TW200811295A - Systems and methods for efficient collection of single cells and colonies of cells and fast generation of stable transfectants - Google Patents

Description

200811295 九、發明說明： 【相關申請案之交互參照】 本申請案主張2〇〇6年4月10日申請之美國臨時專利 申請案第60/744,577號和2006年4月1〇日申請之 60/744,579號的利益，該等申請案係以引用方式納入本文 中〇 【發明所屬之技術領域】 技術領域 本發明係關於生化分析，且更特定而言，係關於具.有 微-底板（pallet)之微圖化（micropattenied)淺盤，其使 可尋址生化分析更容易，以及使分類和選擇細胞和細胞菌 落更容易的方法。 【先前技術】 發明背景 用於細胞生物學之分子分析的現代技術，已經創造出 對製備由均一細胞族群組成之試樣之逐漸增加的需求。基 因組和蛋白質組研究、基因選殖、幹細胞研究、和基於細 胞的篩選’均將獲益於提高獲得活的、單一細胞或小型均 —生物試樣以供進行後續分析的能力。這些試樣包括各種 分子’如DNA或rna，以及細胞或生物。 在從混合族群中選擇細胞的案例中，在鑑認與分離想 要的亞族群之後必須分析具有想要特徵的個別細胞。哺乳 動物細胞的標準分類方法需要使細胞分散成單一-細胞懸浮 液’而最成功的就是造血細胞，其天然便以該方式生長。 7 200811295 這些方法較不適用於黏著細胞’其顯然為最為常見的細胞 表現型。 黏著細胞通常係藉著將它們平舖在生長表面上，然後 使用顯微鏡觀看它們來分析。細胞的位置為隨機的，而使 得尋找細胞可能為耗時的過程。為加快該過程，有時使用 利用機器視覺之機器人系統，以在顯微鏡影像的視野内尋 找細胞。用於從細胞之混合組群中分離感興趣細胞的傳統 # 分類技術，典型需要以酵素或機械方式使黏著細胞從其生 長表面釋放’這會傷害細胞的健康，或涉及基於限制稀釋 或以遺傳工程產生之對選擇環境之抗性之選擇的延伸方 法。在某些情況下，將犧牲的基底層放在培養盤上，使細 胞生長在犧牲的基底層上，且一旦發現感興趣的細胞，藉 著以高功率雷射切下感興趣細胞周圍的圓圈並通過犧牲 層，分離細胞之混合族群的亞組。可藉著剝離犧牲層，或 藉著使用高功率雷射脈衝使切下的物質從培養盤中彈出， • 帶有感興趣的細胞與彈出的切下之物質，來分離細胞。 可使用流式細胞計數器很快地分析非黏著細胞，該計 數器使細胞流迅速地流過檢測裝置。可藉由下游靜電系統 將感興趣的細胞分類’該系統將小滴移至收集容器内。流 細式胞計數亦有助於處理其他的生物基質，如蛋白質和 DNA’只|它們可附著在小珠上。其無益於處理較大的試 樣（如多-細胞的生物），也難以處理複合物。 【發明内容】 發明概述 8 200811295 本文所描述的系統和方法， ^ ^ , 馬[對5式樣進行可羞+1·八 析之目的，提供以得將 〇 仃了 +址为 仵以將4樣（如單或多細 蛋白質、DNA、生物八羊芬甘 ^生物、 物刀子及其他生物基質）放在淺般上特 疋场所或位置之方式而製造㈣盤。料 寺 置較佳是以可移動好祖造、生A, ，、二或王口[5位 的气樣亞έ Γ "、、微*底板的形式，而使感興趣 侍以從淺盤中輕易地分離以進-步進行力工七

Κ樣之分析的結構或化學處理。淺盤亦可含有 協助在淺盤與外部儀器之間偶聯，或協助附屬操作，如維 持该试樣之適合化學條件的結構。 微-圖化淺盤有益地包括⑴在其上企圖促使試樣附著 在已知场所或位置而圖化的結構’⑺經處理或進一步圖化 以便改善對該試樣進行分析的能力之結構或底板，⑺在需 要時可移動，因此不需要雷射切開，並可輕易收集釋放Ζ 的試樣之結構或底板，以及（4)微_圖化的零件，如結構元 件、電極和光學編碼器’其協助操作微_陣列淺盤，2可有 利地放在傳統或專門的卡g或托#中。#圖化淺盤本身使 生物和化學試樣的高速、可尋址分析，以及從較大之試樣 族群中分離試樣亞組的有效方法成為可能。 使用微-底板陣列系統，有利地使基於動態現象選擇並 分類細胞，以及轉染物之迅速穩定建立成為可能。 此外，從下列的詳細說明中，將使本發明的目標和優 點變得更清楚。 【實施方式】 9 200811295 發明之詳細說明 在下文中揭示的每個額外的特徵和教示，可分開使用 或與其他特徵和教示倂用，以提供且 4h ^ ^ ^ ^ ”有镁_底板的改良微圖 化成i ’其有利於可尋址生化分 77析和細胞分類與選擇的改 良方法。現在將參考所附之圖式，、， 更砰細地說明本發明的 代表性貝例，該等實例分別及、^ ^ 科知私- 使用δ午多这些額外的特 欲矛教不。該詳細說明僅企圖教 — ¥ “、、5日此藝者關於實行本 教不之較佳觀點的更多細節，、 上非正圖限制本發明之鉻 圍。因此，在下列詳細說明中揭 χ月之视 對於最膚義地每彳干太&Ba 特徵和步驟的組合， 以教-太： 言’可能不是必要的，且僅用 乂教不本教示特別敘述的代表性實例。 此外，代表性實例和隸屬之申請 lL τ明寻利耗圍的各種特徵， 了以不具體地且明確地列舉的方式組合 其他有用的且髀童者„ L 乂便如供本教不 由上 八體事λ卜，應特別注意所有在說明及/赤 明專利範圍中揭示的特徵，為了原弘揭t 5 了限制獨立於且於事4 wi揭不之目的，並為 的所請主題專利㈣中之特徵的構成 特別、主立係企圖彼此分開且獨立地揭示。亦岸 /忍所有的數值範圍或實體群的 之目的，并* 马了原始揭不 亚為了限制所請主題之 中間值或中間㈣。 *路母個可能的 在較佳的具體事實中，“提供微 盤 式樣可附著於其上的可移動區域或位置 ^其包括 學編碼哭中1 Λ ^罝之可哥址陣列。光 电極及其類似物使微-圖化淺般能& 使阿速可哥址細胞測定成為可能。機器可移動 200811295 淺盤到顯微鏡下的任何 接物鏡顯像，因為僅使 相反）°至於細胞，細肢 多的分析成為可能。 可尋址位置之地點。可使用高倍率 單一位置顯像（與許多細胞的大視野 細胞位置的索引使比目前所使用的快很 可以附著於表面的 早一或多個細胞、分子、化合物、

0 7 \ 的而求’大大地增加速度和處理量，同時降低了 遥擇忒樣的複雜性。因為底板被排列在淺盤上，可以可與 流式細胞計數相比擬的速度，以簡化很多的方式進行高速 分析和試樣選擇。 在較佳的具體事實中，如在圖1A中所述，為了對試 樣14進行可尋址分析，以可將試樣14(如單一或多個細胞、 U _生物、蛋白質、DNA、生物分子及其他生物介質）放在 淺盤10上之特定場所或位置13上的方式，製造淺盤1〇。 一些或全部的位置13較佳是以可移動的材料建造成底板i 2 之形式’而使感興趣試樣14的亞組可輕易與淺盤1〇分開 並分離’進行進一步的加工或分析。淺盤可含有提高或促 進試樣14之附著及/或功能，並促進或協助其分析的結構 或化學處理。淺盤1 〇亦含有協助在淺盤10與外部儀器之 11 200811295 間連結的結構。淺# 1()亦可含有額外的結構，其協助附 屬操作，如維持適合該試樣的化學條件。

電、機械、熱能）探測，以測定在位置13處捕捉之試樣Μ 的特性’或以修改在位置13處的試# 14。而且，可從淺 盤10中移出含有感興趣之試樣14的位置13，實際上是底 板12，以與淺盤1〇分離，進行進一步分析或加工。 參考圖1B，微-圖化淺盤10，如同所述，包含附著在 特定可尋址位置13,即小而薄的底板12上之試樣14(如單 一或多個細胞），該底板12黏在淺盤1〇的位置13處。如 同在該具體事實巾所述’當將試樣14迅速地移進檢測器Μ 下的位置内蚪，使用顯彳政鏡或其他檢測器1 6使試樣14顯 像。可使每個位置13顯像’或以光或其他能源(例如磁:、 你茂盤的表面上製備底板丨2,且較佳是以具有與 ，盤10之主體材料不同之性質的第二種材料建構。可藉 =各種機械作用’從支撐的淺盤10中移出底板12，其中g :有试樣14，使試樣14得以與淺盤1〇分離並移出。可藉 者局部修改表面化學’《藉著以物王里方式改變表φ，製備 位置13或底板12。企圖使位置13或底板12小得足以能 夠在每個位置13處截留數個或單一個細胞、微-生物、生b 物分子或其他生物學或化學介質(在本文中稱為試樣⑷。 底板12亦可含有在從淺盤1()中移出之後，協助移動或安 置底板12的結構。 代表性的方法包 使用局部化的熱 可藉著任何適當的方法移動底板12 括以機槭方式從淺盤中推或抬起底板12 12 200811295 或光、以改變底板12的黏附特性、使用聲學或機械 從淺盤U)中取下底板12、使用高能量雷射脈衝從淺盤！ 中取下底板12、改變底板12的電或磁特性、及其類似皿者。0 翻到圖2,顯示使用來自雷射18的雷射脈衝η移動 底板的實例。如同說明，藉著從淺盤1〇中釋放 夕 ΛΑ ^ , Α 樣 14 的底板12,完成試樣14的陽性選擇。如上述， 放底板的其他方法，包括應用機械、埶、 旦 …、尤学、磁能

置。可讓釋放的底板12流向下游收集，或可藉其他方法 傾倒或吸移）收集。 ’ U 位置13或底板12較佳係彼此密接形成，使得淺盤ι〇 可在分析儀器下移動，以迅速地進行許多位置丨3的分析。 例如，若位置13的位置相隔〇·〗毫米，則可以5〇毫米/秒 移動淺盤10，以每秒分析5〇〇個試樣。可以許多方法中的 任-種使試樣14附著在位置13上。例如，可容許活細胞 漂浮在介質中，直到它們附著在位置上。可洗去剩下的細 胞，留下可迅速顯像的細胞可尋址陣列。亦可使用傳統方 法，如墨點法（spotting )、絲印法（silkscreen )、型板 噴刷（stenciling)、平版印刷（mh〇graphy)、光學操作、 或機械附著，使試樣附著於該位置。 位置13或底板12可形成長方形或其他規則的圖案（例 如六邊形、圓形、線形等等），或可隨機定方位。可將圖化 的位置或底板放在較大的結構中，如多孔培養盤的底部。 圖化的淺盤容許將其他結構放在其中，以利於其他功能， 例如使用臨時的分割器，其容許將不同的試樣導入淺盤的 13 200811295 不同區域，或流動結構（如通道），以便使緩衝溶液易於流 過該位置（如在圖6中的說明）。 參考圖3，顯示微-圖化淺盤2〇裝有附著至特定可尋 址位置23的試樣24(生物）。在該具體事實中，在淺盤2〇 上的3-D結構圖案25，協助在特定位置收集試樣24，在 那裡它們可直接附著至淺盤20’或在每個位置23處附著 至小底板22。 可修飾表面的物理形狀，以提高在位置處捕捉（在非_ 位置處則否）’或改善分析。例如’可在柱子頂端形成位置 (麥見32，圖4)。這提供了顯微鏡顯像系統 位置處的優點(參見35,圖4)，減少了影像的背景、= 實施例可包括空腔，其截流試樣於其中，或在淺盤上的不 透明區。 可將其他特徵加在淺盤上，以利其與外部儀器連接。 例如’可將光學編碼器、電極或磁性裝置納入淺盤上，以 利於安置；可使用感應器測試生長條件；為了光學定位可 納入框標；等等。 在圖4中出示一些提到的增強。如同在圖4中所述， 微-圖化淺盤30包括在特定可尋址位置附著至底板32或柱 子的試樣（細胞）34。在該具體事實中，當試樣34迅速移進 接物鏡36下的位置内時，使用顯微鏡接物鏡36使，，焦點上 的”試樣34顯像。其他所包括的特徵包括圖化的電極”、 圖化的不透明㊣38 ’以及從外面施加的電場Μ，盆 來溶胞感興趣的特定細胞。 /、 200811295 亦可修飾位置的化學特性，以提高在該位置處的捕捉 (在非位置處則否），或改善分析。例如，可修飾表面化學， 、衣4些疏水性區域和其他親水性的區域，以提高細胞 附著在疏水性位置上。亦可使用表面化學製造淺盤不透明 的非•位置和透明的位置_區域，以提供局部的隙缝，增加 光學顯像。 可在現有之工業標準盤和卡匣内，產生位置的陣列。 例如，可在多孔培養盤的底部内建造該位置，替工業標準 設備提供高速可尋址測定（參見，例如圖5)。亦可在筒狀 的疋製系統中產生位置的陣列（參見，例如圖6)。 如同在圖5申所述，將微_圖化淺盤4〇放在多孔培養 盤〇之單一孔47的底部，容許對淺盤40使用傳統的二 具。微’化淺盤40包括多個底板42，形成多個裝有試樣 44的位置43。緩衝溶液充滿該單孔。 如同在圖6中所述，顯示微-圖化淺盤5〇包含臨時或 _永久的分割器51附著在流體帽55上，以容許將不同類型 或病史的試樣54平舖在淺盤50上的不同場所。這容許在 單一淺盤上進行多重分析。分割結構51亦利於緩衝溶液 k動覆蓋減樣區，以便提取釋放的底板$ 2。 翻到圖7A ~ 7B，顯示在使用底板淺盤進行黏著細胞 篩選和培養之過程中的步驟。該實施例說明如何可使用所 揭示之系統，從大的細胞集合中篩選罕見的細胞或感興趣 的細胞。例如，可從患者生檢取得黏著細胞，並可使用所 揭示之系統搜尋及選擇顯示出不尋常或惡性行為的細胞。 15 200811295 或可以希望能轉染細胞& DNA冑體處理黏著細胞，並使 用該系統找出並分離被適當轉染的細胞。

較佳沖洗該淺盤，且較佳進行更多測h作，以便標示感 興趣的細胞。在步驟5,藉著檢測器76篩選淺盤，以得到 關於、、，田胞知群的統計貧訊，並鑑認感興趣的細胞。在步驟 根據實例之過程，在步驟丨，根據適當的方法預處理 、、田肊60然後在步驟2，使細胞60分散在淺盤7〇上，並 容許於多個位置73上附著至淺盤7Q或底板72。這可在多 孔培養盤62,如所示，或在單孔培養盤上進行。在步驟3， 、、田胞4著於&盤7〇或底板72，如試樣74。因為淺盤經過 處理和圖化’細胞寧願黏著特定的位置。然後在步驟4, 伙欠i中移出（釋放）含有感興趣細胞（試樣的底板 72a，較佳是例如藉著來自雷射78的高能量雷射脈衝π。 然後在步驟7,從緩衝溶液中收集自由漂浮的底板72&。在 步驟8’從釋放出的細胞74，生長出新的細胞培養物。 —現在翻到圖8A和8B，出示在使用底板淺盤進行DNA 篩k之過耘中的步驟。該實例說明如何可使用所揭示之系 、先攸大的DNA集合中篩選罕見的DNA股。例如，可對 DNA久盤4選未知的疾病引發性劑，以選出感興趣的股。 域:分離該感興趣的股，並進# PCR，以擴增它們以進 行更夕的刀析。該過程的步驟如下：在步驟1，在特定位 置83處轉核㈣沾點在淺盤⑼上，其係擔任股 1目標二亦製備作為對照組的寡核苷酸。在步驟2，從試 I中取得DNA 85 ’變性並根據適#的方法預處理。在步 200811295 驟3，使DNA 85分散在淺盤80上，並容許與在特定位置 8 3上’與其相配的目標雜交。在步驟4，徹底沖洗淺盤， 移除未結合的DNA。進行更多測定工作，以標示感興趣的 DNA。然後在步驟5，藉著檢測器86篩選淺盤，以進行試 樣的統計分析，並鑑認感興趣的DNA。在步驟6，藉著來 自替射8 8的南能f雷射脈衝8 7 ’從淺盤8 0中移出（釋放） 含有感興趣DNA 84的底板82a。在步驟7，從緩衝溶液中 收集自由漂浮的底板。在步驟8，使DNA 84變性以離開 _ 底板，並在PCR反應中使用，以擴增該試樣。 參考圖9，說明用於自動測定的整合底板淺盤卡£ 9〇。 該實例說明如何可將所揭示之系統與其他系統整合，產生 自動筒形系統。如同在圖9中所述，整合底板淺盤卡匣9〇 包含微底板淺盤99,有多個底板92在淺盤99上形成三列， 以及流體帽91，在其内面有小通道95形成。帽91與微底 板淺盤99配對，使緩衝溶液流動覆蓋底板92。 翻到圖10A到M，出示使用微-機械之整合底板淺盤 卡匣100的過程。卡匣100包含底板淺盤1〇9 ,其最好包 含可釋放底板102之預-設陣列，用於細胞培養，其以可釋 放之方式安置在以玻璃或類似物形成的淺盤丨〇9之頂部。 底板102較佳經過處理以促進細胞在底板1〇2的中央生 長。底板1〇2較佳有索引，例如以橫條編碼，使得在使用 卡匣1 00之前，知道它們的位置。 在圖10B和！0C中，將帽1〇1蓋在淺盤1〇9上，露出 進出孔！〇7。在圖10D中，使細胞分散在淺盤1〇9上，並 17 200811295 容許附著至淺盤之特定位置102或底板上。然後藉著檢測 器106篩選淺盤109，如同在圖10E中所述，進行試樣之 統計分析，並鎩認感興趣的細胞。如同在圖1 0F中所示， 藉著來自雷射1 0 8之南能量雷射脈衝，從淺盤1 〇 9中移出（釋 放）含有感興趣之細胞的底板l〇2a。如同在圖i〇G中所示， 淺盤自緩衝溶液至盤109的末端收集自由漂浮的底板 102a。在圖10H中，藉著來自雷射108之高能量雷射脈衝， 從淺盤109中移出（釋放）含有額外感興趣細胞的第二個底 板102b。如同在圖1〇1中所示，淺盤自緩衝溶液至盤1〇9 的末端收集自由漂浮的底板102b。如同在圖1〇J和1〇κ中 所述，通過進出孔107,使用提取器11〇，提取底板i〇2a 和102b。如同在圖10L和1〇M中所示，從釋放出的細胞 中生長出新的細胞培養物。 如同在BI 1 1中所不，卡£ i 70包括玻璃或類似物形成 171。淺盤169可包含安置在 的受質或淺盤179，以及帽

淺盤179上的微·底板172之陣列·例如，提供则，刪個 (50x50微米)底板位置。為了顯像、螢光分析、分類及其 、乜者卡匣1 70可與顯微鏡附件1 5〇 —起使用❹可使用 在電腦_上提供的分析軟體，進行高容量筛選和細胞選 擇。可使用底板提取器提取從卡E 17()中選出的底板。 在本文中描述的微_底板陣列系統，有益地讓使用各式 各樣的選擇基舉;_ Λ ^ ^ It、、田胞、細胞菌落和生物成為可能。 该系統有益地讓以下！ + & ^ 者成為可能··分析存在於底板上之細 胞或其他材料的各種牿鉍 ^ 寺淡接者細胞的陽性選擇，且細胞 18 200811295 r著在底板上。依據分析方法，這些特性或選擇基準可 包括先學特性，如榮光、光散射、形態學、菌落形成及其 斗寸I·生化學特性和機械特性。例如，基於該等 編碼營光蛋白之目標基因之那些細胞的榮光之分析的細胞 之早期檢測’接著細胞選擇，即底板釋放和收集，會使迅 j地建立無性繁殖系、族群成為可能。與利用有毒性之抗生 素的選擇相比較’結果可能明顯地節省了時間和人力。 底板陣列系統的底板釋放和收集過程，使細胞經歷 八2流動細胞計數分類更少的擾亂，因為細胞在分析和 間仍維持附著。結果提供了改善的細胞健康和存 疋白：外：生長在底板上的細胞將展現其全組的細胞-表面 :貝’並維持其天_態學和信號特性。因此，可利用 胞屬性作為選擇基準。重要的是，可在-段時 2 h些特性’以讓基於特定特性的時間性改變之 擇成為可能。 質^吏用Γ底板陣列系統有益地使基於動態現象（如蛋白 鱼分，成2酶活化、離子改變及其類似者)之細胞的選擇 -細胞或細胞群時合族群中分離單 不會改變的選擇過程期間内 表 寺性’例如表面蛋白的存在或螢光蛋白的 使得二ί蛋白質的壽命尺度是許多小時至數天及更長， 同^^厂白質的含量在分類過程之前、期間和之後是相 度（秒至、=’Λ多細胞特性的改變是於快很多的時間規尺 、里）°例如’細胞内的自由舞濃度或細胞骨架網 200811295 的組織化。諸如此類的特性在細胞中是極為動態的，尤其 是回應在細胞環境中加入刺激或藥物。因為在回應激動劑 或抑制劑時，細胞不會同步行動，故在測量一段時間時， 即在加入刺激或藥物之前、期間和之後，最容易評估這些 動態特性。 基於動態特性分離或選擇細胞，通常是不可能的，因 為這些屬性係處於比可利用或傳統分類方法的時間尺度更

快之流動狀態。此外，如同上文暗示的，&了分類將黏著 細胞從表面分開，排除或至少非常戲劇化地改變了這些動 態細胞過程。最後，許多傳統的分類過程，如流式細胞計 數’僅允許單-時間點的測量；結果，使用在單—細胞内

迅！發生的變化來作為選擇基準是非常困難的。容許基於 動心#寸ί生選擇並分離黏著細胞的方法，將明顯地擴大分類 基於其的特徵。例如’細胞可基於其等對激動劑反應或被 拮抗劑抑制反應的能力來選擇。藉著結合精密的顯影技術 (如標準顯影細胞計數）或當前技術發展水平之顯影技術 (如雷射掃描細胞計數）與可釋放之微.底板陣列系統，基 於在細胞行為或信號動態上之差異分類係可能的。 心=著IW時間經過追蹤細胞（即隨時間經過追蹤經編 馬或可尋址底板）@能力，可使用更複雜的篩選基準。一 種這類應用是I㈣及選擇表現遺傳編馬之蛋白質的細胞， 其特性會隨時間經過而改變’例如螢光蛋白共輕物，其螢 光朴y在、、、田胞刺激之後增加或減少。可基於在刺激後的最 Η最大螢光熒化選擇細胞’以產生顯示出提高螢光特性 20 200811295 ^範圍的細胞株。其他的實例為針對阻斷第二個 貝之細胞質移位’或減少妈細胞中转高峰之頻率 質，篩選隨機siRNA庫。轉染細胞可存活一段時間，同栌 在底板陣列上發送出這些動態改變的信號。然後釋放陽： 的細胞’培養並解碼在細胞中之siRNA序列。 微-底板陣列系統所具有之優點，亦可應用在幹細胞選 =技術上大多數的幹細胞分離依賴一或多個生物標記（通 常是表面抗原）。黏著幹細胞的分類，藉著容許在解聚步= =後補充表面蛋白，將改良檢測並增廣表面標記的選擇。 結果，可在大量族群中迅速地鑑認少數幹細胞或其後代， 並在一個步驟中直接分離。 憑藉著隨時間經過追蹤個別細胞的能力，可選殖具有 4寸殊守間f生特徵之細胞。該能力使篩選並選擇經過遺傳設 計以表現編碼蛋白質的細胞成為可能，該編碼蛋白質被設 計以指出細胞内狀態的改變。這些狀態包括各種細胞特 性，如酵素活性、離子或第二信使的濃度、pH值、酵素活 性、蛋白質位置或任何可隨時間改變的其他特性。產生改 良指示子的目前實施，涉及藉著編碼原型指示子的基因之 P返機大全產生大1不同的DNA分子。使用這些各式各樣 的DNA序列轉染細胞，接著在誘導想要的細胞狀態改變 之後篩選細胞。因為目前的技術僅使在單一時間點測量個 別的細胞成為可能，故不能測定在指示子變化上的大小。 在鑑認表現最佳選擇之指示子的細胞時，必須基於指示子 的改變程度（即動態範圍）選擇細胞。最想要在細胞狀態改 21 200811295 變時，顯示出最大指示子變化。例如，細胞内約濃度的理 想指示子（其已被設計以基於妈的結合改變螢光共振能量 轉移（FRET))，當鈣從最低增加到最大值時，將顯示出最 大的FRET動態範圍。若細胞的基礎FRET也很高，可能 不想要在使細胞内的妈升高之後，僅基於高程度之FRET 選出的細胞。在本申請案中，選擇和收集具有最大動態範 圍指示子之細胞的能力是一項驚人的優點。

在細胞選殖中’另一時間測量所需的領域是產生具有 均一信號特性的細胞株。許多基於細胞的篩選測定依賴時 間-分辨的讀出，如加上標籤之分子的移位、細胞内指示子 之螢光特性的改變、或細胞狀態的其他動態標記。終點目 標是決定細胞的狀態是否已經被實驗操作（如暴露至藥

物J •干擾RNA、或其他形式）擾亂。一個在分析這些 測疋時的m是在個別細胞中’其隨著時間經過對刺 激之反應的異質性。該目標的一個實例是在以激動劑刺激 細胞之後，加上螢光標籤之信號蛋白的移位模式。在給定 =族群^’暴露至相同的刺激下之個別細胞，可能展現極 模式。將藉著選録生具有均-時間特性(像 這類讀出的測定。…：拉式）的細胞會改良依賴 選細胞，接著選擇、/ 於在二或多個時間點的測量篩 提高這類細胞株的：：：具有想要,應模式的個別細胞， 得到具有較一致行°然後可選殖擴大這些細胞，以 丁馬的細胞族群。 翻到圖12，务、+、p — ，、述展不基於時間特性選擇細胞的實驗。 22 200811295 關於該實驗以及在本文中描述的其他實驗，使用標準光刻 蝕法在玻片上製造底板陣列，即藉著旋塗並烘烤玻片上的 抗蝕劑，獲得具有想要厚度的.su_8薄膜，接著通過具有 «又计特彳政的光罩’使SU-8薄膜暴露在uv光下。使SU-8 試樣顯影，並藉著氮氣流脫水。在製造之後，處理底板陣 列，以在氧化矽表面形成疏水性全氟烷基矽烷層。該步驟 使陣列能夠在底板之間保留連續的氣泡（“虛擬牆”），防止 在底板之間區域中的溶液或細胞接近（參見，例如美國專利 申明案第1 1/539695號，2006年1〇月9曰提申，標題為 圖化生物學和非·生物學材料的微·氣泡盤（Micr〇_BubMe Plate For Patterning Biological And Non-Biological Materials)，其係以引用方式納入本文中）。在矽烷化之後， 藉著使用PDMS將矽，，〇，，_環（24毫米外直徑）附接至底板陣 列，建造小隔間。然後使用膠原蛋白或纖維網蛋白修飾底 板的上表面，以提高細胞附著。在平舖細胞之前先以基質 沖洗陣列。 為收集釋放的底板和黏著細胞，藉著以鑄模鑄 造PDMS，以製造微孔淺盤。淺盤具有多個尺寸為〗毫米 的方或圓孔。該孔之深度為15〇微米，並以〇·25毫米厚的 壁分開。每個孔按號碼標示以供鑑認。微孔淺盤是圓形的， 具有17毫米之直徑，並被設計成與含有底板陣列之隔間 相配對，以形成不透水密封。在底板釋放之前，使用無菌 稱墊將PDMS微孔淺盤與底板陣列密封。在底板釋放之後， 倒轉微孔淺盤-底板陣列組件，使底板和含水溶液因重力而 23 200811295 落入微孔淺盤中。 如上文提及的，底板-陣列系統的有利條件之一是以美 於其中需要多次測量的動態現象，在一 ,,,, 长奴日守間内從相同的 細胞或細胞群中選擇細胞的能力。為展示底板陣列在基於 時間特性分離的利用性，基於其生長速率分離細胞。以產 ^每個底板<!個細胞的密度，將心細胞平舖在具有按 號碼編碼之底板的陣列上，並在2小時内藉著顯微鏡檢查， 以證明底板具有每個底板〇 $ i個、細胞。在這些實驗中， 以獨特的數字碼編碼底板，而使在陣列上追削找的底板 超過數天成為可能。在培養96 、時時，再度檢杳在平舖 時含有單-細胞的底板。拆開此時有<4個細胞（2·5+〇8個 細胞[平均值土標準差]，η=6)之菌落的底板，收集到第—個 多孔培養盤内，並在條件培養基中培養。如在圖12八中所 見，輕易地測定在每個衍生自單一細胞之菌落中的細胞數 目。亦釋放在96小時有g22個細胞（25±2, η=5)的底板， 收集至第二個多孔培養盤内，並放在條件培養基中（參見圖 12C)。在平舖在底板陣列上之後118和144小時，再次= 定每個收集到之底板中出現的細胞數目。在144小時，具 有緩慢和迅速生長族群的孔，分別具有3 〇±1 6對 個細胞（參見圖i2B和12D)。兩個細胞族群的生長曲線之 Μ &緩丨更生長的細胞有4天的加倍時間，而較快速生+ 的細胞則有1天的加倍時間，因此展示基於加倍時間或^ 長速率成功地分類。這些數據亦展示收集細胞菌落的能 力。基於生長速率的選擇，可以在鑑認涉及調節細胞週期 24 200811295 或,進生長抑制之基因和蛋白質上找到利用性。其他藉由 在單、、、田胞上重複測量而成為可能之分離的類型，包括基 於離子（例如舞》農度、蛋白質移位、酵素（例如激酶）活化 或細胞骨架改變之時間模式的選擇。 %翻到圖i2E和12F，敘述展示基於細胞形態學之細胞 =擇的貝驗。可使用流式細胞計數評估顯著的細胞形態 车如土於正向光散射的尺寸和粒性。目前在流動細胞中 之細胞高速顯影上的進步

已經證明可用以獲得額外的結 構數據，其對增加可能的分類決定顯示有用。然而，這些 方法需要在分析之前先使細胞置入懸浮液，結果喪失了細 胞在其黏著狀態下特有的三維結構。為展示藉著形態學分 離細胞 以產生每個底板<1個細胞的密度，將HeLa細胞 平舖在底板陣列上，並培養4天。已知 組織培養條件下會展現出一些形態學。 曰守’偶爾在底板上的細胞具有完全-伸展

HeLa細胞在標準 當在透照法下觀察 的表現型，其因為

細胞被在陣列上維持於培養中而被保留（圖12E)。較常看 到的是展現出較球狀形態的細胞，與底板接觸最少（圖 12E)。標記非常扁平的圓形細胞，而”Λ，’標記球狀的細 胞。在相同的實驗中，釋放並收集含有顯示兩種形態學之 細胞的底板（每個表現型η=6)。當分類到多孔培養般中時 再度檢查底板，而在所收集之底板上的所有細胞均保持其 在釋放前的形態學，即使是在持續培養3天之後（圖12=) 亦如此。因此，可基於其形態學或形狀來選擇和收集細胞。 基於形態學的選擇使鑑認調節細胞骨架、表面附 系田 25 200811295 胞-對-細胞黏附的基因及/或蛋白質成為可能。 翻到圖13,敘述展示無性繁殖系菌落中基於個別細胞 特性之細胞選擇的實驗。可在大範圍之尺寸内（數十到數百 微米）製造陣列中的底板。如同先前討論的，可使用該系統 分離單一細胞或細胞菌落。當在能夠容納多個細胞的底板 上培養單一細胞時，在底板上形成細胞的菌落。因為在底 板之間的虛擬牆限制細胞移動至其他底板，這些菌落大多 數本貝上應5亥疋無性繁殖系的。因為可隨著時間經過重複 查詢底板，可隨著菌落生長測量在底板上菌落中之個別細 胞的特性。因此，基於創建細胞之後裔的特徵（如基因表 現）的分離應該是可能的。對於這些研究，使用以包括與 組織蛋白-H1蛋白質融合之EGFp的蛋白質穩定轉染的 HeLa細胞株。組織蛋白-H1與細胞DNA密切相關，使得 經轉染之細胞在其核中局部地展現出綠螢光。分別以i〇:i 之比例，將野生型HeLa細胞與表現EGFp'^織蛋白_hi的 細胞混合。然後將細胞以產生每個底板q個細胞之限制稀 釋平舖在陣列（175微米邊長，40微米間隙，5〇微米高）上。 以獨特的號碼將陣列中5,600個底板分別編碼，以使在分 類之前和之後追蹤特定的底板成為可能。在數天内藉著顯 微鏡（透射和螢光）檢視底板陣列，並測量在陣列上每個親 代細胞之後代的螢光。可在含有非螢光細胞的底板中輕易 地看出有螢光細胞的底板（圖13八和UB)。在這些條件下， 看不見底板的綠自身螢光。在培養72小時之後，76%底板 沒有細胞，22〇/〇含有非螢光細胞的菌落，而2%顯示出具有 26 200811295 ， 螢光細胞的菌落（n=10實驗）。其中所有細胞均表現EGFP_ 組織蛋白-HI的菌落，具有平均7+4個細胞，為最初在底 板上培養之單一親代細胞的後裔。為展示這些無性繁殖系 菌落的分類，釋放榮光菌落、收集、並安置於培養中（圖 和13D)。這些螢光㈣的擴展持續六天，產生表現融合蛋 白之細胞的無性繁殖系族群（n=15)(圖13E和UF)。這些實 驗展示基於個別細胞是否保有親代細胞之特性分類細胞菌 洛的能力。該選擇策略可在細胞之分子設計或細胞株（例 如幹細胞）的發育方面，找到利用性。 諸如在流式細胞計數、LCM、Palm系統、抗生素選擇、 和限制稀釋中使用的標準選擇基準，亦可能用於微_底板陣 列系統技術。這些選擇基準包括螢光，如來自自身榮光、 由細胞表現的螢光分子、螢光染料、免疫螢光；螢光特性， 如$光哥命、極化、各向異性現象、螢光共振能量轉移、 猝滅、螢光光譜；生物發光；化學染色；從產色原受質中 產生有色產物；光學特性，包括光散射、消光、干涉、相 位、分光光度吸收、極化、紅外光譜；電學特性，包括阻 抗和電容，聲學特性；及其他。例如，如在圖1 4中所示， 可分析使用免疫螢光染色的細胞，然後基於表面蛋白的有 無或強度選擇。該實例展示可在生長在底板上的細胞上進 行免疫螢光染色’並可基於細胞-表面標記的螢光染色呈像 細胞，同時在底板上培養細胞。在該實例中，將RBL細胞 與經Alexa Fluor 647-標示之IgE(l〇微克/毫升）一起培養， 然後沖洗。RBL細胞具有表面Fee受體，其與IgE結人。 27 200811295 在底板陣列上可輕易看到Alexa Fluor-染色的細胞（激發/發 射_65〇/665毫微米）。空的底板（在中央下排）顯示無明顯背 景螢光。 如同在前圖10中所述，可在從底板陣列中釋放之後選 殖細胞。為進一步展示在底板釋放之後的存活力，並展示 可使用底板選擇技術產生無性繁殖系族群，進行進一步的 貫驗。為測定在底板釋放與收集之後，細胞是否能生長成 菌落，將細胞平舖在底板陣列上。在培養24小時之後， 從陣列中釋放出在底板上的個別細胞，收集在多孔培養盤 中，亚安置在標準組織培養恆溫箱中。在收集的一小時内， 以及之後不同的時間，使細胞顯像。在收集之後一小時， 大多數細胞仍維持在底板頂端（參見圖15A和B)。在收集 之後1〇小時，大多數細胞已經從底板移動到鄰近的表面 上，且有些細胞亦已經經歷細胞分裂（參見圖和。 在底板釋放與收集之後5和7天，在以含有細胞之底板平 舖的那些孔令出現許多細胞（參見圖16和丨乃。在孔中 現衍生自在底板上收集之細胞的無性繁殖系或出 同的菌落。 迅丨寻上相 除了使使収廣泛的細胞選擇基準成為可能，微_ 陣列糸統亦有利地使迅速建立穩定轉染物的 能。以DNA轉染細胞，以過度表現蛋白質，、’、、、可 天然或突變蛋白質，是在生物學實驗室中進=1表現非- 標準過程。從大族群中選擇少數的細 ：“、、數-人的 因為穩定轉染細胞的發生率可能是1〇 八 刀之1那麼低。 28 200811295 雖然現代的分子生物學技術經常可獲得高百分比攝入DNA 的細胞，但將DNA倂入宿主基因組内卻是相當罕見的事 件，其為穩定複製並轉移至子代細胞所必需的。被暫時轉

染的細胞通常在培養數天時喪失外來的DNA，並停止表現 蛋白質。通常藉著抗生素選擇與限制稀釋法倂用，建立轉 染細胞之穩定表現的無性繁殖系。當轉染細胞攜帶螢光標 記時，在消耗足夠的時間建立適當數目的穩定無性繁殖系 之後，亦可使用流式細胞計數來分類細胞。抗生素選擇法 通常需要數週和大量的人力。此外，選擇法本身可能是有 毒性的，更降低了穩定轉染物的發生率。 在許多暫時轉染方法中看到之表現的迅速喪失，展示 在轉&數天内分離並擴展細胞的小型無性繁殖系菌落時， 可比傳統方法更迅速地產生穩定的無性繁殖系。當以dna 轉染細胞時，可在轉染後幾天内（例如<5_10天）分離仍表現 融合蛋白的無性繁殖系菌落。無性繁殖系菌落在這幾天中 的生長，可包括在範圍大約<50_1000個細胞内的菌落尺 寸，具有在範圍大約<10-20次細胞分裂内的細胞分裂次 數。若原始細胞（群）的所有後代均在底板上持續表現該基 因’則這些菌落就是被穩定轉㈣。然後所選殖的菌落^ 迅速地擴展，目為收㈣菌落而非[細胞1提供細胞 生物學家有力的新工具’以迅速製備無性繁殖系族群，明 顯地減少了時間、人力和成本。 立穩定細胞株之用途，在圖 實驗。第一個步驟包括以欲 為說明底板陣列於迅速建 18到20中敘述並說明代表性 29 200811295 表現之DNA (如編碼螢光蛋白者）轉染細胞（步驟〇，並 回收在燒瓶中的轉染細胞（步驟2)。可使用各種轉染載體 中的任-者’包括但不限於以基於脂質的載劑、病毒或微 生物。或者，可在存在DNA構築體下使用電穿透。在所 敘述之方法中，在將細胞放在底板陣列上之前，先進行該 步驟’ I然後容許回收細月包’並在培養燒瓶中繁殖一段適 當的時間（步驟2)。在下一個步驟（步驟3)中，使細胞沉降 在含有底板的陣列上，每個底板都有足夠的表面積，以容 許具有想要細㈣目的、細胞菌落在單一底板上生長。細胞 可自具有適當後度和體積之懸浮液的平舖，使得大多數的 底板僅含有單一細胞。或者，可在細胞沉降使底板含有單 一細胞之後，筛選陣列。在平舖之後，鑑認並記錄僅含一 個細胞的底板。在一段時間内隨著細胞生長和繁殖來分析 陣列。憑藉著在底板之間插入空氣障壁，將細胞維持限制 在其最初附著的底板上；因此’在任一底板上僅發現原始 細胞的後代。針對感興趣的特徵（如螢光’其代表目標dna 的表現）對後代評分。如同在圖19和2〇中指出的，釋放 並收集含有一或多個具有感興趣特徵（在這裡是綠螢光） 之細胞的底板（步驟4)，並容許小型無性繁殖系菌落擴展（步 驟5)。穩定轉染結果將產生由所有皆展現感興趣特徵（即 綠螢光）之後代組成的菌落。翻到圖2〇，出示—段時間内 之無性繁殖系菌落的擴展。 或者，如在圖21中所示，可藉著在轉染步驟之後馬上 將細胞平舖在底板陣列上，甚至更迅速地鑑認並選擇穩定 30 200811295 轉染（步驟1)。然後在陣列上進行細胞生長大約5至7天（步 驟2)。如上文提及的，穩定轉染結果將產生由全部皆展現 感興趣特徵（即綠螢光）之後代組成的菌落。纟目前的實 例中’在®落中的所有後代，由於表現目標蛋白的結果， 均為有螢光的。未經穩定轉染的細胞，將隨時間導致在一 些或全部後代中喪失特徵的菌落。接下來，如在圖21和22 中所述，釋放(步驟3)並收集（轉4)含有穩定轉染物的底 板-即僅含有綠螢光細胞的底板，然後容許穩定轉染物之小 型無性繁殖系菌落擴展（步驟5)。 雖然本發明可容許各種修飾和可選擇的形式，但已經 在圖片中出示，並在本文中詳細說明其特定的實例。然而， 應瞭解本發明並不受限於所揭示之特定形式或方法，相反 的’本發明涵蓋所有^在附錄之中請專利範圍之精神與範 圍内的修飾、相等物和選擇。 【圖式簡單說明】 圖1A為具有微_底板之陣列的微_圖化淺盤。 圖1B為微-圖化淺盤的侧面圖，其在特定之可尋址位 置具有與附著在底板的試樣（細胞)。 圖2為微-圖化淺盤另一具體事實的側面圖，並說明藉 著從該淺盤中釋放含有試樣之底板的試樣的陽性選擇。曰 圖3為微-圖化淺盤另一具體事實的側面圖，其具有附 著至特定之可尋址位置的試樣（生物）。 圖4為微·圖化淺盤另一具體事實的侧面圖，其具有附 著特定之可尋址位置的試樣（細胞）。 31 200811295 圖5為微-圖化淺盤另一具體事實的側面圖，其位在多 孔培養盤之單孔的底部，容許對該淺盤使用傳統的工具。 圖6為淺盤的側面圖，顯示使用臨時或永久的分割器， 以容許將不同類型或病史的試樣平舖在淺盤上不同的場 所’或在不同的通道内。 圖7A和7B顯示在使用底板淺盤進行黏著細胞篩選和 培養之過程中的步驟。 圖8A和8B顯示在使用底板淺盤進行DNA篩選之過 程中的步驟。 圖9為自動測定之整合型底板淺盤卡匣的透視圖。 圖1 〇 A到Μ顯示在使用整合型底板淺盤卡匣進行試樣 篩選和培養之過程中的步驟。 圖11為使用包括微-底板陣列之微-底板卡匣的高容量 篩選和細胞選擇系統的圖解。

隹圖12Α到12F為顯示基於不同的細胞特徵，鑑認並收 木生物本細胞的影像。圖12 a和C顯示從同時平舖在麻& 陣列上之單-細胞生長的細胞無性繁殖系菌落。釋:= 的底板’ ϋ分開收集，以產生兩個生長特徵有所不同的無 性繁瘦系族群。圖12B # D顯示細胞以不同的速率增殖。 圖咖和F顯示同時平舖在底板陣列上的細胞具有;同的 ^學。可釋放含有想要形態學之細胞的底板，收集並與 具有另類形態學之細胞分離。 螢光標記蛋白穩定轉染 細胞平舖在陣列上，使 圖13 A到13 F是顯示收集以綠 之热性繁殖系菌落的影像。將單一 32 200811295 得一或數個細胞平舖在個別的底板上。圖13A、c和e為 透射光影像，而目13B、D和F為相對應的螢光影像。圖 13A和B顯示，表現螢光蛋白之細胞的無性繁殖系族群的 單一菌落以及缺少該蛋白質之細胞的數個菌落。圖丨和 D _不已經與陣列分開，並放在培養孔中的底板和螢光菌 洛。圖13E和F顯示無性繁殖系菌落已經增殖成僅含有螢 光細胞的大型菌落。 圖14為以長波長螢光染料（Alexa Fluor647)染色活細 胞的透射光和相對應螢光影像。圖13和14 一起證實在廣 大範圍螢光波長内，進行生長在底板陣列上之細胞的透射 光學顯微鏡和螢光顯微鏡檢查的能力。 圖1 5 A到1 5D為顯示含有收集自陣列之單一細胞，並 將其維持培養1 〇小時的個別底板的兩個實例的影像，其 證貫在分離並放在培養孔中之後，該單一細胞仍保持黏著 亚存活。在圖1 5 A和C中，在分離之後仍看到細胞保持與 底板黏著，然後顯示其開始移動離開底板。在圖1 5B和D 中’顯不在放在培養孔中之後，另一個細胞開始增殖。 圖1 6為顧示獲自底板陣列之個別細胞的實例的影像， 其顯示在培養孔中收集和分離之後，該細胞生長成為無性 繁殖系菌落。 圖17為顯示獲自底板陣列之個別細胞的另一實例的影 像’其顯示在培養孔中收集和分離之後，該細胞生長成為 無性繁殖系菌落。 圖1 8為流程圖，其顯示使用底板陣列建立穩定之轉染 33 200811295 細胞株的方法。 圖19八和达 _ 9B為頌不從使用在圖1 8中出示之方法產 生的細胞陣列中协崎、，γ τ m不急万沄屋 沾^条 亚釋放（陽性選擇）轉染無性繁殖系

圖20為兹苜― 巧-員不在圖19中看到之轉 成穩定之轉染菌落的影像。^無丨生繁殖糸’生長 圖21為顯示使用底板陣列 < 株之另-個方法的流程圖。更t易建立穩定轉染細胞 圖 陣列中 22為顯示從使用在圖21 ’建立穩定之轉染無性繁 主要元件符號說明】 中出示之方法產生的細 殖系菌落的影像。 胞

10 淺盤 12 底板 13 位置 14 試樣 16 檢測器 17 雷射脈衝 18 雷射 20 淺盤 22 底板 23 位置 25 淺盤 30 淺盤 32 底板 34 200811295

34 試樣 35 非-位置 36 顯微鏡接物鏡 37 電極 38 不透明區 39 電場 40 淺盤 41 多孔培養盤 42 底板 43 位置 44 試樣 47 單一孔 50 淺盤 51 分割器 52 底板 54 試樣 55 流體帽 60 細胞 62 多孔培養盤 70 淺盤 72 底板 72a 底板 73 位置 74 試樣 35 200811295

76 檢測器 77 雷射脈衝 78 雷射 80 淺盤 82a 底板 83 位置 84 DNA 85 DNA 86 檢測器 87 雷射脈衝 88 雷射 90 整合底板淺盤卡匣 91 流體帽 92 底板 95 小通道 99 淺盤 100 整合底板淺盤卡匣 101 帽 102 底板 102a 底板 102b 底板 106 檢測器 107 進出子L 108 雷射 36 200811295 109 淺盤 110 提取器 150 顯微鏡附件 160 電腦 170 卡匣 171 帽 172 底板 179 淺盤 參 37

Claims (1)

1. 200811295 十、申請專利範園： 1. 一種收集單一活細胞的方法，其包括下列步驟： 將多個活細胞排列在陣列上， 從。亥多個活細胞中選擇單一的活細胞，並 從陣列中移出所選擇的活細胞。 2. 如申請專利範圍第丨項之方法，其中該選擇步驟包 括基於時間上分離之細胞的二或多次測量，鑑認感興趣的 細胞。

   3 ·如申請專利範圍第2項之方法，其中該二或多次該 測量係以超過1秒之間隔得到。 4·如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞體積小 於1毫微升。 5·如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞體積小 於100微微升。 6·如申請專利範圍第1項之方法，其中該選擇步驟包 括鑑認展現出感興趣之短暫特徵的細胞。 7.如申請專利範圍第1項之方法，其中該選擇步驟包 括鑑認展現出感興趣之動態特徵的細胞。 8·—種收集單一活細胞的方法，其包括下列步驟： 基於％間上分離之細胞的二或多次測量，從多個活細 胞中鑑認單一的活細胞， ''' 從該多個活細胞中分離所選擇的活細胞。 9.如申請專利範圍第8項之方法，其中該二或 量係於以超過1秒之間隔得到。 州 38 200811295 10.如申請專利範圍第8項之方法，其中該鑑認步驟包 括鑑認展現出感興趣之短暫特徵的細胞。 11 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中該鑑認步騾包 括鑑忍展現出感興趣之動態特徵的細胞。 12 · —種收集細胞菌落之方法，其包括下列步驟： 將多個細胞之菌落排列在陣列上， 從該多個細胞菌落中選擇細胞菌落，並 從陣列中移出所選擇的菌落。 _ I3·如申請專利範圍第12項之方法，其中該菌落包括 500個以下的無性繁殖系細胞。 14·如申請專利範圍第12項之方法，其中該菌落包括 1 00個以下的無性繁殖系細胞。 15·如申請專利範圍第12項之方法，其中該菌落包括 50個以下的無性繁殖系細胞。 16.如申請專利範圍第12項之方法，其中在該菌落中 每個細胞的細胞體積，按體積計小於1毫微升。 ^ 17·如申請專利範圍帛12項之方法，其中在該菌落中 每個細胞的細胞體積，按體積計小於1〇〇微微升。 18·如申請專利範圍第12項之方法，其中在該菌落中 每個細胞的細胞體積，按體積計小於1 〇微微升。 19. 如申請專利範圍第12項之方法，其中該選擇步驟 包括基於時間上分離之菌落的二或多次測量，鑑認感興趣 之菌落。 20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該二或多次 39 200811295 測量係以超過1秒之間隔得到。 21 ·如申請專利範圍箆,。= 国弟12項之方法，其中該選擇步驟 包括鑑認展現出感興趣之暫時特徵的菌落。 22·如申明專利範圍第12項之方法，其中該選擇步驟 包括鑑認展現出感興趣之動態特徵的菌落。 23 · —種方法，其包括下列步驟： 以感興趣之DNA轉染或以微生物-介導之方式感染多 個細胞，並 在轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不 超過1 0天，從該多個細胞中鑑認細胞的穩定轉染物。 24·如申請專利範圍第23項之方法，其中該鑑認步驟 包括在轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不 超過5天，鑑認細胞的穩定轉染物。 25.如申請專利範圍第23項之方法，其進一步包括在 轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不超過 1 〇天，收集該細胞之穩定轉染物的步驟。 26_如申請專利範圍第24項之方法，其進一步包括在 轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不超過5 天，收集該細胞之穩定轉染物的步驟。 27·如申請專利範圍第23項之方法，其中該細胞體積 小於1毫微升。 28·如申請專利範圍第23項之方法，其中該細胞體積 小於100微微升。 29.如申請專利範圍第23項之方法，其中該多個細胞 40 200811295 "係排列在陣列上。 3 0·如申請專利範圍第23項之方法，其中該細胞係附 著於表面上。 31.—種方法，其包括下列步驟： 以感興趣之DNA轉染或以微生物-介導之方式感染多 個細胞，並 在轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不 超過20次細胞分裂，從該多個細胞中鑑認細胞的穩定轉 馨染物。 32·如申請專利範圍第3 1項之方法，其中該鑑認步驟 包括在轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不 超過10次細胞分裂，鑑認細胞的穩定轉染物。 33·如申請專利範圍第31項之方法，其進一步包括在 轉染或以微生物-介導之方式感染該多個細胞之後不超過 20次細胞分裂，收集該細胞之穩定轉染物的步驟。 籲 34·如申請專利範圍第32項之方法，更包括在轉染或 以Μ生物-介導之方式感染該多個細胞之後不超過1 〇次細 胞分裂’收集該細胞之穩定轉染物的步驟。 35·如申請專利範圍第31項之方法，其中該細胞體積 小於1毫微升。 36·如申請專利範圍第31項之方法，其中該細胞體積 小於100微微升。 37·如申請專利範圍第31項之方法，其中該多個細胞 係排列在陣列上。 41 200811295 ，其中該細胞係附 38.如申請專利範圍第31項之方法 著於表面上。 十一、圖式: 如次頁

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