母囷株⑹输、念珠菌 屬，或是能夠表現異質性蛋白的任何酵母菌株。合適的細 囷囷株包括大腸桿菌、栝草桿菌、鼠傷寒沙門桿菌，或是 月匕夠表現異質性蛋白的任何細菌菌株。細菌内的表現可以 15導致併入該重組型蛋白之包涵體的形成。因此，該重組型 蛋白的再折疊可以被要求俾以生產活性或是更有活性的材 料數種供用於自細菌包涵體獲得正確地折疊的異質性蛋 白的方法是本技藝中所知道的。此等方法一般涉及自包涵 體溶解蛋白，接而利用一種促溶劑(cha〇tr〇pic哗⑽)而完全 2〇地欠I亥蛋白。當半胱胺酸殘基係存在於該蛋白之原始的 土酉文序列日守，通常需要在一種允許雙硫鍵之正確的形成 的知<境中完成再折疊(一種氧化還原系統)。一般的再折疊方 法係被以揭示於K〇hn〇 (199〇)M献仏抓185 187 95,卯 0433225，以及美國專利案案號5,399,677中。 52 200816990 本文中所說明的多肽和多核苷酸可以利用本技藝中昊 有技藝者的那些人知道的方法予以純化。舉例而言，NS5B 多肽可以利用一種商業上可得的蛋白濃縮過濾器予以濃 縮，舉例而言，藉由利用一種AMICON㊣或是PELLICON®超 5 過濾單元(Millipore，Billerica，MA)。接著濃縮步驟之後，濃 縮物可以被施加至一種純化基質，如：一種凝膠過濾媒介。 任擇地，一種陰離子交換樹腊可以被使用，舉例而言，一 種具有懸掛二乙基胺基乙基（DEAE)或聚伸乙亞胺 (polyethyleneimine)(PEI)基團的基質或基材。該等基質彳以 10 是丙烯醯胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或是普遍被使用於 蛋白純化的其他種類。任擇地，——種陽離子交換步驟可以 被使用。合適的陽離子交換器包括各種各樣的不溶的基 質，其包含磺丙基或羧甲基基團。磺丙基基團是較佳的（例 如 ’ S-SEPHAROSE⑧管柱 s，Sigma-Aldrich，St. Louis， 15 M〇)。NS5B多肽自培養懸浮液的純化也可以包括於此等親 和樹脂上之一種或多種管柱步驟，如··伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖、AF-HEPARIN650、heparin-TOYOPEARL® 或是 Cibacron blue 3GA SEPHAROSE⑧（Tosoh Biosciences，San Francisco, CA);或是藉由利用此等樹脂作為苯基醚、丁基 20醚’或丙基鱗之疏水性交互層析（hydrophobic interaction chromatography);或是藉由免疫親和色譜法。最後，使用 疏水性RP-HPLC媒介，例如，具有懸掛甲基或其他的脂族 基團之二氧化矽凝膠，的一或多種逆相高效液相層析法 (RP-HPLC)步驟能被使用的以進一步地純化NS5B多肽。包 53 200816990 括對於本發明的蛋白之抗體的親和管柱也可以依照已知的 方法而被使用於純化。前述的純化步驟的一些或全部，以 各種各樣的組合或是與其他已知的方法一起，亦可以被使 用以提供一種實質經純化的單離重組型蛋白。較佳地，該 5經單離的蛋白係被純化的以便於其係實質地沒有其他哺乳 動物的蛋白。 一種NS5B多肽（或其之片段）的結構也可以利用各種各 樣的熟知的免疫學的分析予以決定，該等免疫學分析係使 用可以是如本文中說明的方式產生的抗NS5B抗體。免疫學 10分析係關聯於使用一種專一地結合至，例如，一種NS5B多 肽(或其之一個片段)的抗體(例如，多株的、單株的、嵌合、 人化的、cFv，及/或其之片段）的分析。合適於本發明的實 施之此等熟知的免疫學分析包括：ELISA、放射性免疫分 析(RIA)、免疫沈澱、免疫螢光、螢光激發細胞分選(FACS)， 15以及西方墨點法。因此，一種抗體可以對抗，例如，NS5B 的HCV-796結合袋的一部分(換言之，一種抗原決定位)而產 生，藉此於該HCV-796結合袋之内的一個特定的胺基酸的 改變可以使得該抗體不能夠與該抗原決定位交互作用。於 此事例中，一種負向信息(例如，於一種ELISA分析或西方 20 墨點法内）指出一種胺基酸編碼改變已經發生。 一種NS5B多肽可以被利用來免疫動物以獲得專一地 與NS5B多肽反應的多株和單株抗體，俾以偵測一種c型肝 炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B或其之一部分的結構的變 化。此等抗體可以，舉例而言，利用整個NS5B或其之片段 54 200816990 作為免疫原而獲得。該等肽免疫原可以額外地在魏端含有一 個半胱胺酸殘基以及被耦合至一種半抗原，如：鑰孔蟲戚血監 蛋白（keyhole limpet hemocyanin) (KLH)。額外的肽免疫原可以 藉由以硫酸鹽化的酪胺酸殘基取代酪胺酸殘基而產生。用於合 5 成此等肽的方法是本技藝中所知道的，舉例而言，如於 Merrifield (1963) J· dmer· Soc· 85: 2149-54，以及
Krstenansky和 Mao (1987) FMSLe"· 211:10-16，中的。 針對對抗NS5B的人類單株抗體(mAbs)可以利用攜帶 人類免疫球蛋白基因而不是小鼠系統的基因轉殖小鼠予以 10 產生。來自以有興趣的抗原予以免疫的此等基因轉殖小鼠 的脾臟細胞係被使用以生產融合瘤，其等係分泌具有對於 來自一種人類蛋白的抗原決定位專一的親和力之人類 mAbs(參見，例如，WO 91/00906，WO 91/10741，WO 92/03918，WO 92/03917，Lonberg 等人（1994)施加％ 15 368:856_59, Green等人（1994) 7:13-21，Morrison 等人（1994) /Voc· li/· Xc似/· 5W· C/H 81:6851-55，以及 Tuaillon 等人（1993) Prac· TVa"· 5W. t/U. 90:3720-24)。 抗體，包括單株抗體，也可以藉由本技藝中具有技藝 20 者的那些人知道的其他重組DNA技術的方法予以產生。一 種例示的方法，其係被提及為“組合式的抗體展示 (combinatorial antibody display)”方法，已經被發展以鑑定 和分離抗體片段，其等具有一種特定的的抗原之專一性， 以及能被使用以生產單株抗體（關於組合式的抗體展示的 55 200816990 說明’參見’例如，Sastry等人（1989)Prac·施i/· jcad iScz.. t/.5U· 86:5728-32; Huse等人（1989) 薦 246:1275-81;以 及 〇rlandi 等人（1989) Pn AM.心αΑ 知·. t/U. 86:3833-37)。在以一種如以上說明的免疫原免疫一種動物 5之後，形成的B細胞池(pool)之抗體庫係被選殖。免疫球蛋 白分子的一種互異的族群之可變區的DNA序列可以利用寡 聚物引子的一種混合物和PCR而獲得。譬如，對應至5，前 導(信息肽)序列及/或架構1(FR1)序列之混合的寡核苷酸引 子，以及對應至一種守恆的3,恆定區引子的引子可以被利 10用於一些乳科動物抗體之重和輕鏈的可變區的PCR擴增 (Larrick等人（1991)价〇rec/mz.卵烈 11:152-56)。一種相似的 策略也可以被使用以擴增來自人類抗體之人類重和輕鏈的 可變區（Larrick等人（1991)舱炀〇心·· Qmp⑽施认〇办 /n 2:106-10) 〇 15 如本文中使用的，術語“抗體，，包括一種蛋白，其包含 至少一個，以及典型地2個，VH領域或其等之部分，及/或 至少一個，以及典型地2個，VL領域或其等之部分。於某 些實施例中，抗體是2個重人類免疫球蛋白鍵和2個輕人類 免疫球蛋白鏈的-種四聚合物，其中重和輕免疫球蛋白= 20係藉自，例如，雙硫鍵予以互相連接。該等抗體，或是其 等之-部分’能獲得自任何來源，包括但不限於：喃齒動 物、靈長類動物(例如，人類和非人類靈長類動物）、路轮 (cam·)、f、魚料，或是其雜藉由本技藝巾具有技藝 者的那些人所熟知的方法而被重組地生產的，例如，礙合二 56 200816990 人化的，及/或例如活體外產生的。 被包含於術語一種抗體的“抗原結合片段，，之内的結合 片段的實例包括，但不限於：⑴一種Fab片段，一種由VL、 VH、CL和CH1領域構成的單價的片段；⑼一種F(ab，)2# 5 ^又’一種包含於樞紐區（hinge region)藉由一個雙硫橋予以 連接的2個Fab片段之二價的片段；（iii)一種由vjj和CH1領 域構成的Fd片段；（iv)一種由一抗體的一個單一臂之vl和 VH領域構成的Fv片段；（幻一種片段dAb，其係由一種vH 領域構成；（vi) —種單鏈fv(scFv ;見以下）；（vii)一種駱駝 10或是駱駝化的重鏈可變領域(VHH ;見以下）；（viii)—種個 雙專一性抗體（參見以下）；以及(ix)一種被稠合至一種Fc區 的免疫球蛋白分子的一或多個片段。而且，儘管Fv片段的 2個領域，VL和VH，係藉由各別的基因予以編碼，其等能 利用重組方法、藉由一種合成的連接子予以連結而使得其 15等成為一種單一蛋白鏈，其中VL和VH區配對以形成單價的 分子(被知道為單鏈Fv (scFv));見，例如，Bird等人（1988) 細⑼ce 242··423-26; Huston等人（1988) /Voc· AMjcfl义如·· ΠΑ 85:5879-83)。此等單鏈抗體也打算被包含於術語一 種抗體的“抗原結合片段”之内。此等片段可以利用本技藝 20中具有技藝者的那些人知道的慣用技術而獲得，以及該等 片段係以如同完整無缺的抗體被評價的相同的方式予以評 價功能。 於一些實施例中，術語“抗原結合片段，，包含單一領域 抗體。單一領域抗體能包括其之CDRs是一種單一領域多肽 57 200816990 5 的部分之抗體。實施例包括，但不限於：重鏈抗體、天梦 缺乏輕鏈之抗體1生自慣例的4鏈的抗體之單 ^ 口維體以及單一領域支架，除了衍生自抗體的: t。早-領域抗體可以是本技藝中所知道的那此的任竹 個，或是任何未來的單一領域抗體。單〆領域抗體可以扩 生自任何物種，包括’但不限於:小鼠、人類、駱駝、美: 洲秘、山羊'兔子、牛，和黨魚。依據本發明的至少_個 態樣，如本文中使用的一種單一領域抗體是一種天然存在 的單一領域抗體，其被知道為缺乏輕鏈之重鏈抗體。此等 10 單一領域抗體係被揭示於，例如，W〇 94/04678中。此衍生 自一種天然缺乏輕鏈之重鏈抗體的可變領域係於本文中被 知道為一種VHH或奈米抗體(nanobody)，以與慣例的4鏈的 免疫球蛋白之VH區分。此種VHH分子能衍生自路駝科物種 内養育出的抗體，舉例而言：於駱駝、美洲駝、單峰駱駝、 15 羊.IS和南美野生羊騎。除了絡騎科之外，其他的物種可以 生產天然缺乏輕鏈之重鏈抗體；此等VHH分子係本發明的 範疇内。 一種“抗原結合片段”能，選擇性地，進一步包括提高， 例如，安定性，效應細胞功能或補體固定的一或多種之一 20 個部分。舉例而言，抗原結合片段能一步地包括一種聚乙 烯二醇化部分、白蛋白，或是一種重及/或一種輕鏈恆定區。 除了“雙專一性”或是“雙功能性，，抗體，一種抗體被瞭 解會使得其之結合位置為同一的。一種“雙專一性”或“雙功 能性抗體”是一種人造的雜種抗體，其具有2個不同的重鏈/ 58 200816990
5 輕鏈對以及2個不同的結合位置。雙專一性抗體能藉由種種 方法予以生產，包括：融合瘤的融合或是Fab’片段的連接； 見，例如，Songsivilai和Lachmann (1990) •五χ/7· /mmtmo/· 79:315-21; Kostdny等人（1992)/.//η/η·。/· 148:1547-53。 另外，本發明預期小單元免疫藥學（small modular • immunopharmaceutical) (SMIP™)藥 物（TYubion Pharmaceuticals，Seattle，WA)的用途。SMIPs 是單鏈的多 肽，其等係由以下組成：一種同源的結構，如：一種抗原， 之一個結合領域，一種反受體(counterreceptor)或類似物， 10 一種具有一個或沒有半胱胺酸殘基的樞紐區多肽，以及免 疫球蛋白CH2和CH3領域(也參見www.trubion.com)。SMIPs 和其專之用途以及申請案係被揭示於，例如，美國公開專 利申請案案號：2003/0118592, 2003/0133939, 2004/0058445, 2005/0136049, 2005/0175614, 2005/0180970, 2005/0186216, 15 • 2005/0202012， 2005/0202023， 2005/0202028, 2005/0202534，和2005/0238646，以及其等之相關的專利家 族成員，其等之全部係藉此以其等之全體被併入至本文中 做為參考資料。 20 嵌合抗體，包括嵌合免疫球蛋白鏈，亦可以藉由本技 藝中所知道的重組DNA技術予以生產。舉例而言，編碼一 種鼠科動物（或其他的物種）的單株抗體分子之&恆定區的 一種基因係以限制酶予以水解以移除編碼鼠科動物&的 區域，以及編碼一種人類Fc恆定區的一種基因之等效部分 被取代（參見PCT/US86/02269; EP 184,187; EP 171，496; EP 59 200816990 5 • 173,494; WO 86/01533;美國專利案案號 4,816,567; EP 125,023; Better等人（1988) 240:1041-43; Liu等人 (1987) Ptoc. TVa"· JcW· 5W· 乂 84:3439·43; Liu等人 (1987) /· 139:3521-26; Sim等人（1987) Prac· iVai/. dcfli Sci. m 84:214-18; Nishimum等人（1987) Cawc· Res. 47:999-1005; Wood#A(1985) Nature 314:446-49;^^ Shaw等人（1988)1 iVia"· 80:1553-59) 〇 設若所欲的話，一種抗體或一種免疫球蛋白鏈可以藉 由本技藝中所知道的方法予以人化。人化抗體，包括人化 10 ， 的免疫球蛋白鏈，可以藉由以來自人類Fv可變區之等價的 序列予以取代沒有直接地與抗原結合有關的F v可變區之序 列而產生。用於產生人化抗體之一般的方法係由M〇rrison (1985) *SW⑼ce 229:1202-07; Oi等人（1986) 4:214-21;以及美國專利案案號5,585,089，5,693,761和 15 5,693,762予以提供，其等之全部係藉此以其等之全體被併 入以做為參考資料。該等方法包括單離、操作，以及表現 編碼來自一種重或輕鏈的至少一個之免疫球蛋白Fv可變區 20 的全部或部分的核酸序列。此核酸的來源對於本技藝中且 有技藝者的那些人疋熟知的’以及’舉例而言，可以押得 自一種生產對抗一種預先決定的標的之一種抗體的融合 瘤。編碼人化抗體，或是其之片段的重組型〇1^人可以接而 被選殖至一種合適的表現載體之内。 人化的或CDR-移植抗體分子或免疫球蛋白可以夢由 CDR移植或CDR的取代予以生產，其中一種免疫球蛋白鏈 60 200816990 的1個、2個，或是全部的CDRs能被取代。參見例如，美 國專利案案號5,225,539; Jones等人（1986)池ii/re 321:552-25; Verhoeyan等人（1988) ⑼ce 239:1534-36;以 及Beidler等人（1988) J./m臟⑽/· 141:4053-60，其等之全部 5係藉此以其等之全體被併入以做為參考資料。美國專利案 案號5,225,539說明可以被利用以製備本發明的人化抗體之 一種CDR移植方法（亦參見，gb 2188638A)。一種特定的人 痛抗體之CDR的全部可以以一種非人類CDR的至少一部分 予以取代，或是只有一些CDR可以以非人類CDRs予以取 10代。只需要取代該人化抗體的結合至一種預先決定的抗原 要求的CDR數目。 單株的、嵌合和人化抗體，其等係已經藉由，例如， 删除、加入，或取代該抗體的其他部分，例如，恆定區， 予以修飾的，也在本發明的範疇内。舉例而言，一種抗體 15可以如下予以修飾：⑴藉由刪除該恆定區；（ϋ)藉由以另一 種怪定區予以取代該恆定區，例如，一種意圖抗體的增加 半生期、安定性或親和性的恆定區，或是—種來自另一種 物種或是机體種類的怪定區；或是⑽藉由修飾於悝定區内 之—或多個胺基酸以改變，舉例而言，尤其，糖化作用位 2〇址的數目，效應細胞功能，Fe受體(FcR)的結合，補體固定。 用於改變—種抗體^區的方法是本技藝中所知道 的。具有經改變的功能(例如，關於—種效應配體之改變的 親和性，如-種細胞上的FCR，或是補體之C1組份)之抗體 可以藉由以一種不同的殘基取代該抗體的怪定部分内之至 61 200816990 少一種胺基酸殘基而生產（參見，例如，EP 388，151 A1，美 國專利案案號5,624,821和5,648,260，其等之全部係夢此以 其專之全體被併入以做為參考資料^ )。相似的改變類型也 可以被應用至鼠科動物免疫球蛋白以及來自其他物種的免 5疫球蛋白。舉例而言，要改變一種抗體(例如，一種IgG， 如一種人類IgG)之一種Fc區關於一種FcR(例如，& gamma R1)或關於Clq結合之親和性是可能的，其係藉由以於其之 側鏈上具有一種合適的功能性之（一種）殘基取代指定的殘 基，或是藉由一種帶電荷的官能基，如麩胺酸或天冬胺酸， 10或是一種芳族的非極性殘基，如：苯丙胺酸、酪胺酸、色 胺酸或丙胺酸的導入（參見，例如，美國專利案案號 5,624,821)。 對於-種NS5B之人類抗體可以㈣地利用經修飾的 基因轉殖的非人類動物予以生產，以便對藉由一種抗原的 刺激的反應而生產完全地人類抗體而不是動物的内源性抗 體（參見，例如，pct公開案wo 94/026〇2)。於非人類宿主 内之編碼重和輕免疫球蛋白鏈的内源性基因已經是無能 的，以及編碼人類重和輕鏈免疫球蛋白之活性的位點係被 插入至宿主的基因組之内。該等人類基因係，舉例而言， 2〇利用含有需要的人類職段之酵母人造的染㈣而被併 入。提供全部的所欲的修飾之—種動物接而藉由雜交育種 含有比完全地修飾之全體更少的中間基因轉殖的動物而被 獲得為後代。一種基因轉殖的非人類動物的_個實例是一 種小鼠，以及被稱為XENOMOUSE™，如揭示於pCT公開 62 200816990 案WO 96/33735和WO 96/34096中的。此動物生產分泌完全 人類免疫球蛋白之B細胞。該等抗體能在以一種感興趣的免 疫原舉例而a，-種多株抗體的製備物，予以免疫之後 而直接地自動物獲得，或是任擇地來自衍生自該動物的永 5生不死的B細胞，如生產單株抗體之融合瘤。此外，編碼具 有人』可欠區之免疫球蛋白的基因能被回收和表現以直接 也獲知抗體’或疋此被進_步地修飾以獲得抗體的類似 物，如，舉例而言，單鏈Fv分子。 …用於減低-種抗治療紅㈣炎病毒感染出現的頻 率P中低種抗〆口療的c型肝炎病毒感染之抗性的位準，以 及延遲一種抗治療的〇型肝炎病毒感染的出現的方法 本毛月提t、用於減低一種抗治療的C型肝炎病毒感染 出見的、y員率P牛低-種抗治療的C型肝炎病毒感染之抗性的 位準1 乂及延遲-種抗治療的C型肝炎病毒感染的出現的方 15 f ’其係精由’例如，投藥與至少一種額外的抗C型肝炎病 毋山且口之紅型肝炎病毒的苯并吱喃抑制劑（例如， HCV-796)至-個需要其之主體體内。苯并吱喃化合物和額 =的抗C型肝炎病毒劑係於本文中被揭示。於本發明的一些 實施例中，抗C型肝炎病毒劑是一種免疫調節劑，特別地是 20種干擾素產物，或—種抗病毒劑，特別地是一種雷巴威 林的產物。 藥學組成物 於-些態樣中，本發明特徵在於用於減低一種抗治療 的c型肝炎病毒感染出現的頻率，降低-種抗治療的C型肝 63 200816990 炎病毒感染之抗性的位準，以及延遲一種抗治療的c型肝炎 病毒感染的出現的方法。此等的方法可以包含接觸一種族 群的細胞(例如，藉由投藥至一個罹患或處於纖維化或一種 纖維化關聯的P早礙的危險中之主體體内）與一種抗c型肝炎 5病毒劑（例如’一種免疫調節劑，特別地是一種干擾素產 物；一種抗病毒劑，特別地是一種雷巴威林的產物；一種 苯并呋喃’特別地是HCV-796)，以足以減低一種抗治療的 C型肝炎病毒感染出現的頻率，降低一種抗治療的c型肝炎 病毒感染之抗性的位準，延遲一種抗治療的C型肝炎病毒感 10 染的出現的一種量。 用於減低一種抗治療的c型肝炎病毒感染出現的頻 率，降低一種抗治療的C型肝炎病毒感染之抗性的位準，以 及延遲一種抗治療的C型肝炎病毒感染的出現之抗c型肝 炎病毒劑可以被利用為一種藥學組成物，當與一種藥學上 15可接受的載體予以組合時。此種組成物可以含有，除抗C 型肝炎病毒劑和載體之外，各種各樣的稀釋劑、填充劑、 鹽類、緩衝劑、安定劑、助溶劑(s〇lubinzer)，以及本技藝 中熟知的其他材料。術語“藥學上可接受的，，意指一種非毒 性的或是相對地非毒性的材料，其不干擾該（等）活性組份的 2〇生物活性之有效性。載體的特徵將取決於投藥的途徑，以 及通常是本技藝中熟知的。 本發明的藥學組成物可以是以一種脂質體的形式，其 中（種)抗C型肝炎病毒劑係與，除其他的藥學上可接受的 載體之外，如脂質之兩性的製劑予以組合，其等係以聚集 64 200816990 的形式存在’像微團’不溶的單層，液體的結晶，或是存 在於水溶液中的薄片層。關於脂質體的配方之合適的脂質 包括’但不限於：單酸甘油醋、二酸甘油醋、硫酸腦酶脂、、 溶血卵雜、咖旨質、植物4素、膽酸，與類似物。此等 脂質體配㈣製備是在本㈣+具有技藝者的轉内，如 揭示於，例如，美國專利案案號4,235,871，4 5〇1 728 4,837,028，和4,737,323中的，其等之全部係藉此以其等之
全體被併入以做為參考資料。 如本文中使用的，術語“治療有效量，，意指藥學組成物 10或方法的各活性組份的量，其係足以顯示一種有意義的主 體利益，例如，此等病狀的改善或症狀的降低，的預防， 的痤癒，或是錢速率的增加。當被施加一個體活性組份 %，單獨投藥，該術語係僅僅提及那種組份。當以一種個 組合被施加時，該術語係提及導致治療效力之活性組份的 15組合的量，不管是以組合式、連續地或同時地被投藥。 於實施本發明的方法的治療或是用途（包括用於減低 一種抗治療的C型肝炎病毒感染出現的頻率，降低一種抗治 療的C型肝炎病毒感染之抗性的位準，以及延遲一種抗治療 的C型肝炎病毒感染的出現的方法之實施例）中，（一種)抗c 20型肝炎病毒劑的一治療有效量係被投藥至一個主體體内， 例如’ 一種哺乳動物(例如，一種人類）。（一種)抗C型肝炎 病毒劑可以依據本發明的方法而單獨或是與其他的療法組 合予以投藥，如於本文中更詳盡地說明的。當與一或多種 製劑予以共投藥時，（一種)抗c型肝炎病毒劑可以與第二種 65 200816990 製劑同#地或疋相繼地投藥。設若相繼地被投藥，主治的 醫師會決定與其他的製劑組合之（一種型肝炎病毒劑 的投藥之合適的順序。 被使用於本發明的一種藥學組成物或是實施本發明的 5 一種方法之（一種）抗c型肝炎病毒劑的投藥可以以種種慣 例的方式予以進行，如口腔攝取、吸入、或是皮膚的、皮 下的，或疋靜脈内>主射。靜脈内的投藥至該主體有時是係 較佳的。當一種抗C型肝炎病毒劑的一治療有效量係口服地 予以投藥時，結合劑會以一種錠劑、膠囊、粉末、溶液或 10酏劑的形式。當以錠劑形式予以投藥時，本發明的藥學組 成物可以額外地含有一種固體載體，如：一種明膠或一種 佐劑。錠劑、膠囊，和粉末含有自大約5至95的結合劑，以 及較佳地自大約25至90的結合劑。當以液體形式予以投藥 時，一種液體載體可以被添加，如：水、石油、動物或植 15物來源的油，如··花生油（儘管記住花生過敏於族群中的頻 率）、礙物油、大豆油，或芝麻油’或是合成的油。藥學組 成物的液體形式可以進一步地含有生理食鹽溶液，葡萄糖 (dextrose)或其他的糠溶液，或是乙二醇，如：乙二醇、丙 一醇或聚乙一醇。當以液體形式予以投藥時，該藥學組成 2〇物含有以重量計自大約〇.5至90%的結合劑，以及較佳地自 大約1至50%的結合劑。 當（一種)抗C型肝炎病毒劑的一治療有效量係藉由靜 脈内的、肌肉内的、皮膚或皮下注射予以投藥時，結合劑 會以一種無熱原的、非經腸可接受的水溶液的形式。此等 66 200816990 非經腸可接受的蛋白溶液的製備，其係具有關於阳、等張 性、安定性，與類似物的應有的，係於在本技藝中具有技 藝者的水準内。一種靜脈内'皮膚的，或皮下注射之較佳 的藥學組成物應含有，除一種結合劑之外，一種等張的傳 5播媒介，如：氯化鈉注射劑、林格氏注射劑、葡萄糖(dextrose) 注射劑、葡萄糖(dextrose)和氯化鈉注射劑、乳酸化的林格 氏注射劑，或是本技藝中所知道的其他傳播媒介。本發明 的樂學組成物也可以含有安定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧 化劑，或是本技藝中具有技藝者的那些人知道的其他添加 10 物0 本發明的藥學組成物中之（一種）抗C型肝炎病毒劑的 里係將取决於要被治療的病況的本質和嚴重性，以及取決 於該主體已經接受的之前的處理的類別。最後，主治的醫 師將決定結合劑的量，以其去治療各個單獨的主體。最初， 15主治的醫師會投藥低劑量的結合劑以及觀察主體的反應。 直到該主體獲得最佳的治療效力為止，較大劑量的結合劑 可以被投藥，以及在那時劑量通常不會進一步增加。是被 預期的the各種各樣的被使用來實施本發明的方法之藥學組 成物被預期應含有大約每kg體重〇·〇1网至大約2000 mg的 20抗C型肝炎病毒劑。雷巴威林的產物和干擾素產物的給藥時 間表是本技藝中具有技藝者的那些人所熟知的，以及可以 於文獻中發現’例如，於Jen等人(2002) C7/n. TT^r· 72:349_61，Krawitt等人（2006) dm. */· 101:1268-73，Abonyi 和 Lakatos (2005)如价⑽cer 及烈· 67 200816990 25(2B): 1315_20，Jacobson等人（2005) dm. /· (?“价〇⑼era/· 100(11):2453-62，以及Lurie等人（2005) C7M·
Hepatol. 。
於一個實施例中，聚乙烯二醇化干擾素可以在0.01 5 叩/kg/劑量至50 pg/kg/劑量的範圍内予以投藥，例如，0J 4§/]<^/劑|至3 pg/kg/劑量’ 一週一或多次。於另一個實施 例中’ HCV-796可以以落在1 mg至2000 mg的範圍内之劑量 予以投藥，例如，50 mg至1500 mg，一天一或多次。於另 一個實施例中，一種干擾素產物（包括聚乙烯二醇化干擾素) 10係與肌肉内投藥。於本發明的又一個實施例中，雷巴威林 係被口服地投藥。於本發明的又一個實施例中， 係被口服地投藥。 15 20 利用本發明的藥學組成物之靜脈内療法的持續期間將 變化，其係取決於被治療的疾病的嚴重性以及各個單獨的 主體之病況和潛在的特性的反應。設純靜脈内投藥，可 以預期（-種)抗c型肝炎病毒劑的各種應用之持續期間可 以落在大概U至24小時的範圍内之持續的丨v投藥。、利^本 =的-種藥學組成物之皮下的(sx.)療法也是被預期的。 此專療，能，例如，每日的、—天數次、每週的、每二週 =或疋每月的予以投藥。典型地，抗c型肝炎病毒療法持 、只自12至48週。也是被預期的當抗。型肝炎病毒劑是係—個 二分子（例如，用於口腔遞送）時’該等療法可以:的個 =2次，一天3次，等等，予以投藥。最後主治細合 、疋π或以·療法，或是以-個小分子之療法的合適的持二 68 200816990 5 期間，以及利用本發明的藥學組成物之療法的投藥之時間 的選擇。 本發明的多核苷酸和蛋白被預期會展現出以下鑑定的 一或多種之用途或生物活性（包括與本文中引用的分析關 聯的那些）。用來說明本發明的蛋白、抗體，或多核苷酸之 用途或活性可以以下列方式提供：藉由此等蛋白，或抗體 的投藥或用途，或是藉由編碼此等蛋白或抗體的多核苷酸 之投藥或用途（如，舉例而言，於基因療法中或是合適於 DNA的導入之載體）。 10 組合性療法 於至少一個例示實施例中，一種包含一種NS5B的一種苯 并呋喃抑制劑(例如，HCV-796)和至少一種額外的抗C型肝炎病 毒劑之藥學組成物係於組合性療法中予以投藥。此等療法對於 減低一種抗治療的C型肝炎病毒感染出現的頻率，降低一種抗 15 • 治療的C型肝炎病毒感染之抗性的位準，以及延遲一種抗治療 的C型肝炎病毒感染的出現是有用的。術語“組合式”於此上下 文中係意指苯并呋喃抑制劑和至少一種額外的抗C型肝炎病毒 劑係實質同時地被供給，不是同時地就是相繼地。設若相繼地 被供給，在第二種化合物的投藥的開始，2個化合物之第一種 20 在治療的位置仍然可以可偵測為有效的濃度。 舉例而言，該組合性療法能包括與至少一種額外的抗C型 肝炎病毒劑予以共同配方的，及/或共投藥的，或是否則被組合 投藥的，一種NS5B的至少一種苯并呋喃抑制劑（例如， HCV-796)。額外的抗C型肝炎病毒劑可以包括至少一種免疫調 69 200816990 節劑，抗病毒，抗纖維化劑，小干擾RNA化合物，反訊息化合 物，聚合酶抑制劑(如：讀或核*類似物)，蛋白酶抑制劑 • 或其他料好抗，免疫球蛋…肝健劑，抗發炎劑， - 抗病毒疫苗，抗生素，抗感染劑，等等。此等組合療法可以有 5利地使用較低劑量的被投藥的治療劑，從而避免與各種各樣的 - 單一療法關聯的可能的毒性或併發症。 • 肋合以—種抗C型肝炎病毒劑使用的治療劑可以是於自 體免疫和隨後的發炎反應中在不同的階段干擾之製劑。於一個 ^ Λ施例中’本文中說明的至少一種的抗C型肝炎病毒劑可以與 10至少一種苯并呋喃化合物予以共投藥。該苯并呋喃化合物可以 包括於中美國臨時專利申請案案號·· 60/735，190和 6〇/735，19卜以及美國公開專利申請案案號：2〇〇4/〇162318 中提出的那些化合物的任何一種。 能被組合以本文中說明的苯并吱喃化合物使用的製劑的 15非限制性實例，包括，但不限於，例如··干擾素產物和其他 的免疫調節劑，雷巴威林的產物，HCV酶的抑制劑，抗纖 籲 維化劑，等等。此等製劑包括於以下中揭示的那些，例如，
Carroll等人，在前；Dhanak等人，在前；Howe等人， 在前；Love等人，在前；Shim等人，在前；Summa等人， 20 在^I，Olsen 專人，在别，Nguyen 等人，在前；Ludmerer 等人’在前；Mo等人’在前；Lu等人，在前；Leyssen 等人，在前；Oguz等人，在前；美國專利案案號6,964,979 ; 美國專利公開案案號：2006/0063821，2006/0040944, 2006/0035848, 2005/0159345, 2005/0075309, 2005/0059647, 70 200816990 2005/0049204, 2005/0048062, 2005/0031588, 2004/0266723, 2004/0209823, 2004/0077587, 2004/0067877, 2004/0028754 和2004/0082643 ;以及PCT公開案案號WO 2001/032153。 抗C型肝炎病毒劑的實例包括VIRAMIDINE⑧（Valeant 5 Pharmaceuticals); MERIMEPODIB® (Vertex
Pharmaceiiticals);霉紛酸（Roche);金鋼銨；額外的苯并 吱喃；ACTILON® (Coley); BILN-2061 (Boehringer Ingelheim); Sch-6 (Schering); VX-950 (Vertex Pharmaceuticals); VALOPICITABINE® (Idenix 10 Pharmaceuticals); JDK-003 (Akros Pharmaceuticals); HCV-896 (Wyeth/ViroPharma); ISIS-14803 (Isis
Pharmaceuticals); ENBREL® (Wyeth); IP-501 (Indevus Pharmaceuticals); ID-6556 (Idun Pharmaceuticals); RITUXIMAB® (Genentech); XLT-6865 (XTL); ANA-971 15 (Anadys); ANA-245 (Anadys)以及TARVACIN® (Peregrine) 〇 額外的抗C型肝炎病毒劑包括免疫調節劑，例如，干擾 素(例如，IFN α，β，和γ)以及干擾素產物(例如，聚乙稀二 醇化干擾素），其係包括天然的和重組型或是經修飾的干擾 素2者。干擾素產物的實例包括，但不限於，ALBUFERON® 20 (Human Genome Sciences)，MULTIFERON® (Viragen)， PEG-ALFACON⑧（Inter-Mune)，OMEGA INTERFERON® (Biomedicines)，INTRON® A (Schering)，ROFERON⑧ A (Roche)，INFERGEN® (Amgen)，PEG-INTRON® (Schering)， PEGASYS® (Roche)，MEDUSA INTERFERON® (Flamel 71 200816990
Technologies)，REBIF® (Ares Serono)，以及 ORAL INTERFERON ALFA® (Amarillo Biosciences)。 額外的抗C型肝炎病毒劑之實例包括，但不限於，可以 調節T-細胞功能的製劑（例如，胸腺素alfa-1，ZADAXIN® 5 (Sci_clone))，提高免疫細胞的IFN活化的製劑(例如，組織 胺一鹽酸鹽，CEPLEME® (Maxim Pharmaceutical))，以及干 擾素產物。 額外的抗C型肝炎病毒劑亦包括抗病毒劑（例如，核苷 類似物），如雷巴威林的產物，例如，COPEGUS® (Roche); 10 RIBASPHERE® (Three Rivers Pharmaceuticals); VIRAZOLE® (Valeant Pharmaceuticals);以及 REBETOL® (Schering) 〇 複製子變異體的序列分析 HCV-796已經被顯示於一種生化分析中以4〇碰的1(^ ，15而選擇地抑制HCV NS5B RNA依賴型RNA聚合酶。於含有 一種次基因組基因型lb HCV複製子的肝癌細胞中， HCV-796P条低HCV RNA的位準相差3-4 l〇g10 HCV複本/pg 總RNA(EC5〇=9nM)。擁有對於HCV-796有較低敏感性的複 製子變異體之細胞係在HCV-796的存在下接著藉由G418選 20擇而產生。變異細胞顯示出對於HCV-796之23至6812倍的 抗性。如同於實施例中更詳盡地揭示的，的該予以衍生自 該等複製子變異體的NS5B基因之序列分析顯露出於藥物 結合袋的5A之内的數種胺基酸編碼改變。特別地，在ns 5b 的白胺酉文314、半胱fefec316、異白胺酸363、絲胺酸365和 72 200816990 甲硫胺酸414之突變係被觀察到，其等已經顯示會直接地與 HCV-796交互作用。該等胺基酸取代對於病毒的適當性 (viral fitness)和藥物敏感性的影響係於重組型複製子和以 單一胺基酸突變予以分子設計的NS5B酶内予以檢查。與野 5生型複製子比較，該等複製子變異體於人類肝癌細胞中形 成群落是10至200倍較不有效的；S365變異體無法建立一種 安定的細胞株。其他的變異體(L314F、I363V，和M414V) 也具有4至9倍較低的穩態(steady state) HCV RNA的位準。 儘管於複製子和酶變異體内觀察到對於H C V _7 96的抗性 10 之不同的位準，此等變異體保留其等對於聚乙烯二醇化干 擾素(PegIFN)、雷巴威林，和其他HCV-專一性的抑制劑的 敏感性。 如同與其他的RNA病毒一致，HCV的變異體能在藥物 壓力之下於組織培養中被選擇。利用複製子系統，在濃度 15 10、100和1000倍複製子EC5〇，以HCV-796之選擇導致對於 化合物各別地為2 3、618和6 812倍之較小的敏感性的變異體 細胞（表1)。於HCV-796結合袋的5A之内，與HCV-796交互 作用的胺基酸之突變係被觀察到。突變的頻率是低至中等 的，落在自2%至36%的範圍内，C316Y/F/S為最普遍的突變 2〇 (表2B)。複製子變異體的抵抗性表現型（表4和6)暗示此等胺 基酸在決定對於HCV-796的藥物敏感性上扮演一種重要的 角色。該等複製子變異體似乎是比野生型複製子較不適 當，根據低的菌落形成效率（表5)以及於一些變異體中降低 的穩態HCV RNA的位準（表4)。目前，尚不清楚是否由 73 200816990 HCV-796選擇的抗性複製子變異體能於活體内被轉譯成抵 抗性病毒。設若此等抗性複製子變異體事實上具有減少的 複製適當性以及只在來自G418的選擇性壓力之下被安定， 一些含有此等突變之HCV-796_抗性病毒變異體不會於活體 5内存活或會維持是HCV族群的一種少數群是可能的。然 而’藉由活體内免疫反應行使的選擇壓力係被預料對於病 毒的基因演化要具有一種極大的效力。為了評估抗性對於 化療的影響’突變頻率、族群的大小、時間剖面和抗性變 異體的複製適當性也應該被考慮。 10 如表8中顯示的，NS5B内之半胱胺酸316於HCV基因 型1a分離株内是高度守恆的。NS5B内的胺基酸316之變異 係在基因型lb和4中被發現。在GenBank報告的117個基因型 lb序列内，在NS5B的胺基酸316 40%含有天冬醯胺酸，57% 含有半胱胺酸以及4%含有酪胺酸。基因型4中的5個百分 15 比（5%)的天然分離株在NS5B的胺基酸316含有天冬醯胺 酸。在HCV-796之多重的處理之後C316Y突變係於含有複製 子的細胞内被選擇，於抗性複製子内之半胱胺酸316的改變 成天冬醯胺酸(C316N)並未被觀察到。酪胺酸316和天冬醯 胺酸316複製子變異體2者均顯示出對於HCV-796有較低 20 敏感性。於HCV基因型la和lb中之胺基酸314、363、365、 368和414係為相對地守恆的，其等係於美國的75%的HCV 感染的病人體内被發現（國家衛生研究院共識發展聲明 (National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement): Management of Hepatitis C 2002 74 200816990 (J2002) Gosiro⑼iero/ogj； 123:2082-99)。儘管以HCV 796選 擇的抗性變異體具有對於HCV-796和其之相關的化合物之 . 減低的敏感性，此等變異體對於其他的抗HCV的抑制劑， 以及廣效性抗病毒劑（表7)仍是敏感的。此等抗病毒劑的用 5 途可以幫助對付由HCV 796選擇的抗性病毒的出現。 • 衍生自796R細胞的NS5B基因之序列分析導致NS5Bs • 白内的數種胺基酸編碼改變之鑑定，包括L314F、 C316Y/F/S、I363V、S365L/A/T、S368F，和 M414I/T/V。 _ 與HCV NS5B錯合的HCV-796的X射線結晶結構顯露出全部 10 的此等胺基酸與HCV-796有直接的交互作用（數據未顯 示）。半胱胺酸316是直接地鄰接NS5B RdRp的催化三元體 (GDD要素；G317、D318和D319)，其係被報導對於在 HCV RNA合成的期間之協調金屬離子和核苷酸三鱗酸是 重要的（O’Farrell等人(2003) J_ Μο/·ϋ/· 326:1025-35)。根 15 據結構模擬’ NS5B内之以苯丙胺酸或絡胺酸取代半胱胺酸 316(C316F/Y)導致介於苯丙胺酸或酪胺酸的側鏈以及 ® HCV-796和NS5B蛋白其他的殘基2者之間強烈的不協調（第 4圖）。在缺少該化合物的情況下，可接受的幾何學和包裝 能伴隨C316F/Y取代而被達成；然而，形成的蛋白構形不允 20 許於觀察的定位之化合物結合，與如於HCV複製子内顯示 出的對於HCV-796的敏感性之喪失一致(表4)。 依據結晶結構，NS5B蛋白忍受適度的構形變化俾以適 應HCV-796的結合。移動涉及Arg200和一個富含絲胺酸環 (Ser365, Cys366, Ser367, Ser368)(數據未顯示）。絲胺酸365 75 200816990 與HCV-796的醯胺氮形成一個強的氫鍵。絲胺酸365的突變 成丙胺酸(S365A)導致絲胺酸内之羥基基團的喪失，其係為 - 此氫鍵的接受體。另一方面，酥胺酸的取代絲胺酸 365(S365T)導致旋轉構形的3種可能性。於全部的情況中， 5介於酥胺酸的侧鏈和HCV-796的氟-苯基環或醯胺基團之間 - 的強烈的不協調係被觀察到。起因於該等胺基酸取代之气 - 鍵形成的缺乏以及空間的阻礙可以說明於S365A/T複製子 變異體内之對於HCV-796的41至212倍較低敏感性(表4)。 ⑩ 總之，本發明人已經證實HCV-796之分子標的，其係 10經由抗性變異體的選擇以及利用HCV複製子系統之NS5B RdRp内的胺基酸編碼改變的作圖。複製子變異體的特性化 . 鑑定C316Y/F/s* S365A/T為由HCV 796選擇的最抵抗性的 突變。在與HCV-796的接觸表面之胺基酸的取代以及該等 抵抗性的表現型暗示該HCV複製子係在由HCV-796行使的 15 一種直接抗病毒壓力之下，以及此等胺基酸在預料對於 ^ HCV_796的藥物敏感性上扮演一種重要的角色。儘管抵抗 HCV-796，該等複製子變異體保持對於聚乙烯二醇化干擾 素、雷巴威林和其他的HCV-專一的抑制劑之敏感性。此等 抗病毒劑的用途可以幫助對付由HCV 796選擇的抗性病 20 毒。此等抗病毒劑的組合也可以幫助降低抗性病毒的出 現。 遍及此申請案中被引用的全部的參考文獻、專利，和 專利申請案之全部内容係藉此被併入至本文中做為參考資 料0 76 200816990 實施例 下列的實施例提供本發明的之作例證的實施例以及在 β 任何方面不會限制本發明。本技藝中具有通常技藝的一個 人會承認很多的其他的實施例係被包含於本發明的範疇 5 内。 • 實施例1:對於HCV-796有較低敏感性的複製子變異體的選擇 德 實施例1.1 :材料 全部的組織培養試劑係購自於Gibco/BRL® ⑩ （Invitrogen，Carlsbad，CA)和 Hyclone (Hyclone，Logan, 10 11丁）。純系八細胞（由八？八丁11，1^(3,811^〇1^，]^0，所許可 的）係衍生自Huh-7細胞，一種人類肝癌細胞株。純系A細胞 含有每個細胞大概HCV基因型lb複製子的500至1000個基 因組複本，當係被維持於1 mg/ml G418的存在下之一種次 群集的單層内時。該純系A細胞内之複製子的序列係相似於 15 HCV的基因型lb Con 1菌株之序列（GENBANK⑧寄存編 號AJ238799)，具有在NS3 (Q1112R)和NS5A (S2204I)的2個 突變之例外之處。純系A細胞係於含有10%的胎牛血清(FCS; Hyclone)的杜貝可氏最低必須性培養基（DMEM; Gibco/BRL)中繁殖，補充以1%青黴素/鏈黴素(GibcoBRL)， 20 1%非必需胺基酸(Gibco/BRL)，1 mg/ml Geneticin™ (G418 硫酸鹽;GibcoBRL)以及 0_66 mM HEPES 緩衝液，Ph 7.5。 含有HCV基因型lbBB7複製子cDNA之質體ρΒΒ7也 是由APATH，LLC所許可的。pBJB7的編碼序列係相似於 HCV的基因型lb Con 1菌株之序列，除了於NS5A之内有一 77 200816990 種導致S2204I的一種胺基酸編碼改變之核苷酸突變之外。 全部其他的分子生物學試劑係自指出的供應商獲得。 . 實施例1·2 :細胞培養 • 大概3Χ1 〇純系Α細胞係以三重複被播種於一個τ_25組 5織培養燒瓶中，以及被培養於含有2% FCS之培養基内，其 • ;又有被’容解於二苯亞礙(DMSO，培養基内之最終濃度縮是 - 〇·5%，ν/ν)中之G418以及0.1或1 μΜ HCV-796。作為一種對 照’純系Α細胞係以類似方式於含有沒有化合物之〇.5% ^ DMSO的相同的培養基内予以傳代。當細胞密度達到的大 10概80%的群集時（大約2-3天），該等細胞被分開1:3於含有 HCV-796之新鮮的培養基内。來自各傳代的細胞之一分裝 ^ 部分係被收集以監測HCV RNA的位準。 當細胞内的HCV病毒量被降低以及達到一高原(大約 16天)’含有HCV-796和0·5 mg/ml G418的新鮮的培養基係 15 被加入以選擇含有複製子變異體的細胞。大概在選擇的2〇 天之後，抵抗抑制劑和抗生素之小的細胞群落變得可見以 及被集合。自0·1和1 μΜ HCV-796產生的抗性細胞(796R) 係各別地被定名為796R (0·1μΜ)和796R (ΙμΜ)。796R (0·1μΜ)和796R (ΙμΜ)的分裝部分係進一步地以10μΜ 20 HCV-796和0.5mg/ml G418予以培養以產生796R (ΙΟμΜ)細 胞。全部的抗性細胞係在分析之前於〇.5mg/ml G418的存在 下、在指出的藥物濃度下予以培養歷時至少3週。 為了確定選擇的再現性，含有複製子的基因型lb(BB7 分離株)細胞各別地於帶有〇.5mg/ml或Img/ml G418之 78 200816990 0· 1 μΜ或0·2μΜ的HCV-796的存在下予以培養歷時六傳代。 作為一種對照，含有複製子的基因型lb(BB7分離株)細胞係 以類似方式予以傳代，沒有HCV_796。 實施例1:3 :結果 5 為了選擇HCV-796-關聯的複製子變異體，擁有一種基 因型lb HCV複製子的細胞係以〇· 1和1 μΜ的HCV-796(於一 種3天分析中之各別地為HCV-796之1 〇和1 〇〇倍EC5()的等價） 予以處理多次。在16天的處理之尾聲，於HCV RNA的位準 大約3.6-log1()和4.2-log1()的減少係各別地於以〇.1和ΐμΜ 10 HCV-796予以處理的細胞之内觀察到（第ία圖）。一種基本 的（housekeeping)基因，GAPDH mRNA，的位準在整個16 天的期間中保持實質上未改變的（第1B圖）。此等結果暗示 HCV-796對於HCV複製具有一種直接的抗病毒效力，以及 該化合物係被該等細胞所耐受的。 15 該HCV複製子編碼一種可選擇藥物的基因（新黴素磷 酸轉移酶），其允許於G418的存在下、一種官功能性的複 製子的選擇。在藥物選擇的過程期間，只有含有對於 HCV-796有較低敏感性的複製子變異體之細胞存活以及產 生群落。此等變異體細胞的群落(796R)，被稱為796R(0.1 μΜ) 20和乃紐⑽⑷細胞，係被集中以及發展。抵抗性細胞的第三 個庫[796R (10μΜ)]係藉由以1〇 μΜ HCV-796進一步地處理 796ΓΙ(〇.1μΜ)和 796ΙΙ(1μΜ)細胞而產生。 憂異體細胞對於HCV-796的敏感性係藉由在增加的化 合物的濃度缺少或是存在下處理該等細胞歷時72小時而予 79 200816990 以評價。HCV RNA的位準係利用一種定量的TAQMAN® RT-PCR (PE Applied Biosystems，Foster City，CA)予以決 定。該等細胞以HCV-796的培養導致於對照和796R細胞2者 中之病毒RNA的位準之一種劑量依賴性的下降，暗示此等 5變異體對於該化合物不是完全抵抗的（第2圖）。在該化合物 於細胞培養液中的溶解度限制（56 μΜ)下，HCV-796各別地 於796Κ(0·1μΜ)、796R (ΙμΜ)和 796R (ΙΟμΜ)細胞中降低 HCV RNA的位準相差 1·4_ l〇g10、〇·7- l〇g1()和0.5-log1()。對照 細胞於11(：¥1^^八的位準具有2.14〇名1()的降低(表1)。79611細 10 胞與對照細胞内之HCV-796的EC5〇值之比較指出的該等複 製子變異體對於HCV-796具有23至>6812倍的較低敏感性 (表1)。變異體細胞之抵抗性的表現型係於另一個實驗中確 認，其中複製子變異體係於〇·1和〇·2μΜ HCV-796的存在下 予以選擇。大約25至65倍降低的敏感性係於第二個研究中 15 的變異體細胞之中觀察到。 實施例2 ·· HCVNS5B内的胺基酸編碼改變的作圖 實施例2·1:來自含有複製子的細胞之NS5B基因的單離和定序 總細胞RNA係利用一種MICRO-TO-MIDI™總RNA純 化系統（Invitrogen)而自含有複製子的細胞内萃取。含有 20 NS5B之cDNA係以一種2個·步驟RT/PCR反應予以產生。第 一股cDNA係利用RT-PCR之SUPERSCRIPT1^第一股合成 系統(Invitrogen)，藉由反轉錄(RT)、於含有01至0.3 的 總細胞RNA ， 2 pmole的引子 （7761R·· 5’-CGTTCATCGGTTGGGGAGTA-3，（序列辨識編號：3))和 80 200816990
10 nmole的各dNTP之一種1〇μ1反應中產生。該反應係被混 合，在65°C下被加熱歷時5分鐘以及被放置於冰上用於退火 引子和模版RNA。10毫升的RNA/引子混合物係被加入至9μ1 的SUPERSCRIPT™ II反應混合物内，其等包含10mM 5 DTT、5μΜ MgCl2和 40單位的 RNASEOUT· RNase抑制劑 (Invitrogen)。在42°C下培育反應混合物（19μ1)歷時2分鐘之 後，RT反應係藉由加入Ιμΐ的SUPERSCRIPT™ II反轉錄酶 (50單位）(Invitrogen)而起始，接著在42°C下培育歷時50分 鐘。反應在70°C下被終止歷時15min，接著在37°C下藉由以 10 RNase Η的水解歷時20min。為了擴增NS5B基因，2至4μ1 的RT-反應產物係被混合以1 〇 pmoles之引子的各個 (5919F: 5’-GATCTCAGCGACGGGTCTT-3’（序歹丨】辨識編 號：4) ; 7761R:如上)，10 nm〇les的各dNTPs，2單位的Taq DNA聚合酶以及由供應廠商提供的補充以ι·5 mM MgCl2的 15 lx缓衝液(Invitrogen)。該反應（最終體積是5〇yL)在95°C下 被進行歷時1 min，接著25個循環(95°C歷時30 sec ; 60°C歷 時30 sec以及72°C歷時2 min)以及在72°C延伸歷時7 min。 PCR的產物係被的藉由瓊脂糖凝膠電泳予以評價。在18 kb 的電泳帶被割去，以及cDNA片段係自凝膠予以萃取。cdNA 20被連接與PCR4-TOPO™載體（Invitrogen)，以及形成的重組 型DNA質體係依據製造商·的指示而被轉形至one SHOT⑧ 化學勝任(chemical-competent)大腸桿菌（定序之ΤΟΡΟ® ΤΑ CLONING kit (Invitrogen))。質體内的HCV NS5B插入物的 存在係藉由EcoRI的水解予以證實。含有HCVNS5B插入物 81 200816990 5 的質體係利用ABI PRISM® BIGDYE⑧終止子循環定序現 成的反應套組v3.〇(Applied Biosystems，Foster City，CA)而 接受核苷酸定序。定序反應係以20 μΐ的最終體積被建立於 一種個96井PCR盤内。反應混合物由的1 μΐ的現成的終止劑 (terminator-ready)反應混合物，3·5 μΐ的5Χ定序緩衝液，3.2 pmoles的引子以及500 ng的質體DNA構成。定序反應係在 依照製造者的指示之條件下予以實施。被定序的產物係利 用 DYEEX™ 9ό套組(Qiagen，Valencia，CA)予以凝膠純化， 徹底乾燥，以甲醛予以變性，以及藉由利用一種ABI 10 PRISM® 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)之電泳 予以分離。序列數據係利用SEQUENCHER® v4.0 (Gene Codes Corp·，Ann Arbor, MI)予以分析。 實施例2.2 :結果 15 • ^ HCV-796是抑制HCV NS5B RdRp之一種有效力的以及 選擇性抑制劑（數據未顯示）。與HCV-796錯合的NS5B的結 晶結構顯示的HCV-796結合接近於酶的掌心領域之催化的 位址（數據未顯示）。因此，很可能於79611細胞内觀察到的 抗性係由於NS5B之内的突變。為了作圖NS5B之内的胺基 酸編碼改變，總細胞RNA係自796R細胞予以萃取。編碼 20 NS5B的基因段係藉由rt-PCR予以擴增，接著藉由選殖以 及轉形至大腸桿菌。含有一種全長的NS5B基因之93種細菌 純系被定序。另外，含有衍生自對照純系A細胞的NS5B基 因之11種純系係被使用作為比較器。 82 200816990 如表2A中顯示的，自對照細胞製備的NS5B包含帶著非 特異性形態之隨機的胺基酸編碼改變。在11種純系之中總 計32個胺基酸編碼改變被觀察到，具有每種純系3個胺基酸 編碼改變的一平均。全部的胺基酸編碼改變含有一種核苷 5 酸變化每個胺基酸，其導致HCV複製子之每個核苷酸 1·6χ10_3突變的一突變率。 於NS5B之内的數種獨特的突變，其等未被發現於於對 照細胞内，係於衍生自796R細胞的93種純系内被觀察到（表 2Β)。特別感興趣的是於HCV-796結合袋的5Α之内的突變， 10 其等包括：胺基酸316(Cys變成Tyr，10種純系；Cys變成 Phe，17種純系；Cys變成Ser，6種純系），363(Ile變成Val， 4種純系），365 (Ser變成Leu，23種純系；Ser變成Ala，3種 純系；Ser變成Thr，4種純系），368(Ser變成Phe，2種純系） 以及414(Met變成lie，11種純系；Met變成Thr，2種純系）。 15 一種在胺基酸314(Leu變成Phe)之額外的變化係於第二個研 究中被觀察到。如第3A圖中闡明的，關鍵的胺基酸取代係 分佈於藥物結合袋之内的5個結構組份之中；即，活化位址 環、富含絲胺酸(Cys366)環，以及a-螺旋Μ，α-螺旋G和Tyr448 環。胺基酸L314和C316係位於活化位址環之内，1363、S365 20 和S368係位於富含絲胺酸環内，以及M414突變係位於α•螺 旋Μ内。全部的此等胺基酸與HCV-796有直接的交互作用， 如於NS5B-HCV-796錯合物的結晶結構中鑑定的（第3Β 圖）。多數突變以落在2-18%的範圍内之一個頻率發生，除 了 C316Y/F/S、S365L/T/A和C445F之外，其等係各別地以 83 200816990 36%、31%和54%發生(表2B)。半胱胺酸445係座落於最接近 HCV-796結合袋。C445F的取代係於由其他種類的HCV聚合 酶抑制劑予以選擇的複製子變異體之内頻繁地發現。 為了評估是否於複製子變異體内之NS5B中有任何突 5 變的模式，僅與其他的取代組合出現之胺基酸取代係被評 價。於DMSO-處理的對照細胞内出現，且僅發生一次的胺 基酸取代被認為是隨機突變，以及不被包括於評估中。利 用此等標準，總計24個NS5B之内的胺基酸編碼改變係被觀 察到（表2B)。胺基酸編碼改變的嚴密檢查顯露出7種突變的 10 模式（表3)。K355R和C445F被發現於796R細胞的全部的3個 庫之内。V85L、F162Y和C316F，有或沒有T19P ;以及 C316S/Y和C445F被發現於以1和10 μΜ HCV-796選擇的複 製子變異體之内。剩下的3種組合：Ρ197Α、C445F和 V581A ; C316Y和Μ414Ι ;以及S365L和Τ390Ι被發現不是 15 796R(1 μΜ)就是796R(10 μΜ)變異體細胞内。於一些複製子 變異體中，C445F或S365L存在為唯一的胺基酸編碼改變（表 2Β)。 實施例3:於複製子變異體中之胺基酸取代的特性化 實施例3·1: ΒΒ7複製子變異體質體的建構 2〇 標準的重組DNA技術係被使用以建構且純化ΒΒ7複製 子變異體質體。全部的NS5B變異體起始係利用質體 NS5B-BB7dCT21_His作為輸入模版來產生(H〇we等人(2004) dgewe CAem· 48:4813-21)。單一核普酸變化 係依據製造者的程序、利用QUIKCHANGE® XL定點突變 84 200816990 套組（Stratagene，La Jolla，CA)予以導入。被使用於定點突 變的寡核苷酸引子的序列係被指出如下（F (順向）和反 向)): L314F(c940t-F)(序列辨識編號：5) 5 5,-AGGACTGCACGATGTTCGTATGCGGAGACG-3’ L314F(c940t-R)(序列辨識編號：6) 5,-CGTCTCCGCATACGAACATCGTGCAGTCCT-3， 10 C316F(g947t-F)(序列辨識編號：7)
5’ -GCACGATGCTCGTATTCGGAGACGACCTTGTC-3’ C316F(g947t-R)(序列辨識編號：8) 5’ -GACAAGGTCGTCTCCGAATACGAGCATCGTGC-3’ C316S (t946a-F)(序列辨識編號：9) 5’-GCACGATGCTCGTAAGCGGAGACGACCTTG-3’ C316S(t946a-R)(序列辨識編號：10) 20 5’-CAAGGTCGTCTCCGCTTACGAGCATCGTGC-3’ S365L (cl094t-F)(序列辨識編號：11) 5’-GACTTGGAGTTGATAACATTATGCTCCTCCAATGTGTCAG-3’ 25 S365L(cl094t-R)(序列辨識編號：12) 5’-CTGACACATTGGAGGAGCATAATGTTATCAACTCCAAGTC-3’ S365A(tl093g-F)(序列辨識編號：13) 5’-CTTGGAGTTGATAACAGCATGCTCCTCCAATGTG-3’ S365A(tl093g-R)(序列辨識編號：14) 5’ -CACATTGGAGGAGCATGCTGTTATCAACTCCAAG-3’ S365T(tl093a-F)(序列辨識編號：15) 85 200816990 5’-GACTTGGAGTTGATAACAACATGCTCCTCCAATGTGTC-3’ 5 S365T(t 1093a-R)(序列辨識編號·· 16) 5’-GACACATTG GAGGAG CAT GTTGTTATCAACTCCAAGTC-3’ S368F(c7085t-F)(序列辨識編號：17) 5，-GATAACATCATGCTCCTTCAATGTGTCAGTCGCG-3’ ， 10 S368F(c7085t-R)(序列辨識編號：18) 5,-CGCGACTGACACATTGAAGGAGCATGATGTTATC-3， • M414T(tl241c-F)(序列辨識編號：19) 5, -TAGGCAACATCATCACGTATGCGCCCACCTTG-3’ 15 M414T(tl241c-R)(序列辨識編號·· 20) 5’-CAAGGTGGGCGCATACGTGATGATGTTGCCTA-3’ 20 M414V(al240g-F)(序列辨識編號：21) 5,-CTAGGCAACATCATCGTGTATGCGCCCACCTT-3， M414V(al240g-R)(序列辨識編號：22) 5’-AAGGTGGGCGCATACACGATGATGTTGCCTAG-3， ·， 25 為了 製備表現質體NS5B-BB7dCT21-His(C316Y)，一種 點突變係於質體NS5B-BB7dCT21-His之内被製造以改變 TGC密碼子（半胱胺酸)成為一種TAC密碼子（酪胺酸）。為了 製備表現質體NS5B_BB7dCT21 -His(C316N)，一種雙重的點 突變係於質體pRSET-BB7dCT21-His之内被製造以改變 TGC密碼子（半胱胺酸)成為一種AAC(天冬醯胺酸）。為了製 備表現質體NS5B-BKdCT21(N316C)，一種雙重的點突變係 30 於質體pRSET_BKdCT21 _His之内被製造以改變AAC(天冬 醯胺酸)成為一種TGC密碼子（半胱胺酸）。為了製備表現質 86 200816990 體NS5B-BB7dCT21-His(M414I)，一種點突變係於質體 NS5B-BB7dCT21-His之内被製造以改變ATG密碼子（甲硫 胺酸)成為一種ATC密碼子（異白胺酸）。為了製備表現質體 NS5B-BB7dCT21-His(I363V)，一種點突變係於質體 5 NS5B-BB7dCT21-His之内被製造以改變ΑΤΑ密碼子（異白胺 酸)成為一種GTA密碼子（綠胺酸）。單獨的純系被定序以確 認所欲的突變的存在以及其他的變化之缺乏。 為 了製備pBB7_L314F、pBB7-C316F/S/Y/N、pBB7-B63V、 pBB7-S365L/A/T、pBB7-S368F和pBB7-M414/T/V/I，來自質體 10 NS5B-BB7dCT21-His(L314F)? NS5B-BB7dCT21-His(C316F/SAr/N)? NS5B-BB7dCT21 -His(I363V)5 NS5B-BB7dCT21 -His(S365L/A/T), NS5B-BB7dCT21 -His(S368F)和 NS5B-BB7dCT21 -His(M414T/V/I)之 Bsu36I片段係被選殖至以Bsu36I予以水解的 pHCVreplb.BB7(由APATH LLC許可的）骨幹内。ρΒΒ7·質體 15 被定序以癌認NS5B的編碼序列之内的預期的單一核苷酸 變化。 實施例3.2··培養細胞的RNA轉錄和電穿孔 ρΒΒ7·複製子變異體DNA係以Sea I予以線形化，以及 活體外轉錄係利用Ambion的MEGASCRIPT® T7高產率轉 20錄套組(Austin，τχ)予以執行。被純化的RNA轉錄品係利用 一種Biorad GENE PULSER⑧電穿孔系統(設定：270V，950 pF) (Hercules，CA)以四重複予以電穿孔進入Huh-7細胞。安 定地轉染的複製子變異體細胞株起始係以〇.25 mg/ml G418 予以選擇以及在進一步地測試之前升級至丨mg/ml。一個細 87 200816990 胞平盤係以結晶紫予以染色以看得見群落的數目以及決定 群落形成效率。來自各平盤之各別的細胞純系係被集合以 . 及擴展用於藥物敏感性的測試。在一個早期傳代之各複製 子變異體的NS5B基因係被定序以確認NS5B的編碼區之預 5期的核苷酸變化的存在。沒有任何其他影響NS5B的胺基酸 * 序列的變化被觀察到。 . 實施例3·3: NS5B酶變異體的表現和純化 全部的NS5B酶係依據如說明的NS5B_BB7dCT21-His 的秀王序 專尺Antimicrobial Agents Chem· 10 48:4813-21)予以表現和純化。簡單地說，表現質體係被轉 形至大腸桿菌細胞内以及NS5B表現係藉由異丙基-貝它 (P)-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的加入予以起始。在4至6小時 的培養之後，該等細胞被收穫以及被溶解。NS5B酶係藉由 利用一種錄親和管柱之層析（Talon，BD Biosciences， 15 Clontech Laboratories，Inc” Mountain View，CA))予以純 鲁 化，接著一種陽離子交換管柱（Poros HS, Applied
Biosystems，Foster City，CA)。 ’ 實施例3.4 :結果 各別的胺基酸編碼改變對於抗藥性之貢獻係於基因型 20 lb，BB7適應性複製子的背景下之NS5B内的含有單一胺基 酸的突變之複製子變異體中予以評估（Blight等人(2000) Sconce 290:1972-74)。複製子變異體係於一種3天的分析 内、在HCV-796之提高的濃度缺少或存在的情況下予以測 試。於活化位址環之内，胺基酸314自白胺酸變成苯丙胺酸 88 200816990 的改變（L314F)沒有改變複製子内對於HCV-796的敏感性 (表4)。相對地，半胱胺酸316以苯丙胺酸或酪胺酸或絲胺酸 的取代(C316F/Y/S)導致392、501和30 ιιΜ的EC5〇值，其等 各別地比野生型lb，BB7複製子的EC5G值更大130、166和10 5 倍(表4)。另一種複製子變異體，C316N，其未於複製子的 • 抗性選擇中發現，但是被報導是組成NIH基因序列資料庫 • (GenBank)内之天然的分離株的40%的NS5B序列，顯示對於 HCV-796超過26倍的較低的敏感性。 _ 雖然於富含絲胺酸環之内的殘基363 (I363V)和 10 368(S368F)的改變對於HCV-796的敏感性有一種不太大的 效力，絲胺酸365之以丙胺酸或酥胺酸之取代（S365A/T)各 ， 別地導致對於該化合物之41和212倍降低的敏感性(表4)。 於α-螺旋Μ内，甲硫胺酸414之以異白胺酸或纈胺酸的 取代(M414I/V)導致複製子EC5G值之低至中等的增加，其導 15 致對於HCV-796之3-8倍降低的敏感性（表4)。甲硫胺酸414 ^ ^ 變成酥胺酸的改變沒有改變複製子内之對於HCV_796的敏 感性。 胺基酸取代的對於病毒的適當性和生長動力學的影響 係以菌落形成效率和含有複製子的細胞内之穩態HCV 20 RNA的位準為基礎而予以估計。複製子RNA的轉染進入 Huh-7細胞導致在轉染之後2〇天之内、於G418的的存在下 之菌落形成。以於NS5B之内含有一種GAA突變的RNA予 以轉染的或是被虛擬轉染的Huh-7細胞内沒有獲得群落(結 果未顯示）。如表5中顯示的，複製子變異體之菌落形成效 89 200816990 率係以10至200倍的次序比野生型BB7複製子更少，暗示 NS5B内的胺基酸取代可能對於病毒的適當性具有一種不 利的效力。於複製子變異體L314F、I363V和M414V内之穩 態HCV RNA的位準當相較於野生型BB7複製子時是4至9倍 5更少，以及至於幻651^其無法產生一種安定的細胞株（表 4)。很可能於此等複製子變異體内的Ν85Β《中的突變已經 導入一種對於病毒的複製有害的效力。應該注意到可比較 的HCV RNA之穩態的位準係於79611的庫和對照純系a細 胞中被觀察到（表1)。可能補償的突變可能已經發生於複製 10子基因組的其他部分，因此恢復病毒的RNA至野生型的位 準。 實施例4 : HCV-796於突變的NS5B酶内之抑制活性 為了評估HCV-796對於複製子變異體内之聚合酶的活 性的效力，在胺基酸316、414和363處以單一取代予以分子 15設計的重組型基因型A，BB7NS5B酶係被選殖以及被表現 於大腸桿菌内。經純化的突變酶之聚合酶的活性係在漸增 濃度的HCV-796缺少或存在的情況下、於一種生化分析中 予以評價。相似於複製子變異體，當相較於野生型酶時， 聚合酶變異體顯示一種對於HCV_796i較低的敏感性，儘 2〇 $抗性的位準係實質減輕的。在酶變異體之中，胺基酸316 自半胱胺酸成為天冬醯胺酸或酪胺酸或苯丙胺酸的取代 (C316N/Y/F)導致對於HCV-796之2至125倍的降低的敏感 I4生’反之曱硫胺酸414成為綠胺酸或異白胺酸的取代 (M414V/I)，以及異白胺酸363成為纈胺酸的取代(I363V)於 200816990 對於該化合物的藥物敏感性上顯示出沒有可以察覺到的不 同（表6)。 於生化分析中，來自基因型lb分離株BK和J4的重組型 HCVNS5B酶，其等在位置316各含有一個天冬醯胺酸，比 5 在此位置含有一個半胱胺酸的那些對於HCV-796是較不 敏感的（數據未顯示）。為了轉定是否天冬醯胺酸和半胱胺酸 對於HCV-796的敏感性具有相反的效力，衍生自基因型化 BK分離株的NS5B酶被設計為在胺基酸316處以一個單一天 冬醯胺酸變成半胱胺酸的改變(BK_N316c)。此酶變異體對 10於HCV-796是比野生型BK酶4.5倍更敏感的（表6)，其確認此 殘基對於HCV-796的藥物敏感性之重要性。 實施例5:於含有抗HCV-796複製子的細胞内之抗病毒劑的活性 實施例5.1 :抗病毒劑於複製子變異體中之評估 含有複製子的細胞對於各種各樣的化合物之藥物敏感 15性係如之前說明的方式予以評價（Howe等人（2004) 如⑼b Chm· 48:4813-21)。簡單地說，細胞 係在37。(：和5% C〇2之下、於含有2% FCS以及沒有G418的 培養基内、以漸增濃度的化合物予以處理歷時3天。在培養 之後，來自含有複製子的細胞之總RNA係被單離。HCV、 20甘油醛3 -磷酸脫氫酶(GAPDH)和核糖體(1*1^八)1^八的位準 係利用 TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) 反轉錄酶PCR反應予以定量。各樣本中之HCV、18S核糖 體’和GAH3HRNA的量係藉由比較在PCr的擴增的指數期 期間之循環的數目與對應的標準曲線之循環的數目而予以 200816990 估計。被用於建構標準曲線的HCVRNA標準品係藉由自純 系A細胞而萃取總RNA予以製備。RNA樣本被送至國家遺 傳研究院(National Genetics Institute)以定量 HCV RNA。自 純系A細胞萃取的總rN a係藉由〇 · D · 2 6 〇測量予以定量以及 5 被使用於rRNA和GAPDH的標準曲線之建構。抑制50%的 HCV RNA的位準之化合物的濃度（EC5G)係於微軟 EXCEL⑧、禾J 用 MDL® LIFE SCIENCE WORKBENCH® (LSW)數據分析軟體（MDL Information Systems，San Leandro, CA)予以決定。樣本中之HCV或GAPDH RNA的量 10 係各別地被表達為每的總RNA之HCV RNA(複本）或 GAPDH(ng)，利用rRNA作為總RNA測量的一種標誌。 實施例5.2 :結果 抗病毒劑小組，包括2個廣效性抗病毒劑和一種HCV專 一性抑制劑，的抗病毒活性係於C316Y複製子變異體以及 !5由HCV-796選擇的變異體細胞庫之中予以評價。聚乙烯二 醇化干擾素和雷巴威林，2者均已經顯示出對抗許多的病毒 的抗病毒活性(Akahane等人（1999)·/· Med Fz>a/. 58:196-200; Hartman 等人（2003) /W· Z)以βαπ J. 22:224-9;
Lanford等人(2003) J·巧>〇/. 77:1092-104; McCormick等人 20 (1984) Z⑽cw 2:1367-9; McCormick等人（1986)枞仏g/· 乂 M^/· 314:20-6; Umemura等人(2002) 35:953_9;
Yu等人(2001) JWWrfl/及⑵· 52:241-9)，如同於野生型複製 子之内一般有效地抑制C316Y複製子變異體内之HCV複 製(表7)。雷巴威林也抑制含有其他的HCV-796-關聯的胺基 92 200816990 酸突變之複製子變異體(數據未顯示）。
浪喃吲哚HCV聚合酶抑制劑HCV»371([(lR)-5-氰基 -8-甲基-1-丙基-1，3,4,9-四氫σ底喃[3,4-b] 卜朵-1-基]乙酸 ([(lR)-5-cyano-8-methyl-l-propyM，3,4,9-tetrahydropyano[3 5 ，4-b]indol-l-yl] acetic acid))對抗複製子變異體的活性也被 評價。HCV-371已經顯示要結合在]sjS5B内之一個與 HCV-796不同的位址(Howe專人(2004) Antimicrobial Agents Chem· 48:4813-21)。與HCV-796形成對比，HCV-371 以相似 的活性抑制野生型和C316Y複製子2者(表7)。 10 合起來，此等結果暗示由HCV 796選擇的抗性對於苯 并呋喃類的抑制劑是專一的，以及複製子變異體對於聚乙 烯二醇化干擾素、雷巴威林和其他的抗HCV化合物仍是敏 感的。 表1: HCV-796對抗複製子變異體的活性 細胞a ECS0 (μΜ) 士 SDb 平均l〇g10 病毒的降低^ 純系A 0.013 土 0.013 (n=8) - 3·7±2_4χ 108 2.1 ± 0·4 (0·7 μΜ) 796Κ(0.1μΜ) 0.3 土 0.2 (n=4) 23 2·9±〇·5χ 108 1.4 ±0.3 (56 μΜ) 796Κ(1μΜ) 8.0 ± 5·2 (n=12) 618 2.4 ± 2.0 x l〇8 0·7 土 0·2 (56 μΜ) 796Κ(10μΜ) >88.0 (n= 4) >6812 4.1±1·7χ108 0·5 ± 0.3 (56 μΜ) 15 a: =R^i^CV_796是較小敏感的細胞。被使用於選擇之HCV-796的濃度係被指示 c:病f量的f低係於一種3天的分析中、以圓括號内指示的合 表示病毒的祖之平均log的降低鱗偏差。結果表數據 93 20 200816990
556 m o ΓΛ cn P-i t〇 Pi 〇 478 m Ah t-H < H 465 Pi a h4 1¾ 432 H-4 > > 424 'M H H > 412 >-< H 407 m 369 c〇 CO in m Oh jn m ό 322 > < m CN HH H 1-H m C4 Q Q ΓΝΪ oo； i—Hi. o t—f < > in (N P z CSI (N > < 卜 1—4 m i—l > 2 r—4 Ρί Os M oi Pi 一 m H < H 胺基酸 pBB7 p7-l p7-2 m 1 P7-4 j 1 p7-6 p7-7 oo p7-9 p740 p7-ll 94 200816990 t(^f f 齧蝴^ΝεραςϋοΝ^_1Ή96卜孤却絮：a(N4 GO «η > 534 > > Pk 514 σ |445 υ Ρη .¾ 1¾ fe 1¾ & 442 < |440 I 414 § μ >-H 1—ί |390 Η [368 CO I 365 m < |363 Η > > 丨355 Ρί Ρί Pi |329 Η |316 U Pk fa |286 Κ [201 > < < Ο, f—4 00 Η I 162 fe > I 147 > o\ < 00 > h4: 2 Η PU (¾ PL> 寸 胺基酸 ρΒΒ7 ρ14 Ο I α ρ1-26 pl-27 pl-25 p3-8 p3-22 n a p3-2 p3-n p3-5 ! 1 P3-14 1 ΙΛ 00 CN T—H a p3-l pl-1 a ΤΠ i p34 p3-2S p4-2 p4-3 1 in 4 p4-7 00 i 經單離 的純系 Ο.ΙμΜ HCV-796 1 HCV-796 95 200816990
<當赞埭)¾爸 ff-f4IWcH?SMs遥宙 Γϋ96Λ€Ι^絮：a(N« ㈣ > A/V < < < < < < a 445 1 U CiF\ ft ll4 A 1¾ fe tu fe； 1¾ .¾ Pu 442 < 440 m 414] S 1:390 Η 13681 m 365 m L/S < H .j 1363] Η > > 13551 Ρί 1329 1 h Ι316Ί U ilH PM 03 00 m 00 s/a |286| H |201| > C < |:197| 〇l 1 < < < < < < C * 丨181| H [162| ΠΪ471 > αί < 00 > Os τ-Η H CL< fXi 寸 > 丨胺基酸 卜 m m o 4 D PCR4 1 PCR4M C\ 4 O T—· ' a PCR6 00 Os ά _ a P.6-1 \〇 .a rn t a f*4 v〇 'A \Q <N \D a 00 νό • p. Γ4 rH A ^ PL & fO ϊ-^ί On a ά cn ά n 6s a ά a PCR9 Ch A〇 〇\ a 寸 t—r i p6_4 r- λ〇 Q, 寸 T"M Os a 經單離 的純系 ΙμΜ HCV-796 96 200816990
(§'憋豫)t<^ff 韃猶集 WCCQ?SN^遥田ra96£®^$:': az:_ > 1 534 一 |514 σ Di 445 υ PN fe 442 c H H |440 m 0 0 [414 S H-< hH! HHi HH HH H 390 H >-H HH JMH hH — HH >H 1 368 Q0 fci 丨365 m L/S h4 a [363 H |355 Vi Pi |329 H HH HH 丨316 ϋ .卜 C/Y > > > > C/F |286 H < 丨201 > 1197 00 H K-4 H-4 HH 162 >< Y/F |147 > M M 卜 os < 00 > w4 •4 Os H < Oh Oh λ Pu 寸 in ffi 胺基酸 m PQ a γ—4 1 1 <N T-H a cn r—t P, in wv — 1 PCR41 卜 二 1 Ϊ cn 〇\ t & \o t 寸 Λ «Λ 1—4 4 4 4 V 2 4 a 4 1 CO 4 1 PCR44 »r> — VD 1 VO v〇 1 PCR46 p46-7 p46-14 p46-8 p46，12 經單離 的純系 ΙΟμΜ HCV-796 97 200816990
(霜螫 #s'Mf€馕讀爾碌srSWSM奪讀薦 1:961 镏韻奪：©!:« ψ^. m m > 卜 ir> 呀 m m 对 m 寸 m σ Μ ㈣ c^i 5 u Cl« ίΐκ 1^4 Ui Ο m m m m u •c :㈣ M e4 o 1¾ 04 d 寸 呀 :S: rn o 2* Ο 〇\ cn H ㈣： H^i ¥^i Ο 00 d m m <Ν <N O m m pj： -4 Η Η Η < S ν4 wJ 〇\ €Η <N rn m \D CO m tA ΓΛ οί 〇4 Ρ4: fn o 寸♦ ψ··*% €Ni m H m ΓΗ fn U fn ii C4 rn m H #(¾ m > 的 寸 Ss 00 礞 od 00 H 贫丨 cn CN1 s〇 ψ"*4 i tx* m \ 寸 :〇ζ φ*^4 > C4 〇i οΐ 〇% < >\ CS c4 00 > oo <h Q\ N < 寸 <.*,mntf >4 iSt <N f-i r^ ω m tx Os ND 寸 o. v—e 's〇 寸 cu m ⑽ 1 呀 臂 s« m r·^ « 6s 寸 P. 臂， m Γ^Ι ά % § Η CM — 1 01 CM t Ott ο % 學囊 m 齋 m s C 藝 M 鑤儀 丨醉瀠 屬s ΙΟμΜ HC^796, 98 200816990 表3 :複製子變異體中之胺基酸取代的組合 胺基睃取代的組合a 純系的數目 _ (從93個纯糸） 突變的頻率(％) K355R 和 C445F1 12 13.0 ’ V85L、F162Y和 C316F2 17 18.3 V85L、F162Y、C316F和 T19P2 9 9.7 C316S/Y 和 C445F2 9 9.7 P197A、C445F和V581A3 8 8.6 C316Y 和且 414I4 7 7.5 S365L 和 T390I4 10 11.0 * 1 a: NS5B基因係由選擇自以下的抗性複製子庫予以擴增以及定序：1 0.1、1和 ΙΟμΜ HCV-796 ; 21 和 ΙΟμΜ HCV-796 ; 31μΜ HCV-796和410μΜ HCV-796。 表4 : HCV-796對抗HCV-796複製子變異體的活性 複製子變異體3 HCV RNA EC50 (nM) 土 SDb 抗性的倍 數 病毒董 (HCV複本㈣） 土 SD 病毒量 的降低e lb, BB7 3.0 土 1.0(n=ll) - 1·8土 l.lxlO8 1·9 士 0.3 lb, BB7-L314F 4 ± 2 (n=4) 1 0.3 土 0·1 x 108 1.6 ± 0.3 lb，BB7-C316F 392 ± 209 (n=4) 130 1.0 土 0·2χ ΙΟ8 0_8±0·5 lb, BB7-C316Y 501土 291(n=4) 166 1.3 土 0·6χ108 0.9 土 0.2 1b，BB7-C316Nd 220±110 (n=4) 26d Ν/Α Ν/Α lb，BB7-C316S 30 土 4 (n=4) 10 1·3±0.7χ108 1.3 ±0.1 lb, BB7-I363V 16 土 5 (n=3) 5 0·2 土 0.1 χ ΙΟ8 1.4 ±0.1 ^ 1b，BB7S365A 124 土 41 (n=4) 41 1.2 ±0.3 χΙΟ8 1.7 ±0.1 lb, BB7-S365T 643 士 168 (n=4) 212 1·3 士 0.6 χ ΙΟ8 0.6 ± 0.1 lb，BB7-S365L N/Ae N/Ae N/Ae N/Ae lb, BB7-S368F 5 土 2 (n=4) 2 2.6 ±1.2 χ ΙΟ8 1.4 ±0.3 1b，BB7_M414I 23 士 3 (n=5) 8 1.3 ± 0.5 χ ΙΟ8 1.5 ± 0.2 lb, BB7-M414T 3 士 1 (n=4) 1 1.5 土 0.7 χΙΟ8 2.0 ±〇.2 lb, BB7-M414V 8 ± 1(n=3) 3 0.4 ±0.1 χΙΟ8 1·5±0.1 ----- a · ，1515,衣不mv丞囚型比，灿7分離株。複製子NS5B變異體的命名（例如， L314F)係以輸入複製子的胺基酸，胺基酸位置和胺基酸取4予以表達。 b : EQo值係利用MDLLSW數據分析™予以決定。抑制活性係被表達為平均Ec 土標J偏差。η指出測定的數目。 50 c :病香量的降低係於一個3天的分析中、在2240nM HCV-796下予以決定。數攄 手示病毒RNA之平均的log的降低土標準偏差。結果表示至少3個獨立的測定。 d: lb，BB7_C316N的評估係於一個獨立的實驗室+被評價。lb，BB‘之HCV-796 99 15 1 4 (n=14l，其係被使用以計算1b，BB7-C316N的抗性倍數。 2 e · ‘衣孕變異體S365L當以G418選擇時無法建立一種安定的細胞株。 200816990 表5 : Huh-7細胞内之複製子變異體的群落形成效率
複製子變異體 CF_g RNA lb，BB7對照 20,000 L314F 1500 C316F 3,000- 5,000 C316S 3,000 - 5,000 I363V 100 S365A 1000 S365T 120 S365L 20a M414V 500 M414T 3000 a:無法於G418選擇後存活
m IC^〇 fnM) ± SD BB7 iC316、 40 + 20 in=35、 BB7-C316N 81 土 42 in=4、 BB7-C316Y 320 ±10 BB7-C316F 1508 ± 419 BB7-M414V 28 + 2 in=3> BB7-M414I 24 + 6 fn=3> BB7-I363V 60 + 10in+3) ΒΚ ίΝ316、 140 ± 50 (n=3^ BK-N316C 31 ± 4 in=3、 野生型酶的敏_&感性 2倍i少 8倍更少 124倍更少 L4倍更多 U倍更多 1^5倍更少
C316Y RBV lb，BB7(WT) 132·6±40·5 (η=5) C316Y 200.9 ±36.7 (η=3) 1.8 HCV-371
lb，BB7 (WT) C316Y 12.2 土 1.8 (n=2) 10·8 士 0.8 (n=2) 0.9 a:表達為pg/ml 100 200816990 表8 ··天然的HCV分離株之胺基酸發生 基因型a 314 316 363 胺基酸 365 368 414 445 la(n=142) 97% Leu 3%Val 100% Cys 100% He 99% Ser l%Tip 100% Ser 100% Met 100% Cys lb(n=117) 100% Leu 40% Asn 56.5% Cys 3.5% Tyr 100% fle 100% Ser 100% Ser 100% Met 100% Cys 2 (n=13) 100% Leu 100% Cys 100% De 100% Ser 100% Ser 100% Gin 100% Phe 3b(n=45) 100% Leu 100% Cys 100% He 100% Ser 100% Ser 100% Met 100% Phe 4(n=22) 100% Leu 95.5% Cys 4.5% Asn 100% Me 100% Ser 100% Ser 100% Val 100% Phe 5(n=2) 100% Leu 100% Cys 100% Val 100% Ser 100% Ser 100% Met 100% Phe 6 (n=2) 100% Leu 100% Cys 100% He 100% Ser 100% Ser 100% Met 100% Phe a: η指出於GenBank中發現的全長的HCV分離株的數目
【圖式簡單說明3
第1圖顯示以HCV-796之純系A細胞的多重的處理。純 5 系A細胞係以配於含有2% FCS和0.5% DMSO的DMEM培養 基（沒有G418)中之0·1 μΜ和1 μΜ的HCV-796予以處理。細 胞分裝部分中之HCV RNA和rRNA的量係利用一種定量的 雙重的TAQMAN® RT-PCR予以估計。Y轴表示每pg的總細 胞RNA之HCV複本(利用rRNA作為一種定量的標誌）。各數 10 據點表示3個複製品之一平均值。（第1A圖）HCV-796對於 HCV RNA的效力。（第 1B圖）HCV-796對於GAPDH RNA的 效力。
第2圖顯示HCV-796對於藉由HCV 796選擇的變異體細 胞的效力。純系A和796R細胞係以每井7〇〇〇個細胞予以播 15 種於一種96井組織培養皿内’以及在缺少G418的情況下、 以漸增濃度的HCV-796予以處理。來自培養物之HCV RNA 101 200816990 的位準係被表達為％ HCV RNA相關於對照。各點表示的4 個複製品一平均。於含有複製子的細胞内之抑制5〇%的 HCVRNA的位準(EC^)之有效的濃度係被指示。 弟3圖顯示HCV-796關聯的胺基酸突變之結晶結構。 5該蛋白係以一種理想化的帶狀物予以表示。HCV-796係被 描晝為一種凡得瓦爾表面。（第3A圖）與HCV-796交互作用 的NS5B之結構組份。含有抗性突變的NS5B之結構組份係 被指出（α-螺旋G，活化位址環，酿胺酸448環，α_螺旋]VI， 以及半胱胺酸366(富含絲胺酸）環）。（第3Β圖）於C型肝炎 10 RNA依賴型RNA聚合酶NS5Β的HCV-796結合袋之内的胺 基酸，於該處藉由HCV-796選擇的複製子變異體内之取代 係被觀察。苯并呋喃的甲基-乙醯胺基團係被指出。 第4圖顯示介於HCV-796和C型肝炎RNA依賴型RN A聚 合酶NS5B的HCV-796結合袋内的胺基酸之間的交互作 15 用，以及突變C316F與HCV-796如何抵觸。（第4A圖）介於 HCV-796和該HCV-796結合袋内的胺基酸之間的交互作 用。HCV-796係被顯示為一種分子表面。於一種5A球體之 内的全部的殘基係被顯示為棒狀物。於抗性複製子菌株内 之突變的殘基係以粗鍵顯示。（第4B®)突變C316F與 20 HCV-796抵觸。重疊凡得瓦爾表面（箭頭）指出介於HCV-796 和抗性的突變C316F之一種假設的模型之間的衝突。 【主要元件符號說明】 (無) 102 序列表 200816990 〈110>惠氏 維若醫藥股份有限公司 <120〉鑑定及特性化對於HCV-796有較低敏感性的HCV複製子變異體，以及其之相關方法 <130〉 03127.002200 <150> US 60/840,353 <151〉 2006-08-25 <160〉 22 <170〉Patentln 版本3. 3 <210〉 1 <211> 1773 <212> RNA 〈213> C型肝炎病毒 <220〉
<221> CDS <222〉（1).· (1773) <400〉 1 ucg aug ucc uac aca ugg aca ggc gcc cug auc acg cca ugc gcu gcg 48
Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu lie Thr Pro Cys Ala Ala 15 10 15 gag gaa acc aag cug ccc auc aau gca cug age aac ucu uug cue cgu 96
Glu Glu Thr Lys Leu Pro lie Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg 20 25 30 cac cac aac uug guc uau gcu aca aca ucu ege age gca age cug egg 144
His His Asn Leu Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg 35 40 45 cag aag aag guc acc uuu gac aga cug cag guc cug gac gac cac uac 192
Gin Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Val Leu Asp Asp His Tyr 50 55 60 egg gac gug cue aag gag aug aag gcg aag gcg ucc aca guu aag gcu 240
Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala 65 70 75 80 aaa cuu cua ucc gug gag gaa gcc ugu aag cug acg ccc cca cau ucg 288
Lys Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser 85 90 95 gcc aga ucu aaa uuu ggc uau ggg gca aag gac guc egg aac cua ucc 336
Ala Arg Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser 100 105 110 age aag gcc guu aac cac auc ege ucc gug ugg aag gac uug cug gaa 384
Ser Lys Ala Val Asn His lie Arg Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu 115 120 125 gac acu gag aca cca auu gac acc acc auc aug gca aaa aau gag guu 432
Asp Thr Glu Thr Pro lie Asp Thr Thr lie Met Ala Lys Asn Glu Val 130 135 140 uuc ugc guc caa cca gag aag ggg ggc ege aag cca gcu ege cuu auc 480
Phe Cys Val Gin Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu lie 145 150 155 160 gua uuc cca gau uug ggg guu cgu gug ugc gag aaa aug gcc cuu uac 528
Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr 165 170 175 gau gug guc ucc acc cue ecu cag gcc gug aug ggc ucu uca uac gga 576
Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly 180 185 190 624 624
200816990 uuc caa uac ucu ecu gga cag egg guc gag uuc cug gug aau gee ugg
Phe Gin Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp 195 200 205 aaa geg aag aaa ugc ecu aug ggc uuc gca uau gac acc ege ugu uuu
Lys Ala Lys Lys Cys Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe 210 215 220 gac uca aeg guc acu gag aau gac auc cgu guu gag gag uca auc uac . Asp Ser Thr Val Thr Glu Asn Asp lie Arg Val Glu Glu Ser lie Tyr 225 230 235 240 caa ugu ugu gac uug gee ccc gaa gee aga cag gee aua agg ucg cue Gin Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala lie Arg Ser Leu 245 250 255 aca gag egg cuu uac auc ggg ggc ccc cug acu aau ucu aaa ggg cag Thr Glu Arg Leu Tyr lie Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin 260 265 270 aac ugc ggc uau ege egg ugc ege geg age ggu gua cug aeg acc age
Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser 275 280 285 ugc ggu aau acc cue aca ugu uac uug aag gee gcu geg gee ugu ega
Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Cys Arg 290 295 300 gcu geg aag cue cag gac ugc aeg aug cue gua ugc gga gac gac cuu
Ala Ala Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu 305 310 315 320 guc guu auc ugu gaa age geg ggg acc caa gag gac gag geg age cua
Val Val lie Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Glu Ala Ser Leu 325 330 335 egg gee uuc aeg gag gcu aug acu aga uac ucu gee ccc ecu ggg gac
Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp 340 345 350 ccg ccc aaa cca gaa uac gac uug gag uug aua aca uca ugc nee ucc
Pro Pro Lys Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu lie Thr Ser Cys Ser Ser 355 360 365 aau gug uca guc geg cac gau gca ucu ggc aaa agg gug uac uau cue Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu 370 375 380 acc cgu gac ccc acc acc ccc cuu geg egg gcu geg ugg gag aca gcu
Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala 385 390 395 400 aga cac acu cca guc aau ucc ugg cua ggc aac auc auc aug uau geg
Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn lie lie Met Tyr Ala 405 410 415 ccc acc uug ugg gca agg aug auc cug aug acu cau uuc uuc ucc auc
Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met lie Leu Met Thr His Phe Phe Ser lie 420 425 430 cuu cua gcu cag gaa caa cuu gaa aaa gee cua gau ugu cag auc uac
Leu Leu Ala Gin Glu Gin Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gin lie Tyr 435 440 445 ggg gee ugu uac ucc aim gag cca cuu gac cua ecu cag auc auu caa
Gly Ala Cys Tyr Ser lie Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gin lie lie Gin 450 455 460 ega cue cau ggc cuu age gca uuu uca cue cau agu uac ucu cca ggu
Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly 465 470 475 480 gag auc aau agg gug gcu uca ugc cue agg aaa cuu ggg gua ccg ccc
Glu lie Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro 672 720 768 816 864 912 960 1008 1056 1104 1152 1200 1248 1296 1344 1392 1440 2 1488 200816990 485 490 495 uug cga guc ugg aga cau egg gee aga agu guc ege gcu agg cua cug Leu Arg Vai Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu 500 505 510 ucc cag ggg ggg agg gcu gee acu ugu ggc aag uac cue uuc aac ugg
Ser Gin Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp 515 520 525 gca gua agg acc aag cue aaa cue acu cca auc ccg gcu geg ucc cag
Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro lie Pro Ala Ala Ser Gin 530 535 540 uug gau uua ucc age ugg uuc guu gcu ggu uac age ggg gga gac aua
Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp lie 545 550 555 560 uau cac age cug ucu cgu gee cga ccc ege ugg uuc aug ugg ugc cua
Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Trp Cys Leu 565 570 575 cue cua cuu ucu gua ggg gua ggc auc uau cua cue ccc aac cga
Leu Leu Leu Ser Val Gly Val Gly lie Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 580 585 590
〈210〉 2 <211〉 591 <212> PRT 〈213〉C型肝炎病毒 〈400〉 2
Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly Ala Leu He Thr Pro Cys Ala Ala 15 10 15
Glu Glu Thr Lys Leu Pro lie Asn Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg 20 25 30
His His Asn Leu Val Tyr Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ala Ser Leu Arg 35 40 45
Gin Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg Leu Gin Val Leu Asp Asp His Tyr 50 55 60
1536 1584 1632 1680 1728 1773
Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala 65 70 75 80
Lys Leu Leu Ser Val Glu Glu Ala Cys Lys Leu Thr Pro Pro His Ser 85 90 95
Ala Arg Ser Lys Phe Gly Tyr Gly Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser 100 105 110
Ser Lys Ala Val Asn His lie Arg Ser Val Trp Lys Asp Leu Leu Glu 115 120 125
Asp Thr Glu Thr Pro lie Asp Thr Thr lie Met Ala Lys Asn Glu Val 130 135 140
Phe Cys Val Gin Pro Glu Lys Gly Gly Arg Lys Pro Ala Arg Leu lie 145 150 155 160
Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr 3 200816990 165 170 175
Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gin Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly 180 185 190
Phe Gin Tyr Ser Pro Gly Gin Arg Val Glu Phe Leu Val Asn Ala Trp 195 200 205
Lys Ala Lys Lys Cys Pro Met Gly Phe Ala Tyr Asp Thr Arg Cys Phe 210 215 220
Asp Ser Thr Yal Thr Glu Asn Asp lie Arg Val Glu Glu Ser He Tyr 225 230 235 240
Gin Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu Ala Arg Gin Ala lie Arg Ser Leu 245 250 255
Thr Glu Arg Leu Tyr lie Gly Gly Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gin 260 265 270
Asn Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser 275 280 285
Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr Leu Lys Ala Ala Ala Ala Cys Arg 290 295 300
Ala Ala Lys Leu Gin Asp Cys Thr Met Leu Val Cys Gly Asp Asp Leu 305 310 315 320
Val Val lie Cys Glu Ser Ala Gly Thr Gin Glu Asp Glu Ala Ser Leu 325 330 335
Arg Ala Phe Thr Glu Ala Met Thr Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp 340 345· 350
Pro Pro Lys Pro Glu Tyr Asp Leu Glu Leu lie Thr Ser Cys Ser Ser 355 360 365
Asn Val Ser Yal Ala His Asp Ala Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu 370 375 380
Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Leu Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala 385 390 395 400
Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp Leu Gly Asn lie lie Met Tyr Ala 405 410 415
Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met lie Leu Met Thr His Phe Phe Ser lie 420 425 430
Leu Leu Ala Gin Glu Gin Leu Glu Lys Ala Leu Asp Cys Gin lie Tyr 435 440 445
Giy Ala Cys Tyr Ser He Glu Pro Leu Asp Leu Pro Gin He lie Gin 450 455 460 4 200816990 His Gly Leu Ser Ala Phe Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly 465 470 475 480
Glu lie Asn Arg Val Ala Ser Cys Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro 485 490 495
Leu Arg Val Trp Arg His Arg Ala Arg Ser Val Arg Ala Arg Leu Leu 500 505 510
Ser Gin Gly Gly Arg Ala Ala Thr Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp 515 520 525
Ala Val Arg Thr Lys Leu Lys Leu Thr Pro lie Pro Ala Ala Ser Gin 530 535 540
Leu Asp Leu Ser Ser Trp Phe Val Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp lie 545 550 555 560
Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg Pro Arg Trp Phe Met Trp Cys Leu 565 570 575
Leu Leu Leu Ser Val Gly Val Gly lie Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 580 585 590 <210〉 3 <211> 20 <212> DNA 〈213>人造的 <220> <223〉7761R反向引子 <400> 3 cgttcatcgg ttggggagta > > > > 0 12 3 1± ΙΑ 1Λ tl 2 2 2 2 < < < < 4 19
DNA
Artificial <220> 〈223〉5919F順向引子 <400> 4 19 gatctcagcg acgggtctt <210> 5 <211> 30 <212> DNA 〈213>人造的 〈220〉 <223〉L314F(c940t-F)順向引子 <400> 5 aggactgcac gatgttcgta tgcggagacg <210〉 6 〈211〉 30 <212> DNA <213〉人造的 〈220〉 〈223〉L3l4F(c940t-R)反向引子 5 30 200816990 <400> 6 cgtctccgca tacgaacatc gtgcagtcct <210> 〈211〉 <212> <213> 7 32 DNA 人造的 <220> <223> C316F(g947t-F)順向引子 <400> 7 32 gcacgatgct cgtattcgga gacgaccttg tc
〈210〉 〈211〉 〈212〉 <213> <220> 〈223〉 32 DNA 人造的 C316F(g947t-R)反向引子 <400> 8 gacaaggtcg tctccgaata cgagcatcgt gc <210> <211> <212> 〈213〉 的 A造 930DN人 <220> <223〉C316S(t946a-F)反向引子 <400> 9 gcacgatgct cgtaagcgga gacgaccttg 〈210> 10 <211> 30 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉C316S(t946a-R〉反向引子 caaggtcgtc tccgcttacg agcatcgtgc 32 30 30 <210> 11 <211〉 40 <212〉DM 〈213〉人造的 〈220> <223〉S365L(cl094t-F)順向引子 <400> 11 40 gacttggagt tgataacatt atgctcctcc aatgtgtcag <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213〉人造的 <220> 〈223〉S365L(cl094t-R)反向引子 <400> 12 ctgacacatt ggaggagcat aatgttatca actccaagtc 6 40 200816990 <210> 13 <211> 34 <212> DNA 〈213>人造的 <220> <223〉S365A(tl093g_F)順向引子 <400> 13 cttggagttg ataacagcat gctcctccaa tgtg <210> 14 <211> 34 <212> DNA <213〉人造的 <220> <223〉S365A(tl093g-R)反向引子 <400> 14 cacattggag gagcatgctg ttatcaactc caag 〈210〉 15 〈211〉 38 <212〉 DNA <213〉 人造的 〈220〉 <223> S365T(tl093a_F)順向引子 <400〉 15 gacttggagt tgataacaac atgctcctcc aatgtgtc <210〉 16 <211〉 38 <212〉 DNA <213> 乂 3½的 <220> <223〉 S365T(tl093a-R)反向引子 〈400〉 16 gacacattgg aggagcatgt tgttatcaac tccaagtc
<2i0> 17 <211> 34 <212〉 DNA 〈213>人造的 〈220〉 〈223〉S368F(c7085t-F)順向引子 <400> 17 gataacatca tgctccttca atgtgtcagt cgcg <210> 18 <211> 34 <212〉 DNA 〈213>人造的 <220> ' 〈223〉S368F(c7085t-R)反向引子 <400> 18 cgcgactgac acattgaagg agcatgatgt tatc <210> 19 200816990, <212> DNA <213〉人造的 <220> 〈223〉M414T(tl241c-F)順向引子 <400> 19 taggcaacat catcacgtat gcgcccacct tg 32 <210> 20 <211> 32 〈212〉 DNA 〈213>人造的 <220> <223〉M414T(tl241c-R)反向引子 <400> 20 caaggtgggc gcatacgtga tgatgttgcc ta 32 〈210〉 21 〈211〉 32 <212> DNA 〈213〉 人造的 <220〉 〈223〉 M414V(al240g_F)順向引子
<400> 21 ctaggcaaca tcatcgtgta tgcgcccacc tt 32 〈210〉 22 〈211〉 32 <212> DNA 〈213〉人造的 〈220〉 <223〉M414V(al240g-R)反向引子 <400> 22 aaggtgggcg catacacgat gatgttgcct ag 32

Claims (1)

  1. 200816990 十、申請專利範圍： 1. 一種c型肝炎病毒的一種苯并呋喃抑制劑和至少一種額 外的抗C型肝炎病毒劑於一種藥物之製造上的用途，其 係供用於同時地或相繼地投藥2種製劑至一個需要其之 主體體内，用於減少一種抗治療的C型肝炎病毒感染的 出現頻率。 2. —種C型肝炎病毒的一種苯并呋喃抑制劑和至少一種額 外的抗C型肝炎病毒劑於一種藥物之製造上的用途，其 係供用於同時地或是相繼地投藥2種製劑至一個需要其 之主體體内，用於延遲一種抗治療的C型肝炎病毒感染 的出現。 3. —種C型肝炎病毒的一種苯并呋喃抑制劑和至少一種額 外的抗C型肝炎病毒劑於一種藥物之製造上的用途，其 係供用於同時地或是相繼地投藥2種製劑至一個需要其 之主體體内，用於降低一種抗治療的C型肝炎病毒感染 的抗性位準。 4·如申請專利範圍第1-3項之中任一項之用途，其中該至 少一種額外的抗C型肝炎病毒劑是一種免疫調節劑。 5·如申請專利範圍第.1-3項之中任一項之用途，其中該至 少一種額外的抗C型肝炎病毒劑是一種雷巴威林 (ribavirin)的產物0 6.如申請專利範圍第1-3項之中任一項之用途，其中一種C 型肝炎病毒的苯并呋喃抑制劑是HCV»796。 7 · —種H C V-7 9 6和至少一種額外的抗C型肝炎病毒劑於一 1 200816990 種藥物之製造上的用途，其係供用於同時地或是相繼地 投藥2種製劑至一個需要其之主體體内，用於減少一種 抗HCV-796的C型肝炎病毒感染的出現。 8· —種HCV-796和至少一種額外的抗C型肝炎病毒劑於一 種藥物之製造上的用途，其係供用於分別地投藥2種製 劑至一個需要其之主體體内，用於減少一種抗HCV-796 的C型肝炎病毒感染的出現。 9·如申請專利範圍第7或8項之用途，其中該至少一種額外 的抗C型肝炎病毒劑是一種免疫調節劑。 10·如申請專利範圍第7或8項之用途，其中該至少一種額外 的抗C型肝炎病毒劑是一種雷巴威林的產物。 11· 一種鑑定對一種抗C型肝炎病毒療法具有一穩減低的反 應可能性之一個體的方法，其包含： (a) 決定在一第一個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構；以及 (b) 決定在一第二個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構’ 其中在該第二個時間點之來自該個體的樣本中之C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合 袋之胺基酸序列或結構的一種變化，與在該第一個時間 點之來自該個體的C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比， 2 200816990 係指示該個體會對一種抗C型肝炎病毒療法予以反應之 一種減低的可能性。 12· —種鑑定對一種抗C型肝炎病毒療法具有一種減低的反 應可能性之一個體的方法，其包含： (a) 決定來自該個體的一種樣本中之c型肝炎RNA 依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸 序列或結構；以及 (b) 比較來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV_796結合袋之胺基酸序列 或結構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴梨 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或 結構的一種變化，與該參考樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構相比，係指示該個體會對一種抗C型肝炎病毒療 法予以反應之一種減低的可能性。 13· —種用於監測、診斷，或是預後於一個主體體内之一種 抗治療的C型肝炎病毒感染的方法，其包含： (a) 決定來自該主體的一種樣本中之c型肝炎RNA 依賴型RNA聚合酶NS5B的一種苯并呋喃結合袋的胺基 酸序列或結構； (b) 投藥一種苯并呋喃化合物至該主體；以及 3 200816990 (C)决疋在該笨并呋喃的投藥至該主體之後的來自 該主體的一種樣本中之C型肝炎^^八依賴型RNA聚合酶 NS5B的該苯并呋喃結合袋的胺基酸序列或結構， 其中在該苯并呋喃的投藥至該主體之後的來自該 主體的一種樣本中之C型肝炎^^人依賴型RNA聚合酶 NS5B的該苯并呋喃結合袋的胺基酸序列或結構的一種 變化’與在該苯并呋喃的投藥之前的來自該主體的一種 樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該苯 并呋喃結合袋的胺基酸序列或結構比較，係提供於該主 體體内之C型肝炎病毒感染的治療之效力的一種負指 示0 14· 一種用於監測一個主體體内之一種c型肝炎病毒感染的 治療之進程的方法，其包含： (a) 決定來自該主體的一種樣本中的C型肝炎RNA 依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796之胺基酸序列或 結構； (b) 投藥HCV-796至該主體；以及 (c) 決定在HCV-796的投藥至該主體之後的來自該 主體的一種樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的HCV-796結合袋的胺基酸序列或結構’ 其中在HCV-796的投藥之後的來自該主體的一種 樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋的胺基酸序列或結構的一種變化’與在 HCV-796的投藥之前的來自該主體的一種樣本中之0型 4 200816990 肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋 的胺基酸序列或結構比較，係提供於該主體體内之c型 肝炎病毒感染的治療之效力的一種負指示。 15· —種用於監測一個主體體内之一種c型肝炎病毒感染的 治療之進程的方法，其包含： (a)決定來自該主體的一種樣本中的c型肝炎RNa 依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796之胺基酸序列或 結構； ⑻投藥HCV-796和至少一種額外的抗c型肝炎劑至 該主體，以及 (c)決定在HCV-796和至少一種額外的抗c型肝炎劑 的投藥至該主體之後的來自該主體的一種樣本中之C型 肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的HCV-796結合袋的 胺基酸序列或結構， 其中在HCV-796和至少一種額外的抗C型肝炎劑的 投藥之後的來自該主體的一種樣本中之C型肝炎RNA依 賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋的胺基酸序 列或結構的一種變化，與在HCV-796和至少一種額外的 抗C型肝炎劑的投藥之前的來自該主體的一種樣本中之 C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結 合袋的胺基酸序列或結構比較，係提供於該主體體内之 C型肝炎病毒感染的治療之效力的一種負指示。 16. —種用於預後於一個主體體内之一種抗治療的C型肝炎 病毒感染的發展之方法，其包含： 5 200816990 (a) 決定在一第一個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構；以及 (b) 決定在一第二個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中在該第二個時間點之來自該個體的樣本中之c 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合 袋之胺基酸序列或結構的一種變化，與在該第一個時間 點之來自該個體的C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比， 係指示该個體會發展一種抗治療的C型肝炎病毒感染的 增加的可能性。 17. —種用於預後於一個主體體内之一種抗治療的c型肝炎 病毒感染的發展之方法，其包含： (a) 決定來自该個體的一種樣本中之亡型肝炎&]^八 依賴型RNA聚合酶NS 5B的該HC V-79 6結合袋之胺基酸 序列或結構；以及 (b) 比較來自該個體的樣本中之c型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或 6 200816990 結構的一種變化’與該參考樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構相比，係指示該個體會發展一種抗治療的C型肝 炎病毒感染的增加的可能性。 18. —種用於監測一個主體體内之一種C型肝炎病毒感染的 方法，其包含： (a) 決定在一第一個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構；以及 (b) 決定在一第二個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中在該第二個時間點之來自該個體的樣本中之C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合 袋之胺基酸序列或結構的一種變化，與在該第一個時間 點之來自該個體的C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比， 係提供該C型肝炎病毒感染已經於嚴重性上改變的一種 指示。 19· 一種用於監測一個主體體内之一種c型肝炎病毒感染的 方法，其包含： (a)決定來自該個體的一種樣本中之C型肝炎rna 依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸 序列或結構；以及 7 200816990 (b)比較來自該個體的樣本中之c型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴蜇以^八聚 合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴蜜 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或 結構的一種變化，與該參考樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構相比，係提供該C型肝炎病毒感染已經於嚴重性 上改變的一種指示。 20· —種用於診斷一個主體體内之一種抗治療的C型肝炎病 毒感染的發展之方法，其包含： (a) 決定在一第一個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構；以及 (b) 決定在一第二個時間點之來自該個體的一種樣 本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該 HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中在該第二個時間點之來自該個體的樣本中之C 型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合 袋之胺基酸序列或結構的一種變化，與在該第一個時間 點之來自該個體的C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶 NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構相比， 8 200816990 係表示該主體已經發展或是將發展一種抗治療的c型肝 炎病毒感染之一種增加的可能性。 21. —種用於診斷一個主體體内之一種抗治療的C型肝炎病 毒感染的發展之方法，其包含·· (a) 決定來自該個體的一種樣本中之C型肝炎RNA 依賴型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸 序列或結構；以及 (b) 比較來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構與一種參考樣本中之C型肝炎RNA依賴型RNA聚 合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或結構， 其中來自該個體的樣本中之C型肝炎RNA依賴型 RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列或 結構的一種變化，與該參考樣本中之C型肝炎RNA依賴 型RNA聚合酶NS5B的該HCV-796結合袋之胺基酸序列 或結構相比，係表示該主體已經發展或是將發展一種抗 治療的C型肝炎病毒感染之一種增加的可能性。 22·如申請專利範圍第15項之方法，其中該至少一種額外的 抗C型肝炎劑是一種免疫調節劑。 23·如申請專利範圍第15項之方法，其中該至少一種額外的 抗C型肝炎劑是一種雷巴威林的產物。 24*如申請專利範圍第11-23項中任一項之方法，其中該C型 肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS 5B的該HCV-796結合袋 包含該C型肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B之大約胺 9 200816990 基酸殘基120至450。 25.如申請專利範圍第24項之方法，其中該HCV-796結合袋 的胺基酸序列或結構的變化是一種選自於表2B中提出 的那些所構成的群組之胺基酸改變。 26·如申請專利範圍第24項之方法，其中該HCV-796結合袋 的胺基酸序列或結構的變化發生在胺基酸殘基3丨4、 316、363、365、368、414或是445。 27·如申請專利範圍第26項之方法，其中該HCV-796結合袋 的胺基酸序列或結構的變化是一種選自於以下所構成 的群組之胺基酸改變：L314F、C316F、C316Y、C316S、 C316N、I363V、S365A、S365T、S368F、M414I，以及 M414V。 28·如申請專利範圍第11-23項中任一項之方法，其中該C型 肝炎RNA依賴型RNA聚合酶NS5B係衍生自一種選自於 以下所構成的群組之C型肝炎病毒基因型：基因型la、 基因型lb、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5，以 及基因型6。 10
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