TW200815605A - Nucleic acid concatenation - Google Patents

Description

200815605 九、發明說明: 【發明所屬之技術領域】 本發明大致與核酸領域有關。明確而言，本發明係關 於梭酸之多聯化（concatenation)。 【先前技術】

人類基因體定序計劃最重要的目標之一為提供人類和 模式生物之基因體的完整基因列表。基因的完整基因體註 解（genome annotation)依賴藉由實驗性和計算性方法的綜 合式轉錄體（comprehensive transcriptomes)分析。必需藉由 實驗數據確認最初預測的基因。然而’由於生物生命週期 之不同發育階段中表現之轉錄本（transcript)的複雜性與魔 大數量，完全定序分析所有不同的轉錄體仍屬不切實際。 在過去十年間以eDNA標定法已可克服此問題，此方 ......... - - . . ,. - ... 法中可獲得代表全長轉錄本的部分序列。此策略已廣泛地 . . ... . . . .... 被用於測定基因及定性轉錄體。 在表現序列標記（EST)法中，從5,及/或3,端核苷酸定 序 cDNA 轉殖株(Adams，M·等人，1991，心iewe，252: 1 65 1 〜 1 656)。每個EST序列讀取可產生每轉錄本平均5⑽鹼基 對（bP)的標記(tag)。相同或重疊ESTs的數目將顯示基因表 現活性的相對程度。雖然此法為一種辨別基因的有效方 法’但是標定轉錄體内的每個轉錄本的費用極為昂貴。實 際上，通常由cDNA資料庫（其中選殖數百萬的轉錄本）獲 得1〇,〇〇0個或更少的ESTs後停止定序。 200815605 择增加定序和計算大量轉綠本的效率，根據一轉錄本 如此短的標識序列（14〜20 bp)就足以特異性地代表該基因 的發現發展出基因表現的糸歹分析（S e r i a 1 A n a 1 y s i s 〇 f .· ' —V . .. - . .. · ... . .' - ....

Gene Expression，SAGE)(Velculescu，V.E 等人 ’ 19 9 5， Sc/ewe，270 : 484〜487)以及最近的大規模平行信號定序

實.

(Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)技術 630〜634)。 實驗上，可從cDNA萃取出每個、轉錄本的一短標記。 此類短標記可藉由多聯化策略（如用於SAGE)或藉由用於 MPSS的雜合式方法有效地加以定序。例如在SAGe中， . ... . . 夕個彳示5己可連接成長D Ν Α片段並選殖以便定序。每次 ' · SAGE序列的讀取通常可顯露20〜30個SAGE標記。低於 10,000次讀取的適度SAGE定序法可顯著地覆蓋一轉錄 體。藉由單純計算SAGE標記的數目頻率可測定轉錄本的 數量。 理論上，約2〇 bp的短DNA標記可明確地定位於複雜 的哺乳動物基因體中之單一位置，並獨特地代表全轉錄體 含量中的一個轉錄本。然而，實際上仍存在大量「不明確」 . ' ... . . ’ .. .... ' . 的SAGE標記（14〜21 bp)和MPSS標記（17 bp)，其在基因 體内具有多重位置並可能被許多基因所共用。 「熱解定序(pyrosequencing)」或「454 丄技術（Margulies 專人’ 2005)是一種最近的定序技術。最近的報告發現， 「454」定序儀可同時讀取300,000傭模板（template),且 200815605 '目月〗的疋序儀斋比較，可達到增加100倍的效率和降低 10倍的成本，然而，每次「454」定序讀取僅能讀取約1⑽ bp，而由於無法定序大型連續性的DNA串(stretch)故嚴重 限制其效能。 因此’目前基因體定序技術的主要問題為利用短核苷 酸標記代表基因轉錄本的不確定性，以及目前讀取短串核 苷酸之多重測序技術的限制。 — ' . ... . . ' 【發明内容】 - - . -+ . [国 — , 本發明藉由提供一種新穎的核酸操作法解決上述的問 題。更明確而言，本發明係關於核酸的操作方法。明確而 言，本發明係關於藉由多聯化製備聚核苷酸片段的方法。 在一態樣中，本發明提供一種多聯化核苷酸片段的新 賴方法。明確而言，提供一種控制多聯化核苷酸片段之長 度的方法’故而可製備出具有所欲核苦酸片段數目或特定 長度之多聯體（concatemers)。本發明亦提供藉由此方法製 備的分子和成分。根據本發明的核普酸片段可包含至少一 雙標記（ditag)及/或至少一標記。因此，至少兩核皆酸片段 的多聯化可包含至少兩多聯化的雙標記及/或標記。 因此’提供一種控制多聯化棱芽酸片段之長度的方 - ..... . .〆 . . - . 法，該方法包含：(a)提供至少兩核苷酸片段，其中各片段 具有一可揍合端和一不可揍合端;以及（b)使兩片段連接在 ; ._ - - : - ..... ' 可接合端而开Α成包含至少兩多聯化核苷酸片段的至少一寡 核苷酸。 7

200815605 在一具體實施例中，該方法可進一步包含以 處理該至少一寡核苷酸以形成具有一可接合端和 合端的至少一寡核苷酸，以及使該寡核苷酸接合 普酸或核普酸片段以形成包含多於兩多聯化核普 普酸。此方法可重覆一或多次而使至少一寡核苦 增數目的核苷酸片段。根據一態樣，該多聯化的 多聯化梭苷酸片段的數目加倍。 本方法可進一步包含處理該至少一寡核普酸 有兩個可接合端的至少一寡核苷酸\並使該寡核 接合端自環化（self -circularize)。本方法可進一步 談至少一環化寡核苷酸及/或擴增該寡核苦酸。本 一步包含處理該環化及/或經擴增寡核苷酸以產 可接合端和一不可接合端的至少一寡核苷酸，以 兩寡核苦酸連接在可接合端而形成包含至少兩多 苷酸的多聯體。 在另一具體實施例中，該方法可進一步包含 該至少一寡核苷酸以產生具有兩個彼此机容之可 至少一寡核苷酸，以及使該寡核普酸在其可揍 化；（b)選取該至少一自環化寡核苷酸；（c)視需要 : ： ' 取之寡核苷酸;(d)處理該寡核苷酸(從步驟b或 產生具有一可接合端和一不可搔合端的至少一寡 以及（e)使兩寡核苷酸在該可接合端相連接而形 — - - ^ 少兩多聯化寡核苷酸的多聯體。 在另一具體實施例中，本方法的步驟包括： 下步驟： 一不可接 其他寡核 酸的寡核 酸具有漸 重複產生 以產生具 苷酸在其 包含選取 方法可進 生具有一 及使至少 聯化寡核 ·· (a)處理 接合端的 合端自環 擴增該選 c取得）以 核苷酸； 成包含至 (a)提供至 200815605 少一寡核普酸，其中該寡核苷酸具有可接合端；（w使該至 少一寡核皆酸在其可接合端自環化;(C)選取該至少一自環 化寡核皆酸；（d)以至少一種限制酶處理該選取之環化寡核 苷酸以獲得具有一可接合端和一不可接合端的至少一寡核 皆gf ;以及（e)在可接合端多聯化至少兩寡核普酸以形成至 少兩寡核苷酸的多聯體。

對本發明之具體實施例而言，可擴增該核苦酸片段、 寡核#酸及/或多聯體。該擴增法可藉由細菌擴增法、滚輪 式擴增法（rolling circle amplification)及/或聚合酶鏈反 應。該方法可包含重複一或多次的步驟以獲得具有所欲長 度及/或募核普酸或核苷酸片段數目的多聯體。該重複可加 • · : ... 倍多聯體内寡核苷酸的數目。各片段的可接合端可為一迴 文黏性末端（palindromic cohesive end)。該可接合端及/或 該不可接合端可能位於至少一轉接子（adaptor)。該轉接子 可為質體或載體的一部分。該核苦酸片段可包含至少一雙 標記，該雙標記包含至少一包含聚核苷酸5,端的第一標記 以及至少一包含聚核皆酸3’端的第二標記。多聯體的各個 核皆酸片段與位於其上游及/或下游之核苷酸片段的方向 相反。此方法可進一步包含定序該多聯體。該定序可為任 何適當的方法，例如藉由熱解定序法。/ 在另一態樣中，本發明提供一種單離的多聯體（一寡校 苷酸或至少兩多聯化寡核普酸），其包含至少兩核苦酸片 段，其中各片段具有至少一可接合端和一不可接合端，而 '- . · ' 該片段連接在可接合端而形成該多聯體。該可接合端可為 200815605 一迴文黏性末端。該片段包含至少—雔 4触 又—返，該雙標★ 含至少一包含聚核r酸5,端的第一栌 远包 铩c以及至少一包人 核苷酸3,端的第二標記。多聯體各Ί來 、 、^各個核苷酸片段與位认 其上游及/或下游之核普酸片段的方^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^、 插入一質體或載體内。該聚核苷釀^體 為DNA或rNa。 【實施方式】 定義 限制酶一一限制酶（或稱為限 ^ a 別核酸内切酶）為可. 雙股Ε>ΝΛ的酵素。該酵素形成兩切口，夂 + 刀 谷自在不後壞緣 ^ ff ^ T ^ if ^ ^ ϋ ^ ^ ^ ^ ± ^ 〇 # ^ ^ ^ ^ ^ ^ 化學鍵可藉由其他已知酵素（例如，接合酶）再形成，故的 使不同染色體或基因獲得的限制片段，从1 山、 而 右，、末端為互補赤 相容時則可連接或剪接（splice)在—起。第π型酵素可次 別特定核酸序列'(識別部位）且在接近或再識別序列却位t 内的界定位置處剪切DNA。其產生不連接的限制片段及^ 區別的凝膠帶狀圖樣。第II型酵素在复螂如广^丨“可 承牡再識別序列外側剪切 至一側。Mmel以及大部分的第II型限制酶可產生多種吾产 的末端。Dunn等人（2002)指出Mmel以大约】· \ 、、又 八4 1 · 1比例切除 ! 8/20或1 9/21的驗基^第⑴型酵素亦為大齓 飾酶的組合物。其切斷識別序列外側且需要同一 dnA八子 中此兩序列分別位於相對方向，才能完成切割。歸家内切 酶（homing endonucleases)為具有大型、不對稱識別部位 (!2〜4〇個驗基對^的罕見雙股去氧核糖核酸水解酶 (DNase)，且其編碼序列通常包埋於内隱子（DNA)或内隱蛋 10 200815605 白(蛋白質）中。限制酶的剪切可留下無點性（銳）端或且有 外伸（overhang)之黏性（可接合）端。黏 Λ/、’ 挪Λ权不僅可接人 至其最初被切下的片段，亦可接合至且女口 、 ♦ ，、有一互補、相容、 黏性末端或黏知（sticky end)的任何复抽 '他片段。因此，由不 同酵素所產生的末端亦可被此相容。誅 旰夕弟II型限制酶可 剪切迴文DNA序列。若一限制酶剪出一儿 囬 未退化迴文剪切 部位’則其產生的所有末端均為相容。—「、口文 (Panndr。―」序列意指在一股上的序列與在互補二 反方向的序列讀起來係一樣的’使經‘她^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 〇 ^ 文中「迴文」的意義不同於其語言學上的甩法。例如，序 列GTAATG不是一迴文DNA序列，但序列〇τΑτ^則是。 留下黏性末端或黏端之限制酶的實施例包括BamHi、 和HindIII。留下鈍端、非黏性或非黏端之限制酶的 ^實施例為Alul。在本發明之下，若其為一互補、相容、 ^性末端或黏端或經礙酸化鈍端時則將—核酸股末端稱為 1連鋒或严被連接。若其和核酸之另一股均為去磷酸化末 !*者若其不是與核酸另一鏈為互補、相容、黏性末端 或站端之末端時’則將一校酸末端稱為不可連接或不能被 連接〇 i 土 ， 士 丹者，由本文中所示的酵素或識別部位名稱可輕易 i也瞭 '、 限制酵素名稱（例如，EcoR 1)亦指酵素識別的核酸序 列或識別部位。 核势酸—核苷的磷酸酯；核酸（DNA或rnA)的基本結 構單亓。仏 核苷酸形成驗基對一一對化學驗基的其中之一經 200815605

由氫鍵接合以連接dna分子或具有雙股之RNA分子之互 樣股；該驗基對在DNA内為腺嘌呤(A)與胸腺嘧淀(τ)以及 鳥翼％呤（G)與胞K(c);而在RNA内為腺嘌呤與脲嘧啶 (U)以及鳥糞嘴呤與胞嘧咬。核苷酸可與其他核苦酸松接合 或多聯化。核苷酸一詞可與梭酸一詞互用。各個核苷酸具 有一 5’端和一 3’端，而因此一串核酸亦具有一 5,端和一 3, 端。一串核酸的末端區域分別被稱為5,末端和3,末端。核 酸序列通常係從5,至3,方向讀取，這為該核普酸的方向。 短版核苦酉曼^皮稱為寡核苦酸（〇 1 i g 〇 n U c 1 e 〇 t i d e )而較長股者 被稱為聚核苦酸（p ο 1 y nu c 1 e o t i d e)。在本發明之下，一寡核 普酸可包含至少一梭苷酸片段、標記或雙標記。一片段為 由較長核酸獲得、衍生或製備的一段梭酸。因此，一片段 $包含至少一標記或雙標記且可代表一較大的核酸分子。 在本發明之下，聚核苷酸可為一基因、基因的信息RN A轉 錄本、部分基因或代表一基因的cDNA序列。參照第一寡 核苦酸，若第二寡核苷酸位於接近該第一募核苷酸的5,端 時其被稱為「上游」；而若第二核苷酸接近該第一核苷酸的 3端時其被稱為「下游」。 多聯體一其由至少兩核普酸單體序列端對端連接所構 成’其視需要由連接子(linker)或間：隔子（spacer)所隔開。 用於本發明之目的時，一多聯體包含根據本發明方法製備 的至少兩標記、兩雙標記、兩核普酸片段或兩募核苷酸。 在本發明中，兩寡核苷酸可被多聯化而使寡核苷酸内一核 脊酸片段的5,至3,方向與位於其上游或下游的一接鄰核 12 200815605 苷酸片段之方向相反。 質體一具有載體或重組載體之名稱，意思為經由插入 或併入雙標記基因序列加工的一質體、病毒或技術中已知 ... ...： ： - . 的其他載體。此類載體含有可有效轉錄談插入序列的一啟 動子（promoter)序列。該载體基本上含有一複製起點（origill . .. . · - of replication)、一啟動子’以及允許以表現型來篩選轉形 細胞的一特定基因。適合用於本發明的載體包括諸如，

pBlueScript (Stratagene ’ 加州 Jolla 市）;pBC、pZEr〇:l (Invitrogen ’ 力口 州 Carlsbad 市）和 pGEM3z (Promega，烕斯 康辛州Madison市）或其等之改質载體，以及熟習本技術者 所習知的其他類似载體。該 pGEM載體亦彼露於 US 4,76 6,072，將其併入於此以供參照。在本發明中，使用質 體PGIS4a2 (B4-1選殖株）（第5 A圖)。 來自(obtain)、衍生(derive)、製備一利用分子生物學 和基因工程學及操作技術於生物材料（例如，核酸和蛋白質） 上以賦予該材料某些所欲的特性。來自、衍化:和製備一詞 在本發明中可交互使用。 擴增一增加梭酸的複本數。一種常用方法為聚合酶鏈 反應（PCR)。亦可使用熟悉技術者所習知的其他壙增法， 例如細菌擴增法或滾輪式擴增法。 標記一標記或特徵為核酸的一可識別序列。其代表衍 生自任何連續D N A區的5，或3，最末端的核酸序列（末端， 任何長度均可但通常為1S〜20 bp)。本發明之標第或特徵一 詞可互用。在本發明之下，分別來自兩核苦酸片段的單— 13 200815605 標記特徵（約20 bp)可相接合而形成「標記連接 2」(亦稱為「第一標記-連接子_第2標記」）的成/ 記（paired end ditag，PET)構造。另一種可能的配眷、雙標 手-擇却押# 从 置為連接 子私己-連接子構造，其連接子位在―輕r (亦即，i車垃工/么/ ' 〇己的兩側 (7Γ Ρ連接子係位於至少一該標記的上游及/或 、查 4A ~τ ..卜.游）。’..

—連挨子為一種人工的核酸序列，Α $ A 一或多個限制酶辨別位點。 含有 雙標記一包含衍生自較長股核酸至少柄 徵的短股桉:a：缺，、a、 ^ 標記或特 乂皆酉夂（通吊為1 2〜6 0 b p)。可柄

2005025550 1 ；5 / 十 ηο λλ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 根據 US 及/或US 20050059022製備雙標記， 容併入於此以祉*。 争…内 供參照。一雙標記可包含一核酸分子 區（亦稱為5，,々、R子的5端 ‘圯）及3端區（亦稱為3,標記）复中夕 者。在本發明夕丁 〜τ之一或二 之下，來自兩核普酸片段各者的單一々 徵（约20 bp)可人· 早払s己特 T相接合而形成「標記！ ·連接子 稱為「第一椁# 、^ 俠·^ 5己2」（亦 構造。告W _第2樣記」）的成對端雙標記(PET) 構仏田兩個成對端 々 女 bT) 之5,標記和3, Γ又（）各自包含各個核苦酸片段 rPET1^^^PET2j 成斜蠕雙標記（diPET):。: 绝 定序S用 用於測定生物聚合物（在此例中兔仿 成順序的方法 / 1為一核酸）中組 。可使用的定序技術包括蠱狄 法及其改良方也 斤孜釘匕栝桑格（Sanger)剛序 力丁 、，以及熱解測序法或定序的「454法。 在下列的筇BB + & 例。然而熟習^ ，供細節以描述本發明的具體實施 可進行操作^、技術之人士應瞭解本發明不需該些細節印. 為了不模糊本發明有些細節並不加以贅述。 14 200815605 為執行特定具體實施斜之本發明的方法，亦可利用為 執行本發明其他具體實施例所彼露的任何說明而將其併入 於此以供蒼照。明確而言，其指技術、試劑、實驗條件、 限制位點、酵素、载體、引手（primers)等。明確而言， 何技術人員可利用揭示於其他具體實施例的技術和材料於 本發明的具體實施例广^ ^ ^ 為方便之計本發明說明書内所提及的參考文獻目錄以 表單方法列舉亚附加於該實施例之末。 技術中已知和未特別說明的標準分子生物學技術通常 述於標準分子生物學參考書例如分子選殖：Sambr〇〇k和 RusseU的實驗室手冊，第三版，2〇〇1，冷泉港出版社出版。 詳細說明 本發明係關於一種處理核酸的新穎方法。更明續而 吕’本發明係關於藉由多聯化處理核酸的方法。明確而—， 本發明係關於藉由多聯化製備代表聚核苦酸之雙標記^/ 或才示§己的方法。 在心樣:中’本發明提供一種控制多聯化特徵標記（代 表聚核普1曼）之長度的方法，因而製備具有所欲數目的錐伊 記及/或標記或呈右蛀—且命 又你 飞，、有特疋長度之多聯體。本發明亦提供藉由 此方法所製備的分子和成分。 :因此，提供—種控制多聯化核苷酸片段之長度的方 法該方法包含：（a)提供至少兩核苷酸片段，其中各片段 具^山可接合端和一不可接合端；以及（b)使該兩片段在其 接口端相連接而形成包含至少兩多聯化核苷酸片段的至少 15 200815605 一寡核苷酸（第1圖）。此方法可重複一或多次。

上述方法可進一步包含處理該至少一獲得的寡核苷酸 以產生具有兩個可接合端的至少一寡核苷酸，以及使該寡 核皆酸在其可接合端自環化。該方法可進一步包含選取至 少一環化寡核苷酸及/或擴增該寡核苷酸。該方法可進一步 包含處理該環化及/或經擴增的寡核普酸以產生具有一可 接合端和一不可接合端的至少一寡核苷酸，以及使至少兩 募核皆酸在該可接合端相連接而形成包含至少兩寡梭普酸 的多聯體。此方法可重複一或多次。在一態樣中，該多聯 化的重複可加倍多聯化核苷酸片段的數目。 在另一具體實施例中，提供一種方法(請看第2圖）， 其步驟包含（a)提供包含至少一核苦酸片段的至少一寡核 苷酸，其較佳為包含至少兩核苷酸片段，其中該寡核苷酸 具有可接合端；（b)使該至少一寡核苦酸在其可接合端自環 化；（c)選取讓至少一自環化寡梭苷酸；（d)以至少一限制酶 處理讓選取之環化寡核苷酸以獲得具有一接合端和一不可 接合端的至少一寡核苷酸；以及(e)在該可接合端多聯化至 少兩寡核苷酸而形成至少兩寡核苷酸或至少兩核苷酸片段 的多聯體。明確而言，步驟（a)所產生的寡核苷酸可包含至 少兩多聯化核苷酸片段，而步驟（e)所獲得的多聯化寡核苷 酸則包含至少兩個四聯化核芽酸片段（如第2圖中所示）。 各核苷酸片段可包含至少一雙標記，該雙標記包含至少一 包含聚核苦酸 5 ’端之第一標記以及至少一包含聚核苷酸 3’端之第二標記。在一具體實施例中，該核苦酸的第一標 16 200815605 記與同一核苷酸片段之第一声卞的 乐一己的方向相反。因此，該寡 核苷酸的各自核苦酸只防 心甘蛟片段與位於其上游及/或下游之核普 酸片段的方向相反。此方 ^ 方法可重複一或多次。在一態樣中， 該多聯化的每次重藉w 4 > 稷了加倍多赛化核苷酸片段的數目。 多重測 4 54」測序法或執艇你 …、解疋序技術已被發展用於基因體 DNA的定序，但每次僅能 ^ Λ κ l m唄取l oo bp。此限制使可使用之 標記的數目受到限制。卷拗n/ 田€力口可谷亦的標記數目時，必需 縮短各標記的長度；這侔ρ左 一 + 專一性的降低及不明確性的增 加。對照之下，本發明夕 4 屯德描二 版備控制長度的多聯體方法若使 用雙標記時’各讀取胳甚一 、 …不數百或甚至數千以雙標記劃分 的驗基對資訊。此外， ra · ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 吏用dlPETs作為模板時，「4 5 4」測 序法的定序產量和能力將 # 處 等曰加兩倍。因此，本發明之方法 畐應用於製造多聯體以便皮分々 吏疋序且搭配多重測序法時，可較 任何目前甩於DNA測庠八\」 刀析法的效率高出至少500倍。此 多聯體長度控制法可被棒 χ u 二 1曰至夕:人循環以製造具有多個雙 才示§己的多聯體以及可被廉兩 由/ 應用於產生任何種類標記片段之所 奴長度多聯體，何如SAc}p十〆 + π > ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 或 4 5 4」多重測序技術乂 本發明之方法可用於 、Α測序法和染色質免疫展 (chIP)DNA片段測序法以及复仙的产木色貝免度Λ我 Mpss)。 \ ^ 他的測序技術（例如，SAG^ ^ 為克服目前技術的問韻名p连 ]題和限制，本發明在一且每# 例中提供一種控制多聯特汽俨々 ' ％ 身被私C (代表聚核苷酸）之具 的方法，因而考製備且古 ;《長度 ，、有所欲數目之標記或雙標記以及且 17 200815605 有一棒定長度的多聯體。此類多聯體可用於多種的測序技 術中。 ' V · ' - .... . . 標記和雙標記 可從成對端雙標記（PET)法製備或獲得本發明的雙標 記（US 20 0 5025 5 501 )。本說明書之目的而言，一標記為來 得自一核酸分子的片段，且代表獲得或衍生標記的聚核普 酸。擬被縮短或代表的聚核苦酸可為RNA、mRNA、美_ 體 dna、全長 cDNA，或 cDNA。二土 咬片^本發明之下’存在於本發Μ $片段亦可被稱為雔 u Ί己 俜矩认 丨和片段或標記相同，—雙椤卞 係短於其來源或所代表的原始核酿八又 必需相當短於其Y於妨妒乂 〇 X刀子。該雙標記較佳為 ^ 原始核酸分子。「始^ · 基本上可包含；f私分^ 、、旦」的釔果，該雙標記 入。％席始核酸分子的 广 蠕區（亦稱為3，_々、甘士 '區（亦稱為5,標記）和3, 订V 知έ己）其中之一或一 ^括介於5,標^ I/根據本發明的雙標記保留兮搭内側的原始核酸分子部 ^ # ^ ^ ^ ^ ^ I, „ ^ ^ ^ ^ ^ ^ t * ^ 4 性 形成雙標記的5，許」 、特徵。 n 的5標記和3,於 °。其較佳為具有相同數目的枯^記之大小可為相同或不 的大小’但對其所衍生之全丨督賤。該雙標記可為任何

!^ 4 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ # t A 疋。對細菌基因體而言.，釣8小由基因體的複雜度所決 約，位較複雜的基因體（例如，^至約I6 bP的標記即已足 bP的襟記(其雙標記則為32〜4〇 ^基因體）可能需要16~2| P) °通常，雙標記的大小 18 200815605 約為12〜00 bp 〇

對本發明之目的而言，5’末端、5’端和5’標記等詞為 彼此相同且可交換使用。同樣，3’末端、3’端和3’標記等 詞為彼此相同且可交換使用。在一原始核酸分子或聚核普 酸中，或擬被減少或代表之核酸分子或聚核苷酸的内側部 分，各5’端和3’端代表最接近末端；最遠離核酸分子或聚 核苷酸之中段區的區域或部分。至於聚核苷酸的 5’或 3’ 末端，應暸解聚核苷酸之實際5’或3’末端的任何區域、片 段或全部聚核苷酸亦被包括在内。 各個雙標記包含足夠的資訊以定性一特定聚核苷酸。 因此，該雙標記可代表該聚核普酸的構造與身分。 多聯化寡核苷酸、核苷酸片段、雙標記或標記 雖然可製備足夠長度的片段或標記，但是獲得預設長 度之多聯體有其技術上的困難。目前用於標記多聯化的方 法可隨機產生一定範圍長度的多聯體：單體、雙體、三體 等等。在目前的技術中，此類多聯體必需在電泳凝膠上流 動以分離多聯體，然後從凝膠上切除所欲大小的多聯體一 此為一項極為煩索的工作。此技術的效率不佳且需要输入 大量的DNA。 本發明提供一種控制多聯化長度以製造預'定長度之寡 梭苷酸的方法。本發明藉由製備具有一可接合端和一不可 揍合端的片段、雙標記或標記而達到此目的。利用此技術， 在一片段或標記上的一相容、黏性末端或黏端將與另一片 段或標記的另一黏端相連接或接合。當此現象發生時，該 19 200815605 非黏端不再進一步接合而停止多聯化。進一步以rf列實施 例說明此技術。若不易找到片段或標記内的可接合端時， 可將具有適當限制酶辨識部位的適當轉接子連接多該片段 或標記。該接合端為一迴文序列端。

或者’右為了產生一端為迴文而另一端不會自我連接 而無法使用兩種不同酵素，可接讀使用該酵素，在第一限 制询酵解後藉由去碟酸化或其他方法將一端「阻斷j ’例如 將其附著至一固體基材。 ........ :. ...... . MPET的具體實 - - .. . . - . ..’ * . ·. _ 在此具體貫施例中，質體内黏性迴文酵素與〆留下純 端的酵素之限制酶辨識部位位於具有單一 PET構造的標記 兩側。例如，該兩個部位一邊可為BamHl (B)而另〆邊可為

BseRl (Bs)(第1 A圖），而使BamH1剪切留下一可彼此互容的 .., _ ... ... 迴文黏性末端，而該BseRl的剪切則留下一 AA殘基或任何 非迴文序列（不與其本/身相配）。談pETs可藉由細菌擴增 法、滾輪式擴增法或其他擴增法而擴增（第1 A和1B .圖）。 ,，.. .. ； - 然後以一限制酶（在此具體實施例中^ BseR1)第一次切割談 PETs，接著以不同限制酶（在此具體實施例中Β^Ηΐ)進行切 可藉由任何適當方法（彻上 、、以 (例如’凝膠純化法）純化釋出 PETs。在接觸另一類似方法& ， 所製備的PET時，BamHl的 何兩個黏性末端將找到彼此* 亚互相連接，造成寡核苷酸 聯體在寡核苷酸各邊為兩個 隹遇文端的雙體PET或dip 構造（第1 B圖）。這些非迴女山 又V可阻止與其他P ETs進一 20 200815605 接合而中止多聯化。 此具體實施例可產生由兩約80 bp之PETs所構成的 diPET寡核普酸多聯體，其低於目前「454」測序系統的最 大能力。 較佳具體實施例中雖然利用pETs，但是藉由此方法亦 可將任何的標記送進「diPETs」。亦較佳為使用至少一第 IIs型限制酶（例如，BseR1)，因為此將減少邊界序列的長

度。祗要第IIs型限制酶有不同的切割位點，僅使用一個 第IIs型限制酶位點。 p-PET的具體眚施例 — 此方法可產生由n個PETs(其n = 4、8、16、32.··)所構 成的DNA序列，而可利用長度控制法向上擴充pETs的數 目成適舍特定測序技術的能力。 參考第2圖，兩種不同類型的轉接子（標示為a:和上: 連接於該diPET的末端。這些轉接子含有用於後續限制酶 酵解所需的不同限制酶剪切位點。接合該些轉接子，因而 僅那些具有連接不同轉接子的diPETs可藉由自環化作用 而環化，而因此藉由姑缺从丄 “， 由核s义外切_ (exonuclease)處理所挑 出。滾輪式擴增法係用於擴烊 δ + ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 尽擴〜DNA。或者，已知轉接子序 列時亦可藉由PCR進钚彼描1庇 仃擴V和選取。然後以適當的限制.酶 剪切該DNA以製造一迪々υ 、 # ) ΛΤ^丁一 文、和一非迴文端，而可藉此接合 形成4-ΡΕΤ养核苷酸。、始 人 FT沾十後如所預斯的重複該循環以製造 包含n-PETs的較大寡核聲酸多聯體。 或者，兩種不同_型韓不 I的轉接子可連接至該di_pET的末 21 200815605 端然後進行P C R。相容的轉揍子將會相黏合而阻止P C R發 生，僅允許具有不同轉接子的di-PET被擴增。然後以適當 的限制酶切割該DNA，若想要時重複該循環。 在diPET和n-PET的具體實施例中可看出這些具體實 ' :' - . ·. . . .： - 施例中的多聯化可使一核苷酸片段、標記或雙標記的5,至 3’方向和另_與其相鄰（亦即，位於上游或下游）的核苦酸 片段、標記或雙標記相反（第丨和2圖）。在此具體實施例 中亦可看出該接合步驟的每次重複可加倍diPETs多聯化 的數目。 上述本發明方法的具體實施例雖然利用具有可接合端 的片段或標記，但是本發明之方法藉由加入其適合的轉接 子亦可使用無可接合端的片段。或者，若無法利用兩種不 同酵素使其產生一端為迴文及另一端無法自連接時，可接 ’使用該酵素而在第一限制酶酵解之後藉由去磷酸化或其 他方法將一端「阻斷」，例如將其附著至一固體基材。 該用於片段、雙樣記或標記之方法的具體實施例亦可 %、用於养核苷酸或寡核苦酸多聯體。例如，亦可將適當 的轉接子連接於寡核苷酸多聯體而使其以相容的黏性末端 連接至另一核苦酸片段、標記或寡核苷酸。 - - . - . ~ _ - - - . 因此’在另一具體實施例中，該方法之步騍可進一步 ，處理該至少一秦核芽酸以製造具有一可接合端及一不 σ接a ‘的至少一秦核普酸，以及使該寡核苦酸與另一寡 核苷酸或核皆酸片段相連接而形成包含至少兩寡核發酸或 至少一寡核皆酸和至少一核苷酸片段妁多聯體。 22 200815605

在另一具體實施例中，該方法進一步包含:(a)處理該 至少一寡核苦酸以製造具有兩個彼此相容之可接合端的至 少一寡棱苷酸，以及使該寡核苷酸自環化;(b)選取該至少 一自環化寡核苷酸；（c)視需要擴增該經選取之寡核苷酸； (d)處理來自先前步驟的寡核普酸以製造具有一可接合端 及一不可接合端的至少一寡核苦酸；以及（e)使兩寡核苷酸 在其可接合端相連接而形成包含至少兩寡梭苦的多聯 體。 亦提供包含至少兩核苷酸片段的獨立寡核芽酸，其中 各片段具有至少一可接合端及一不可接合端，而該片段在 其可接合端相連接而形咸該寡核苷酸。該可接合端較佳為 迴文黏性末端。根據本發明之多聯體或多聯化寡核芽酸包 含至少一核苷酸片段，該片段包含至少一雙標記，該雙標 記包含至少一包含聚核普酸 5 ’端的第一標記及至少一包 含聚核苷酸3 ’端的第二標記。該聚核苷酸可為全長cDNA 或一或多個表現子（exons)。因此，讓雙標記可代表該全長 cDNA。在一具體實施例中，根據本聲明之多聯體或寡核苷 酸之各個核苷酸片段（或雙標記）與位於其上游及/或下游 之核苷酸片段（或雙標記)的方向栢反。可將根據本發明之 多聯體、寡核勞酸、核苷酸片段、雙標記或標記插入一質 體或载體内。因此，根據本發明亦提供一種包含至少一多 聯體、寡核苷酸、核苦酸片段、雙標記或標記的質體或載 體。可將該質體或載體插入一宿主細胞内。 亦提供一種根據本發明任一具體實施例多聯化寡核苷 23 200815605 酸、核苷酸片段、雙標記及/或標記所用的套組，其包含至 少一限制酶、至少一核苷酸片段、雙標記或標記、視需要 的截體，以及此處所彼露之用於多聯化反應的任何試劑（例 如，如實施例中所述）。該套組進一步包含與應用該套組有 關的說明書及/或資訊。

亦提供包含至少一根據本發明任一具體實施例之多聯 體、多聯化寡核普酸、多聯化核苷酸片段、多聯化雙標記 及/或多聯化雙標記的資料庫。 變化 - . ... .. ... . _ ... 對本發明此方面„的具體實施例而言，可能存在許多種 不同的方法。例如，可擴增該標記或核苷酸片段，及/或寡 核苷酸或多聯體。該擴增法可藉由細菌擴增法、藉由滾輪 式擴增法，及/或藉由聚合酶鍊反應。該方法可包含重複該 - - 步驟一或多次以獲得所欲長度或寡核苷酸數目的多聯體。 該重複可倍增多聯體内之寡核苷酸的數目。各片段、標記 或雙標記的可接合端可為迴文黏性末端。該可接合端及/ 或該不可接合端可能位於至少一轉接子。該轉接子可為貧 體或載體的一部分。該核發酸片段可包含至少一雙標記， L . — * - . * * 該雙標記包含至少一包含聚核苷酸 5’端的第一標記以及 - . - ' . ^ ' - 至少——包含聚核苷酸3’端的第二標記。多聯體之各個核普 酸片段或樣記輿位於其上游及/或下游之核普酸片段的方 向相反。該方法可進一步包含定序該多聯體。該定序可藉 由任何適當的方法，例如藉由熱解測序法。 本發明現已經通盤地說明.，透過下列提供作為本發明 24 200815605 之說明而非限制的參考實施例可更輕易地暸解本發明。 * - ..... 實施例 • .... .... -- · · - . 一 PET皙體的BseRI線性化 在轉化單一 pET質體DNA之後開始利用訄&乂丨？1^?擴 增載體（述於 US 2005025551 和 US 20050059022)。可用任 何適當的載體選殖和擴增該目樣序列，例如pGIS4a2 (第 • . ·... ... .

5A圖；序列辨識編號：14)或pGIS3h(第5B圖；序列辨識 編號· 15)。通常，1 〇Q_tray的產量约1 ·2毫克，其濃度约 400奈克/微升。 1000 微克單一 PET 質體 ^ ^ ^ ^ ^ 2500 微升 1 Ox NEBuffer 2(New England Biolabs) 400 微升 lOOx BSA(New England Biolabs) 40 4 單位 /微升 BseRI(New England Biolabs) 1000 微升（超過 4 倍量） 無核酸酶水 至4000微升 ..... · ' . . .. ... 建議將该反應混合物等量（a 1 i q u 01)於各1 〇 〇微升的試 • ' ...... ... .... .- 管内可進行更有效率的酵解。

BseRI酵解單一 PET質體Maxiprep-將酵解在下 培養3小時（效率最好）。在pH7·9下利用Eppendorf50毫 升翁相膠（phase-lock gel)執行盼·氣仿的萃取。 - - · . 注意可得到的各種尺寸鎖相膠所需的最小和最大體 積。為了調整該體積至所需的最小體積，可加入高達1〇〇〇 微升的無核酸酶水。 - ' .... ' ' .. .. .. " 50毫升鎖相膠： . . ' . ... 最小體積：5毫升 25 200815605 最大體積：20亳升 由於包含大量體積，故在下〆步驟執行異丙醇沈澱：

BseRI酵解的單一 ？丑丁質體 500微升 3M NaOAC pH 5、2(Ambion：^ ^ ^ ^ 50 微升

Glycoblue(Ambion) 5 微升 異丙醇(SigmaL ^ ^ ^ ^ ^ ^ 微升 總量^ ^ ^ 1055 微升

在-2〇t：下培養1小時。在4£€下以13,0〇〇”111離心3〇 分鐘（利用Eppendorf541 5R離心機：其餘的步驟可使用相 - · 4 ' 同的離心機）及以75%乙醇清洗一次（由1⑽％乙醇製備，取 自Merck)。將DNA片狀物再懸浮於最終體積1 500微升的 Qiaen 沖提液（Elution Buffer，EB)内。 為檢查其品質，利用中間性膠體(medium gel)在 ΓΙΟ 伏特下之1%瓊脂凝膠上使4〇〇奈克之BseRI剪切物或未剪 刀的單一 PET質體流動40分鐘。超螺旋（supercoiled)單一 • ； . · PET質體的存在將可產生PET的5,和3,端均為BamHI黏 性末端的PETs。然後將其多聯化而產生關注之BamHi ^Ts多聯體和diPETs之混合物的最終產物。若大部分的 ^累％早一 PET質體仍未被切割時則重複該B wRI的酵解 U 3 «)-

pEt挤 Λ阅綱不将W个70王叶，即仍存在超J 質體的條帶(band)，建議進行另一次的BseRi ' - / · ' · ... ... . . 在BseRr酵解後單一 pET質體的去磷酸化 庄意：此步驟僅為經由pGISSh载體產生dipET、 26 200815605 驟。pGIS4a載體進行此步驟並無傷害但也不需要。保存約 400奈克的此樣本，即磷酸化的BseRI線性化單一 PET質 體，以便後續的電泳檢查去磷酸化的品質。 1500微升（〜1000微克） 600微升 1000微升（超過5倍量） 2900微升 6000微升

BseRr剪切的單一 PET質體 1 Ox南極磷酸酶缓衝液 (New England Biolabs)

5單位/微升的南極磷酸酶 (New England Biolabs) 無核酸酶水 總量 進行異丙醇沈澱： 去磷酸化的BseRI線性化單一 PET質體 500微升’ 3M NaOAC pH 5.2(Ambion) 50 微升

Glycoblue(Ambion) ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 5 微升 異丙醇(Sigma：r^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 500 微升 總量 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 105.5 微升 在-2 0°C下培養1小時。在4°C下以1 3,000rpm離心30 分鐘及以75%乙醇清洗一次。將.該片狀物再懸浮於最終體 積為500微升的沖提液（Qiaen)内。 取約400奈克與先前保存的磷酸化BseRI線性化單一 PET質體在1%瓊脂凝膠上進行電泳。 經BamHI酵解以釋出單一 PETs 500微升(〜1000微克） 〗00微升

磷酸化/去磷酸化BseRI剪切之單一 PET 質體 10x BamHI專屬缓衝液 (New England Biolabs) 27 200815605 lOOx BSA(New England Biolabs) 10微升 20 單位 / 微升 BamHI(New England Biolabs) 100微升 無核酸酶水 290微升 總量 1000微升 每試管100微升的等量樣本。在 37°C下培養隔夜。 用 Glycoblue 進行乙醇沈澱以減少 體積以便容易裝 (loading)於凝膠中。 製備5根下列組威物的試管： 經BamHI酵解的質體 200微升 100% 乙醇(Merck) 600微升 3M NaOAC pH 5.2(Ambion) 20微升 1M MgCl2(0.0225x 的樣本體積） (Ambion) 4.5微升 Glycoblue(Ambion) 2微升 在-8 0°C下至少培養30分鐘，接著在4°C下離心30分 鐘。以75%乙醇清洗一次。將該片狀物再懸浮於最終體積 為3 50微升的EB内。裝載於凝膠時，加入100微升的裝 ' * . · ' 载染料（loading dye)並在2%瓊脂凝膠上裝載45微升/孔

(不超過100微克的DNA/孔）。在80伏特下進行電泳1.5 . . ... . . ；. 小時。 電泳透析（Electroelution) 將 800 微升無菌 milli-Q 水加入 Fermentas ElutaTubes 以水解膠膜。這些將於後績被用於電泳透析。 〆......... .........八... ... . 在3 65奈米的紫外線下觀察並從凝膠切下〜40 bp的 PETs。捨棄該800微升滅菌milli-Q水然後將切下之凝膠 塊置入ElutaTube内。每根五1\11&1'1^6内僅加入一凝膠塊。 28 200815605 以無漠化乙錠（Ethidium Bromide)的1 xTAE緩衝液充填1 管然後在90伏特下電泳透析30分鐘揍著在冷房内反轉極 性1分鐘。確認讓ElutaTube在加入缓衝液之後没有氣泡。 以多支Eppendorf試管收集經透析的PETs然後在ί 下以1 3，000 rpm離心1 0分鐘。這是為了將可能存在的賓 脂部分片狀化。儘可能吸取上清液然後進行異丙醇沈幾： 5 00微升 50微升 11 · 2 5微升 5微升 500微升 1066.25 微升 透析的DNA 3M NaOAC(Ambion)

1M MgCl2(〇.〇225x 的樣本體積） (Ambion)

Glycoblue( Ambion) 異丙醇（Sigma) 總量 注意：該lMMgCl2係有助於小片段DNA的沈澱。 在-20°C下培養1小時。在4。(：下以13,0〇〇 rpm離心 3〇分鐘。以75%乙醇清洗一次。將PETs再懸浮於最終體 積12微升的EB内。 ； ..... .. . 4. PET DNA的定量 在4〜20%逑你PAGE凝膠（Invitrogen)上定量PET DNA。將0·2微升之PET DNA與25 bp階梯條帶（ladder) 與Low Mass DNA階梯條帶（均來自Invitr〇gen)一起進行電 泳。後者有助於評估談PET DNA的數量。目前，使用2 • - - · - ' 微升和4微升之L0W Mass DNA階梯條帶作為定量之用。 下列顯示每個裝載之階樣條帶的製備方法: .. ' '' 製備25 bp階梯條帶 29 200815605 1微升之1微克/微升25 微升之裝載染料 總量為12微升 bP階梯條帶+9微升之EB + 2 製備Low Mass 梯條帶 製備2徵升Low Mass階梯條帶 2微升tow Mass階梯條帶+8微升之EB+ 2微升之裝 載染料

總量為12微升 製備4徵升L 〇 w M a s s階梯條帶 ... . ' . . ' . * 4微升Low Mass階梯條帶+6微升之EB + 2微升之裝 載染料 總量為12微升 在2 0 0伏特下，在力口入T B E缓衝液（A m b i ο η )之4〜2 0 % 迷你PAGE凝膠上將PET DNA(即將定量）與這些階梯條帶 一起電泳30分鐘。 在TBE緩衝液内（最終濃度應為l x，Ambion)以Sybr Green I(Molecular Probes)將 PAGE 凝膠染色 10〜15 分鐘。 注意：若DN A帶的強度在定量上無差異時，建議裝載較少 ..... .... ·. ... . ....... ' .· · · · ; . ...... ... . · ..... 的 DNA。粗略的估計即足夠，因為最終的 diPET將在 ‘ . .... * .... _ ... . - · .[ .... 二

AgilentBioanaly zer 5 00/ 1 000套組上進行定量及評估大小 以便進行「454」熱解測序法。 diPET反應 PET DNA(至少5微克) 7微升 30 200815605 升 升升微 微微ο IX lx 1X 至 ΐοχ精胺素緩衝液(自行配製，如下） 5單位/微升T4 DNA接合酶（Invitrogen) 無核酸酶水 含精胺素（Spermidine)的1〇χ接合酶緩衝液的成分： . .' - ' 60mM Tris-HCl pH 7.5(Ambion) · · ； . . . · · 60mM MgCl2(Ambion) 50mM NaCl(Ambion) 1 毫克 / 亳升 B S A(New England Bi〇labs) 7OmM -魏基乙醇（Sigma) - .... —. . .. .. ..' 1 mM ATP (Invitro gen) 2 0mM DTT (In vitro gen) 1 OmM 精胺素（Sigma) 在1 6 °C下培養隔夜。以無核酸酶水將體積調整至2 0 0 微升及進行酚氯仿pH 7.9的萃取。 進行以下的乙醇沈澱： diPETs ^ ^ ^ ^ 200 微升 3M NaOAC(Ambion) K)微升 1M MgCl2(Ambion) 4,5 微升

Glycoblue(Ambion) 2.2 微升 絕對酒精(Abs EtOH)(Merck) 800 微升 在-2 0°C下培養1小時。在下以13,000 rpm離心 :… ........_ ' ..

30分鐘。以75%乙醇清洗一次。將該dipETs再懸浮於2C 微升的EB内。 在 diPET 反應之後，在 AgilentBioanalyzer DNA 500/ 1 0 00套組上依照製造商的指示估測所得diPETs的多聯化 31 200815605 測序 和數里。然後〆進行任何較佳的定序法（例如，「454」 法）。 - · 乂 - . -. 作為窥例 來源 理想 使其 為該 端時 後使 連接兩不同的轉接子1若有需要該轉接子可含有 辨識標記。該轉接子較佳為具有彼此互補的一端，而 上在轉接子的另一端為與DNA之黏端互補的黏端，而 輕易地接合且該轉接子不會與其自身相連接。最佳 DNA已含有黏端，如dipETs。然而，若該關a為越 則該DNA可以DMA取人給I丨 UNAn _ 加上 A_ 尾部（A-tailed)，然 用1^尾部（T-tailed)的轉接子。 加上尾部（若使用diPETs時則不需要） 〇·5微升 〇·5微升 2 · 5微升 20微升 1.5微升 25微升 lOmMdATP ExTaq聚合酶 lOxExTaq嚴衝液 2微克之樣本 無核酸酶水 總體積 ‘鎗， 再懸 利用PCR儀器以下列程式進行培養：72。〇下3〇 接著在4°(:下直至結束。 進行酴氨仿的萃取及以G1yC〇blue的乙醇沈毅 浮於12微升的Eluti〇nBuffer内。 轉接子的接合 譬如5微升 1微升 1微升 DNA(約200〜1000奈克） 1 〇χ接合酶緩衝液（帶有精胺辛） 以乃财揍合酶仏單位/微升）’、） 32 200815605 無核酸酶水 在1 6°C下培養1〜2小時。 轉接子的磷酸化 DNA 10x T4 PNK缓衝液 10mM ATP 溶液 T4聚核苦酸激酶（Polynucleotide kinase)(3單位7微升) 無核酸酶水 在 37°〇下培養30分鐘 (heat inactivate)5 分鐘。 轉接子的環化 約200奈克的DNA 5x Invitrogen接合酶緩衝液（含PEG) T4 DNA接合酶（5單位/微升） 無核酸酶水 至10微升 以乙醇沈澱DNA。 譬如20微升 5微升 5微升 1微升 至50微升 然後在70°C下加熱去活化 譬如50微升 20微升 1微升 至100微升

該DNA濃度在最終接舍溶液内需被稀釋至約2奈克/ 微升一該稀釋液將有利於分子内的接合。 在1 ό °C下培養1 6小時。 核酸外切酶處理 轉接子接合的DNA λ -核酸外切酶 核酸外切酶I 1 Οχ λ -核酸外切酶緩衝液 無核酸酶水 譬如2微升 1微升 Γ微升 若接合材料少於5微升 時加至5微升 至50微升 33 200815605 在37它下培養]小時。 進行8¾氯仿的萃取及以G1 y c 〇七1 u e的乙醇沈澱。以7 5 % 古月人 再懸浮於12微升的ElutionBuffer内。不 t 純化’ >[曰焚如热士 1一右想要時可依以下方式進行： 凝膠純化

藉由加入〇 · 2體積的溴驗藍（b r 〇 m 〇 p h e η ο 1 b 1 u e )凝膠裝 载緩衝液以凝膠純化該經環化的轉接子接合dna。在中間 - ... . ; -- 尺寸2%瓊脂凝膠的每槽裝載6〇微升。在8〇伏特下電泳 1.5小日卞。在紫外線照射之下以尖銳解剖刀取下經環化的 匹配對。 .... .. - . - -. .. 若DNA大於15〇 bp則利用QiagenGel萃取套組。若 A J、於 100 bp 則利用 GeBA-flex Elutatubes ;其係根據 製造商的方法而進行。 / ' - ..... ； ... . 限制酶的酵解（例如，Hindlll，根據製造商的方法） 接合反應 • ·· · ·· · · . · . · . BamHl/BseRi切下的單一 PET 12微升 含精胺素的l〇x接合酶缓衝液 1.5徵升 T4 DNA接合酶（5單位/微升） 1微升 無核酸酶水 ^ 八 0.5微升 總體積為15徵升。在16Χ:下培養16小時。以無核酸 酶水將髋積調整至200微升。在ΡΗ 7.9下利用鎖相膠進行 酉分氯仿的萃取。以Glycoblue進行乙醇沈殿。 以PAGE凝膠進行品質管制和定量。 34 200815605 在4〜20%梯度PAGE凝膠上裝載約1 〇〇奈克的樣本， 與定量所需的TakaraWide Range DNA階梯條帶和 InvitrogenLaw Mass DNA階梯條帶或其他階梯條帶。為更 準確地疋S可裝载1微升和2微升的in vitro genLow Mas s DNA階梯條帶（第4圖）。 重複進行以獲得所欲長度的多聯體。 PCR改變型 若使用PCR擴增時，不需進行核酸外切酶的處理。代 . - 之可使用 80?€反-8616〇1:8壮(^614&1〇611〇1116 8111)1:^(：1:1〇11套 組。 .... — .. 實施iL_3 具有黏性和非迪文，或鈍端之diPETs或n-PETs 的變>f匕 此憂化可藉由在擴增之後（Maxiprep或滾輪式擴增或 - .. 、 - .· .. · ....... 其他方法)將該樣本分成兩批。一批以限制酶、磷酸酶和激 酶的组合處理而產生一端可接合的標記，例如一磷酸化鈍 V或外伸的碌酸化端。此批中，另一端為不可接合，例如 另一端為一去鱗酸化鈍端或具有不與第一端互補之外伸的 填酸化或去碟gt化端。 另一批以限制酶、磷酸、酶和激酶的組合處理而產生一 可接合端，例如一磷酸化鈍端或外伸的磷酸化端，以及另 一不可接合端，例如一去磷酸化鈍端或具有不與第一端互 補之外伸的碌酸化或去碟酸化端，其中該可接合端可連接 至該第一批的可接合端。 35 200815605 因此’鱗g§；化鈍端可相互接人，/ ί互接口 而彼此互補之磷酸化 黏性末端可相互接合。例如一酵解作甩可在一半内產生ΑΑ 尾部而另一酵解可在另一半内產生ττ尾部，然後可以t : 1或其他適當比例混合而導致苴雙聚濟彳 · r守双，、又水|北（dlmerizati〇n)以 製造可控制長度的diPETs。

36 200815605 的一黏性、非迴文端或一鈍端，但其5，端為不可接合端。 接著，將這兩批混合並以接合酶處理。來自相同批的片段 由於其末端互不相容因此不能相互接合。然而，來自不同 批的片段由於其末端係選自可彼此相容的黏性端因此應可 相互接合。 實碌...例染色質免疫沈澱成對踹撬t(ChIp_PETi

ChlP-PET為一種用於識別與蛋白質（例如，發現於染 色質構造内）相互作用之DNA區域的方法。此改良方法需 使用不同的載體’ pGIS3h (第5B圖；序列辨識編號：15)。 剪切後此將產生約88個鹼基對和4個殘基的di-PETs(在其 兩端分別為兩個CG殘基)。無AA尾部。對照之下，本發 明的另一改良方法為利用P GIS 4 a2(第5 A圖;序列辨識編 號：14)。此產生總大小為8〇個鹼基對及4個殘基的 di-PETs(在其雨端分別為兩個AA殘基）。 本發明雖然已藉由參考上述實施例作詳細的說明，但 是應暸解其所作出的各種的變化並未偏離本發明的精神。 因此，本發明僅侷限於下列的申請專利範圍。此申請案内 所引述的全部專利、專利申請案和公開案在此將其全文併 入以供參照。 .... ’ ’- .. ... ....... . 參考文獻

Adams，M.，et al·，1991，Science，252, 165 1-1656 Brenner s， et al·， 2000， Nature Biotechnology, 18, 37 200815605 630—634

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Strausberg，R.L·，et a 1·，1999，Science，286: 45 5-45 7 ' ....

Velculescu，V· E·，et al·，1995，Science，270，484 —487 , , .... ... US 4,766,072 .... _ ' · . . . . . ..... ' . . . ... ， . U S 2 0 0 5 0 2 5 5 5 0 1 US 20050059022 【圖式簡單說明】 第1圖概述本發明之方法的具體實施例，其用於製備 多聯化核普酸片段（多聯化反應（concatements))。各核苷酸 片段包含一雙標記。該雙標記包含具有聚核苷酸（例如，全 - .. . . 1 . _ : . / 長c D N A ) 5，端（圖中灰色)的第一標記及具肴聚核苦3 ’端 (圖中黑色）的第二標記。該雙標記具有一黏性或可接合端 及無黏性的另一端(第1 A圖）或鈍端（為可接合或不可接 . - · . - - 合)（第1B圖)V第1 A圖所示的 有互補端的核苷酸片段，而第1B圖所示的di7PET可進一 步連接至具有可接合端（磷酸化純端）的核苷酸片段。獲得 38 200815605 的該兩多聯化核苷酸片段包八 向相反。該雙標記適合用於^夸個第一和第二雙標記的方 如「454」測序法。藉由利用^模平行定序法的測序，例 插入關注之5,和.3,端的复他^對端雙標記（PET)質體，或 有Mmei位點，但未顯示於質^A序列可製備該雙標記。 貝霞上。 苐2圖概述本發明之方沬心 製備包含n - P E T s (其η = 4

知人：――…厂的另一具體實施例，其用於 加成對端雙標記(PET)的數目、二 古，丌杜亡上 吼者應用測序技術的能力提 同’可精確地増加該多聯體内的秒誓 μ μ垃V 土 ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ 旧养核甘酉文0兩種不同類型 的轉接子連接至該di_PET的東一 w 〆 末编。延些轉接子含有用於後 、戈限制_酵解時所需的不同限 兮+广 丨艮制it男切位點。接合這些轉 接子而僅有連接不同轉揍子的 τ 乂 文丁妁ch-PETs破環化，因此藉由 選擇性核酸外切酶的處理而潠吞 、 肩、取。滾輪式擴增法係用於擴 曰該DNA。然後以適當的限制酶剪切該Dna以製造一黏 端及一非黏性束端’因此可利用該接合形成η_ρΕτ。然後 可視需要重複該循環以製造較大的η· ΡΕ Τ。亦可藉pC R進 行擴增和選取： 第3圖說明在一 PAGE凝膠内電泳透析的pETs。第i 和9行：Invitrogen 25 bp階梯條帶：第+行：匕^加^以⑽ bP階梯條帶。第3行：BseRl和BamH 1剪切對照序列庫 .. . . \ . . . · - ； 的PETs。第4行：BseRl和BamHl剪切實驗式序列庫的 PETs。第5行：2微升Invitrogen Low Mass階梯條帶。第 6 行:4 微升 Invitrogen Low Mass 階梯條帶。第 7 行·· BseRl 39 200815605 和BamHl剪切對照序列庫的鈍端PETs。第 8行·· BseRl 和BamHl剪切實驗式序列庫的鈍端PETs。

第4圖說明在PAGE凝膠内電泳透析的di-PETs。第1 行·· I n v i t r 〇 g e η 2 5 b p 階梯條帶。第 2 行·· I n v i t r 〇 g e η 1 0 0 b p 階梯條帶。第3行：對照序列庫的接合產物，如所預期般 此序列庫形成多聯體。第4行:實驗式序列庫的接合產物一 此序列庫形成可控制長度di-PETs，其為單一乾淨、明顯 條帶。第5行:2微升Invitrogen Low Mass階梯條帶。第 6 行：4 微升111¥111*〇86111〇1^ ]\/1&3 8 ?皆梯條帶。 第5圖說明用於本發明之方法的兩種載體樣本。第5A 圖為pGISa2載體及第5B圖為pGIS3h載體。 第6圖說明雙標記的多聯化以獲得用於測序之所欲長 度的多聯體。 引子、轉接子和载體的序列編號 序列辨識編號：1 Gsul-oligo dT引子 5,-GAGCTAGTTCTGGAGTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3,

序列辨識編號:2 GIS-(N)6轉接子上股 5，-CTAAACTCGAGGCGGCCGCGGATCCGACNNNNNN-3, 序列辨識編號：3 GIS-(N)6轉接子下股 5，-p-GTCGGATCCGCGGCCGCCTCGAGTTT-3' 序列辨識編號：4 GIS-(N)5轉接子上股 5、CTAAACTCGAGGCGGCCGCGGATCCGACGNNNNN-3, 40 200815605 序列辨識編號：5 GIS-(N)5韓接羊下胳 5，-p-GTCGGATCCGCGGCCGCCTCGAGTTT-3, 序列辨識編號：6迴文序列上股 5，-GTCGGATCCGAC-3， 序列辨識編號：7迴文序列下股 5’-GTCGGATCCGAC-3’

序列辨識編號：8 n-PET TT-尾棘接孑（PMR 011V— 股 5，,GCTTGTAAGCTACTCCTCGATGTGCTGC AAGGCGATTAAG-3，(4 Out) 、 序列辨識編號：9 n-PET TT-尾韓接孑（PMR Oil)—下股 3，-TTCGAACATTCGATGAGGAGCTACACGACGTTCCGCTAATTC-5 9 (42 nt) 序列辨識編號:10 n-PET TT-尾棘接手(TMR 012)—上股 ： ....... ... 5，-GCTTGTAAGCTACTCCTCAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，( ..... . · . ........ . 41 nt) ‘.. .. 序列辨識編號：11 n-PETTT-尾轉接手（PMR012)—下股 3，-TTCGAACATTCGATGAGGAGTCGCCTATTGTTAAAGTGTGTCC- . -- · - · .... .· , · -· - · . . · .. . 5，(43nt) . .... . .· . . 序列辨識編號：12 PMR Oil 5，-GATGTGCTGCAAGGCGATTAAG-3’(22 nt) 200815605 5’端為磷酸化 序列辨識編號：13 PMR 012 5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3，(23 nt) 5’端為磷酸化 序列辨識編號：14正義〇018432(第5八圖）（3531匕13) 請看序列表

序列辨識編號：15反義pGIS4a2(第5A圖)(3531 bp) 請看序列表 序列辨識編號:16正義pGIS3h(第5B圖）(2765 bp) 請看序列表 序列辨識編號：17反義pGIS3h(第5B圖）(2765 bp) 請看序列表 . ； · - .... 序列辨識編號:18 來自 pGIS4a ildi-PETWb^di-PET(82bp) 序列辨識編號：19來自pGIS4a 反義 di-PET 化的di-PET (82 bp) 序列辨識編號：20來自pGIS3h正義di-PET化的di-PET (90 bp) 序列辨識編號:21來自pGIS3h反義以-?£丁化的出-?五1'(90 6?) 【主要元件蔚號說明】 42 200815605

Claims (1)

1. 200815605 十、申請專利範圍： 1. 一種控制多聯化核苷酸片段之長度的方法，該方法包 含： (a) 提供至少兩核苦酸片段，其中各片段具有一可接合端 和一不可接合端；以及 (b) 使該兩片段連接在該可接合端而形成至少一寡核普 酸，其包含至少兩多聯化梭苷酸片段。

   2·如中請專利範爵第1項所述之方法，其中上述之各片段 的可接合端係一迴文黏性末端。 3 ·如申請專利範圍第1項所述之方法，其中上述之可接合 端及/或不可接合端係位於至少一轉接子内。

   4. 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中上述之轉接子 係一質體或載體的一部分。 5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中上述之核芽酸 片段可被擴增。 6·如申請專利範圍第5項所述之方法，其中上述之擴增係 藉由細菌擴增法、滾輪式擴增法，及/或聚合酶鏈反應。 44 200815605 7.如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含以下 步驟：處理該至少一寡核苦酸以產生至少一寡核苦酸，其 具有一可接合端和一不可接合端；以及使該寡核苷酸接合 一其他寡核香酸或核苷酸片段以形成一寡核苷酸，其包含 至少兩多聯化核苷酸片段。

   8.如申請專科範圍第7項所述之方法，其中上述之步驟可 被重複一或多次。 9.如申請專利範圍第7項所述之方法，其中上述之各寡核 苷酸或梭苷酸片段的可接合端係一迴文黏性末端。 10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含以 下步驟：處理該至少一寡核苦酸以產生具有兩假可接合端 的至少一寡核努酸；並使讓寡核普酸在該接合端自環化。 * - ... ... .... ' 11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中上述之可接 国『国 '' ' ' 合端係迴文黏性束端。 12.如申請專利範圍第10項所述之方法，其中上述之可接 合端係來自兩轉接子，各轉接子連接至該寡核苷酸的各端。 13·如申請專利範圍第10項所述之方法，其進一步包含選 45 200815605 取該至少一環化寡核苷酸及/或擴增該寡核苷酸。 14.如申請專利範圍第13項所述之方法，其進一步包含以 下步驟：處理該至少一環化及/或經擴增的寡核苷酸以產生 至少一寡核苷酸，其具有一可揍合端和一不可接合端；以 及使該寡核苷酸在其可接合端與至少一其他寡核苦酸相連 ♦接而形成至少兩多聯化寡核苷酸。 15·如申請專利範圍第1項所述之方法，其進一步包含： (a) 處理該至少一寡核普酸以產生具有兩個可接合端的 至少一寡核苦酸，以及使該寡核脊酸在其可接合端自 環化; (b) 選取該至少一自環化寡核苷酸； 、 （c) 視需要擴增該選取之寡核苷酸； (d) 處理該寡核普酸以產生至少一寡核苷酸，其具有一可 接合端和一不可接合端；以及 (e) 使該寡核苷酸在其可接合與至少一其他寡核皆酸相 連接而形成至少兩多聯化募核苷酸。 ‘ 16.如申請專利範圍第15項所述之方法，其包含將上述（&) 至（e)之步驟重複一或多次。 17.如申請專利範圍第1項所述之方法，其中上述之至少 46 200815605 及 (e)在該可接合端多聯化至少兩寡梭苷酸以形成一多聯化 寡核苷酸，其包含至少兩核苷酸片段。 22.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中上述步驟（a) 中所提供的該寡核苷酸包含至少兩多聯化棱苷酸片段，而 由上述步驟（e)所獲得的該多聯化寡核普酸包含至少四多

   聯化核普1片段。 2 3.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中上述之核苷 酸片段包含至少一雙樣記，該雙標記包含至少一包含一聚 核苷酸5’端的第一標記及至少一包含該聚核普酸 3’端的 第二標記。 24.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中上述之可接 -. _ . . . . 合端係迴文黏性末端。 2 5.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中上述步驟（e) 之多聯化可被重複一或多次。 . . ' . , 2 6.如申請專利範圍第25項所述之方法，其中上述多聯化 的每次重複可加倍該多聯化核苦酸片段的數目。 48 200815605 2 7.如申請專利範祖第2 1項所述之方法，其中上述之可接 合端係來自轉接子。 28.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中上述步驟（c) 進一步包含擴增該寡核•酸。

   2 9.如申請專利範面第28項所述之方法，其中上述之擴增 係藉由滚輪式擴增法，及/或藉由聚合酶鏈反應。 3 0.如申請專利範圍第21項所述之方法，該方法進一步包 含定序該多聯化寡核苷酸。 3 1.如申請專利範圍第21項所述之方法，其中上述之寡核 苷酸的各個核皆酸片段與位於其上游及/或下游之一核苷 酸片段的方向相反。

   3 2· —種單離的寡核苷酸，其包含至少兩核苦酸片段，其 中各個片段具有至少一可揍合端及一不可揍合端，而該片 段在談可搔合端相連接而形成該寡核苷酸。 33·如申請專利範圍第32項所述之寡核苷酸，其中上述之 可接合端係迴文黏性末端。 49 200815605 34.如申請專利範圍第32項所述之寡核苷酸，其中上述之 片段包含至少一雙標記，該雙標記包含至少一包含一聚核 苷酸5’端的第一標記及至少一包含該聚核苷酸3’端的第 二標記。

   3 5..如申請專利範圍第34項所述之寡核苷酸，其中上述之 寡核苦酸的各個梭普酸片段與位於其上游及/或下游之一 核苷酸片段的方向相反。 36.如申請專利範圍第34項所述之寡核苷酸，其中上述之 寡核苷酸係插入一質體或載體内。

   50 200815605 序列表 <110>新加坡科技研究局 <120>核酸多聯化 <130> FP3678 <160> 21

   <170> Patentln version 3.4 <210〉 1 <211> 33 <212〉DNA <213> 人工 <220> <223> Gsul-寡 dT 引子 <220> <221> misc_feature <222〉(33)..(33) <223〉n is a，c，g，or t

   <400> 1 gagctagttc tggagttttt tttttttttt tvn <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> GIS-(N)6轉接子上股 200815605 <220> <221> misc_feature <222> <223> (29)..(34) n is a，c5 g，or t <400〉 2 ctaaactcga ggcggccgcg gatccgacnn nrnin 34 <210> 3 <21i> 26 <212> • <213〉 DNA .人工.： <220〉 <223> GIS-(N)0轉接子下股 <400〉 3 gtcggatccg cggccgcctc gagttt 26 <210> 4 <211〉 34 <212> DNA <213> • 人工 <220> <223〉 ，' GIS-(N)5轉接子上股 <220> <221> misc—feature <222> <223> (30)..(34) nisa5c，g，ort <400〉 4 ctaaactcga ggcggccgcg gatccgacgn nnnn 34 2 200815605 <210〉 5 <211> 26 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> GIS-(N)5轉接子下股 <400 5 gtcggatccg cggccgcctc gagttt <210〉 <211> 6 12 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223〉 迴文序列上股 <400> 6 gtcggatccg ac 12 <210> 7 <211〉 12 <212> <213〉 DNA 人工 <220〉 <223> 迴文序列下股 <400〉7 gtcggatccg ac 12 200815605 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> n-PET TT-尾轉接子(PMR 011)-上股 <400〉8 gcttgtaagc tactcctcga tgtgctgcaa ggegattaag 40

   <210〉 9 <211> 42 <212> DNA <213〉人工 <220〉 <223> n-PET TT-尾轉接子(PMR 011)—下股 <400〉9 ttcgaacatt cgatgaggag ctacacgacg ttccgctaat tc 42 <210〉 10 <211〉 41 <212> DNA <213〉人工 <220> <223> n-PET TT-尾轉接子(PMR012)—上股 <400> 10 gcttgtaagc tactcctcag cggataacaa tttcacacag g 4 41 200815605 <210 11 <211> 43 <212〉DNA <213> 人工 <220> <223〉n-PETTT-尾轉接子(PMR012)—下股 <400〉 11 ttcgaacatt cgatgaggag tcgcctattg ttaaagtgtg tcc

   <210> 12 <211> 22 <212〉DNA <213> 人工 <220> <223〉PMR011 <400〉 12 gatgtgctgc aaggcgatta ag <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> 人工 <220〉 <223> PMR012 <400> 13 agcggataac aatttcacac agg <210> 14 <211> 3531

   200815605 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> pGIS4a2-正義(第 5A 圖) <400> 14 gggcgaattc gatatcgcgg ccgcgcctgg ataaagtcag cagcttccac gccagcttca cacaaaaagt gactgacggt agcggcgcgg cggtgcagga aggtcagggc gatctgtggg tgaaacgtcc aaacttattc aactggcata tgacacaacc tgatgaaagc attctggttt ctgacggtaa aacactgtgg ttctataacc cgttcgttga gcaagctacg gcaacctggc - --- .. ' ' - tgaaagatgc caccggtaat acgccgttta tgctgattgc ccgcaaccag tccagcgact ggcagcagta caatatcaaa cagaatggcg atgactttgt cctgacgccg aaagccagca atggcaatct gaagcagttc accattaacg tgggacgtga tggcacaatc catcagttta gcgcggtgga gcaggacgat cagcgcagca gttatcaact gaaatcccag caaaatgggg ctgtggatgc agcgaaattt accttcaccc cgccgcaagg cgtcacggta gatgatcaac gtaagtagag gcacctgagt gagcaatctg tcgctcgatt tttcggataa tacttttcaa . .. . . ’ cctctggccg cgcgtatgcg gccagaaaat ttagcacagt.atatcggcca gcaacatttg ....... -.— ctggctgcgg ggaagccgtt gccgcgcgct atcgaagccg ggcatttaca ttctatgatc ctctgggggc cgccgggtac cggcaaaaca actctcgctg aagtgattgc ccgctatgcg aacgctgatg tggaacgtat ttctgccgta agtcggatcc tcctcgtcga cctgcaggca tgcaagcttg agtattctat agtgtcacct aaatagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 6

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