FR2933094A1 - Mutations dans la proteine ns5b du vhc. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une protéine NS5B du virus de l'hépatite C (VHC), performante pour la réplication, qui porte une mutation ponctuelle à l'une au moins des positions suivantes : - à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou - à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou - à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1.

Description

MUTATIONS DANS LA PROTEINE NS5B DU VHC DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne l'identification de nouvelles mutations présentes dans la protéine NS5B du virus de l'Hépatite C (VHC) amplifié dans des moustiques du genre Aedes.

10 L'identification de telles mutations, associées à une réplication efficace, offre des perspectives prometteuses notamment dans le cadre des réplicons.

ETAT ANTERIEUR DE LA TECHNIQUE 15 Le virus de l'hépatite C (VHC) a été identifié comme étant responsable de l'hépatite non A non B développée, évoluant fréquemment vers des pathologies chroniques malignes, du type cirrhose du foie ou encore carcinome hépato-cellulaire. Il est estimé qu'environ 3% de la population mondiale est infectée par le VHC, avec une augmentation 20 des infections de 3 à 4 millions de personnes par année (Neumayr et al., 2000).

Le VHC, membre du genre Hepacivirus, appartient à la famille des Flaviviridae qui sont des virus à ARN monobrins enveloppés, parmi lesquels on rencontre les virus responsables de maladies épidémiques majeures telles que la Fièvre Jaune (YF), la 25 Dengue (DEN) et la Dengue Hémorragique (DHF), l'Encéphalite Japonaise (JE), l'Encéphalite de Saint-Louis (SLE) et la fièvre de West Nile (WN), pour ne citer que les plus importantes.

Une majorité de Flavivirus sont transmis par des insectes vecteurs, selon des modalités 30 épidémiologiques très différentes. Certaines maladies sont typiquement humaines et ne touchent jamais les animaux comme la DEN et la DHF ; d'autres infections sont plutôt zoonotiques et touchent plus ou moins accidentellement l'être humain, comme la JE, la SLE et la WN. Enfin certains Flavivirus peuvent circuler de façon épidémique aussi bien dans des populations humaines qu'animales (WN). Ces modalités épidémiologiques 35 différentes ont pourtant des bases communes telles qu'une amplification virale dans des cellules d'insectes.5 Concernant le VHC, les voies de transmission aujourd'hui bien établies sont essentiellement: transmission par les produits sanguins, toxicomanie et contexte nosocomial. Toutefois, 30 à 40% des infections à VHC aujourd'hui répertoriées chez l'homme ont une origine inexpliquée, dans la mesure où aucune des conditions listées n'est réunie (Neumayr et al., 2000).

Le génome du VHC est constitué d'un ARN simple brin de 9,6 kilobases environ, qui code une polyprotéine précurseur d'environ 3000 acides aminés. Cette polyprotéine est constituée des protéines virales dans l'ordre qui suit : C-El-E2-p7-NS2-NS3-NS4A- NS4B-NS5A-NS5B.

Parmi les protéines non structurales, NS5B correspond à une ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp), décrite par exemple dans le document WO 96/37619.

La réplication efficace du VHC en culture cellulaire a été associée à des mutations adaptatives qui augmentent fortement l'efficacité de réplication, identifiées notamment dans le gène codant NS5B. Ainsi, le document WO 2005/047463 décrit 3 mutations (sérine en position 24, isoleucine en position 31 et leucine en position 392) dans NS5B d'un VHC de génotype 2b, augmentant l'efficacité d'un réplicon intégrant cette séquence.

Or, dans la lutte menée contre les hépatites virales de type C, un obstacle majeur entravant le développement d'un traitement et d'un vaccin efficace est l'absence d'un système permettant la multiplication à haut niveau du virus in vitro. Il existe donc un besoin persistant de développer des systèmes, notamment des réplicons plus efficaces. EXPOSE DE L'INVENTION

Il s'avère que le Demandeur a réussi à obtenir une amplification in vivo du virus de 30 l'hépatite C (VHC) dans des moustiques du genre Aedes.

De manière privilégiée, la charge virale utilisée provient d'un sérum, avantageusement d'origine humaine, par exemple celui d'un porteur d'hépatite chronique VHC de génotype lb. Après une amplification d'une durée moyenne de 21 jours, l'analyse du génome du VHC ayant été efficacement répliqué a révélé la présence de mutations dans NS5B. 35 Ainsi et selon un premier aspect, la présente invention a trait à une protéine NS5B du virus de l'hépatite C (VHC) mutée, performante pour la réplication.

On entend par protéine NS5B du VHC , l'ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) codée par l'extrémité 3' de la région codante du génome viral.

Bien que susceptible de variations, cette protéine a été caractérisée comme comportant 591 résidus ou acides aminés. Cette taille est notamment conservée pour les protéines NS5B issues des virus de génotype lb ou 2b décrits dans l'art antérieur mentionné ci-dessus.

La séquence disponible dans les bases de données sous le numéro EF507504 a été choisie comme référence. Elle correspond à un génome entier de génotype lb. La région C- terminale de la polyprotéine correspondante contient la protéine NS5B qui présente la séquence identifiée SEQ ID NO : 1 dans le cadre de la présente demande.

Ainsi et dans le cadre de l'invention, on entend avantageusement par protéine NS5B du VHC , une protéine présentant au moins 70% d'identité, avantageusement 80%, voire 85%, 90%, voire même 95% d'identité avec la présente séquence SEQ ID NO : 1. Avantageusement, il s'agit d'un équivalent fonctionnel de la séquence SEQ ID NO : 1, pour lequel l'activité enzymatique peut être aisément testée à l'aide du test décrit dans le document Lohmann et al. de 1997.

Ainsi, il a été déterminé qu'une protéine d'intérêt selon l'invention portait une mutation à l'une au moins des positions suivantes : - à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou - à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 ; et/ou - à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1.

Il est à noter que ces mutations présentent la particularité d'être localisées dans le site actif de cette protéine. En effet, Lohmann et al. (1997) ont mis en évidence 4 motifs d'acides aminés qui s'avèrent essentiels pour l'activité de la polymérase NS5B de VHC. En particulier, il a été montré qu'un remplacement de l'acide aspartique (Asp ou D) à la position 220, de la glycine (Gly ou G) à la position 283 ou de l'acide aspartique (Asp ou D) à la position 318 supprimait totalement l'activité enzymatique. On constate que les 3 résidus visés par la présente invention sont situées au sein de cette région cruciale.

Avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 n'est pas un acide aminé choisi dans la groupe suivant : valine (Val ou V), leucine (Leu ou L), isoleucine (Ile ou I) et cystéine (Cys ou C). Encore plus avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 262 de SEQ ID NO : 1 est un résidu alanine (Ala ou A).

Avantageusement, le résidu observé à la position correspondant au résidu 265 de SEQ ID NO : 1 n'est pas une proline (Pro ou P). Encore plus avantageusement, il s'agit d'une sérine (Ser ou S).

Avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 n'est pas un acide aminé choisi dans la groupe suivant : asparagine (Asn ou N), cystéine (Cys ou C) et histidine (His ou H). Encore plus avantageusement, le résidu à la position correspondant au résidu 316 de SEQ ID NO : 1 est un résidu acide aspartique ou aspartate (Asp ou D).

Il apparaît que dans la séquence SEQ ID NO : 1, le résidu à la position 262 est une valine (Val ou V), celui à la position 265 est une proline (Pro ou P) et celui à la position 316 est une asparagine (Asn ou N).

Ces résidus sont également retrouvés aux positions 47, 50 et 101 de la séquence SEQ ID NO : 2 correspondant aux résidus 216 à 345 de NS5B codé par le génome viral ayant servi à l'infection au jour 0 (JO), même si par ailleurs des divergences ponctuelles sont observées.

L'expression position correspondant au résidu indique que la numérotation exacte des acides aminés peut varier en fonction des séquences. Ainsi, une position correspondante peut être identifiée en alignant les séquences de manière à obtenir le plus haut degré d'homologie autour de la position en question. 30 En effet, il est à noter que les séquences de NS5B rapportées dans la littérature présentent certes une forte homologie mais également des divergences ponctuelles.

Ainsi, dans la référence WO 96/37619, et plus précisément dans la séquence SEQ ID 35 NO : 1 de ce document qui correspond à NS5B, les résidus aux positions 265 et 316 sont bien une proline et une asparagine, respectivement. En revanche, la position 262 correspond à une isoleucine et non à une valine, mais n'est pas une alanine comme dans la présente invention. 25 En ce qui concerne la référence WO 2005/047463, et plus précisément dans la séquence SEQ ID NO : 1 de ce document qui correspond à NS5B issu d'un VHC de génotype 2b, les résidus aux positions 262 et 265 sont bien une valine et une proline, respectivement. En revanche, la position 316 correspond à une cystéine et non à une asparagine, mais n'est pas un acide aspartique comme dans la présente invention.

A la connaissance du Demandeur, c'est la première fois que des mutations aux positions particulières identifiées sont rapportées.

Selon un mode de réalisation avantageux, la protéine NS5B selon l'invention porte les trois mutations décrite ci-dessus.

De fait, en comparant les régions allant des acides aminés 216 à 345 de NS5B entre le jour 0 (JO) et le jour 21 (J21), c'est à dire en comparant les séquences SEQ ID NO : 2 et 15 SEQ ID NO : 3, seuls les trois résidus à ces trois positions divergent.

Ainsi et selon un mode de réalisation privilégiée, une protéine NS5B selon l'invention comprend la séquence SEQ ID NO : 3. En d'autres termes et en partant d'une protéine NS5B sauvage , il est possible de remplacer les résidus aux positions 262, 265 et 316 20 par une alanine, une sérine et un acide aspartique, respectivement, ou bien remplacer la région 216-345 par la séquence SEQ ID NO : 3.

Sont également visés des fragments de la protéine NS5B selon l'invention, lesdits fragments comportant au moins une mutation ponctuelle à l'une des trois positions clefs 25 identifiées dans le cadre de la présente invention. Avantageusement, il s'agit de fragments fonctionnels dont l'activité RdRp peut être aisément testée à l'aide du test décrit dans le document Lohmann et al. de 1997.

Un autre aspect de l'invention concerne une séquence d'acides nucléiques codant une 30 protéine NS5B mutée telle que décrite ci-dessus.

On entend par acide nucléique aussi bien une molécule d'ADN que d'ARN. Les séquences nucléiques présentées dans la cadre de l'invention correspondent à de l'ADN mais les séquences ARN correspondantes sont aisément déduites par l'homme du métier 35 en remplaçant T par U.

Par ailleurs, une séquence d'acides nucléiques selon l'invention peut aussi bien correspondre strictement à la partie codant NSSB, qu'à un génome entier de VHC portant les mutations définies ci-dessus.

Avantageusement, le codon codant le résidu correspondant à la position 262 de NS5B doit coder pour une alanine et peut donc correspondre à GCA, GCC, GCG ou GCT.

Avantageusement, le codon codant le résidu correspondant à la position 265 de NS5B doit coder pour une sérine et peut donc correspondre à TCA, TCC, TCG, TCT, AGC ou 10 AGT.

Avantageusement, le codon codant le résidu correspondant à la position 316 de NS5B doit coder pour un acide aspartique et peut donc correspondre à GAC ou GAT.

15 A titre d'illustration, la séquence codant la portion 216 à 345 de NS5B du VHC au jour 0 (JO) apparaît à la séquence SEQ ID NO : 4.

En comparaison, la séquence codant cette même portion au jour 21 (J21) apparaît à la séquence SEQ ID NO : 5.

Ainsi, on constate aux positions 139 à 141 de SEQ ID NO : 4 et 5 (codant le résidu à la position 47 des séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ou à la position 262 de la séquence SEQ ID NO : 1), le codon GTC (SEQ ID NO : 4) codant une valine devient un codon GCC (SEQ ID NO : 5) codant une alanine.

De même, on constate aux positions 148 à 150 de SEQ ID NO : 4 et 5 (codant le résidu à la position 50 des séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ou à la position 265 de la séquence SEQ ID NO : 1), le codon CCC (SEQ ID NO : 4) codant une proline devient un codon TCC (SEQ ID NO : 5) codant une sérine.

Enfin, on constate aux positions 301 et 303 de SEQ ID NO : 4 et 5 (correspondant à la position 101 des séquences SEQ ID NO : 2 et 3 ou à la position 316 de la séquence SEQ ID NO : 1), le codon AAC (SEQ ID NO : 4) codant une asparagine devient un codon GAC (SEQ ID NO : 5) codant un acide aspartique.

Typiquement, une séquence d'acide nucléique selon l'invention peut donc comprendre la séquence SEQ ID NO : 5. 20 25 30 35 Avantageusement, les protéines, séquences d'acides nucléiques et fragments de ceux-ci décrits dans la présente invention sont d'origine humaine.

Dans le cadre de la présente demande, il est décrit 3 mutations adaptatives susceptibles 5 d'améliorer la réplication du VHC. Les séquences mises en évidence trouvent donc de nombreuses applications, notamment dans le cadre de vecteurs ou de réplicons.

Ainsi, un autre aspect de l'invention vise un vecteur comprenant une séquence d'acides nucléiques selon l'invention. Avantageusement, cette séquence est placée sous le contrôle 10 de séquences régulatrices aptes à assurer son expression, notamment un promoteur. En particulier, ce mode de réalisation permet la production d'une protéine NS5B mutée portant au moins une, deux, voire les trois mutations identifiées ci-dessus.

Selon un autre aspect, c'est un réplicon qui contient une séquence selon l'invention. Un 15 réplicon VHC est une molécule d'acides nucléiques capable de se répliquer de manière autonome en culture cellulaire et qui produit des niveaux détectables d'une ou plusieurs protéines virales. Le réplicon du VHC exprime les composants dérivés du VHC de la machine de réplication et contient des éléments cis requis pour la réplication en culture cellulaire. 20 Des réplicons du VHC existent déjà, tel que, par exemple, celui décrit dans le document EP 1 666 598. Il est donc possible de modifier la séquence codant NS5B dans ce réplicon aux positions et à l'aide des mutations décrites ci-dessus. Alternativement, il est possible de remplacer la région du réplicon codant NS5B par une séquence selon l'invention. On 25 obtient alors un réplicon chimérique. Il est ainsi possible d'augmenter l'efficacité de réplicons déjà existants.

Sont aussi visées par l'invention des cellules hôtes comprenant des vecteurs ou des réplicons tels que définis précédemment. De manière privilégiée, ces cellules sont issues 30 de moustiques, avantageusement du genre Aedes. Sans vouloir être lié à une quelconque théorie, il est supposé que ces mutations résultant d'une sélection chez ce moustique, la combinaison de cet hôte et de la protéine NS5B mutée selon l'invention devrait donner lieu à un système de réplication particulièrement efficace.

35 Ces systèmes de réplication in vitro offrent de nombreuses perspectives. Ainsi, ils permettent de tester la capacité d'un composé à inhiber l'activité réplicative et constituent donc des outils de criblage pour des molécules thérapeutiques contre le VHC.

EXEMPLES DE REALISATION

L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées. Ceux-ci ne sont cependant en aucun cas limitatifs. La figure 1 illustre la compétence de moustiques pour la réplication du VHC, 21 jours après la mise en contact entre le moustique et le virus. La compétence dépend du genre du moustique : Le génome du VHC a été détecté par qRT-PCR, 21 jours après incubation avec le virus dans les moustiques du genre Aedes mais pas dans ceux du genre Culex. 10 La figure 2 illustre l'évolution de la détection du génome viral dans les corps et les têtes des moustiques. Les extraits d'ARN totaux ont été analysés après qRT-PCR, précédée par amplification du transcriptome total ( whole transcriptome amplification ou WTA). Dès le 15ème jour, la combinaison WTA-qPCR révèle la présence du génome VHC dans la 15 tête des moustiques.

La figure 3 représente l'alignement de séquences de la région amplifiée de NS5B. La région NS5B 8228-8628 des moustiques positifs a été séquencée au jour 21 (J21) et comparée à celle des moustiques infectieux au jour 0 (JO). La séquence NS5B 20 correspondant à la séquence EF407504 a servi de références. Les triangles montrent les acides aminés mutés au jour 21 (262 Val/Ala, 265 Pro/Ser, 316 Asn/Asp). L'analyse de séquence a porté sur 2 régions du génome viral car elles sont fréquemment séquencées et très informatives au niveau phylogénique : la région 5'UTR est une région hautement conservée alors que le gène NS5B a été rapporté comme étant particulièrement affecté par 25 des mutations adaptatives pendant la phase aiguë d'infection (Kuntzen et al., 2007).

PARTIE EXPERIMENTALE

30 I - Infections expérimentales

1. Elevage des espèces testées Les individus testés proviennent d'un élevage réalisé à partir de moustiques (oeufs, larves et adultes) collectés sur le terrain dans la zone urbaine de Marseille pour l'espèce Culex 35 pipiens et dans la réserve de la Tour du Valat en Camargue pour les espèces Aedes vexans et Aedes caspius. Ces élevages ont été réalisés dans les locaux de 1'ENSAM situés au Domaine du Merle, à Salon de Provence. Ces élevages sont réalisés dans un insectarium classique, aux normes d'élevage. Les larves sont nourries avec de la levure de bière et de l'alimentation pour poisson et les adultes sont nourris avec une solution de sucrose. Les 85 repas sanguins des Culex et Aedes sont composés de globules rouges lavés de mouton, le but du lavage étant d'éliminer l'interférence des éléments du sang.

2. Introduction des moustiques dans le Laboratoire Sécurisé (niveau 2+) Au jour J-1, les moustiques femelles sont répartis en lots, placés dans les boites de gorgement avec un coton humide sur chaque boite et introduits dans le laboratoire sécurisé. Les moustiques sont conservés à température et humidité contrôlées (T = 25°C 2,RH80% 10). 3. Introduction du virus VHC dans le Laboratoire L2+ Au jour JO, la solution virale contenant du virus VHC (sérum de patient porteur d'hépatite chronique à 2E6 copies/ml) est transportée par transporteur spécial jusqu'au L2+ où sont placés les moustiques. La solution virale est fournie par le Laboratoire de virologie du CHU Albert-Michallon à Grenoble. La solution virale est conservée dans le congélateur à -80°C du L2+.

4. Préparation de la solution sanguine infectée Au jour JO, le mélange globules rouges lavés (sang de mouton) non-infectés et solution virale est réalisé, de manière à obtenir un titre suffisant pour infecter des moustiques (1500 copies / moustique). De l'ATP est rajouté pour rendre le sang plus attractif et augmenter l'appétence des femelles. Chaque moustique prend entre 3 et 5 l par repas de sang.

5. Infection des lots de femelles Au jour JO, le gorgeoir contenant le sang infecté et chauffé à 37°C est présenté aux femelles, privées de glucose depuis 24 heures. Le gorgeoir est posé sur chaque boite et laissé sur place environ 4 heures pour la prise de repas sanguin. En parallèle, le gorgeoir avec du sang non contaminé est présenté au lot de femelles témoins négatifs. Au bout de la durée de gorgement des femelles, celles-ci sont récupérées par l'aspirateur à bouche, endormies par les vapeurs de chloroforme puis triées sous loupe binoculaire. Les femelles ayant gorgé du sang sont remises dans les cages. Un gîte artificiel est laissé dans chaque cage métallique à la disposition des femelles pour la ponte (bac d'eau pour les femelles Aedes et terre humide pour les femelles Culex). A partir de ce jour, les cages métalliques contenant les femelles gorgées ne sont ni ouvertes, ni manipulées jusqu'au sacrifice des moustiques. 6. Entretien des lots de femelles Les lots de femelles sont maintenus à une température constante d'environ 28°C et avec une humidité contrôlée d'au moins 70%. Chaque jour, les femelles sont nourries grâce à du coton imbibé d'une solution de glucose à 10 % déposé sur la cage métallique. Les gîtes de ponte sont humidifiés à travers la cage avec une pissette.

7. Traitement des femelles Aux jours de prélèvement, les moustiques sont sacrifiés en plaçant la cage métallique au froid. Les moustiques sont ensuite placés individuellement dans des tubes de 1,5 ml, identifiés et remis au congélateur jusqu'à l'étape d'extraction d'ARN avant les PCR. Les témoins négatifs, gorgés sur sang non virémique sont aussi sacrifiés. Le lot de moustiques, sacrifié au jour JO et mis au congélateur à -80°C, constitue les témoins positifs JO de gorgement, d'extraction et d'amplification de l'ARN viral.

II û Recherche d'ARN viral

8. Extraction de l'ARN pour les organes infectés L'extraction de l'ARN viral du VHC à partir de tissus de moustiques a été réalisée sous hotte, à l'aide du kit High Pure RNA Tissue Kit commercialisé par Roche.

9. Amplification de l'ARN viral Les amorces utilisées ainsi que la sonde (pour la qPCR) ont été conçues pour l'amplification de la région conservée de l'extrémité 5' non codante du génome viral. Nous avons utilisé l'amorce sens 2CH (5'-AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA-3') (SEQ ID NO : 6), localisée entre les nucléotides -289 et -269, et l'amorce antisens 1TS (5' GCG ACC CAA CAC TAC TCG GCT-3') (SEQ ID NO : 7), localisée entre les nucléotides -70 et -90. La sonde utilisée pour la qPCR est la TM416 (5'-6Fam-AAC CCG CTC AAT GCC TGG A-Tamra-3') (SEQ ID 8) située entre les nucléotides -137 et-119.

La composition du mélange réactionnel pour la RT PCR classique et la qRT PCR est résumée dans le tableau suivant : RT-PCR classique RT-PCR en temps réel Conc. Initiale Conc. Finale Volume par Conc. Initiale Conc. Finale Volume par tube tube ((l) ( l) Tampon 5X 1X 12.5 5X 1X 4.8 dNTP 10mM 2 10mM 0.8 Amorce sens 10 M 0.6 M 0.75 10 M 0.6 M 0.3 Amorce 10 M 0.6 M 0.75 10 M 0.6 M 0.3 antisens Sonde - - - 25 M 0.312 M 0.05 Eau qsp - - 19.8 - - 7.95 volume final RNase OUT 1.2 0.4 RNA master 3 1.2 Mix Matrice (ARN) - - 10 - - 4 Volume final : S0 1 Volume final : 2O 1 La RT-PCR a été réalisée dans les conditions suivantes: La rétrotranscription se déroule pendant 30 minutes à 50°C, suivie par une étape de désactivation de la reverse transcriptase (15 minutes à 95°C), puis 45 cycles de PCR alternant une étape d'élongation (1 minute à 63°C) et une étape de dénaturation (30 secondes à 90°C).

10. Séquençage de la région (52-271) correspondant à l'IRES et de la région (8228- 8628) correspondant à une partie du gène NS5b du génome viral extrait des moustiques positifs à JO et J21 :

L'ARN viral a été extrait selon le protocole décrit au point 8.

Le séquençage a été réalisé à partir des extraits d'ARN totaux des moustiques identifiés 15 comme contenant le génome du VHC par qRT-PCR.

Les étapes du séquençage sont dans l'ordre :

a) Amplification : Les régions à séquencer ont d'abord été amplifiées par qRT- 20 PCR en utilisant les amorces adéquates. Pour la région 52-271 de l'IRES, les amorces 1TS (SEQ ID NO : 7) et 2CH (SEQ ID NO : 6) décrites plus haut ont été utilisées. Pour la région 8228-8628 nucléotides du gène NS5b, les amorces 1PR et 2PR décrites dans la référence Sandres-Sauné et al. de 2003. b) Migration sur gel : Les produits d'amplification sont mis à migrer dans un gel à 1% d'agarose avec un marqueur de poids moléculaire. A la fin de la migration, les amplicons ont été révélés par du BET. La bande d'intérêt a été découpée et les séquences contenues dans la bande, extraites du gel. c) Clonage : Le clonage a été réalisé dans le vecteur pUC18. Afin de pouvoir réaliser les insertions, les sites de restriction (correspondants aux enzymes de restriction) présents sur le vecteur pUC18 et absents sur les amplicons ont été déterminés : les sites EcoRI et Hindlll ont été sélectionnés. De nouveaux couples d'amorces ont été choisis à partir des amorces décrites plus haut, auxquelles deux courtes séquences ont été rajoutées de part et d'autre, l'une contenant le site de restriction de EcoRI et l'autre le site de restriction Hindlll, afin que l' amplicon puisse être introduit dans le vecteur ouvert et déphosphorylé. d) Transformation : Le produit de clonage a été introduit dans les bactéries compétentes TOP10. Les bactéries ont ensuite été étalées dans des boites de Petri contenant de la gélose LB agar-Ampicilline. Enfin, elles ont été incubées pendant la nuit à 37°C. e) Contrôle qualité du clonage : Afin de vérifier que les bactéries ayant poussé contenaient l'insert, une PCR a été réalisée directement sur les bactéries : les clones ayant poussé ont été repiqués par la pointe d'un cône de l0 1, la pointe a d'abord été trempée dans un tube pour PCR contenant le master mix (voir composition plus haut), puis a servi pour inoculer la boite de pétri contenant de la gélose LB agar-Ampicilline. A la fin de l'étape de repiquage, la PCR a été lancée et les boites de Petri ont été incubées à 37°C pendant la nuit. f) Les produits de PCR sont mis à migrer dans un gel à 1% d'agarose avec marqueur de poids moléculaire. A la fin de la migration, les amplicons ont été révélés par du BET. Les clones qui contenaient la bande ayant la bonne taille ont été amplifiés afin de produire des quantités suffisantes de plasmides pour le séquençage. g) Miniprépartaion : les plasmides ont été extraits des bactéries. h) Séquençage : le séquençage a été réalisé automatiquement par la société MWG. Les amorces universelles M13 ont été utilisées. La lecture a été faite dans les deux sens pour plus de précision et de fiabilité.

RESULTATS

Trois expériences ont été réalisées : (i) Expérience 1 : Des femelles de Ae. vexans ont été collectées au stade larvaire et ont été testées à un âge inférieur à 10 jours. Environ 20 moustiques ont été nourris avec une suspension contenant 106 copies du VHC par millilitre. Après 21 jours d'élevage, les moustiques ont été congelés et leur ARN extrait. Une RT-PCR ponctuelle finale a révélé des signaux positifs correspondant à la présence de génome du VHC dans 3 moustiques sur 5 (résultats non montrés).

(ii) Expérience 2 : Pour tester la spécificité génique, 36 Aedes sp. et 15 Culex pipiens ont été nourris avec une suspension contenant 8,3.105 copies du VHC par millilitre et élevés pendant 21 jours. La qRT-PCR réalisés sur les extraites de moustique correspondant au 21ème jour d'élevage a révélé la présence du génome du VHC dans 33% (2/6) des moustiques Aedes sp.. Au contraire, l'ARN du VHC n'a jamais été détecté dans les moustiques Culex sp. (Figure 1).

Une caractéristique commune à la réplication des virus à ARN est l'apparition de mutations adaptatives. Pour tester cela, les séquences d'ARN du VHC extraits de moustiques positifs à 21 jours (J21) après infection ont été comparées à des échantillons au jour 0 (JO). Deux régions du génome du VHC ont été sélectionnées : 220 nucléotides (région 52-271) de la région 5'UTR (5' untranslated region ) et 400 nucléotides (région 8228-8628) de la partie codant la protéine non structurale 5B (NS5B ou RdRP pour RNA dependent RNA polymerase). Aucune mutation n'a été notée dans les 220 nucléotides analysés de la région 5'UTR. En revanche, 3 mutations adaptatives (262VaIAla, 265 Pro/Ser et 316 Asn/Asp) ont été identifiées parmi les 400 nucléotides de RdRP qui correspondent au site actif (Figure 3). (iii) Expérience 3 : 124 Ae. caspius et 85 Ae. vexans ont été nourris avec une suspension contenant 1,2.106 copies du VHC par millilitre et élevés pendant 15 jours. Tous les moustiques ont été disséqués pour séparer les têtes (incluant les glandes salivaires) et les corps (incluant le mésentère). La présence du VHC a été recherchée sur des échantillons au jour 0, 4, 8 et 15. Pour obtenir une plus grande sensibilité, la RT-PCR quantitative (qRT-PCR) a été précédée par une pré-amplification du transcriptome entier via la technique WTA ( Whole Transcriptome Amplification ). Dans ces conditions, l'ARN du VHC n'a été détecté que dans les têtes des moustiques correspondant au 15ème jour d'élevage (Figure 2). Le signal positif ne pouvait pas être dû au virus résiduel, puisque le 13 génome viral était totalement absent dans les têtes des moustiques au jour initial (JO), même en combinant WTA et qPCR. Ainsi, le cycle extrinsèque du VHC, défini comme le temps nécessaire au parasite pour se répliquer chez son hôte, a pu être estimé comme étant supérieur à 15 jours à une température ambiante de 25°C. A ce stade, on peut suggérer que le VHC ingéré pourrait i) passer par les tissus du mésentère du moustique, ii) se répliquer dans les autres tissus en particulier les glandes salivaires.

Pris ensemble avec les mutations adaptatives identifiées, ces résultats apportent les premiers éléments en faveur de la compétence de certains moustiques, en particulier Ae. caspius et Ae. vexans, pour répliquer le VHC naturel.

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