TW200540183A - Genes and polypeptides relating to prostate cancers - Google Patents

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TW200540183A
TW200540183A TW094108341A TW94108341A TW200540183A TW 200540183 A TW200540183 A TW 200540183A TW 094108341 A TW094108341 A TW 094108341A TW 94108341 A TW94108341 A TW 94108341A TW 200540183 A TW200540183 A TW 200540183A
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Yusuke Nakamura
Hidewaki Nakagawa
Shuichi Nakatsuru
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Oncotherapy Science Inc
Univ Tokyo
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Description

200540183 • 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本’X明屬於生物科學領域，i明確地，為癌症治療及 Θ斷項域。具體而言’本發明關於一攝護腺癌相關基因 B3537(CCDC：4)所編碼之新穎多肽。另外，本發明關於該新 ，穎性基因CXDU。本發明之基因以及多肽可用於例如，診 斷攝護腺癌，作為發展對抗攝護腺癌藥物之分子標的，並 且可用於減緩攝護腺癌之細胞生長。 【先前技術】 攝護腺癌為西方國家之男性最常見的惡性腫瘤疾病之 一（Gronberg，Lancet 361: 859 - 64 (2003))。由於西方飲 食習慣的普及與老年人口的增加，已開發國家中攝護腺癌 的發生率正逐漸提高。藉由偵測血清中的攝護腺專一性抗 原（PSA)可幫助早期診斷及手術治療，攝護腺癌的預後 (prognosis)已大幅改善，然而仍有將近3〇%的患者由於復 發必須接受根除性攝護腺切除術（^丨⑷ prostatectomy)(Han et al·， J Urol 166: 416-9 (2001 ))。由於攝護腺癌初期的生長必須依賴雄性素，因此 多數復發或晚期癌症（a(ivanced cancer)可用雄性素阻斷 療法來治療，然而攝護腺癌最後會發展成非雄性素依賴疾 病，到時雄性素阻斷療法便失去療效。攝護腺癌最嚴重的 問題在於，其他任何療法均無法治療非雄性素依賴之前列 腺癌（Gronberg，Lancet 361: 859-64 (2003))，因此發展 2125-6959-PF;Chiumeow 5 200540183 • 一雄性素阻斷療法之外的新療法為目前治療攝護腺癌刻不 容緩之工作。 cDNA彳政陣列技術可以得到正常及惡性細胞内的整體基 因表現圖譜（profiles)，並比較兩者基因表現之異同 (Okabe et al., Cancer Res 61:2129-37 (2001)； Kitahara et al., Cancer Res 61： 3544-9 (2001); Lin et al., Oncogene 21:4120-8 (2002)； Hasegawa et al., Cancer Res 62: 701 2-7 (20 02))，該技術可以幫助了解複雜的癌細 φ 胞習性以及癌化的過程。辨識於腫瘤中失去控制的基因可 以更準確及正確地診斷每種癌症，並發展新的治療標的 (Bienz 及 Clevers，Cell 103:311-20 (2000))。為 了從整 個基因體的角度了解腫瘤發生的機制、發現診斷用的標的 分子以及發展新的治療用藥，本發明人利用cDNA微俥列技 術分析腫瘤細胞内的23040種基因的表現圖譜（〇kabe et al·， Cancer Res 61:2129-37 (2001); Kitahara et al·，
Cancer Res 61:3544-9 (2001)； Lin et al., Oncogene _ 21:4120-8 (2002); Hasegawa et al·，Cancer Res 62:7012-7 (2002))。 針對癌化機制所設計的研究已幫助確認出多種抗腫瘤 藥劑的分子標的。例如，於後轉譯過程（posttranslational ) 藉由法呢基化（farnesylation)而活化的Ras，其相關之生 長訊號傳遞路徑可利用法呢基轉移酶抑制劑（inhibitors of farnesyltransferase， 驗中證實法呢基轉移酶抑制劑可以有效地治療Ras相關的 6 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 、腫瘤（He et al.，Cell 99:335-45 ( 1 999))。人體臨床試 驗利用抗癌藥物結合抗HER2之單株抗體，賀赛汀 (trastuzumab) ’可用於拮抗原致癌基因（pr〇t〇 — 〇nc〇gene) 受體HER2/neu，且對於乳癌患者的臨床反應及總生存率 (overall survival)有所助 g(Un al·，Cancer Res 61:6345-9 (2001 ))。酪氨酸激酶抑制劑，STI — 571，由於 其可選擇性地去活化bcr-abl融合蛋白，而被發展用於治 療慢性骨髓性白血病（chronic myel〇genc)US leukemias)， φ該疾病的形成主要因為bcr-abl酪氨酸激酶的持續活化而 導致白血球轉形。該類藥劑係被設計用以抑制特定基因產 物的致癌活性（Fujita et al·，Cancer Res 61:7722-6 (2001 ))。因此，一般於癌細胞中表現增加的基因產物可作 為發展新穎抗癌藥物的潛在標的。事實上，以該些對於癌 症生長及進展具有影響的表現異常分子做為新穎藥物標 的，已被證實於特定種類的癌症中具有療效，該類藥物包 括治療乳癌的贺賽汀、治療慢性骨髓性白血病（CML)的格列 鲁衛（GliveC(STI571))，以及治療非小細胞肺癌的易瑞沙 (Iressa(ZD1839))。 已知有數種於攝護腺癌中過度表現之分子，並且被辨 識可作為攝護腺癌的治療標的或標記（Xu et al.，Cancer Res 60: 6568-72 (2000)； Luo et al., Cancer Res 62: 2220-6 (20 02))。然而，多數該些分子同樣於其他主要器 官高度表現，因此以該些分子做為樣的之藥劑或許可以毒 害癌細胞但亦對於其他器官之正常生長的細胞具有副作 2125-6959-PF;Chiumeow 7 200540183 ^ 用。 CD8 +毒性 T 淋巴球（CD8+ cytotoxic T lymphocytes， CTLs)已被證實可辨識由第一類組織相容蛋白（MHC Class I) 分子所表現之腫瘤相關抗原（TAAs)衍生的抗原決定胜肽 (epi tope peptides)，並溶解腫瘤細胞。繼第一個被發現 的腫瘤相關抗原--MAGE家族之後，已有許多腫瘤相關抗原 藉由免疫技術陸續被發現（Boon，Int J Cancer 54 : 1 77-80 ( 1 993); Boon and van der Bruggen, J Exp Med 183 : 725-9 • ( 1 996); van der Bruggen et al_，Science 254: 1 643 - 7 (1991) ; Brichard et al. , J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami et al.， J Exp Med 180: 347-52 (1994)) 〇 部 份被發現的腫瘤相關抗原為現在臨床上發展免疫療法之標 的。目前所發現的腫瘤相關抗原包括MAGE (van der Bruggen et al·，Science 254: 1 643-7 (1 991 ))、gpl00(Kawakami et al.，J Exp Med 1 80: 347-52 ( 1 994))、SART(Shichi jo et al., J Exp Med 187: 277-88 (1998))以及 ® NY-ESO-1 (Chen et al., Proc Natl Acad Sci USA 94: 1 914-8 (1997))。另一方面，特定於腫瘤細胞中過度表現 的基因產物亦會成為誘發細胞免疫反應的標的，該類基因 產物包括 p53(Umano et al·，Brit J Cancer 84: 1 052-7 (2001)) 、 HER2/neu(Tanaka et al·， Brit J Cancer 84: 94-9 (2001 ))、CEA(Nukaya et al·，Int J Cancer 80: 92-7 (1 999))等等。 儘管關於腫瘤相關抗原的基礎及臨床研究有相當程度 8 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 ， 的進展（Rosenbeg et al·，Nature Med 4: 321-7 ( 1 998); Mukherji et al.， Proc Natl Acad Sci USA 92: 8078-82 (1995) ; Hu et al·， Cancer Res 56: 2479-83 (1996))， 只有少數的候選腫瘤相關抗原可用來治療腺癌，包括直腸 癌’且僅有在癌細胞才大量表現的腫瘤相關抗原才能做為 有希望的候選免疫治療標的。另外，找出新的可引發強大 且特定抗腫瘤之免疫反應的腫瘤相關抗原，可幫助臨床利 用胜肚疫苗接種以對抗多種癌症（Boon and van der _ Bruggen，J Exp Med 1 83 : 725-9 (1 996) ; van der Bruggen et al.，Science 254: 1643-7 ( 1 991 ); Brichard et al·， J Exp Med 178: 489-95 (1993); Kawakami et al.,J Exp Med 180: 347-52 (1994); Shi chi jo et al., J Exp Med 187: 277-88 (1 998); Chen et al·，Proc Natl Acad Sci USA 94: 1 914-8 (1 997); Harris, J Natl Cancer Inst 88: 1442-5 (1996) ; Butterfield et al., Cancer Res 59: 3134-42 (1999); Vissers et al·， Cancer Res 59: 5554-9 (1999); ® van der Burg et al., J Immunol 1 56: 3308-14 (1 996); Tanaka et al·， Cancer Res 57: 4465-8 (1997); Fujie et al.，Int J Cancer 80: 1 69-72 ( 1 999); Kikuchi et al·， Int J Cancer 81: 459-66 (1999); Oiso et al., Int J Cancer 81·· 387-94 (1 999))。 有許多報告指出，來自某些健康捐贈者的周邊血液單 ^ ^ (peripheral blood mononuclear cel^ PB#6s)$ 胜肽刺激時會反應產生大量的干擾素r UFN-r )，但是於 9 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 • 人類白血球抗原（HLA)A24或A0201限制的鉻51釋放分析 實驗（51Cr-release assays)中，卻不會影響對抗腫瘤細胞 的毒性（Kawano et al·，Cance Res 60: 3550-8 (2000 ); Nishizaka et al. , Cancer Res 60 : 4830-7 (2000) ; Tamura et al·， Jpn J Cancer Res 92: 762-7 (2001))。然而， 人類白血球抗原-A24及-A0201均為日本人種及高加索人 種常見的人類白血球抗原類型之一（Date et al.，Tissue Antigens 47: 93-101 (1996)； Kondo et al., J Inununo1 籲 155: 4307-12 (1995); Kubo et al., J Immunol 152: 3913-24 (1994); Imanishi et al., Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference Oxford University Press, Oxford, 1065 (1992); Williams et al., Tissue Antigen 49: 129 (1 9 9 7 )) ’因此由這些人類白血球抗原所表現的癌症抗原胜 肽或許可用於治療日本人種及高加索人種的癌症疾病。此 外，已知活體外誘導低親和性毒性T淋巴球通常需要使用 鲁尚濃度的胜肽，以便於抗原表現細胞（antigen cel Is，APCs)上產生大量專一的胜肽/組織相容蛋白複合 物’才能有效地活化該類毒性T淋巴球（Alexander-Mi 1 ler et al·， Proc Natl Acad Sci USA 93: 4102-7 (1996))。 【發明内容】 為了解攝護腺癌之機制以及辨識新，的腫瘤診斷標記及 /或腫瘤治療藥物標的，本發明之作者利用基因體cDNA微 2125-6959-PF；Chiumeow 10 200540183 陣列以及結合雷射微光束微切除技術（laser microbeam microdissection)以分析攝護腺癌之基因表現模式。習知 技術係結合雷射微切除技術及基因體cDNA微陣列技術得 到攝護腺癌細胞（PRC)以及非侵略性的前驅細胞（PIN)之確 切基因表現模式。比較侵略性的攝護腺癌細胞與正常前列 腺上皮細胞或非侵略性前驅細胞之基因表現模式，本發明 之作者辨識出普遍存在於侵略性攝護腺癌細胞以及前驅細 胞中的88個上調基因（Up-regUiateci genes)以及207個下 Φ 調基因（down-regulated genes)。於本發明中，作者將焦 點集中於一表現序列標籤（EST)，並辨識出一於攝護腺癌細 胞中過度表現之新基因，CCDC4。 結果證實，CCDC4為一專一於攝護腺癌細胞中過度表 現之基因。本發明之作者利用小型干擾RNA(siRNA)阻斷 (kn〇Cking-d〇wn)CCDC4之效應，發現會減緩攝護腺癌細胞
的生長，並且在設計對抗攝護腺癌的新穎療法之藥物時， 該分子具有作為藥物標的之潛力。 CCDC4編碼一具有53〇個胺基酸，包含捲曲螺旋區域 (coiled-coiled domain)之蛋白f。根據北方染潰分析結 果，CCDC4僅在睪丸及攝護腺中表現。 " 許多抗癌藥物會不僅毒害癌細胞，亦會傷宝正常 細胞。然而’由於㈣4正常表現僅限於睪丸及攝護腺， 抑制⑽4表現的藥劑並不會對其隸織有不良影響 此方便用於治療或預防攝護腺癌.。 曰 CCDC4，其可做為攝 因此，本發明提供一分離之基因 212 5-695 9-PF；Chiumeow 11 200540183 ♦護腺癌診斷標記之候選物，用以發展新賴診斷策略之潛力 標的物，以及有效的抗癌藥劑。另外，本發明提供一該基 因所編碼之多月太’及其生產與使用方法。具體而言，本發 明提供一於攝護腺癌細胞中表現上升之新穎人類多肽， 或其功能等同物（functional equivalent)。 於一較佳實施態樣中，CCDC4多肽包含一由SEQ ID N〇:l之開放讀碼區（open reading frame)所編碼之53〇個 胺基酸的蛋白質，或是一由SEQ ID N〇:3之開放讀碼區所 |編碼之437個胺基酸的蛋白質。CCDC4多肽較佳包含SEQ ID 仰：2(基因資料庫登錄號：^126828)或邡(31])仙.4(基因 資料庫登錄號：AB126829)所示之胺基酸序列。本發明亦提 供一至少由部分CCDC4多核普酸序列所編碼之分離蛋白 質’或SEQ ID NO : 1或3所示序列之至少1 5%或較佳至少 25%互補之多核苷酸序列所編碼之分離蛋白質。 本發明進一步提供一新穎的人類基因CCDC4，其於絕 大多數攝護腺癌中之表現，相較於非癌化之攝護腺管上虔 零細胞’具有顯著的提升。該分離之CCDC4基因包含SEQ ID NO: 1或3所示之多核苷酸。具體而言，CCDC4 cDNA包含 8763個核苷酸，其包含1 593個核苷酸（SEQ ID NO: 1)為開 放讀碼區，或是CCDC4 cDNA包含8692個核苔酸，其包含 1314個核脊酸（SEQ ID NO:3)為開放讀碼區。本發明更進 一步包含一與SEQ ID NO: 1或3所示核脊酸序列雜交，並 且與SEQ ID Ν0··1或3所示校苷酸序列之至少15%或較佳 至少25%互補之多核苷酸序列，其可編碼一 CCDC4蛋白質 12 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 • 或其功能等同物。該類多核昏酸為，例如，SEQ ID NO · l 或3所編碼之CCDC4的退化物（degenerates)或對偶突變物 (allelic mutants) 〇 本文所述之獨立基因係指一多核苔酸，其結構與任何 天然生成的多核杳酸’或是任何跨越三個以上個別基因之 天然生成的基因體多核普酸之部分片段（f ragment)之結構 均不相同。獨立基因一詞包含，例如，（a)一 DNA，其序列 為一有機體（organism)之基因體中一段天然生成的基因體 ❿ DN A分子片段；（b)—插入載體（vector)或原核生物或真核 生物之基因體之多核苷酸，使其得到的產物分子與天然生 成的載體或基因體DNA不為相同；（c)'^藉由聚合酶連鎖反 應（polymerase chain reaction，PCR)所得到的個別分子， 例如，cDNA、基因體片段、聚合酶連鎖反應所得到的片段， 或一經由限制酶切割後得到之片段（restricti〇n fragment);以及（d)—為雜合基因（hybrid gene)部分片段 的重組核苷酸序列，該雜合基因為一編碼融合多肽（fusi〇n ® peptide)之基因。 因此，本發明之一目的為提供一種可編碼本發明所述 之多肽或其片段之獨立多核苷酸。該獨立多核苷酸較佳包 含一序列與SEQ ID NO: 1或3之核苷酸序列具有至少60% 的相似度。該獨立多核苷酸更佳包含一序列與SEQ ID NO : 1 或3之核苷酸序列具有至少65%、70%、75%、80%、85%、 90% 、 91% 、 92% 、 93% 、 94% 、 95% 、 96% 、 97% 、 98% 、 99%或 以上的相似度。若該獨立多核苷酸之長度與參考序列，如 2125-6959-PF；Chiumeow 13 200540183 ♦ .SEQ IDNCM或3,之長度相等或較長，相似度的比較以參 考序列的全長為準。若該獨立多核苷酸之長度較參考序 列，如SEQ ID N0:1或3,之長度為短，相似度的比較則 取同長度的參考序列片段為準（任何同源性計算所需的環 狀結構除外）。 本發明亦提供一種製造蛋白質之方法’係將一編碼 CCDC4蛋白質的多核㈣序列轉染（transfect)或轉形 (transform)至宿主細胞並使其表現。此外，本發明提供含 鲁有編碼CCDC4蛋白質的多核苷酸序列的載體’以及含有編 碼CCDC4蛋自質的多核㈣序列的宿主細胞。該類載體及 宿主細胞可用來製造CCDC4蛋白質。 本發明亦提供一種可專一性辨識CCDC4蛋白質的結合 劑（binding agent)。例如，一結合劑可以為對抗ccdc4蛋 白質的抗體。另外，一結合劑可以為該蛋白專一性的配體 (ligand)，或一可與該蛋白質專一性結合的合成多肽（參 考，例如，W200404401 1 )。本發明另外提供一 CCDC4基因 籲的反義（antisense)核苷酸（例如，反義DNA)、核糖酶 (ribozyme)以及 siRNA (小型干擾 RNA)。 本發明更進一步提供一種診斷攝護腺癌之方法，其步 驟包括：偵測取自一對象的生物樣本中的基因表現量；將 該樣本的CCDC4基因表現量與正常樣本相比較；以及當該 樣本具有高表現量的CCDC4基因時，表示該對象已羅患攝 護腺癌或具有罹患攝護腺癌之風險-。 此外’本發明又提供一種治療或預防攝護腺癌之化合 2125-6959-PF;Chiumeow 14 200540183 物之筛選方、Ά a 、心乃居，包括將CCDC4多肽與測試化合物接觸；以 、、擇可” CCDC4多肽結合或可改變其生物活性的測試化 合物。 又月進步提供一種治療或預防攝護腺癌之化合物 之篩選方法，甘rK#丄 ”中該方法包括將測試化合物與表現CCDC4 多^太的細胞接觸，或是將測試化合物與—細胞接觸，該細 胞係導人上游接有GGDG4的轉錄調節區域的報導基因之載 體；以及選擇可抑制⑽C4多肽表現量的測試化合物。
種治療或預防攝護腺癌之醫藥組合 ，例如，一抗癌藥劑。該醫藥組合 本發明另外提供一 物。該醫藥組合物可為 物可包含至少一部分的反義S-寡核杳酸、siRNA或核糖 酶’前述醫藥組合物係可分別對抗如SEQID N0s ·· i及3所 不之CCDC4多核苷酸序列。一合適的siRNA可以SEQ汕肋· 8 的序列作為標的。因此，本發明之siRNA亦包括一來自 ID Ν0··8的核苷酸序列。於本發明中，其較佳可選擇作為 治療或預防攝護腺癌的標的。該醫藥組合 發明之筛選可用於治療或預防細胞增生疾病二= 癌，之化合物之方法所篩選到的化合物。 本發明醫藥組合物之作用結果較佳為抑制癌化細胞， 如攝護腺癌細胞，之生長。該醫藥組合物可施用於包含人 類及馴養的（domesticated)哺乳類動物等哺乳類動物。 本發明進一步提供一種使用本發明之醫藥組合物以治 療或預防攝護腺癌之方法。 此外，本發明提供一種治療或預防癌症之方法，其步 2125-6959-PF;Chiumeow 15 200540183 CCDC4多肽。期望可藉由施用CCDC4多肽以激 驟包含施用 發抗腫瘤之免疫能六，_ 力因此，本發明亦提供一種激發抗腫 瘤免疫能力之方法，盆舟驟由紅— 八梦騍包括施用CCDC4多肽，或是施 用一包含CCDC4多狀、可用你、二由> U T用於/σ療或預防癌症之醫藥組合 物。 而要了解的疋，則述本發明之發明内容以及下述本發 明之實施方式均為較佳的皆你能接 勹早乂住的只施恶樣，並不宜用於設限本發 明或是其他本發明之實施態樣。
【實施方式】 於本文所述之—《_種，，，除非特別說明，係 代表“至少一”或“至少一種，，之意。 為了解攝護腺癌的致病機制以及找出新的診斷標記及 /或藥物標的以治療及/或預防該類腫瘤，本發明之作者利 用基因體cDNA微陣列結合雷射微光束微切除技術分析攝 護腺癌的基因表現模式，其結果發現CCDC4基因專一地於 攝護腺癌細胞中過度表現。另外，利用小型干擾 RNAsUiRNAs)抑制CCDC4基因表現，發現可顯著抑制癌化 細胞的生長。這些發現暗示著CCDC4可給予癌細胞致癌活 性（oncogenic activity)，因此抑制其蛋白質的活性便可 用來發展具有潛力之治療及預防如攝護腺癌等增生性疾病 之策略。 CCDC4 本發明辨識出兩種序列相近之基因，其可編碼CCDC4 16 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 的變異體（variants)。較長的cDNA變異體包含8763個核 苷酸，其含有一段1 593個核苷酸之開放讀碼區（seq id Ν〇··1) ’較短的cDNA變異體包含8692個核苷酸，其含有_ 段1314個核苷酸之開放讀碼區（SEQ ID N〇:3)。該開放讀 碼區分別編碼一 5 3 0胺基酸及4 3 7胺基酸的蛋白質。 因此，本發明提供由前述基因所編碼、實質上純化的 多肽，其含有SEQ ID N0:2或4的胺基酸序列，及其功能 相等物，以編碼CCDC4蛋白質。與CCDC4功能相等的多肽， 包括，例如，等同於人類CCDC4蛋白質之其他生物體的同 源蛋白質，以及人類CCDC4蛋白質两-突—變禮~〇--------------------- 本發明之“功能相等物，，指可以像CCDC4蛋白質一樣 具有促進細胞增生活性，以及給予癌細胞致癌活性之對象 多肽（subject polypeptide)。評量該對象多肽是否擁有細 胞增生活性’可藉由將編碼該對象多肽的DNA導入細胞中 使其表現該對象多肽，並偵測細胞增生狀況是否加速，或 是群落形成活性（colony forming activity)是否提升。該 類細胞包括，例如，NIH3T3、C0S7及HEK293等細胞。 製備一已知蛋白質的功能等同多肽之方法，以及製造 突變蛋白質之方法均為本技術領域之人士所熟知。舉例而 言’一本發明之技術領域者可藉由定點突變技術 (site-directed mutagenesis)於蛋白質的胺基酸序列引 入適當的突變，以便製備CCDC4蛋白質的功能等同多肽 (Hashimoto-Gotoh et al·， Gene 152:271-5 (1995);
Zoller and Smith, Methods Enzymol 100: 468-500 (1983); 2125-6959-PF;Chiumeow 17 200540183 • Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12:9441-9456 (1984)； Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154: 350-67 (1987)； Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82: 488-92 (1 985)； Kunkel, Methods Enzymol 85: 2763-6 ( 1 988))。胺基酸 突變也可為自然發生。本發明之多肽包括含有人類CCDC4 蛋白質胺基酸序列之蛋白質，其中有一或多個胺基酸為突 變，該突變後的多肽為人類CCDC4蛋白質的功能均等物。 突變的胺基酸數目通常少於或等於1 〇個胺基酸，較佳為少 φ 於或等於6個胺基酸，更佳為少於或等於3個胺基酸。 經由取代、刪除、插入及/或置換一或多個胺基酸殘基 (residue)等改造方式而獲得的突變或改造後的蛋白質，已 知可以保持其原本的生物活性（Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81: 5662-6 (1984); Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10:6487-500 (1982);
Dalbadie-McFarland et al. , Proc Natl Acad Sci USA 79: 6409-13 (1982))。 • 進行突變的胺基酸殘基較佳為突變成一可保留其胺基 酸側鏈特性之不同胺基酸（一種名為保留性胺基酸取代之 技術）。胺基酸側鏈的特性，包括，例如，疏水性胺基酸（A、 I、L、Μ、F、P、W、Y、V)、親水性胺基酸（R、D、N、C、E、 Q ' G、Η、Κ、S、Τ)，以及含有下列官能基或共同特性的側 鏈，包括：一脂肪族（£1111)11&1^(：)侧鏈（〇、儿、¥、1、1、？）； 一含有羥基（hydroxy 1)之側鏈（S ν Τ、Υ);——含有硫原r子之 侧鏈（C、M); —含有羧酸（carb〇Xy 1 ic acid)及醯胺（amide) 2125-6959-PF；Chiumeow 18 200540183 •之側鏈⑶^^”一含有鹼基化“…的側鏈⑶^)， 以及一含有芳香基之侧鏈（H、F、γ、w)。註··括號内的英 文字母為胺基酸的單字母代碼。 一個將一或多個胺基酸殘基加入人類cCDC4蛋白質胺 基酸序列之多肽例子為含有人類CCDC4蛋白質的融合蛋白 質。本發明亦包括結合人類CCDC4蛋白質以及其他胜肽或 蛋白質之融合蛋白質。融合蛋白質可以利用本領域之人士 所熟知之技術，例如，連結編碼本發明之CCDC4蛋白質的 # DNA以及編碼其他胜肽或蛋白質之DNA，並使其讀碼區 (frame)正確配合，之後將該融合的dna至一表現載體並使 其於一宿主内表現。與本發明之蛋白質進行融合的胜肽或 蛋白質並無任何限制。 已知可用於和本發明之蛋白質融合的胜肽，包括，例 如，FLAG(Hopp et al ·，Biotechnology β： 1204-10 (1 988))、6xHis(含有六個組胺酸殘基）、1〇xHis、流行性 感冒凝集素（Influenza agglutinin，HA)、人類 c-myC 片 籲段，VSP-GP片段、pl8HIV片段、T7標籤（tag)、HSV標籤、 E標籤、SV40T抗原片段、lck標籤、α-微管蛋白片段（α -tubulin fragment)、Β標籤、蛋白質c片段及其類似物。 可用於和本發明之蛋白質融合的蛋白質，包括，例如， GST(麩胱甘肽 S 轉移酶（glutathione-S-transferase))、 行性感j凝集素（HA)， 免疫球蛋白怪定區 (immunoglobulin constant region)、斤半乳糖普酶（沒 -忌318<：1：081(1386)、118?(麥芽糖結合蛋白）等等。 2125-6959-PF;Chiumeow 19 200540183 - 融合蛋白質之製備可將市面上購得之編碼前述融合胜 肽或蛋白質的DNA，與編碼本發明之多肽的DNA相融合， 並使製得之融合DNA表現。 另外一種習知用來分離功能等同多肽之方法為，例 如，使用雜交技術之方法（Sambrook et al.，Moleculai·
Cloning 2nd ed. 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab.
Press ( 1 989))。本技術領域之人士可輕易地分離一與編碼 人類CCDC4蛋白質之全部或部分DNA序列（即，SEQ汕N〇:1 • 或3)具有高度相似度的DNA，並且自該DNA中分離出與人 類CCDC4蛋白質功能等同之多肽。本發明之多肽包括該些 與編碼人類CCDC4蛋白質之全部或部分dna序列雜交之dna 所編碼之多肽，且該多肽為人類CCDC4蛋白質之功能等同 物。該類多肽包括人類蛋白質所對應的哺乳類同源物 (homologue)(例如，一由猴子、大鼠、兔子及牛的基因所 、、爲碼之夕肽）。當欲從動物身上分離出與編碼人類蛋 白質之DNA高度相似之cDNA時，較佳為使用動物的睪丸或 攝護腺組織。 編碼與人類CCDC4蛋白質功能等同多肽之DM的雜交 環境可由本技術領域者循常例選擇。例如，雜交可利用
RaP1d-hyb 緩衝液’’（Amersham LIFE SCIENCE)在 68°C 進 仃30分鐘或更久的前雜交（1)1^]1}^1^(11^^〇1^,之後加入 標記探針（labeled probe),並於68t進行一小時或更久。 其後的清洗步驟可以，例如，於低嚴。袼（1〇w stringent) 環境進行。低嚴格環境為，例如，42t，2χ ssc，1% sds， 2125-6959-PF；Chiumeow 20 200540183 或較佳為50。(：，2\88〇,0.1%汕3。更加為使用高嚴袼（1^的 stringent)環境。高嚴格環境為，例如，於室溫以2xss(：， 〇.〇l%SDS，清洗三次，每次20分鐘，之後再於3rc以1χ SSC，0· 1%SDS清洗三次，每次20分鐘，最後再於5(rc以 lx SSC，〇· 1% SDS清洗兩次，每次2〇分鐘。然而，多種 因素，例如，溫度及鹽濃度，均可能影響雜交環境的嚴格 程度’因此熟習本技術領域者可以選擇合適的因素以達到 所需的嚴格程度。 除了雜交以外，另一種用來分離編碼人類CCDC4蛋白 質功能等同多肽之DNA之方法為基因放大方法，例如，聚 合酶連鎖反應（PCR)，其可根據編碼蛋白質的DNA序列情報 (SEQ ID N0:1或3)合成引子（primer)來進行。 藉由上述雜交技術或基因放大技術所分離得到的dna 所編碼的人類CCDC4蛋白質功能等同多肽之通常與人類 CCDC4蛋白質的胺基酸序列具有高同源性（high homo 1 ogy )。高同源性般指一多肽序列或一多核香酸序列與 一參考序列之間具有40%或更高，較佳為60%或更高，更佳 為80%或更高的，甚至最佳為85%、90%、93%、95%、98%、 99%或更高的同源性。同源性百分比（亦稱為相似度百分比 (percent identity)) —般用於比對兩條以最理想方式排 列之序列。排列序列之比對方法為本技術領域所習知。序 列的最理想排列方式及比對可以藉由，例如“ Wi丨bur and Lipman, Proc Nat l Acad Set USA 80 ： 726-3 0 (1 983) 中所述的演算法來實行。 212 5 -6 95 9-PF;Chiumeow 21 200540183 本發明所述之多肽其胺基酸序列、分子量、等電點 (isoelectricpoint)、糖鏈的存在與否、或形式均可能因 為使用的細胞或宿主或純化方式的不同而有所變化。然 而’只要其為本發明之人類CCDC4蛋白質之功能等同物:、、 均屬於本發明之範疇。
本發明之多肽可藉由本技術領域所習知之方法，以重 組蛋白或天然:蛋白的形式製備…重組蛋白的製備可以將 一段編碼本發明之多肽的職(例如，含有SEQ ID N〇:l或 3之多核普酸序列< _，插入—合適的表現載體 (expression vector)，並將該载體導入一合適的宿主细 胞，取得其萃取物(extract)，並將該萃取物藉由層析法 (chromatography)，即利用固定有可對抗本發明蛋白質之 抗體之管柱或結合至少—個前述之管柱，以純化出多狀， 前述之層析法，例如’離子交換層析法、逆向層析法、膠 體過濾法或親和層析法。 此外’本發明之多肽於宿主(例如，動物細胞及大腸桿 菌胞）中的表現形式可以為結合有谷耽甘狀硫轉移酶蛋 白質（glUtathi〇ne-S一transferase㈣以⑷的融合蛋 白’或者是補助有複數個組氨酸的重組蛋白。該表現的重 =蛋白可以藉由谷胱甘肽管柱或㈣柱進行純化。另外， 當本發明之多肽以C-myc、複數個組氨酸或是FLAG標籤標 不的蛋白質形式存在時，其可分別藉由c_myc、Hid mG 抗體來偵測及純化。 當純化出融合蛋白後 亦可視需要利用凝金蛋白酵素 2125-6959.pF；Chiume〇w 22 200540183 (thrombmht Xa因子來切除非目標多肽之部分。 天…、蛋白質的分離方式為本技術領域所習知。例如， 藉由將表現有本發明多肽之組織或細料取物通過結合有 下述㈣4蛋白質抗體的親和性管柱。該抗體可以多株抗 體或單株抗體。 本發明亦包括本發明多狀之部分胜狀。該部分胜狀所 含的胺基酸為本發明多肽之特定的胺基酸，錢部分胜肢 至少含有七個以上胺基酸’較佳為八個或八個以上，更佳 為九個或九個以上。該部分胜肚可詩，例如，製傷對抗 本發明多肽之抗體、筛選與本發明多肽結合之化合物，以 及篩選本發明多肽之抑制物。 …本發明之部分胜肽可藉由已知的胜肽合成方法或利用 適當的胜肽酶㈣（digest)本發明之多肽等基因工程技術 製造。胜肽合成方法可使用’例如，固相合成或液相合成 方法。 本發明進一步提供可編碼前述CCDC4多肽的多核苷 酉文。本發明之多核苷酸可用於活體内（in viv〇)或活體外 (in vitro)生產前述本發明之多肽，或可應用於基因療法 以便治療與本發明蛋白質相關之基因異輯導致的疾病。 4何形式之本發明之多核脊酸，包括、rna、cDNA、 基因體DNA、化學合成多核脊酸，只要其可編碼多發明之 肽句*T被使用。本發明之多核香酸亦包含一含有已知核 苔酉夂序列及其簡併序列（degenerate sequences)，唯前述 夕核苔酸DNA須能編碼本發明之多肽。 212S>6959-PF；chiumeow 23 200540183 本發明之多核苷酸可藉由本技術領域所熟知之方法製 備:例如，本發明之多核脊酸可藉由··製備一可表現本發 明多肽之細胞的CDNA資料庫，以及使用本發明DNA序列（例 如’ SEQ ID NQ:1或3)之部分片段做為探針進行雜交。一 。臟·貝料庫可以參照 Sambrook et al·，Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press Π 989) 所述之方法製備，亦可使用市面上販售的_資料=州
養資料庫亦可藉由下述方法製備··由表現本發明多肽之 細胞中萃取其RNA，根據本發明之DNA序列（例如，SEQ ID N〇:1或3)合成寡DNA，利用該寡DNA作為引子進行PCR， 以及放大可編碼本發明多肽之cj)NA。 此外，藉由定序得到的cDNA的核苷酸也可藉由一般定 義方式定義出該cDNA的轉譯區域，也可輕易得到本發明多 肽之胺基酸序列。此外，利用該得到的cDNA或其片段做為 探針用來篩選並分離出基因組DNA資料庫。 更明確而言，mRNA可以由任何表現本發明之目標多肽 之細胞、組織或器官（例如，睪丸或攝護腺）中製備。習知 了用以刀離mRNA的方法，例如，利用鳥嘌吟超高速離心法 (guanidine ultracentrifugation)(Chirgwin et al.,
Biochemistry 18:5294-9 (1979))或 AGPC(ChomCZynski and Sacchi, Anal Biochem 1 62:1 56-9 (1 987))法製備總 RNA。接著，再利用 mRNA 純化套組（mRNA Purification Kit (Pharmacia))等由總·A中純北出ffiR勝…也可利用 QuickPrep mRNA PUrificatiori Kit (Pharmacia)直接純化 2125-6959-PF;Chiumeow 24 200540183 » • 出 mRNA 〇 該得到的 mRNA 可藉由反轉錄酶（reverse transcriptase)合成cDNA。cDNA的合成可利用市面上販售 的套組，例如 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku Kogyo)。或者，cDNA 的 合成及放大可根據 Frohman et al·，Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002 (1988)及 Belyavsky et al.， Nucleic Acids Res 1 7: 291 9-32 ( 1 989))所述之 5’ -RACE 方式使 φ 用一引子，5， -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech)，以 及聚合酶連鎖反應（PCR)。 從PCR產物中製備出一段所欲的DNA片段，再將其連 接至一載體DNA。將該重組載體轉形（transform)至大腸桿 菌等宿主中，之後便可以從菌落中選出所欲的重組載體。 該所欲DNA的核苷酸序列可以藉由傳統方法，例如，雙去 氧核醣鏈停止法（dideoxynucleotide chain termination) 判讀。 ® 如欲本發明多核苷酸的核苷酸序列具有更高的表現效 率’可以考慮選用密碼子使用頻率較高的宿主（Grantham et al·，Nucleic Acids Res 9: 43-74 (1 981 ))。本發明 多核苷酸的序列可藉由商業販售的套組或是傳統方式進行 改變。例如，該序列可利用一限制酶做切割，插入一段合 成的寡核脊酸或是適當的多核普酸片段，加入一連結子， 或是加入一段啟動密碼子（ATG)及或停止密碼子,(TAA、TGA 或 TAG)。 2125-6959-PP；chiumeow 25 200540183 明確而5，本發明之多核苷酸為含有SEQ ID NO: 1或 3之核普酸序列的j)NA。 另外，本發明提供一種可在嚴格環境下與含有seq N〇:l或3之多核普酸進行雜交的多核脊酸，且該多核苔酸 可編碼前述本發明之CCDC4蛋白質之功能等同物…熟習 本技術領域者可選擇適當的嚴格環境。舉例而言，可Z使
用-低嚴格環境，或較佳可使用―高嚴格環境。該環境與 前文所述之環境相同。該雜交的DNA較佳為⑼…或染色體 DNA 〇 本發明亦提供-種多核：§：酸，其可與編碼人類ccdc4 蛋白質之多核苷酸⑽IDN0:1或3)互補或與其互補股互 補，且其至少包括15個核苷酸。本發明之多核苷酸較佳為 -可與編碼人類⑽4多肽之多核脊酸專—性雜交的多核 苷酸。名肖“專—性雜交，，於本文中指在-般的雜交環境 下’較佳為嚴格雜交環境下，不會與_所編碼的其他蛋 白質發生顯著的交互性雜交現象（cross hybridization)。該類多核苷酸包括探針、引子、核苷酸 以及核苷酸衍生物(例如’反義寡核苷酸及核糖酶)：其； 專一地與編碼本發明多社DNA或其互補股雜交。再者， 該類多核苷酸可用來製備DNA晶片。 載體及宿主 本發明亦提供一種插入有本發明之多核苔酸的載體及 別是DNA ’維持存在宿主細胞内，以便其表現本發明之多 2125-6959-PF；Chiumeow 26 200540183 • 肽，或施用於基因療法。 當欲將載體放大及大量表現於一大腸桿菌（例如， JM109，DH5a，HB101或xLiBlue)的宿主細胞時，該載體 需含有or i以便於大腸桿菌内放大，並且須有一段標記 基因（marker gene)(例如，一段抗藥性基因，其中該藥物 可以為安比西林（ampicillin)、四環黴素 (tetracycline) ' 卡那黴素（kanamyCin)、氯黴素 (chloramphenicol)或其類似物）用以選擇轉形成功的大腸 _ 桿菌。舉例而言，可使用Ml3系列載體、PUC系列載體、 PBR322、pBluescript、pCR-Script 等。此外，PGEM-T、 pDIRECT以及pT7也可如上述載體一樣用來次選殖 (subcloning)以及萃取DM。當欲使用一載體生產本發明 之蛋白質，可以選用一表現載體。例如，一可於大腸桿菌 内表現的表現載體應具有上述可於大腸桿菌内放大的特 性。當使用JM109、DH5a、HB101或XL1 Blue等大腸桿菌 作為宿主細胞時，使用的載體應該具有可有效於大腸桿菌 鲁表現所欲基因的啟動子（promoter)，例如，1 acZ啟動子 (Ward et al., Nature 341: 544-6 (1989); FASEB J 6： 2422-7 (1992))、araB 啟動子（Better et al·，Science 240: 104卜3 (1 988))、T7啟動子或其類似物。於有效表現的面 來考量，例如 pGEX-5X-l(Pharmacia) 、 “ QIAexpress system”（Qiagen)、pEGFP 以及 pET(宿主較佳為表現 T7 RNA 聚合酶的BL21)可用來取代上述載體j此外，該載v體亦可 包含一段訊號序列用來分泌多肽。於大腸桿菌中，可用來 2125-6959-PF;Chiumeow 27 200540183 ， 指揮將多肽分泌至細胞膜隙（periplasm)的序號序列為，例 如 pelB 序號序列（Lei et al·，J Bacteriol 1 69: 4379 ( 1 987))。將載體導入目標宿主細胞的方式包括，例如，氯 化#5方法（calcium chloride method)以及電穿孔方式 (electroporation method) ° 除了大腸桿菌以外，還可以使用衍生自哺乳動物的表 現載體（例如，pcDNA3( Invi trogen)以及 pEGF-BOS(Nucleic Acids Res 1 8(1 7): 5322 (1 990))、pEF、pCDM8)，衍生自 _ 昆蟲細胞的表現載體（例如，“ Bac-to-BAC桿狀病毒表達 系統”（GIBCO BRL)、pBacPAK8)，衍生自植物的表現載體 (例如，pMHl、pMH2)，衍生自動物病毒的表現載體（例如， pHSV、pMV、pAdexLcw)，衍生自反轉錄病毒的表現載體（例 如，pZIpneo)，衍生自酵素的表現載體（例如，“ pichia
Expression Kit”（Invitrogen)、pNVll、SP-Q01)，衍生 自枯草桿菌（Baci 1 lus subti 1 is)的表現載體（例如， pPL608、pKTH50)均可來生產本發明之多肽。 _ 為了於動物細胞，例如，CH0、COS或NIH3T3細胞， 内表現’載體必需擁有能於該類細胞中表現的啟動子，例 如，SV40 啟動子（Mulligan et al·，Nature 277: 1〇8 ( 1 979))、the MMLV-LTR promoter、EF1 α 啟動子（Mizushima et al·， Nucleic Acids Res 18: 5322 (1990)) 、 CMV 啟 動子及其類似物，並且較佳含有一標記基因（例如，一抗藥 性基因，該藥物可為，如新霉素… 成功的細胞（transformants)。具有前述特性的載體包括， 2125-6959-PF;Chiumeow 28 200540183 例如，pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV 及 p〇Pl 3。 生產多肽 此外’本發明亦提供一種生產本發明之多肽之方法。 該多肽可從一宿主細胞中製備，其中該宿主細胞攜帶含有 編碼多肽之基因的表現載體。根據需要可採用一邊穩定表 現基因，一邊放大細胞内基因的拷貝數（c〇py number)的方 法。舉例而言，可將一含有互補DHFR基因（例如，PCH0 I)
的载體送入CH0細胞’其中該核酸合成途徑已被移除，藉 由加入甲氨蝶呤（methotrexate，MTX)來達到放大基因拷貝 數的功效。另外，若欲暫時表現基因，可採用將含有sy4〇 複製來源（replication origin of SV40 )，如 pcD 等，之 載體轉形至染色體含有SV4〇 τ抗原的c〇s細胞之方法。 利用前述方式所得到之本發明多肽可由宿主細胞内或 外（如培養基）分離，並純化成為實質上純淨的同源多肽 (substantially pure h_gene〇us p〇lypeptide)。名詞 “實質上純淨”於本文中指-多肽實質上不含有其他生物 巨分子。該實質上純淨之多肽其乾重（的―伽）純度至 少達到75%(例如，至少8〇、85、95或99%)。純度可藉由 任何適當的標準測量方式來測量，例如，層㈣、聚丙稀 醯胺膠體電泳或HPLC分析。多肽的分離及純化方法並無特 別限制’事實i ’任何標準方法均可使用。 舉例而言，營知届批 e柱層析法、過濾、超濾 (ultrafiltration)^ ^^ . ^ 免疫沉澱、SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳、等電點電泳、透析 2125-6959-PF；Chiumeow 29 200540183 -以及再結晶等均可適當的選用或合併以用來分離及純化多 肽。 層析法包括，例如，親和層析法、離子交換層析法、 疏水性層析法、膠體過滤法、逆向層析法、吸收性層析法 等（Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al.5 Cold Spring Harbor Laboratory Press (1 996))。該類層析法也可利用液相層 .析法，> HPLC及FPLC來進行。因此本發明提供一利用上 述方法所製備得到之高度純化的多肽。 本發明之多肽，亦可選擇性地於純化前或純化後，利 用α適的蛋白質改造酵素改造或部分刪除。可使用的蛋白 質改造酵素包括，但不限於，騰蛋白酶（trpsin)、糜姨蛋 白酶（Chym〇trypsin)、離胺醯基内胜肽酶 (lysyiend〇peptidase)、蛋白激酶、糖苷酶（giuc〇sidase) 等等。 春抗體 本發明提供一種可與本發明多肽結合之抗體。本發明 之抗體可以任何形式使用，例如，包含藉由注射本發明之 多肽至一動物，如兔子，使其免疫產生的單株或多株抗體， 抗血π，以及藉由基因重組產生的所有種類的多株及單株 抗體、人類抗體，以及人源化抗體。 本發明之多肽可作為抗原施用至任何動物種類以產生 抗體，前述動物較佳為哺乳類動物，例如人類、小鼠或大 2125-6959-PF；Chiumeow 30 200540183 .鼠’較佳為人類。-人類衍生的多肽可以藉由本發明所述 的核苷酸或胺基酸序列而得到。 本發明中’用來作為免疫抗原的多肽可為一完整的蛋 白質或一蛋白質的部分胜肽。一部分胜肽可包含本發明多 肽之’例如，胺基（N)端或羧基（c)端片段。 於本文中，抗體係定義為一可與完整之本發明多肽或 其片段產生反應之蛋白質。 一編碼本發明之多肽或其片段之基因可插入一已知之 Φ 表現載體，之後再如本所述將該載體轉形至一宿主細胞。 該所欲之多肽或其片段可利用標準方法由宿主細胞外或内 取得’並於之後作為一抗原使用。另外，該整個表現多肽 之細胞或其浴解產物（1 y s a t e )，或是一化學合成之多狀均 可作為抗原使用。 任何哺乳類動物均可被該抗原免疫，但以能與用於細 胞融合的親代細胞（parental cel ls)相容的哺乳類動物較 佳。一般使用嚙齒目（Rodentia)、兔形目（Lag〇morpha)或 籲靈長目（Primates)等動物。嚙齒目動物包括，例如，小鼠、 大鼠或天竺鼠。兔形目動物包括，例如，兔子。靈長目動 物包括，例如，狹鼻下目的猴類（Catarrhini)(舊大陸猴）， 例如’食蟹猴（Macaca fascicularis)、恆河猴（rhesus monkey)、阿拉伯狒狒（sacred baboon)以及黑獲猩。 利用抗原免疫動物之方法為本技術領域所習知。將抗 原以腹腔内注射（intraperitoneal· in 射（subcutaneous in jection)為一標準的免疫動物之方 2125-6959-PF;Chiumeow 31 200540183 法。更明確而言，可將以適當量的麟酸鹽緩衝溶液、生理 食鹽水等稀釋並懸浮抗原。該抗原懸浮液並可視需要混合 適當畺的表準佐劑，例如，弗氏完全佐劑（preund， s complete adjuvant)，製成乳化劑再將其注射至哺乳動物 體内。較佳係將抗原混合適量的弗氏完全佐劑並每隔4至 21天後注射，如此進行數次。免疫注射時亦可配合使用適 ¥的載劑。當利用上述方法進行免疫後，取出血清並利用 標準方法評估所欲抗體抗體的量是否增加。 # 對抗本發明多肽之多株抗體可藉由收集接受免疫之哺 乳類動物的血液，評估其血清中所欲抗體的增加，之後再 利用任何傳統方法將血清自血液中分離。多株抗體包括含 有血清的多株抗體，亦包括自血清中獨立出來的多株抗體 部份（fraction)。免疫球蛋白G或Μ可以利用，例如，一 含有本發明多肽之親和性管柱之方式，自僅可辨識本發明 多肽之部分製備，並進一步利用蛋白質Α或蛋白質g管柱 進行純化。 _ 為製借單株抗體，收集接受抗原免疫的動物的免疫細 胞’檢查其血清中所欲之抗體之增加量，之後進行細胞融 合。用於細胞融合之免疫細胞較佳為取自脾臟。其它可用 來與上述免疫細胞（immunocyte)融合的親代細胞包括，例 如’較佳為哺乳類動物的骨髓瘤細胞（mye 1 〇ma ^ 1 1 S )，更 佳為具有可利用藥物選擇融合細胞之特性的骨髓瘤細胞。 上述免疫細胞及骨髓瘤細胞可种用習知方法，例如， Milstein et al. (Galfre and Milstein, Methods Enzymol 2125-6959-PF；Chiumeow 32 200540183 · 73: 3-46 ( 1 981 ))之方法，進行融合。 細胞融合後形成的融合瘤（hybridomas)可培養於一標 準選擇培養基，例如HAT培養基（含有次黃嗓呤 (hypoxanthine)，胺基蝶呤（aminopterin)以及胸腺啼咬 (thymidine)之培養基）。於HAT培養基培養的時間一般為 持續數天至數週’該時間足以使非所欲的融合瘤之外的其 他細胞（非融合細胞）死亡。之後，進行標準限制稀釋以篩 選並複製一融合瘤細胞產生所欲之抗體。 參 除了上述利用抗原免疫非人類動物以產生融合瘤之方 法以外’人類淋巴細胞，如感染有EB病毒之人類淋巴細胞 也可利用一多肽、表現多肽的細胞或其溶解物進行體外免 疫。之後，再將該免疫的淋巴細胞與可無限分裂之人類衍 生的骨髓瘤細胞，如U266，進行融合，以形成一融合瘤， 該融合瘤所生產之人類抗體可與多肽結合（Unexamined Published Japanese Patent Application No. (JP-A) Sho 63-17688)。 所得到的融合瘤可接著移植到小鼠的腹腔（abdominal cavi ty) ’並萃取其腹水（asci tes)。所得到的單株抗體可 利用，例如，硫酸銨沉澱法、蛋白質A或蛋白質G管柱、 DEAE離子交換層析法或一結合有本發明多肽之親和性管 柱’等方式純化。本發明之抗體不僅可用於純化及偵測本 發明之多肽’亦可作為本發明多肽之促進劑（agon i sts)或 拮抗劑（antagonists)的候選物。此外，該'抗體可應用於本 發明夕肽相關疾病之抗體治療（ant i body treatment)。當 2125-6959-PF；chiumeow 33 200540183 -’ 該得到的抗體用於注射至人體時（抗體治療），較佳使用_ 人類抗體或人源化抗體以減少免疫抗原性 (immunogenicity) 〇 舉例而言’可選擇一多肽、表現多肽的細胞或其溶解 物作為抗元，免疫含有人類抗體基因的轉殖動物。收集自 該動物細胞產生的抗體，並將其與骨髓瘤細胞融合以形成 融合瘤，便可製得抗該多肽的人類抗體（參見W092-0391 8、 W093-2227、W094-02602、W094-25585、Ψ096-33735 以及 φ W096-34096)。 此外’一產生抗體的免疫細胞，例如免疫後的淋巴球， 可利用一致癌基因（oncogene)使其長生不老，以便用來製 備單株抗體。 所得到的單株抗體，也可利用基因工程技術進行重組 (參見，例如，Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies, published in the United
Kingdom by MacMillan Publishers LTD ( 1 990))。例如， _可由免疫細胞中，如一可產生抗體之融合瘤或一免疫後的 淋巴球，複製出一編碼抗體之DNA，然後將其插入適當的 載體並送入宿主細胞以製備重組抗體。本發明亦提供重組 抗體，其製備方式如前述。 此外’本發明之抗體，只要在可與本發明之一或多種 多肽結合之前提下’其形式可以為抗體之片段或改造過之 抗體。舉例而言，該抗體片段可以為Fab、p(ab，)2、Fv 或單鏈Fv(scFv)，其中來自H鏈及L鏈的Fv可以一適當 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 • 之結合物連結（Huston et al.，Proc Nat 1 Acad Sci USA 85 : 5879 - 83 (1988))。更明確而言，一抗體片段可以利用一酵 素’例如木瓜酶（papain)或胃蛋白酶（pep sin)，分解一抗 體而得。或者，也可構築編碼一抗體之基因，將其插入一 合適之表現載體，並於一合適之宿主細胞表現（參見，例 如，Co et al·，J Immunol 1 52: 2968-76 (1 994); Better and Horwitz, Methods Enzymol 178: 476-96 (1989);
Pluckthun and Skerra, Methods Enzymol 178: 497-515 J (1989); Lamoyi， Methods Enzymol 121: 652-63 (1986);
Rousseaux et al·，Methods Enzymol 121: 663-9 ( 1 986); Bird and Walker, Trends Biotechnol 9: 1 32-7 ( 1 991 ) ) 〇 一抗體可藉由將其與不同的分子，如聚乙二醇（PEG)， 結合而進行改造。本發明亦提供該類改造抗體。該改造抗 體可藉由化學方式進行改造。該改造方式亦為本技術領域 之習用方式。 此外，本發明之抗體亦可為嵌合抗體之形式，其可變 £域為竹生自非人類抗體’而其怪定區域衍生自人類抗 體。本發明之抗體亦可為人源化抗體之形式，其互補決定 區（complementarity determining region ，CDR)衍生自 非人類抗體，而其骨架區（FR)及其恆定區衍生自人類抗 體。該類抗體可藉由習知技術製備。抗體的人源化 (Humanization)可藉由將嚙齒類的CDRs或CDR序列以其對 應的人類抗體的序列取代（參見，封如，VerhOeyen et a 1 ^ Science 239:153 4 -1536 (1988))。因此，該人源化之抗體 35 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 為嵌合抗體，其中實質上少於一個完整的人類可變區域被 其非人類種之對應序列所置換。 含完整的人類骨架、恒定區域以及人類可變區域的完 整人類抗體也可被使用。該類抗體可利用多種習知技術方 法製造。體外方法包括使用展示於噬菌體内的人類抗體片 段重組資料庫（recombinant libraries of human antibody fragments)(例如，Hoogenboom & Winter, J· Mol· Biol. 227:381 (1991))。同樣地，人類抗體也可藉由將人類免疫 # 球基因位置（loc〇插入内源基因部份或完全失活的轉殖動 物體内，如小鼠。該方法描述於，例如，美國專利第 6，1 50,584 號、第 5,545,807 號、第 5,545,806 號、第 5,569,825 號、第 5,625，126 號、第 5,633,425 號及第 5, 661，016 號。 以前述方法所得到的抗體也可純化至均質狀態 (homogeneity)。例如，抗體的分離和純化可利用一般蛋白 質的分離和純化方式。例如，該抗體之分離及純化可藉由 適當地挑選並結合使用管柱層析法，例如，親和性層析法、 過濾、超濾、鹽析、透析、SDS聚丙烯醯胺膠體電泳以及
等電點焦集法（isoelectric focusing)(Antibodies: A
Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1 988))，但並不限於前述方 法。一蛋白質A官柱及蛋白質g管柱可用作親和性管柱。 可使用的蛋白質A官柱包括，例如，fjyper d、porqs以及
Sepharose F.F. (Pharmacia)。 2125-6959-PF；Chiumeow 36 200540183 - 除了親和性層析法以外，其他可使用的層析法包括， 例如，離子交換層析法、疏水性層析法、膠體過滤法、反 相層析法、吸收層析法及其類似方法（（strategies
Protein Purification and Characterization： a Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press (1 996))。該層析 步驟可使用液相層析法，例如HPlc及FPLC。 本發明之抗體與抗原的結合能力可藉由，例如，吸光 # 度、酵素連結免疫吸收分析（ELISA)、酵素免疫分析（EIA)、 放射性免疫分析（RΙΑ)及/或免疫螢光法等方式測量。於 ELISA中’本發明之抗體係固定於本發明之抗體係固著於 一平盤’將本發明之多肽加至該平盤，之後加入一含有所 欲抗體的樣本，例如可產生抗體之細胞的培養上清液。接 者再於平盤上加入可辨識第一抗體（primary antibody)， 且以酵素，如鹼性磷酸酶，標示的二次抗體，並培養該平 盤。其次進行清洗，加入一酵素物質，如對硝基苯磷酸 鲁 （P—nitrophenyl phosphate)至平盤，再藉由偵測吸光度以 評估樣本的抗體結合活性。一多肽片段，如C端或N端片 段，均可作為抗原以評估抗體的結合活性。於本發明中， 也可使用BIAcore(Pharmacia)以評估抗體的活性。 前述方法係藉由將本發明之抗體與一推測含有本發明 多肽之樣本接觸，並偵測或測量該抗體及多肽所形成的免 疫複合物，以便偵測或測量本發明之多肽… 由於本發明之多肽的偾測或測量方法可專一地偾測或 2125-6959~PF；chiumeow 37 200540183 夢 • 測量該多肽，因此該方法亦可應用於多種使用該多肽的實 驗中。 反義多核苷酸、小型干擾RNAs以及核糖酶 本發明包括一可與SEQ ID NO: 1或3核苷酸序列之任 一位置產生雜交反義多核脊酸。該反義多核苔酸較佳可對 抗SEQ ID NO: 1或3核苷酸序列中至少約1 5個連續核苷 酸。前述反義多核苷酸更佳係於前述至少15個連續核苷酸 中含有一個起始密碼子。 | 反義多核苷酸之衍生物或改造物亦可作為反義多核苷 酸。該類改造物包括低階驗性磷酸鹽改造（1 ower a 1 ky 1 phosphonate modifications)，如甲基磷酸鹽形式或乙基 磷酸鹽形式、硫代磷酸鹽改造（phosphorothioate modifications)及磷酸醯胺鹽改造（phosphoroamidate modifications) 〇 文中“反義多核苷酸”不僅包括該些針對某特定區域 的DNA或idRNA元全互補的的核普酸，亦包括含有一或多個 •錯誤配對（mismatch)的核普酸，但該些含有錯誤配對核苔 酸之DNA、RNA或反義多核脊酸必須能與SEQ ID NO : 1或3 核苔酸序列進行專一性雜交。 該類多核苷酸包含於前述“至少約15個連續核苷酸 區域、至少7 〇 %或更鬲的同源性”、較佳為“至少8 〇 % 或更高的同源性”、更佳為“至少9〇%或更高的同源性”、 最佳為“至少95%或更高的同源性，，等多檢：g；酸牛。本文 中所述之演算法可用來計算同源性。本技術領域所習知之 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 /秀异法可用來計异同源性。此外，該反義多核杳酸的衍生 物或改造物也可作為本發明之反義多核苷酸。該類改造物 包括低階驗性磷酸鹽改造（l〇wer alkyl phosphonate modifications)，如甲基磷酸鹽形式或乙基磷酸鹽形式、 硫代鱗酸鹽改造（phosphorothioate modi f icat ions)及鱗 酸醯胺鹽改造（ph 〇s phoroamidate modifications)。 該類反義多核苷酸可做為探針以分離或偵測編碼本發 明多肽之DNA，或者作為引子用來放大MA。 # 本發明反義多核苷酸之衍生物可作用於產生本發明多 肽之細胞，其藉由和編碼本發明之多肽的DNA或mRNA結 合’抑制其轉錄或轉譯，促進該mRNA的降解，並抑制本發 明多肽之表現，因而可以抑制該多肽之作用。 本發明亦包括小型干擾RNAs(siRNA)，其含有SEQ ID N0:1或3核脊酸序列的正義（sense)核酸及反義核酸。更 明確而言，該用來抑CCDC4表現的siRNA包含可以SEQ ID NO: 8核苷酸序列作為目標之核苷酸序列。 “siRNA”為一可防止目標mRNA轉譯的雙股RNA分 子。用來將siRNA導入細胞的標準技術，包括利用DNA作 為模板（template)再轉錄成RNA的技術。該siRNA包含一 段編碼人類CCDC4蛋白質的多核苷酸（SEQ ID Ν0··1或3) 之正義核酸序列及反義核酸序列。該s i RNA係被構築成一 單一轉錄子（雙股RNA)含有目標基因的正義及互補的反義 序列’例如，一髮夾結構（hairpin)、 將siRNA與目標細胞内CCDC4的轉錄子（transcript) 2125-6959~Pp；chiumeow 39 200540183
• · 結合後會導致該細胞内的該蛋白質產量減少。該募核苷酸 的長度為至少ίο個核苷酸，其長度也可以與天然轉錄子一 樣長。該券核脊酸之長度較佳為約1 9至約2 5個核苔酸。 該募核苷酸之長度更佳為小於約75個、約5〇個、約25個 核符酸。於實施例中，目標序列含有SEQ ID N0:8之CCDC4 的siRNA寡核苷酸可抑制癌細胞的生長。此外，為加強 siRNA的抑制活性，可將核苷酸“u，，加至目標序列的反義 股的3’端。加入的“ u”的數目至少約為2個，一般約為 _ 2至10 , ’較佳約為2至5個。加入的“ u”會再s i RNA 的反義股的3’端形成單股。 一 CCDC4的siRNA可以能夠與mRNA轉錄子結合的形式 直接送入細胞内。於該實施態樣中，本發明之siRNA分子 通常會以上述方式於反義股分子進行改造。也可實行其他 實施態樣’例如，結合膽固醇的s i RN A顯示可增進其藥理 性質（Song et al· Nature Med. 9:347-351 (2003))。另 外，也可將編碼CCDC4 siRNA的DNA置入一載體内。 • 載體之構築可藉由，例如，將CCDC4目標序列複製入 一表現載體，並且使CCDC4序列的旁側有一段調控序列， 可控制CCDC4兩股的表現（藉由DNA分子的轉錄）（Lee， N.S·，Dohjima，丁.，Bauer, G.，Li, Η.，Li，Μ. -J·， Ehsani，Α·，Salvaterra，Ρ·，and Rossi，J· (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20·· 500-505.)。CCDC4 mRNA 的反義 RNA 2125-6959-PF;Chiumeow 40 200540183 .刀子由第啟動子轉錄（例如，位於複製的DNA之3，端的 啟動子序列），另外一段CCDC4RNA的正義RNA分子則由第 二啟動子轉錄（例如，位於複製的驅之5，端的啟動子序 列)。該正義及反義股可於活體内進行雜交形成“謝以關 閉（S1lenclng)CCDC4基因。或者也可構築兩個載體已分別 製造siRNA的正義及反義股。複製的CC])C4可以編碼一含 有二次結構，如髮夾結構，的siRNA，其中該單一 轉錄子可同時擁有目標基因的正義及互補的反義序列。 • 此外，一含有一任意核苷酸序列的環狀序列可位於正 義及反義序列之間，以便形成髮夾環狀結構。因此，本發 明亦提供含有通用結構式5，_[A] 一 [B] 一 [A, ] —3，之 siRNA ’其中[A]為可與CCDC4基因的mRNA或cDNA專一性 雜交的核糖核苷酸序列。於一較佳實施態樣中，[A]為對應 至SEQ ID NO: 1或3的1 666-1 684核苔酸序列之核糖核脊 酸序列（SEQ ID N0:8)。 [B]為一含有約3至23個核苷酸之核糖核苷酸序列， ®以及 [A’ ]為一與序列[a ]互補的核糖核苷酸序列。該環狀 序列可包含任意序列，其較佳長度為3至23個核苷酸。舉 例而言’該環狀序列可選自包含下列序列之群組 (http://www.ambion.com/techlib/tb/tb一506.html) 〇 本 發明之siRNA可於[A，]的3’端加上核苷酸“u” ，以便 增加該siRNA的抑制活性，。加八的“沙”的數目至少約為2 個’一般約為2至10個，較佳約為2至5個。再者，含有 2125>6959-PF；chiuine〇w 41 200540183 23個核苷酸的環狀序列係可提供具有活性的 siRNACJacque, J.-Μ., Triques, Κ., and Stevenson, Μ. (2002) Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature 418: 435-438·)° CCC、CCACC 或 CCACACC : Jacque, J. Μ·，Triques，Κ·， and Stevenson, M. ''Modulation of HIV-1 replication by RNA interference. Nature, Vol. 418: 435-438 (2002)； UUCG: Lee，N.S·，Dohjima，T·，Bauer，G·，Li，H.，
Li, M. ~J. , Ehsani, A. , Salvaterra, P.，and Rossi, J. (2002) Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology 20: 500-505. ; Fruscoloni, P·，
Zamboni, M·， and Tocchini-Valentini， G. P_ “Exonucleolytic degradation of double-stranded RNA
by an activity in Xenopus laevis germinal vesicles.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(4): 1639-1644 (2003)； 以及 UUCAAGAGA · Dykxhoorn，D· M.，Novina，C_ D.，and Sharp, P. A. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expression. Nature Reviews Molecular
Cell Biology 4: 457-467 (2002)。 以下敘述本發明之一較佳之含有髮夾結構的si RNA之 實施例。於下列結構中，該環狀結構可以選自下列群組包 2125-6959-PF；Chiumeow 42 200540183 • 含：CCC、UUCG、CCACC、CCACACC 以及 UUCAAGAGA。較佳的 環狀結構為 UUCAAGAGA(於 DNA 為 “ttcaagaga”）。 gaugguucugcagcaccac-[B]-guggugcugcagaaccauc(SEQ ID NO : 8之目標序列）。 CCDC4序列旁側的調控序列可為相同或不同，因而其 表現可以被單獨調節，或以時間順序或空間順序調節。 siRNAs在細胞内的轉錄係藉由將CCDC4基因模板複製到一 _ 載體内，該載體含有，例如，一來自小核RNA(snRNA)U6或 人類HI RNA啟動子的R NA聚合酶III轉錄單元。為了將 該載體送入細胞，可使用轉染強化劑。 FuGENECRochedi agnost i ces) 、 Lipofectamine 2000 (Invi trogen) 、 01igofeetamine (Invi trogen) 及
Nucl eo fee tor (Wako pure Chemical)均可作為轉染強化劑。 設計siRNA的核普酸序列可利用 Ambion網頁上的 siRNA 設 計之電 腦程式 ® (http: "www·ambion·com/techlib/misc/siRNA一finder.h tml)。該電腦程式選擇siRNA的核苷酸序列係基於以下流 程： 選擇siRNA的目標位置： 1.自目標轉錄子的AUG起始密碼子開始向下游尋找AA 雙核苷酸序列。紀錄每個AA的發生，以及相鄰3’的19 個核苔酸為潛在的siRNA目標位置。Tuschl·, et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in 2125-6959-PF;Cliiumeow 43 200540183 vitro· Genes Dev 13(24): 3191-7 (1999) ， siRNA 的目 祆位置不建5義位於5及3’未轉譯區域（Utrs)以及接近起 始密碼子的區域（75個鹼基内），原因在於前述位置可能有 很多調節蛋白質結合位置。UTR結合蛋白及/或轉錄起始複 口物可邊會干擾si RNA内切核酸酶複合物的結合。 2·將潛在的目標位置與人類基因體資料庫作比對，刪 除任何與其他編碼序列有高度同源性的目標序列。同源性 的尋找可利用BLAST程式，其位於NCBI伺服器，其網址為： # WWW·ncbi·nlm·nih·gov/BLAST/ 3·選擇合乎要求的目標序列進行分析。可於Ambion上 選出數個該基因中較佳的目標序列進行評估。 寡核脊酸及與CCDC4 mRNA不同區域互補的寡核苷酸對 於減少腫瘤細胞（例如，使用！^3或DU145攝護腺癌細胞株） 中内CCDC4產生的能力，可根據標準方式於活體外進行測 试。利用CCDC4專一抗體或其他偵測方式，可用來偵測當 _與候選siRNA醫藥化合物接觸後，其CCDC4基因產物量較 未接觸的組別所減少的量。在活體外細胞分析或無細胞分 析實驗中，可以減少CCDC4產量的序列接著再測試其細胞 生長的抑制效應。於活體外細胞分析中，可抑制細胞生長 的序列再進一步利用大鼠或小鼠進行活體内試驗，以確認 其能夠於患有惡性腫瘤的動物體内減少CCDC4的產生及減 少腫瘤的生長。 本發明亦包括目標核酸'序列的雙股分子，該目標核酸
序列為，例如，SEQ ID NO: 1或3的核苷酸i 666-1 684(SEQ 2l25-6959-PF；Chiumeow 44 200540183 ID Ν0:8)。於本發明中，該雙股分子包含—正義股及反義 股，其中該正義股含有一段SEQ ID Ν〇 : 8的核糖核苷酸序 列，而該反義股含有一段與正義股互補的核糖核苷酸序 列。該正義股及反義股為互相雜交形成前述雙股分子，且 當將該雙股分子導入-表;見CCDC4 I因的細胞冑，可以抑 制該基因的表現。於本發a月巾’當獨立的核酸為鹽或其 衍生物，核苷酸序列中的“t”鹼基應以“u”鹼基取代。
於本文中，“互補”一詞係指一核酸分子中的核苷酸單元 之間的華生-克里克（watson-Crick)或霍氏（H〇〇gsteen)鹼 基配對。“結合”係指兩核酸或化合物或相關的核酸或化 合物或其組合物之間的物理或化學相互作用。 互補核酸序列可於適當的環境下進行雜交以形成穩定 的、不含或含少數錯誤配對的雙鏈體（duplexes)。再者， 本發明之獨立的核普酸，其正義及反義股可藉由雜交作用 形成雙股核脊酸或髮夾環狀結構。於一較佳實施態樣中， 該雙鏈體之十個配對中含有不多於一個的錯誤配對。於一 更佳實施態樣中’該雙鏈體為不含任何錯誤配對的完全互 補狀態。該核酸分子之長度為少於8763個核普酸（以SEQ ID N0:1而言）或8692個核苷酸（以SEQ ID N0:3而言）。例如， 該核酉文为子之長度係少於500、200或75個核苔酸。本發 明亦包括含有一或多個本發明之核酸的載體，以其含有該 載體的細胞。本發明之獨立核酸亦可作為對抗CCDC4的 s i RNA或者是編碼該s i RNA的DNA。當該核酸作為S4 ·Α或 編碼該siRNA的DNA時，該正義股較佳為長於約19個核苷 45 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 酸，更佳為長於約21個核*酸。 本發明之反義寡料酸或s觀 表現，因此可㈣抑制本發 财Η夕肽之 有本發明之反義寡核苷 、 活性。另外，含 抑制本發明多肽之生=71祖的表現抑制物也可用來 寡核㈣或爾的，一含有本發明之反義 “ 的醫樂組合物可用來治療攝護腺癌。可 於哺乳動物細胞中抑制圭 抑制表現的⑽C4 siRNA募核昏酸包
括’例如，含有SEQH)N0:8的目標序列。再者，為了增 強—s疆的抑制活性，目標序列的反義股的3，端可加上 核甘酸、”。加入的“U”數目至少約2個，一般為約2 個至約1〇個’較佳為、約2個至約5個。加入的“ u，，會於 si RNA反義股的3’端形成單股。 此外3有本發明之反義寡核脊酸或si RNA的表現抑 制物也可用來抑制本發明多肽之生物活性。因此，一含有 本發明之反義寡核苷酸或siRNA的醫藥組合物可用來治療 細胞增生疾病，例如攝護腺癌。 本發明進一步提供一可抑制本發明CCDC4多肽表現之 核糖酶。 一般而言，核糖酶可分為大核糖酶及小核糖酶。大核 糖酶為一用來切斷核酸的碟酯鍵（phosphate ester bond) 之酵素。大核糖酶反應過後，反應位置將含有一 5 ’磷酸 鹽及3’經基。大核糖酶又可進一步分類成（1)藉由鳥脊酸 (guanosine)催化 5 ’ 贫接位點、(sp4 ice〜分 (transesterification)作用之第一群内含子 46 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 (i ntron)R ΝΑ ; (2)藉由套索結構（lariat structure)雙步 驟催化自我剪接（self— Splicing)作用的第二群内含子
(intron)RNA; (3)核糖核酸酶 p(riboniiclease P)的 RNA 部位’其可藉由水解作用切除tRNA前驅物的5，位置。另 一方面’相較於大核糖酶，小核糖酶較小（約4 〇個鹼基配 對（bp))，且其可切rNA以形成5，羥基以及一 2，-3，環 磷酸鹽。錘頭型核糖酶（K〇izumi et al·，FEBS LErr 228: 225 (1 988))及髮夾型核糖酶（Buzayan，Nature 323: 349 _ (1 986) ; Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res 1 9: 6751 U 992))亦屬於小核糖酶。設計及構築核糖酶的方法為本技
術領域所習知（see Koizumi et al.，FEBS Lett 228: 2M (1988); Koizumi et al., Nucleic Acids Res 17: 7059 (1 989); Kikuchi and Sasaki, Nucleic Acids Res 1 9: 6751 (1 992))。因此，只要擁有序列訊息（SEQ D N〇: i或3)， 便可依據傳統方法製作出可抑制本發明多肽表現的核糖 酶。 對抗CCDC4基因的核糖酶可抑制CCDC4蛋白質的過度 表現，故可用於抑制該蛋白質的生物活性。也因此核糖酶 可用來治療或預防攝護腺癌。 診斷攝護腺癌 此外，本發明提供一診斷細胞增生疾病，如攝護腺癌， 之方法，為利用本發明之基因表現量作為診斷標記物。 該診斷方法之步驟包括：(a)翁測味發明GCDC4基因的 表現量，以及（b)表現量的提高代表與攝護腺癌有關。 2125-6959-PF；Chiumeow 47 200540183 生物樣本中CCDC4基因的表現量的測量，可藉由定量 CCDC4基因對應的mRNA或蛋白質。mRNA的定量方法為本技 術領域所習知。例如，CCDC4基因對應的mRNA量可利用北 方墨點法或RT—PCR而定出。由於SEQ ID N0:1或3已經提 供CCDC4基因的全長核苷酸序列，本技術領域人士可根據 該序列設計探針或引子以便定量CCDC4基因。
外，CCDC4基因的表現量可藉由分析該基因所編碼 之蛋白質/舌性或量來得知。一偵測Ccj)C4蛋白質量的方法 如下述。例如，免疫分析方法便可用來定量生物材料内的 蛋白質。只要取自攝護腺癌患者的生物材料内有目標基因 (JCCDC4基因）的表現，任何生物材料均可作為生物樣本， 、、、、】量内的蛋白質或其活性。舉例而言，攝護腺管上皮 細胞便可作為上述的生物樣本。不過，體液，如血液或尿 液，亦可進行分析。另一方面，根據欲分析的蛋白質(⑽C4 基因所編碼的蛋白質）之活性，可選擇適當的方法以進行分 析。 生物樣本中的CCDC4基因的表現量係拿來與—正常樣 本(例如’-取自無患病對象的樣本)作比較。當發現生物 樣本的目標基因表現量較正常樣本為高，該生物樣本的來 源對象被朗為患有攝護腺癌。正常對象及接受診斷對象 的生物樣本内的議基因表現量可同時進行分析。另 外’ -表現#的正常H圍也可根據事前取自控制組的樣本 樣本中的結果係與正常範圍作比較，當結果未落入正常範 2l25~6959-PF；Chiumeow 200540183 圍内時，該對象可能患有攝護腺癌或 風險。 腺癌的 本發明並提供-種診斷細胞增生疾病， 的診斷試劑。本發明之診斷試劑包含一可與本w 苷酸或多肽結合之化合物。該化合物較佳為— ；：：：： 之多核苷酸結合的多核苷酸，或是一 ’、x 合抗體。 了與本發明之多肽結
本發明之診斷攝護腺癌的方法可應用於評估_對象的 攝護腺癌的治療成效。根據該方法，係從_正接: 癌治療的對象身上取得一生物樣本， ' ^ 十 那 /則忒細胞群。該 評估方法可依據傳統診斷攝護腺癌的方法實行。 抽取該生物樣本的時間，可視需要於治療前、治療中 治療後等多個時間點抽取。遍物樣本中的咖、基因 表現量並與控制量，作比較。例如，崎護腺癌狀態為已 知（即，癌細胞或非癌細胞）的細胞作為參考細胞群。該控 制量需以未接受治療的生物樣本的基因表現量為準。二 若控制量係來自非癌細胞的生物樣本，則當取自測試 對象的生物樣本的量與控制量相近時，則表示該治療為有 效。若取自測試對象的生物樣本的量與控制量有差距時， 則表不該治療成果或預後（pr〇gn〇sis)較不理想。 有效一碉代表該治療可使一對象之病理上表現上 升的基因（CCDC4基因）的表現降低或其腫瘤尺寸、範圍或 增生潛力減小。當一治療為預防性的施用時，“有玫，，係 才曰u /π療減緩或防止攝護腺癌的發生。再者，一治療的有 2125-6959-PF；chiume〇w 49 200540183 效性可制任何已知的診斷或治療攝護腺癌的方法來決 定。 另外，本發明之診斷攝護腺癌的方法亦可用來評估一 患有攝護腺癌之對象之預後，係藉由將取自患者的生物樣 本，例如，測試細胞群，的霞4基因表現量與控制量作 比較。另一方面，可取得一患者之不同患病階段之生物樣 本’測量其CCDC4基因表現量以用來評估其預後。 〃相較於正常控制量，CCDC4基因表現量的增加表示預 後較不理想。CCDC4其κι本τ目旦 較為良好。4基因表現里的減少表示該患者的預後 篩選化合物 心基因、其編碼的蛋白質或該基因的轉錄調 =可用來師選可改變其基因表現或其編碼多肽活性之化 合物。該類化合物可作為治療或預防攝護腺癌的醫藥物。 因此，本發明亦提供一種利用本發明之多 療或預防攝護腺癌之化合物之方法。於本發明之-實施: 樣中，該筛選方法包括下列步 ^ 發明之多肽接觸養測本發明之多)= 結合活性；及⑹選擇可與本發明之多I 0物的 用於該㈣^之本發日〇財為^ 物。 蛋白f或其部分胜肽。用來與測試化合物接觸之本發；然 多狀可為，例如，-純化多狀、-可溶性蛋白質本::之 他多肽融合之载體或融合蛋白質形式。 η其 許多為本技街領域者之筛選蛋白質的方法，例 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 如’一與本發明之多肽結合之方法，均可被使用。該類篩 選方法可為，例如，下述之免疫沉澱法。將編碼本發明多 肚之基因插入一表現外來基因之表現載體，例如， pSV2neo、pcDNA I、pCDNA3·卜 pCAGGS 以及 pCD8，並使其 表現於宿主細胞（如，動物細胞）内。該用來控制表現的啟 動子可為任何啟動子，常用之啟動子包括，例如，SV40早 期啟動子（SV40 early promoter)(Rigby in Williamson (ed·)， Genetic Engineering， vol. 3. Academic Press， 籲 London，83-141 (1982))、EF-啟動子（Kim etal·，Gene 91: 217-23 ( 1 990))、CAG 啟動子（Niwa et al·，Gene 108: 1 93-200 (1 991 ))、RSV LTR 啟動子（Cullen，Methods in Enzymology 1 52: 684-704 (1 987))、SRa 啟動子（Takebeet al·，Mol Cell Biol 8: 466 (1 988))、CMV 即刻早期啟動 子（CMV immediate early promoter)(Seed and Aruffo， Proc Natl Acad Sci USA 84: 3365-9 (1987)) 、 SV40 晚 期啟動子（Gheysen and Fiers，J Mol Appl Genet 1 : 385-94 (1982))、腺病毒晚期啟動子（Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9: 946 (1 989))、HSV TK啟動子等等。將基因送入 宿主細胞以表現外來基因的方式可藉由任何方式，例如， 電穿孔法（Chu et al_，Nucleic Acids Res 15: 1311 - 26 (1 987))、磷酸鈣法（Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7: 2745-52 (1987))、DEAE 葡聚糖法（Lopataetal·，Nucleic Acids Res 12: 5707-1 7 ( 1 984); Sussman and Milman, Mol Cell Biol 4: 1642-3 (1985))、月旨質體法（Lipofectin 2125-6959-PF;Chiumeow 51 200540183 / method)(Derijard5 B Cell 7： 1 025-37 (1 994); Lamb et al. , Nature Genetics 5： 22-30 (1 993): Rabindran et al.,
Science 259: 230 - 4 (1 993))等等。本發明之多肽可以一 融合蛋白質之形式表現，其係導入一單株抗體之辨識位點 (抗原決定位（epitope))，該單株抗體對於本發明多肽之N 或C端具有專一性。可使用市面上販售之抗原決定位—抗體 系統（Experimental Medicine 1 3: 85-90 (1 995))。市面 上亦販售含有多重複製位點（muHiple clQning sites)、 ® 可表現含有冷半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、麩胱甘肽S 轉移酶（GST)、綠色螢光蛋白等融合蛋白質的載體。 亦有報導指出，一種藉由導入含有數個或一打胺基酸 之小型抗原決定位所形成的融合蛋白，可避免因為融合而 改變本發明多肽之特性。抗原決定位，例如，多組胺酸（Hi s 標籤）、流行性感冒凝集素（Inf luenza agglutinin，HA)、 人類c-myc片段、FLAG、水皰性口炎病毒糖蛋白片段 鲁（VSP-GP)、T7基因1〇蛋白質（tag標籤）、人類簡單疱疹病 母糖蛋白（HSV標籤）、E標籤（一單株噬菌體的抗原決定位） 等’以及可辨識上述抗原決定位之單株抗體可作為一抗原 決定位-抗體系統，以便用來篩選可與本發明之多肽結合之 蛋白質（Experimental Medicine 13: 85-90 ( 1 995))。 於免疫沉澱法中，當加入一抗體至利用適當清潔劑所 製備的細胞溶解產物時，會形成一免疫複合物。該免疫複 合物包含本發明之多肽、一具有與本發明多肽結合能力之 多肽，以及一抗體。除了使用對抗前述抗原決定位之抗體 2125-6959-PF;Chiumeow 52 200540183 之多肽之抗體，其 之外’免疫沉澱法亦可使用冑抗本發明 製備方式如上述。 免沒複。物可利用’如蛋白質A瓊脂糖凝膠 μ填脂㈣膠’以及使用小鼠lgG抗體，使其沉澱。若 本發明之夕肚為含有抗及法金 ，柷原决疋位，如GST，的融合多肽形 式，則可使用對抗本發明多I大 、 个兔乃夕肽之柷體或專一對抗該抗原決 定位之物質，例如’楚胱甘肽瓊脂糖凝膠
4B(glUtath1C)ne-SepharQse 4B)，使其形成免疫複合物。 免疫沉澱法可根據’例如，文獻上記載之方法（Mow and Lane, Antibodies, 511-52, Cold Spring Harbor
Laboratory publications’ New Y〇rk 〇988))來操作。 SDS-PAGE為常用來分析免疫沉澱蛋白之方法，且藉由 適當濃度的膠體，可以分析出該結合的蛋白質之分子量， 由於與本發明多肽結合之蛋白質不易藉由一般染色方法， 例如，考麻薩染色法（Coomassie staining)或銀染法，偵 測，該蛋白質的偵測靈敏度可藉由將細胞培養於含有放射 性同位素硫35-甲硫氨酸（35S-methionine)或硫35-半胱 氨酸（35S-cystein)的培養基中，如此該蛋白便會被標記並 可進行偵測。該目標蛋白質可以從SDS聚丙醯胺膠體直接 純化，並決定其序列及分子量。 篩選與本發明多肽結合之蛋白質之方法可使用，例 如’西方墨點分析（West-Western blotting analysis)(Skolnik et al·， Cell 65: 83-90 (1991))。 明確而言，由細胞、組織、器官（例如，睪丸或前列腺組織） 53 2125-6959-PF；Chiumeow •200540183 、 或培養的細胞（例如，PC3、DU145)取得一 cDNA資料庫，該 cDNA資料庫含有可與本發明多肽結合之蛋白質。利用一噬 菌體載體（例如，ZAP)表現該可與本發明多肽結合之蛋白 質，將該蛋白質表現於LB洋菜膠，將該表現於濾膜上的蛋 白質固定，將純化並標記的本發明多肽與該濾膜反應，之 後根據標記便可偵測該蛋白質與本發明多肽結合所形成的 班塊（plaques)。本發明之多肽可標記以生物素（bi〇tin) 及印白素（avidin)之間的鍵結，或是標記以可與本發明多 籲肽、或與本發明多肽融合的胜肽或多肽（如，GST)，產生專 一性結合的抗體。本發明亦可使用放射線同位素或螢光等 方法。 另外，於本發明篩選方法的另一實施態樣中，亦可使 用雙雜合系統（two-hybrid system) ，（ “ MATCHMAKER Two-Hybrid system ， “Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit M , “MATCHMAKER one-Hybr i d _ system (Clontech); HybriZAP Two-Hybrid Vector System (Stratagene); the references “Dalton and
Treisman， Cell 68: 597-612 (1992)” ， “Fields and Sternglanz， Trends Genet 10: 286-92 (1994)” ）。 於雙雜合系統中，本發明之多肽與SRF結合區或GAL4 結合區結合，並表現於酵母細胞。從一推測有表現可與本 發明多肽結合的細胞中製備出cDNA資料庫，並將該資料庫 與VP16或GAL4轉錄活化區域結合。將該CDNA資料庫送入 前述酵母細胞中，並從偵測到的陽性克隆（positive 2125-6959-PF;Chiumeow 54 200540183 clones)中分離自資料庫中衍生出來的cDNA(當一蛋白質與 本發明之多肽結合後會表現於酵母細胞中，該結合將活化 一報導基因，產生可偵測的陽性克隆）。該cDNA所編碼的 蛋白可以藉由將該cDNA獨立至大腸桿菌中並使其表現。 報導基因，除了 HI S3基因外，尚可使用例如，Ade2 基因、lacZ基因、CAT基因、冷光基因等。 亦可使用親和性層析法筛選與本發明多肽結合之化合 物。例如，可以將本發明之多肽固定於一親和性管柱的載 體上，並加入一含有能與本發明多肽結合之蛋白質之測試 化合物至管柱内。該測試化合物可為，例如，細胞萃取物、 、、田胞心解產物等。當加入測試化合物後，清洗該管柱，並 可製備該與本發明多肽結合之化合物。 當該測試化合物為一蛋白質，可分析其胺基酸序列， 可根據該得到的胺基酸序列合成一募DNA，並用該寡
作為-探針於識資料庫内進行篩選，以得到編碼該蛋白 質之DNA。 使用表面電漿共振現象的生物感測器可用來作為偵 測或定量本發明之結合化合物的工具。藉由該生物感測 斋’只需少量的多肽’在不需標記的情況下，便可以即時 觀察本發明之多肽與測試化合物之間的作用所發出的表面 電漿共振訊號（例如，BIAcore，Pharmacia)。因此，利用 例如BIAcore等生物感測器，便可能評估本發明之多狀與 測試化合物之間的結合。 、^ Μ將固著好之本發明多肽暴露於含有合成的化合物 2l25-6959-PF；chiumeow 200540183 或天然物質資料庫或一隨機噬菌體胜肽展示資料庫之環境 下，則可利用本技術領域習知的結合化學技術進行高通量 (high-throughput)篩選方式（Wrighton et al·，Sc i ence 273: 458-64 ( 1 996); Verdine，Nature 384: 1 1-13 ( 1 996); Hogan，Nature 384: 1 7-9 ( 1 996))筛選與本發明多肽結合 的分子，以便分離出與本發明之蛋白質結合之蛋白質和化 學化合物（包含促進物及拮抗物）。
本發明另提供一利用本發明多肽篩選可治療或預防攝 護腺癌之化合物之方法，包括下列步驟： (a) 將測試化合物與本發明之多肽接觸，· (b) 偵測步驟（a)之多肽的生物活性；以及 (C)與未接觸測試化合物之本發明多肽之生物活性相 比較，選擇可抑制本發明多肽之生物活性的化合物。 :本發月之CCD(:4蛋白質具有促進攝護腺癌細胞增 能力之活性’因此一可抑制本發明蛋白質活性之化合物 便可利用該特質進行篩選。 任何含有CCDC4蛋白暫4k 餘、要兮‘ 質生物活性之多肽均可用來進行 綠選。該生物活性包括人類cCDC4 i二 仃 性0例如 蛋白質之細胞增生活 f例如，可以使用一人類CCDC4 該蛋白皙X*处如I哲 白質，亦可使用一與 〆蛋白質功旎相等之胜肽。該類 表現。 、了為細胞内源或外源 。同樣地， 利用該篩選方法所分離 促進劑或拮抗劑之候選物。 肽結合並活化其功能之分子 出來的化合物為本發明多肽之 促進劑”為可與本發明之多 拮抗劑”為可與 2l25-6959-PP;chiume〇w 200540183 本發明之多肽結合並抑制其功能之分子。再者，利用該篩 選方法所分離出來的化合物可作為抑制本發明之多肽與分 子（包括DM及蛋白質）之活體内交互作用之候選物。 當本發明之方法欲偵測的活性為細胞增生時，可以利 用下列步驟偵測，例如如同實施例中所述，製備表現本發 明多肽之細胞，將該細胞與測試化合物共同培養，測定細 胞增生的速度、量測細胞週期，以及量測菌落形成活性等 等。 I 於另一實施態樣中，本發明提供一篩選可用來治療或 預防攝護腺癌化合物之方法。如前面所述，藉由控制CCDC4 的表現量，即可控制攝護腺癌的開始及進展。因此，可藉 由CCDC4的表現量作為指標，篩選出可能用於治療或預防 攝護腺癌之化合物。於本文中，該篩選方法可包括，例如， 下列步驟： (a)將測試化合物與表現CCDC4之細胞接觸；以及 • (b)與未接觸測試化合物相比較，選擇可抑制ccdc4表 現量的化合物。 可表現至少一種CCDC4之細胞包括，例如，由攝護腺 癌所建立之細胞株；該類細胞可用於前述本發明之掃描方 法（例如，PC3、DU145)。其表現量之測量可利用本技術領 域所習知之方法。於掃描方法中，一可抑制CCDC4表現量 的化合物可作為治療或預防攝護腺癌的候選藥劑。 本發明之另一篩選方法可包括下列步驟： (a)將測試化合物與一細胞接觸，其中該細胞係導入一 2125-6959-PF；chiumeow 200540183 載體，該载體含有一或多個 # 個榦纪基因的轉錄調節區域及一 1該轉錄調節區域調節之報導基因，其㈣ 吾己基因為CCDC4基因； 尺夕1U釦 (b)測量該報導基因之表現量；以及 =與控制組相比較，選擇可抑制該報導基因 或活性的化合物。 里 合適的報導基因及宿主細胞為本技術領域所習知 用來筛選的報導構築物（rep〇rter c嶋加“）可以内含—〆 2基因的轉錄調節區域。若一標記基因之轉錄調節區域 遙播^術邊域所習知’利用已知的序列資料便可製備—報 導構病物。若;_其土± ^ Ό ^ 轉錄調節區域未定出，則可根攄 該標記基因之轉錄調節區域序列資料，由基因資料庫卜據 離出一含有轉錄調節區域的核普酸片段。 " 夕可用來作為結合蛋白質的支撐物包括’例如，可溶性 :糖，如瓊脂糖、纖維素及葡聚糖，以及合成樹脂，例如 聚丙醯胺、聚苯乙烯及石夕，較佳為市面上販售的由前述材 料製成的珠粒（beads)及平盤（例如，多孔盤，生物感測晶 片等）。當使用珠粒時，可將其填充至管柱。 可根據一常用方法將蛋白質結合至一支撐物，該方法 例如’化學結合或物理結合。也可藉由專一辨識該蛋白質 抗體將蛋白質結合至一支撐物。此外，亦可藉由印白素 及生物素將蛋白質結合至一支撐物。 蛋白質之間的結合可於任何不抑制蛋白質結合的緩衝 液中進仃，例如，但不限於磷酸鹽緩衝液及緩衝液。 2125-6959-PF；chiume〇w 58 200540183 « !Τ 於本發明中，一使用表面電漿共振現象的生物感測器 可用來偵測或定量結合的蛋白質。藉由該生物感測器，只 需少量的多肽，在不需標記的情況下，便可以即時觀察蛋 白質之間的作用所發出的表面電漿共振訊號（例如， BIAcore， Pharmacia)。 此外’也可標記CCDC4多肽，然後藉此以便偵測或量 測結合的蛋白質。明確而言，於事先標記一蛋白質後，將 該標記之蛋白質與其他蛋白質在測試化合物存在的情況下 _ 進行接觸，之後進行清洗，並藉由標記偵測或測量標記物 的量以便了解蛋白質的結合狀況。 標記物質，如放射性同位素（例如，氚（3H)、碳 14(140、磷 32(32P)、磷 33(33P)、硫 35(35S)、碘 1 25(1 251 )、碘131(1311)、酵素（例如，鹼性磷酸酶、辣 根過氧化酶（horseradish peroxidase)、yS半乳糖普酶、 糖苷酶- glUC0sidase))、螢光物質（例如，flu〇rescein 籲 iS〇thi〇Syanete (FITC)、羅丹明（rh〇damine))以及生物素 /卵白素均可用來標記本發明方法之蛋白質。當蛋白質以放 射性同位素標記時，可利用液體閃爍方式（iiquid scintillation)偵測或測量。或者，以酵素標記的蛋白質 可藉由加入該酵素的受質，並利用光吸收測定儀 (abS〇rptiometerhg測該受質受到該酵素的改變，例如， 產生顏色，以偵測或測量。此外，若以螢光物質作 則可利用螢光測定儀偵測或測量結合的蛋白質。# ， 若於本發明之筛選方法中使用抗體，該抗體較佳為標 2125-6959-PF;Chiumeow 59 200540183 •記至少一種前述標記物質，並偵測或測量該標記物質。或 者’也可利用對抗CCDC4多肽的抗體或肌動蛋白作為第一 抗體’再用標記有標記物質的第二抗體去作偵測。再者， 本發明之篩選方法中，與蛋白質結合的抗體可以利用蛋白 質G或蛋白質A進行偵測或測量。 此外’於本發明篩選方法之另一實施態樣中，可於一 使用細胞的雙雜合系統中操作（“ MATCHMAKER TW0 —Hybrid system” ， "Mammalian MATCHMAKER Two-Hybrid Assay _ Kit ， MATCHMAKER one-Hybrid system” (Clontech); HybriZAP Two-Hybrid Vector System” (Stratagene); the references Dalton and Trei sman， Cell 68: 597-612 (1992)” ， “Fields and Sternglanz， Trends
Genet 10: 286-92 (1994)” ）。 於雙雜合系統中，本發明之CCDC4多肽與SRF結合區 域或GAL4結合區域融合，並表現於酵母細胞。 φ 報導基因，除了 HIS3基因之外，還可以使用，例如，
Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、冷光基因等。 任何測試化合物，例如，細胞萃取物、細胞培養液的 上清液、發酵有機體之產物、海洋有機體（marine 〇rganism) 之萃取物、植物萃取物、純化或未加工的蛋白質、多肽、 胜肽、非胜肽化合物、合成微分子化合物及天然化合物等 均可用於本發明之篩選方法。亦可用本技術領域所習知的 組合資料庫方法（combinat〇rial library meth〇ds)中多種 方式的任一種取得本發明之測試化合物，該組合資料庫方 2125-6959-PF；Chiumeow 60 200540183 法包括⑴生物資料庫，⑵空間定址並行固相或溶液相資 料庫，（3)需要解迴旋（dec〇nv〇luti〇n)之合成資料庫方 法，（4) 一珠粒一化合物（one-bead one-compound)，，資 料庫方法，以及（5)使用親和性層析法選擇之合成資料庫方 法。使用親和性層析法選擇之生物資料庫方法僅限於胜肽 資料庫，然而其他四種方法可應用於胜肽、非胜肽寡合物 或小分子化合物資料庫（Lam (1 997) Anti cancer Drug Des. 12 : 145 )。合成分子資料庫之方法，例如下述參考資料： DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 6909; Erb et al. (1 994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1 1422; Zuckermann et al. (1 994) J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al· (1 994) J. Med. Chem· 37: 1233)。化合 物資料庫可呈現於溶液（參見 Houghten ( 1 992) Bio/Techniques 13: 412)，或呈現於珠粒（Lam (1991) Nature 354: 82)、晶片（Fodor (1 993) Nature 364: 555)、 細菌（美國專利第5, 223, 409號）、孔洞（美國專利第 5, 571，698 號、第 5, 403, 484 號，以及第 5, 223, 409 號）、 質體（Cull etal. (1992) Proc· Natl. Acad· Sci. USA 89: 1865)或嗤菌體（Scott and Smith (1990) Science 249: 386; Delvin ( 1 990) Science 249: 404; Cwirla et al. ( 1 990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378; Felici (1991) J. 212 5-6 95 9-PF;Chiumeow 61 200540183
Mol· Biol· 222·· 301 · μ 尉奎 ^ 士 — ’、国專利申請第20021 03360號）。 藉由本發明之篩選方法八 斤刀離出的化合物可作為抑制 本發明胜肽活性、治療或預防沾l姐 利 ’、- 方的如攝濩腺癌等之細胞增生 疾病的藥物候選物。本發明 r乃之師選方法所得到的化合物， 亦包括將其進一步增力π、、決n / ，一 》日加刪減及/或取代等改造後所形成的 化合物。 用於治療或預防攝護腺癌之醫藥組合物 本發明亦提供一種用於、、Λ、忠斗、 於化療或預防攝護腺癌之醫藥組 合物’其包含任何自本發明之餘 師選方法中選出的化合物。 將分離自本發明篩選方法/ 9定万凌之化合物以一醫藥組合物之 形式，施用於人類或其他哺聋丨逢 人/、他兩礼類動物，例如，小鼠、大鼠、 天^鼠、兔子、猶、狗、羊、隸 土 平豬、牛、猴、狒狒、黑猩猩， 以便治療細胞增生性疾病（如，攝 僻邊脲癌），該分離的化合 物可以直接施用或可利用習知蘊从制 用為知樂物製備方法製成一劑型。 舉例而言，該藥物可根據需要製成口服劑型，例如，糖衣 鍵、膠囊、酿劑（elixir)以及微膠囊；或製成滅菌注射溶 液或水懸浮液，或任何其他醫藥可接受液體等非口服劑 型。舉例而言’該化合物可和醫藥可接受之載劑或媒介混 合，明確而言，該載劑或媒介可為滅菌水、生理食鹽水、 植物油、乳化劑、懸浮劑、界面活性劑、穩定劑、調·ς劑、 賦形劑（excipients)、承載劑（vehicles)、保存劑、结合 劑等等，製成-般可接受的藥物施用形式所需的單：二 型。該類劑型内含的活性成分量為處方範圍内的適當劑量。 可混合於錠劑及膠囊的添加物包括，例如·处里 •、、、ti 合物， 2125-6959-PF;Chiumeow 62 200540183 士明膠、玉米殿粉、黃蓍膠（tragacanth gum)及阿拉伯膠； 賦形劑’如結晶纖維素（crystalline ceilui〇se);膨脹 劑’如玉米殿粉、明膠及海藻酸（alginic acid);潤滑劑， 如鎮月曰酸鹽（magnesium stearate);甘味劑，如葡萄糖、 礼糖或糖精（saccharin);及調味劑，如薄荷、Gaultheria adenothrix 〇ii及櫻桃。當單一劑型為膠囊，一液狀載體， 如油，可以進一步包含於上述成分中。注射用之滅菌成分 之製備可依照正常藥物施用形式，例如，使用滅菌水等適 _ 合注射的载劑。 生理食鹽水、葡萄糖及其他含有輔劑（adjuvants)之等 張溶液，如，D-山梨糖醇、D—甘露糖、D—甘露醇以及氯化 鈉可做為注射用的水溶液。前述溶液可與合適的溶解劑 a如/酉精，例如，乙醇；聚醇，例如，丙二醇與聚乙 二醇；以及非離子性界面活性劑，例如，聚山梨醇酯 8〇(Polysorbate 80)(TM)以及 HCO-50。 _ 芝麻油或大豆油可以作為油性溶液，其可與苯甲酸苄 酯（benzyl benzoate)或苯甲醇（benzyl alc〇h〇i)等溶解劑 合併使用，並且可與下列溶液共同製備：一緩衝液，如磷 酸緩衝液及醋酸納緩衝液；一止痛劑，如鹽酸普魯卡因 (procaine hydr〇chl〇ride); —穩定劑，如苯甲醇及苯酚； 及/或一抗氧化劑。一製備好的注射液可以裝入一合適的安 甑（ampoule)。 本發明之醫藥組合物施用至患者的方法可使用本技術 領域之習知方法，例如，動脈、靜脈或腹腔注射，或是經 2125-6959-PF；Chiumeow 63 200540183 由鼻cr卩支氣$、肌肉或口服施用。施用劑量以及方法可 能根據患者的體重、年紀及施用方式而有所改變，然而， 熟習本技術領域者可以依照慣例選擇一合適的施用方式。 若前述化合物係由DNA所編碼，則該DNA可以插入一用於 基因療法的載體’然後將該載體施用於患者以實施該療 法。施用劑量以及方法可能根據患者的體重、年紀及症狀 而有所改變，然而，熟習本技術領域者可以選擇一合適的 施用方式。 I 舉例而言，雖然一化合物與本發明蛋白質的結合量以 及調節該蛋白質活性的程度與症狀相關，但正常成人（體重 60公斤）的口服用量一般為每日約〇·丨毫克至約1〇〇毫克， 較佳為每日約1·〇毫克至約5〇毫克，更佳為每日約1〇毫 克至約20毫克。 雖然施用對象、目標器官、症狀及施用方式有些微差 異，當腸道外注射施用該化合物至一正常成人（體重6〇公 _斤）時，較方便之方式為每曰靜脈注射量約〇〇1毫克至約 30毫克，較佳為每曰約〇·丨毫克至約2〇毫克，更佳為每 曰約0.1毫克至約1〇毫克。如施用對象為其他動物，其適 用量亦可參考體重六十公斤的施用量作換算。 此外’本發明提供一種治療或預防攝護腺癌的醫藥組 合物，其包含可抑制CCDC4基因表現的活性成分，該活性 成分包含可對抗CCDC4基因之反義多核苷酸、siRNA或核 糖酶，或其衍生物，例如反義多核苷酸、siRNA或核糖酶 的表現載體。 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 本發明之活性成分可與一合適且不會與其衍生物作用 的基底材料(basematerial)製成一外用製劑，例如—擦劑 (lini嶋t)或藥糊（pQultiee)。另外，亦可視需要加二賦 形劑、等張試劑、料劑、穩定劑、保存劑、止痛劑等， -起製成錠劑、粉末、顆粒、膠囊、微脂粒膠囊、注射液、 溶液、滴鼻劑（nc)se_drQps)以及冷;東乾燥劑。此類物品均 可依照傳統方法製備。
.本發明之活性成分可直接施用於患者之患部（ai} ing site)或注射至血管使其到達患部…承載媒介（_叫 ―)’例如’但不限於’微脂粒、聚_卜離氨酸、脂類、 膽固醇、脂質體UiP〇fectin)或前述物質之衍生物，亦可 用來增加其耐久性及膜滲透性。 該醫藥組合物的劑量可根據患者狀況而調整並使用所 需的量。例如，施用劑量可介於〇. J至1〇〇毫克/公斤之間， 較佳為0· 1至50毫克/公斤之間。 _ —纟發明之另一實施態樣為一治療或預防攝護腺癌的醫 藥、、且口物，其包含一抗體，該抗體可對抗⑽以基因所編 碼之多肽，其亦包含該抗體之片段，其中該片段可與該多 肚結合。 θ雖然施用該抗體或其片段以治療或預防攝護腺癌之劑 量隨症狀不同而有所改變，但正常成人（體重6〇公斤）的口 服用量-般為每曰、約0.4克至約1〇〇毫克，較佳為每曰 約U毫克至約50毫克，更佳為每曰約1〇毫克至約2〇 毫克。 2125-6959-pp；chiume〇w 65 200540183 雖然根據施用對象的情況、疾病症狀及施用方式而有 些微差異，當腸道外注射施用該化合物至一正常成人（體重 60公斤）時，較方便之方式為每曰靜脈注射約〇 〇1毫克至 約30毫克，較佳為每曰約〇·丨毫克至約2〇毫克，更佳為 每曰約〇·1毫克至約10毫克。如施用對象為其他動物，其 適用量亦可參考體重六十公斤的施用量作換算。 治療或預防攝護腺癌之方法 本發明提供一種針對一對象治療或預防攝護腺癌之方 法，係預防性的或治療性的施用治療化合物至患有前列腺 癌或是具有罹患前列腺癌風險（或容易罹患前列腺癌）之對 象。該類對象可以利用標準臨床方式或藉由偵測CCDC4的 表現量或活性異常，便可以辨識出。預防性的施用係發生 於明顯的疾病臨床症狀發生之前，以便預防一疾病或病 變，或是延緩其進展。 該治療方法包含降低CCDC4基因的表現或功能。於該 方法中，一對象被施以一有效量之化合物，以減少該對象 體内過度表現基因（CCDC4基因）之表現量。施用方式可以 為系統性或局部性。治療性化合物包括可降低攝護腺癌細 胞中該内源基因之表現（即，可下調該過度表現基因之化合 物）。施用該治療性化合物可以拮抗對象細胞内異常過度表 現之基因，並能預期該對象的臨床狀況可獲得改善。該類 化合物可藉由前述本發明之筛選方法得到。 抑制CCDC4基因表現的方式可使用數種習知方式中的 任何種’包括可對該對象施用一種核酸以抑制或拮抗基 2125-6959-PF;Chiume〇w 66 200540183 因（群）表現。亦可使用反義寡核苷酸、si RNA或核糖酶以 便抑制過該基因（群）之表現。 如前所述，對應至CCDC4基因核苷酸序列的反義募核 脊酸可用於抑制CCDC4基因的表現量。明確而言，本發明 之反義募核苷酸可與CCDC4基因所編碼之任何多肚或其 mRNA結合，因此可抑制基因的轉錄或轉譯作用，促進⑽驗 的降解，及/或抑制該基因所編碼的蛋白表現，最終抑制 CCDC4蛋白質的功能。 一反義寡核苷酸及其衍生物可與一合適且不會與其衍 生物作用的基底材料混合以製成一外用製劑，例如一擦劑 或藥糊，並用於本發明之治療或預防攝護腺癌之方法。 抑制一或多種過度表現基因之產物之核酸，亦包括一 小型干擾性RNA，其包含CCDC4基因核苷酸序列之正義股 核酸及反義股核酸之結合。於本發明之治療或預防方法 中，可使用標準技術將siRNA送入細胞，亦可送入DNA分 子做為模板再轉錄成RNA之方式。一個siRNA係被構築成 含有目標基因之正義及互補的反義序列，例如，一髮夾結 構。 、口 該方法為用來抑制細胞内表現上調的CCDC4基因之表 現。於目標細胞中，siRNA與CCDC4基因轉錄子結合，導 致該細胞的CCDC4蛋白質產量減少。 抑制一或多種過度表現基因之產物之核酸，亦包括一 可對抗過度表現基因（CCDC4基因）之核糖酶。 此外，本發明提供-種治療或預防細胞增生疾病，如 2125-6959-PF；Chiumeow 67 200540183 攝護腺癌，之方法’包含施用一對抗本發明多肽之抗體。 該方法為施用一對抗本發明多肽之醫藥有 ^ ^ ”双里之抗體。由 於攝護腺癌細胞内的CCDC4蛋白質表現為上_ 工碼，減低該蛋 類白質的表現便能導致細胞增生活性降低， 因此，利用抗 體，、該類蛋白質結合便能預期該細胞增生疾病可以被户療 或預防。-可對抗本發明多肽之抗體係以足夠抑制轉明 蛋白質活性之劑量施用，其每日施用劑量介於約〇 ι至約 250毫克/公斤。成人的每日施用量一般為約5毫克至約 Π.5克，較佳為每日約5毫克至約1〇克，最佳為每日約 100毫克至約3克。 另外，可專一結合至腫瘤細胞表面標記分子的抗體也 可作為藥物輸送工具。舉例而言，施用一足夠量之抗體， 該抗體與毒性藥劑結合以便破壞腫瘤細胞。 本發明亦關於一種誘發抗腫瘤免疫性之方法，包含施 用CCDC4蛋白質、其免疫活性片段或一段編碼該蛋白質或 鲁其片段之多核苷酸之步驟。CCDC4蛋白質或其免疫活性片 段可作為對抗細胞增生疾病，如攝護腺癌，之疫苗。於某 些情況下’該蛋白質或其片段，可以與T細胞受體（T ce 11 receptor ’ TCR)結合的形式，或呈現於抗原表現細胞 (APC) ’如，巨嗟細胞、樹突細胞（dendritic cell，DC〇 或B細胞’之形式施用。其中樹突細胞具有強大的抗原表 現3b力’為抗原表現細胞中的最佳選擇。 於本發明中，抗細胞增生疾病疫苗係指一物質，當將 其接種至動物體内，具有誘發抗前腫瘤免疫性之功能。一 2125-6959-PF；Chiumeow 68 200540183 •般而言’抗腫瘤之免疫性包括下列免疫反應： -誘發抗腫瘤之毒性淋巴球（cytotoxic lymphocytes) j -誘發辨識腫瘤之抗體，以及 -誘發抗腫瘤之細胞激素的產生。 因此’將某一蛋白接種至動物體内，若可誘發上述任 何一種免疫反應，該蛋白可被視為具有誘發抗腫瘤免疫性 之效果。該蛋白誘發宿主免疫系統抗腫瘤免疫性之能力， # 可於活體内或活體外作觀察。 例如’一偵測毒性T細胞淋巴球之誘發之方法係為習 知。一進入活體内的外來物質，可藉由抗原表現細胞的作 用而呈現給T細胞與B細胞。針對抗原表現細胞所呈現之 抗原’ T細胞由於抗原刺激，會以抗原專一性的形式分化 成毒性T細胞（或毒性τ淋巴球，CTLs)並增生（稱為T細胞 /舌化）。因此’為評估毒性T淋巴球被某胜肽誘發之反應， ❿可將一胜肽藉由抗原表現細胞呈現給τ細胞，以及偵測毒 性T淋巴球的誘發情形。再者，抗原表現細胞可以活化CD4 + T細胞、CD8+ T細胞、巨噬細胞、嗜酸性白血球（e〇sin〇phi ls) 以及NK細胞。由於CD4+ T細胞及CD8+ T細胞對於抗腫瘤 免疫性亦很重要，因此其活化可作為胜肽誘發抗腫瘤免疫 性之指標。 一利用樹突細胞（DCs)作為抗原表現細胞，評估毒性τ 淋巴球誘發之方法為本技術領域所熟知。樹突細胞為抗原 細胞中，具有最強大的毒性T淋巴球誘發能力，因此為最 2125-6959-PF?Chiumeow 69 200540183 具代表性的抗原表現細胞。於該方法中，首先將一測試多 肽與樹突細胞接觸，再將樹突細胞與T細胞接觸，然後偵 測T細胞於接觸樹突細胞後，對目標細胞產生的細胞毒性 效應，便可得知該測試多肽具有激發毒性τ細胞之活性。 亦可偵測毒性T淋巴球抗腫瘤之活性，例如，使用鉻5丨（5iCr) 所標示的腫瘤細胞的裂解（1 yS i S )做為指標。另外，氚一胸 腺’咬核苷（3H-thymidine)的攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶 (lactose dehydrogenase))的釋放亦為習知的指標。 鲁除了 DC之外，周邊血液單核細胞（peripheral bl〇〇d m〇n〇nuclearceii，PBMC)也可作為抗原表現細胞。有報告 才曰出，將，周邊血液單核細胞培養於含有及IL-4 的環境中，可增強毒性T淋巴球的誘發現象。同樣地，將 周邊血液單核細胞培養於含有鑰孔蟲戚血藍蛋白（keyh〇ie limpet hemocyanin，KLH)及IL-7的環境中，亦可誘發毒 性T淋巴球。 φ 藉由該方法證實具有毒性τ淋巴球誘發能力之多肽， 係被認為具有樹突細胞活化效果，以及毒性τ淋巴球的誘 發活性。因此，可誘發抗腫瘤細胞的毒性τ淋巴球之多肽， 便能作為抗腫瘤疫苗。再者，可藉由與多肽接觸而誘發抗 腫瘤母性Τ淋巴球之抗原表現細胞，亦可作為抗腫瘤疫 苗。另外，因與抗原表現細胞表現之多肽抗原接觸而產生 細胞毒性的毒性Τ淋巴球，亦可作為抗腫瘤疫苗。該類腫 瘤治療方法由於利用抗原表現細胞及毒性τ淋巴球的抗腫 瘤免疫性，因此又稱為細胞免疫療法（ceiiuiar 2125-6959-PF；chiumeow 70 200540183 • immunotherapy) ° 一般而s ’當使用多肽進行免疫療法時，為增進毒性 T淋巴球之誘發效率，可合併使用複數種不同結構的多肽 與樹突細胞結合。因此，當使用蛋白質片段刺激樹突細胞 時’使用多種形式的片段混合物會較為有利。 或者’為破認多肽誘發抗腫瘤免疫性之能力，可觀察 抗腫瘤抗體的生成量。例如，將該多肽施用至實驗動物使 其產生抗體，並且腫瘤細胞的生長被該類抗體所抑制，則 ❿該多肽被認為具有誘發抗腫瘤免疫性之能力。 施用本發明之疫苗可誘發抗腫瘤免疫性，並且可治療 與預防細胞增生疾病，如攝護腺癌。抗癌症之治療及預防 療法包含下列任一步驟：例如，抑制癌細胞的生長，使癌 細胞衰退（involution of cancer)以及抑制其發生。癌症 個體之死亡率下降，血液中腫瘤標記物之減少，癌症症狀 之舒緩等，均包括於癌症治療及預防之範圍内。該治療及 _預防效果較佳係具有統計意義，例如，當比較有無施用疫 苗對於細胞增生疾病之治療或預防效果，其顯著性 (significance leve〇係小於或等於5%。又例如，
Student， s t-test、 the Mann-Whitney U-test 或 AN0VA 均可用於統計分析。 前述具免疫活性之蛋白質或一編碼該蛋白質之載體可 和一輔劑合併使用。輔劑係指當與具免疫活性之蛋白質一 起（或相繼）使用時，可增強對抗該蛋白質的免疫反應。'辅 劑包括，例如，但不限於，霍亂毒素（cholera t〇xin)、沙 2125-e959-PF;Chiumeow 71 200540183 門毒素（salmonella toxin)、明礬（aium)等。另外，本發 明之疫苗亦可結合合適的醫藥可接受之載體，該類載體包 括，滅菌水、生理食鹽水、磷酸鹽緩衝液、培養基等。再 者’該疫苗可視需要包含穩定劑、懸浮液、保存劑、界面 活性劑等。該疫苗可以系統性或局部性施用。該疫苗之施 用可為單次施用，或是複數次施用以增進其功效。 當使用一抗原表現細胞或毒性T淋巴球作為本發明之 疫苗，可以藉由，例如，離體（ex viv〇)方式，來治療或預 防腫瘤更明確而言，收集欲接受治療或預防療法的對象 的周邊血液單核細胞，將該細胞與多肽接觸。在抗原表現 細胞或毒性T淋巴球被誘發後，再將細胞送回該對象。亦 可藉由將一編碼多肽之載體送入離體的周邊血液單核細 胞’以誘發抗原表現細㈣毒性U巴球。活體外誘發的 抗原表現細胞或毒性T淋巴球可以於使用前進行複製 (clone)。藉由複製及培養對目標細胞具有高度破壞力的細 胞’可以更有效地實行細胞免疫療法。再者，_用此方法 所分離出的抗原表現細胞及#性τ淋巴球，不但可用於細 胞提供者，亦可用於患有同類型腫瘤之其他對象，以便進 行細胞免疫療法。 另外，本發明並提供一種可用於治療或預防-細胞辦 生疾病，如攝護腺癌，之醫藥組合物，包含一醫藥有效量 之CCDC4多肽。該醫藥組合物可用於提高抗腫瘤免疫性。 CCDC4的正常表現僅㈣睪丸及攝護腺，因此抑制該基因 並不會對其他器官產生副作用。因此，ccdc"肽較佳可 72 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 參 ' 用來治療細胞增生疾病，尤其是攝護腺癌。另外，由於專 一表現於癌細胞的蛋白質的胜肽片段可用來誘發抗癌的免 疫反應，因此CCDC4的胜肽片段可作為治療或預防細胞增 生疾病，如攝護腺癌，的醫藥組合物。於本發明中，一多 肽或其片段之施用劑量係足夠誘發抗腫瘤免疫性，其施用 劑夏介於0· 1至1〇毫克，較佳為〇· 3毫克至5毫克，更佳 為〇· 8毫克至1 · 5毫克。該施用方式為重複施用，例如，j 毫克的胜肽或其片段可以每兩週施用四次以誘發抗腫瘤免 Φ 疫性。 此外，編碼CCDC4的多核苷酸或其片段可用來提高抗 腫瘤免疫性。該多核脊酸可以導入一表現載體以表現cCI)C4 或其片段，送入一對象内以進行治療。因此，本發明包含 一誘發抗腫瘤免疫性之方法，其中一編碼CCDC4或其片段 的多核苷酸係被施用至一罹患細胞增生疾病或具有罹患該 疾病風險之對象，該細胞增生疾病為，例如攝護腺癌。 _ 以下的實施例係用來說明本發明，並幫助具有一般技 術者實行及使用本發明。惟該實施例不宜用於侷限本發明 之申請專利範圍。 本發明之所有技術及科學名詞，若無另外定義，則均 與本技術領域者一般所認知之定義相同。以下係描述合適 本發明之方法及材料，然而其他相似或均等之方法與材料 亦可用來實施或測試本發明。本發明所提及之所有專利、 專利申請案以及著作物均以全文引入作為參考。 本發明之最佳實施例 2125-6959-PF;Chiumeow 73 200540183 以下實施例係用來進一步說明本發明，而非用於侷限 本發明之申請專利範圍。 (1 ) cDNA微陣列及雷射微光束微切除技術 cDNA微陣列玻片的製造已描述於〇n〇 et aL Cancer Res·，60: 5007-501 1，2000。本發明者於每個表現圖譜的 分析中製備兩組含有23, 040個點的cDNA微陣列玻片，以 便減少實驗變動。簡單來說，藉由雷射微光束微切除技術 取得20個攝護腺癌組織，再從該2〇個組織中的攝護腺癌 瞻細胞、PIN細胞以及正常攝護腺管上皮細胞中純化出總 RNA。將該總RNA進行T7為基礎的放大步驟，如此便可得 到合適的RNA以進行微陣列實驗。將攝護腺癌細胞及正常 腺管上皮細胞所得到的放大RNA利用反轉錄法分別標記以 Cy5 dCTP 及 Cy3-dCTP(Amersham Biosciences，
Buckinghamshire，UK)。接著根據 〇no etai·，2000 所述， 進行雜交、清洗以及偵測。 _ (2)新穎基因CCDC4(含有4個捲曲螺旋區域（coiled —coil domain containing 4))之辨識 根據基因體cDNA微陣列分析結果，本發明者辨識出一 上調點（up-regulated spot)，位置名稱（h〇using-name) 為B3537，其代表一個表現序列標籤（人類cDNA FLJ35632)。結合其他利用攝護腺癌cI)NA進行RACE所得到 的EST序列，本發明者辨識出一新穎基因，CCDC4。 (3 )北方墨點分析 將人類複數組織北方墨點（Cl0ntech，Pal〇Alt()，CA) 2125-6959-PF;Chiumeow 74 200540183 / 與[α -磷32]dCTP標記的B3537之PCR產物進行雜交。該 361鹼基對（bp)的PCR產物為RT-PCR所製備，使用的引子 -GAACACGTGGCATTCTAGAGGTA-3，（SEQ ID N0:6)。根據供應 商的建議進行前雜交、雜交及清洗步驟。墨點分析係於一8〇 °C環境下放入增感屏（intensifying screens) —同進行七 天的放射性自體顯影（auto-radiograph)。RT-PCR分析證 實CCDC4於攝護腺癌細胞内過度表現（第ία圖），北方墨點 • 分析（第1B圖）證實此轉錄子約為8.7千鹼基對（kb)，並且 包含6個外顯子（ex〇n)，其編碼一 530胺基酸，含有捲曲 螺旋區域的蛋白質（基因資料庫登錄號：AB1 26828)(SEQ ID NO : 2)。另外也發現另一種剪接形式，其會產生一個較短的 蛋白質’其缺乏前述較長蛋白質的C端，含有43 7個胺基 酸（基因資料庫登錄號：AB1 2 6829) (SEQ ID N0: 4)。於北方 墨點分析中，該基因僅表現於正常的睪丸及攝護腺（第1β _圖），顯示以該分子為目標，對其他人類正常器官並不至於 產生不良的影響。 (4)RNA表現構築物以及菌落形成/MTT分析 本發明使用一 siRNA表現載體（psiU6BX)以便送入針 對目標基因有效的RNA i。於基因專一序列（一段1 9個核脊 酸的序列，其與目標轉錄子的中間有一段取自同序列的反 向互補序列（reverse complement)做成短的間隔序列 (SpaCer)TTCAAGAGA(SEQ ID N0:7))的上游有一段 U6 啟動 子，並且有五個胸腺嘧啶作為終止訊號。另外，尚插入一 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 段neo卡匣（neo cassette)以便產生對於氨基糖苷類抗生 素（Geneticin)(Sigma)的抵抗力。針對CCDC4的目標序列 為 5， -GATGGTTCTGCAGCACCAC-3’ （SEQID:N0.8)(si#l)， 以及 5 ’ -GAAGCAGCACGACTTCTTC-3 ， (SEQ. ID· NO. 9)(siEGFP)做為負控制組。 用於CCDC4 s i RNA的寡核脊酸如下所示。si#l為將下 述雙股寡核脊酸複製入psiU6BX載體的Bbsl位點而得到。 其核苷酸對應位置的相關CCDC4核酸序列，SEQ ID N0:1 • 或3,如下述。該寡核苷酸為一 CCDC4目標序列的正義核 苷酸序列及反義核苷酸序列的結合。si#1的髮夾環狀結構 核苷酸序列為SEQ ID N0: 10(每個髮夾環狀結構序列中需 去除内切限制酶辨識位點（endonuclease recognition cites)) 〇 si#l(SEQ ID No:l 或 3 之核苷酸數目 1 666-1 684/SEQ ID N0:8) • 5’ -caccgatggt tctgcagcac cacttcaaga gagtggtgct gcagaaccat c-3’ （SEQ ID N0:11) 5’ -aaaagatggt tctgcagcac cactctcttg aagtggtgct gcagaaccat c-3’ （SEQ ID N0:12) 將攝護腺癌細胞株，PC3及DU145，種至10公分培養 盤（5 X 1 05個細胞/盤），並根據供應商的操作手冊利用 1^口〇16〇^&11^116 200 0(111¥11：1*〇容611)轉染含£6??目標序列 (EGFP)的psiU6BX以及含CCDC4目標序列的psiU6BX。以 500毫克/毫升的氨基糖苷類抗生素進行一星期的篩選，在 76 2125-6959~PF;Chiumeow 200540183 '轉染後的48小時收集通過初選的細胞，並以rt-PCR進行 分析已確定CCDC4受到阻斷。RT-PCR的引子與上面所述的 相同。將該細胞以Giemsa溶液染色並進行MTT分析以分別 評估菌落形成狀況以及細胞數。 RT-PCR的結果證實siRNA表現載體si#l可以阻斷 CCDC4 mRNA，而siEGFP則不行。菌落形成分析顯示當轉染 si#l後，菌落數目顯著減少，證實si#i可有效的阻斷 CCDC4。MTT分析亦顯示轉染si#l後，生長的細胞數亦顯 # 著降低。這些結果為CCDC4對於PRC細胞生長極為重要的 有力支持證據，並且CCDC4分子標的亦為具有潛力的攝護 膝癌治療方式。 構築psiU6BX 3. 0質體 將編碼siRNA的DNA片段插入GAP中485-490位置處， 即為下列質體序列（（SEQ ID No :13))中標示（-）之處。 GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGGAT CCACTAGTMCGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTGGGGATCAGCGTTTGAGT^^ ^ GCCCGCGTCTGMCCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAMGACGCGCAGG^^ CACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCGGGa^^ CCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGG^ TAGAATTMTTTGACTGTAMCACAMGATATTAGTACAMATACGTGACGTAGAAAGT^ ATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTMAATTATGTTTTAAMTGGACTATCAm^ TACCGTAACTTGAMGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAA^^^^ CACC------TTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTGGmTTTTTTTACACCACGm
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GMTGTATTTAGAMAATAMCMATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCQ
CCTGACGTC 80 2125»6959-PF;Chiumeow 200540183 ^ 據報導，snRNA U6基因由RNA聚合酶111所轉錄，其 會於3’端產生一段短的尿脊（uridine)轉錄子。利用PCR 及一組引子，將含有啟動子區域的snRNA U6的基因體片段 進行放大。 5，-0000ΑΊΧΑ0〇0ΤΤΤ0Α0ΤΑΑ-3’（5Ε(3ΙΡΝο··14：^& 5’ -TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3’（SEQ ID Νο··15) 並利用人類胎盤DNA做為模板。將PCR產物進行純化 並利用TA複製套組（TA cloning kit)，根據供應商的操作 φ 手冊（Invitrogen)將該PCR產物複製到pCR質體載體。將 利用PCR放大（一對引子如下所示），含有snRNA U6基因的 BamHI、XhoI片段純化並複製到pcDNA3. 1( + )質體的第1257 至56核苷酸片段處。
5， -TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3’ （SEQ ID No:16) 以及 5， -CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3’ （SEQ ID
No:1 7)。該連結的DNA可作為PCR的模板，其引子又如下 述： • 5 ’ -TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3 ’ (SEQ ID Νο··18)以及 5，-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3 ’ （SEQ ID Νο:19)。 將該產物以Hindlll限制酶切過後，再自行連結以製 成psiU6BX載體質體。控制組方面，將下述的雙股寡核苷 酸複製到 psiU6BX載體的 BbsL·位點，便可製得 psiU6BX-EGFP 。 81 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 5， -CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCT TC-3’ （SEQ ID No:20)以及 5， -AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCT TC~3, (SEQ ID No:21) 產業利用性 # 人類CCDC4基因於攝護腺癌中，相較於非癌化的攝護 腺管上皮細胞，其表現顯著提高。因此，該基因可作為攝 護腺癌的診斷標記，且該基因所編碼的蛋白質亦可用於攝 護腺癌的診斷分析。 本發明人等亦證實新穎蛋白質CCDC4的表現可促進細 胞生長，然後根據CCDC4基因所設計的小型干擾RNA可抑 制細胞生長。這些結果顯示CCDC4蛋白質可刺激癌化活 I 性。因此，該類新穎的致癌蛋白質（oncoproteins)每種均 可做為發展抗癌醫藥物的目標。例如，阻斷CCDC4表現的 藥劑，或藉由抑制其活性可作為具有療效的抗癌藥劑，尤 其是治療攝護腺癌的抗癌藥劑。該類藥劑包含對抗CCDC4 基因的反義核苷酸、小型干擾RNA以及核糖酶，以及辨識 CCDC4蛋白質的抗體。 本發明雖以參考資料及特定實施態樣詳細地說明，然 而，誠如本技術領域者所了解，對於本發明所進行之各種 改變或調整，均不會脫離本發明之精神及範疇。 82 2125-6959-PF;Chiumeow 200540183 ψ 【圖式簡單說明】 第1(A)圖為半定量 之照片。從人類攝護腺癌組織中藉由微切除所得到的攝護 腺癌細胞中，可以觀察到過度表現的CCDC4。 第1 (Β)圖為北方墨點分析之結果。其顯示正常成人組 織CCDC4的表現模式，8. 7kb大的轉錄子，CCDC4，僅表現 於正常成人的睪丸及攝護腺。 Φ 第2圖顯示利用siRNA阻斷（knocking-down)攝護腺癌 細胞株，PRC3，之内源CCDC4之結果。第2(A)圖為RT-PCR 的結果照片，其證實CCDC4 mRNA被轉染的siRNA表現載體 si#l所阻斷。si#l為針對CCDC4 mRNA序列而設計，siEGFP 則針對EGFP mRNA序列而設計。於轉染的48小時候收集 RNA並進行分析。利用ATCB來校正輸入的cDNA。 第2(B)圖為菌落形成分析的結果相片。其顯示當轉染 經由RT-PCR證實可以有效阻斷CCDC4的si#l後一個星 期，PRC3細胞的菌落數目顯著降低。 第2(C)圖為一顯示MTT分析結果的柱狀圖，其顯示當 轉染s i # 1後，生長的細胞數目顯著降低。 【主要元件符號說明】 無0 83 2125-6959-PF;Chiumeow .200540183
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1/3 9 SEQUENCE LISTING <110> 0NC0THERAPY SCIENCE, INC.
THE UNIVERSITY OF TOKYO <120> Genes and polypeptides relating to prostate cancers
<130〉 ONC-A0404-TW
〈150〉US 60/555,810 〈151〉 2004-03-23 <160> 21 <170> Patentln version 3.1 <210〉 1 <211〉 8763 <212> DNA <213> Homo sapiens <220〉
<221> CDS <222〉 （593)·· (2185) <223〉 <400> 1 60 120 180 240 gcgatgctcg gggaaagcag gaccccaaag ccccgtaaac accgcgcgac cacccgggcc aagatcttca agaggttctt ttcagaagga tcggagagca attcccgatt ggtagaagaa cttgctgtaa tacacacgta ctctgaogac cccgccccaa cgactagccc ctcctctgtg caaccccgag agtttggggt catgcagggg gcgccacgag ctcgtttcgg aagccggacc ccgcccgcag ccgcagaagc ctcgagtcca catctgggtc tctaaagtct cgccgtagcc
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 300 200540183
0NOA0404—TW 2/3 9 agatcccgga tccccacctt cttcaccagt tcccgggcgt cctccaggca ttggcgaggc 360 agcctgtcaa tcaggagctc gggcggcagc cccccgcgcg ggggctcggc gatgccagcc tcagcgacag gcggcggcgg cggcggccac ggcacagaca cacaccctcc oacacgcgcg caccagggca gacccggcgg gcaggcggcg gaggcaccct cggagcccgg cgcccggcgg ggaggggacg tgctccgagg gaccggcccc gaggcgccgg atggaggaag ag atg cag
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Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys lie Tyr Lys Gin Arg Ser 5 10 15 ccc tac age gtc etc aag aeg ttc ccc age aag aga ccg geg ctg gee
Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala Leu Ala 20 25 30
420 480 540 598 646 694 742 790 838 aag ege tac gag ega ccc acc ctg gtg gag ctg ccg cac gtg egg geg Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val Arg Ala 35 40 45 50 ccc ccg ccg ccc ccg ccg ccc ttc geg ccg cac gee gee gtc tee ate Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Yal Ser lie 55 60 65 age age age gag ccg ccg ccg cag cag ttc cag geg cag age tee tac Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gin Gin Phe Gin Ala Gin Ser Ser Tyr 70 75 80 ccc ccc ggg ccc ggc egg gee gee gee gee get teg teg teg teg ccg Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Pro 85 90 95
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 886 200540183
0NC—A0404—TW 3/3 9 tec tgc acg ccc gcc aca tcc cag ggc cac ttg agg act ccg gcg cag Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gin Gly His Leu Arg Thr Pro Ala Gin 100 105 110 934 ccg ccg ccc gcg tcc ccc gcc gcc tcc teg teg tet teg ttc gcc get Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ala Ala 115 120 125 130 982
gtc gtc agg tat ggc cca ggc gcg gcg gcg gcc gcc ggc acc ggc ggc Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly 135 140 145 1030 acg ggt age gac age gcc age ctg gag etc age gca gag agt ega atg Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser Arg Met 150 155 160 1078 ate ttg gat gcc ttt gcc cag cag tgc agt ega gtt ett age etc tta lie Leu Asp Ala Phe Ala Gin Gin Cys Ser Arg Val Leu Ser Leu Leu 165 170 175 1126
aat tgt gga gga aaa etc ctg gac tcc aac cat tet cag tcc atg att Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gin Ser Met lie 180 185 190 1174 tet tgc gta aag cag gaa ggc tea agt tac aac gaa aga cag gag cac Ser Cys Val Lys Gin Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gin Glu His 195 200 205 210 1222
tgt cac att ggg aaa ggg gtc cac agt cag acc tea gac aat gta gac Cys His lie Gly Lys Gly Val His Ser Gin Thr Ser Asp Asn Val Asp 215 220 225 ata gag atg cag tat atg caa agg aaa caa caa act tet gcc ttt ttg He Glu Met Gin Tyr Met Gin Arg Lys Gin Gin Thr Ser Ala Phe Leu 230 235 240GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 1270 1318 200540183
0NC- A0404-TW 4/3 9 agg gtt ttc act gac tct eta caa aat tac ctg etc teg gga age ttt Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gin Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Phe 245 250 255 cca act cca aac ccc teg tea gee agt gaa tat ggc cat ctg gee gac Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu Ala Asp 260 265 270 1366 1414
gtg gat cct ctg tea acc tct cct gtg cat aca tta ggt ggc tgg act Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly Trp Thr 275 280 285 290 1462 tee cca gca aeg tee gaa tee cat ggc cac cca tct tea tct aca ctg Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser Thr Leu 295 300 305 1510 cca gaa gag gag gag gag gag gac gag gaa ggc tat tgt cct ega tgc Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro Arg Cys 310 315 320 1558
caa gag ctg gag cag gag gtt att tea ctg caa caa gaa aat gaa gag Gin Glu Leu Glu Gin Glu Val lie Ser Leu Gin Gin Glu Asn Glu Glu 325 330 335 1606 etc aga agg aaa tta gag age ate cca gtg ccc tgc cag acc gtt tta Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser lie Pro Val Pro Cys Gin Thr Val Leu 340 345 350 1654
gat tac ttg aag atg gtt ctg cag cac cac aac caa etc ctg ata cca Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gin His His Asn Gin Leu Leu He Pro 355 360 365 370 cag cca get gac cag ccg aca gag gga age aag cag ctg ttg aac aac Gin Pro Ala Asp Gin Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gin Cfeli Eeu A：sn 375 380 385 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 1702 1750 .200540183
ONC-A0404-丁W 5/3 9 tat cct gtc tac ata acg age aaa cag tgg gat gag get gta aat tet 1798
Tyr Pro Val Tyr lie Thr Ser Lys Gin Trp Asp Glu Ala Val Asn Ser 390 395 400 tea aag aaa gat ggg aga egg etc ett ega tac etc ate aga ttt gtt 1846
Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu lie Arg Phe Val 405 410 415 1894
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Arg Ser Val Gin Ser Gly Glu Thr Gly Pro Glu Arg Arg Pro Leu Asp 435 440 445 450 cca gtt aaa gta aca tgc etc ega gaa ttc att agg atg cat tgt acc 1990
Pro Val Lys Val Thr Cys Leu Arg Glu Phe lie Arg Met His Cys Thr 455 460 465 2038
tee aac ccc gat tgg tgg atg ccc teg gaa gag cag ata aac aaa gtg Ser Asn Pro Asp Trp Trp Met Pro Ser Glu Glu Gin He Asn Lys Val 470 475 480 ttc age gac get gtc ggt cac gee ega cag ggg egg geg gtg ggg act 2086
Phe Ser Asp Ala Val Gly His Ala Arg Gin Gly Arg Ala Val Gly Thr 485 490 495 ttc ctg cac aac ggt ggc tea ttt tat gaa ggg ate gat cac cag get 2134
Phe Leu His Asn Gly Gly Ser Phe Tyr Glu Gly lie Asp His Gin Ala 500 505 510 tet cag gat gaa gtc ttc aat aaa agt tee cag gat gga tet ggg gat 2182
Ser Gin Asp Glu Val Phe Asn Lys Ser Ser Gin Asp Gly Ser Gly Asp 515 520 525 530
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tag tggacagaat cttcctgttg tagcagctgg tcctctcaag agttccaatt 2235 gtgaatgtcc tgttcctgtc acctgagagt ccaaagcctg tcattctgcc atagtctaca 2295 cattctcagc tgccacagta cccaaataga aatccatttt agggttgttt gggaagtctg 2355 tggcacctac aacagacttt tggaatatta tattataaaa agaaaaaact acatctgatt 2415 tttaaatgat tactagctag atcatgaggg tgaaaaaata ggtgagctcc tagttacctt 2475 tctgaaatct tcaaactctg ctacctgggc agagatagtc cccaaggtag gotggggtag 2535 tgtttctgcc catgggagaa ggtggagaca tggagttgtg ttaagggaca agaagcaaac 2595 attctcttaa ttcaaataag ttgtctttat gttttccaaa gacttgactt catatttctc 2655 ggcaaagaca taggatagat gacatcatat accattttga cattaataat gtctattact 2715 aaaaggaaac cagagaacag aggcaacatc tgcagacagt gattaattac aggtcaactg 2775 tttttctgtt gtttaaaaac cactgtgttg atcaagaagg cactatttga tctctggagt 2835 ttacaaacag tagtcatttt tcattgttag tcaagaaaca tccaaagatc caaaaccatt 2895 ttcaaatgct cagttttgta ggttaataaa tccgcagttt ccatagcctt aaatcaggct 2955 ttgttgacac aatgccaaag tgatgggtag aacaatgaaa atttaaagca attagttgtt 3015 tggtgcactg aagaccaaac aagtggtgtg actgatggta ttcgctgaat tgactagatg 3075 ttctggcatt gtatacacac agcttcaagg cgattctgac aactatgcaa tgggcttgtc 3135 agtaattgct ctgaaatttg agggtctttc tctgctgagc tgatctttag aatttgtatg 3195 aaacttgttt cccattgtcc ttgatgaaaa catttcatcc cctccgtgcc tcctttaccc 3255 GENES. AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS •200540183
ONC-A0404-TW 7/3 9 caatgtaccc cttagctatg gctaagtcag cactgtgccg ctatcccctg gttaatttgt 3315 tgagttccat atgtgaaatt agtggtatct ttggaaactt tccatattgg caaatgctat 3375 agaggtgcta gagtcatcat ttctgagggc ttcctgtttg gactcaggag aggctttctt 3435 taccaaacta gtccagatta ctacattctt tgtagagcaa agggctaaat ggacagcgtt 3495 tattgaaggc tactaatgtc atctacagac atgaccaagg gtttttgaaa attggttgga 3555 gattcaggtt aatgagcatc cattgataaa gggtttttgg gctatttttg tcaacataaa 3615 ctcataaatt gtcctttaga tttaatattt agtttgtatt cactatatac aaagtcctag 3675 aaacaggtct ttctgtagct tttgtttatt agcttttttg tattactaga attcatccat 3735 tgaaaagttt aatgtttatg gaggtggtca tctgtcagat ctgctcaatg atgtagtggg 3795 cactaatatt tcaatcctgt tttgagaaaa ttaactaaaa tttgtcatat cattcaatgg 3855 aatagggaga accaatattc aattctattt ggggcaaatt agctaaaatt tggaagtaaa 3915 agaaatgata tgggcaaatg ccatgttctt acggcagcca tgagaccagt ctctttggct 3975 ctccaaggaa gaaagatacc tcttaaagca ttttttagag gtccgagaag tcagtgtctg 4035 tcttataaga ttctttgaca acatgacatc ttcgctagaa gaaaaacacc accatagcct 4095 catctgtttt tccatcttac cttaattttt cattggcctt aagttgtcct tactgctgaa 4155 tacatcgttc tgtttttcta aagcaacaat atttgatcac tgcttttaag aaaaacagac 4215 tagcccttct tgtttttctg gaagtttgag agtcctgaat atttcttcat atccaaatat 4275 catcttggag ccctatcgtg ctggtcttcg ctgaggctga tgagagcact ttctgcaccc GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 4335 200540183
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ctgctccatg gccgtacatg acaacgcacc tgcaccactg ctgcaagggc ggggggcagc 4395 agcctgtgtt ttggctgtca ctgttacctc ctgagaaggc tgctgtccca ggtttgcaca 4455 ccacttttgt tccaaagtta cacatggtct cttcctccct cgcacccatt ccaggttaat 4515 catttctcta tcagctgttt ctccatccac agattctgaa tgttgagact aattgttggg 4575 catctctttt gcacaaggct gacagactcc atactcagca tcgcacagcc agttctaact 4635 cctctgctgg gtctcggacc tacagctttt gcctgagtga aatgttccta cgacttttgc 4695 tcctgagtga gatattccat tgtacttcta atgtttgtgt atctgctggg ttcctttagc 4755 caagcctagc gtctgacgca ggcactagcc gccactgagg ccgtgataca gcatcactgt 4815 ggacactgct ggctcctctc cttgggacat atccacactg ccccttgagc ttcaccttta 4875 aggctggtat gtacgtaagt tcacggtggt cgtctgcatg gtctcctctt gtttaaatca 4935 ggaccaacaa aggatgttca tttgtatttt ggcaaggccc attgggcctc tgtgtagcca 4995 ggttaaaagc tcactcacta ggatcggatg ctgtcattgc tctgtgagcc tttcagttga 5055 aatccttgga gacttgaagg tgttgcttat tattttgatt tgattttctg catctttatc 5115 tggcaaatgg acagattgct ctcacaagaa acttagtcat gtcagctttt agagtccttc 5175 ttgagtcatg ttagcattgg tagtgtaaaa tagattgagt taaaacagct caggatgcag 5235 ctgtgccccc acttaattgg tgagaggagg aggtcacggg gctggcttga caacaaagac 5295 taaatgtggc ttttttgtcg gtgactaggt gtggtccata agcagaagag ccatacctac 5355 aaaaagtgac aactgtcctg tgttttccaa attaaaatct tgttacaaag atcatgccgg 5415 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS » 200540183
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acagctcata tatacagatt tttagaaatg taatagaaaa tgattttgca catatggtgc 6555 aagtcttgct ggtgtatgtt taatgtggca acacgtgcca gaactgtttg gcaaaacatg 6615 tcaaatggag tgcttgagtc agaactctaa tgtaaatgtg tctaaacagc agtatgtatc 6675 attatgatgt atttttgtaa acatagtgat ggctgctttc agtcatgtaa gtgctggata 6735 aaaataacca cttcagttgg agtaatgtag gaaaacgtca cccagcagat gggtagtcct 6795 ctgcaaagtt acactgtcag ccagtggcac tggttctttt atttatgttg ggtttttgtt 6855 ttttttttag aggagagtga agaattgaca tcagacaaca tggagtgcaa aaataataac 6915 ccatcaatat ttgccttcta aatgtaaaat gtaaaagttt aactgatctg tgtacacatt 6975 agagaccact ttcacacgcc acaatatgtt cagttgcagg ttaacactga gaggttgaga 7035 cttccctcat ctgatgacca gcttggttaa tttgacttct gaaggcacta aattaccaag 7095 tatttgcagt aatggggacc ggattaattt tcctcacaat tctctatagc tgtctgatat 7155 aagggctgtg tttttattga atcacagatc ctcaaattac agtgaaagca tgtcttgcta 7215 gtaagactca tttgaaaacc tctttattct tggaataatt gggccagtac aagtggccag 7275 atgtatcctg gccacattgg aaaactattt gggcccgttc agaaccactt aactgcaaca 7335 acagtagtaa ctatagttaa tatctatcta ttgagttatt gtgtgacagt tacttggata 7395 agtactttaa tgcattctca ttttaatcct cacagctacc ctatgaggct gttactgttc 7455 ttatccccat tgtattgata aggaaactgc ccagggtact cagctaagaa gaggattgct 7515 ttgggcatag gaagcagaat gacgagttca gtcttcctca gtagttggag cacagttctc 7575 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
ONC- A0404-TW 1 1/3 9 aaagcccatc aacactttgg aatggatttg ttgttttatt tatgccatca agggagagtt 7635 gatatttgtg tattgctaaa aactactaaa gtatgtcgat gcttaggtag gaacatacaa 7695 accatatatc ctctgggatc tgcccaggtt tctgtataag gcttgaccta cgtaagatcc 7755 tatgatgaag accagaaaac tttttttaaa agtaggtaaa ttaaaattaa aatcacgagt 7815 ttgttcacat ttgtcccata ggttcctagt gcaaaaatgc agggagataa aagcaaacat 7875 ttgaactcag tgaagtgaga gtctttggga actcctagat gttagaaata gcaccggggc 7935 atcaggtagc caacgttcaa ttcacttttc acgtttgtgt ctttgtagct ttagagctga 7995 tgagtctgat tggtttggaa gagagagttt taatttatga tgtcactgtg agaactgttg .8055 tgaaaatttt gtaagaaaat acagtaatct gttgattttt tcctgtagtt ttggctttca 8115 catccctttg gctgtgttta agttcaagag catgccaagg ccatgagggt cctggcttgc 8175 acttcttggg aacagggcat gctagaggtg ggtcatgaag ctttcaaggt cactgttcca 8235 gcccgaccct gcgcaattta ggcattgcct ttatgtctct cctctctgga acttcatgta 8295 gcagcctaac accggggccg agttgccttt actctatttt ctatgatgaa tacttgtgga 8355 gaaactgtga caaatccatt gatcctgata tttttattgt tggagtcttg ttgattctct 8415 atgaataatt tctatttgat tgtactgtgt agagttaata cccactaggg atatgttaat 8475 aaagctacaa atgcatagtg taatatagaa tagcaagatt tttttgtgaa caatttatat 8535 agaagagtaa gttgtttttt aagtgttagg ctcatttctt ttagaaactt aaaatgttat 8595 aaaagttttt taaacattca atatttttaa ttataagaga catttgttac tagagccaat 8655
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ONC- A0404-TW 12/3 9 tatttcaggt gttctaattg gagtgttgat tttattacct catatacctc tagaatgcca 8715 cgtgttctgt tggggataaa attgcacaat aaatgtcaag tctctgtt 8763 <210〉 2 <211〉 530 <212〉 PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Gin Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys lie Tyr Lys Gin 1 5 10 1.5
Arg Ser Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala 20 25 30
Leu Ala Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val
35 40 45
Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val 50 55 60
Ser lie Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gin Gin Phe Gin Ala Gin Ser 65 70 75 80
Ser Tyr Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser 85 90 95
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Ser Pro Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gin Gly His Leu Arg Thr Pro 100 105 110
Ala Gin Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe 115 120 125
Ala Ala Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr 130 135 140
Gly Gly Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser 145 150 155 160
Arg Met He Leu Asp Ala Phe Ala Gin Gin Cys Ser Arg Val Leu Ser 165 170 175
Leu Leu Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gin Ser
180 185 190
Met lie Ser Cys Val Lys Gin Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gin 195 200 205
Glu His Cys His lie Gly Lys Gly Val His Ser Gin Thr Ser Asp Asn 210 215 220
Val Asp lie Glu Met Gin Tyr Met Gin Arg Lys Gin Gin Thr Ser Ala 225 230 235 240
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
ONC— A0404-TW 14/3 9
Phe Leu Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gin Asn Tyr Leu Leu Ser Gly 245 250 255
Ser Phe Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu 260 265 270
Ala Asp Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly 275 280 285
Trp Thr Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser 290 295 300
Thr Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro 305 310 315 320
Arg Cys Gin Glu Leu Glu Gin Glu Val He Ser Leu Gin Gin Glu Asn
325 330 335
Glu Glu Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser lie Pro Val Pro Cys Gin Thr 340 345 350
Val Leu Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gin His His Asn Gin Leu Leu 355 360 365 lie Pro Gin Pro Ala Asp Gin Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gin Leu Leu 370 375 380
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ONC—A0404-TW 15/3 9
Asn Asn Tyr Pro Val Tyr lie Thr Ser Lys Gin Trp Asp Glu Ala Val 385 390 395 400
Asn Ser Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu lie Arg 405 410 415
Phe Val Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys 420 425 430
Arg Lys Arg Ser Val Gin Ser Gly Glu Thr Gly Pro Glu Arg Arg Pro 435 440 445
Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Cys Leu Arg Glu Phe lie Arg Met His 450 455 460
Cys Thr Ser Asn Pro Asp Trp Trp Met Pro Ser Glu Glu Gin lie Asn 465 470 475 480
Lys Val Phe Ser Asp Ala Val Gly His Ala Arg Gin Gly Arg Ala Val 485 490 495
Gly Thr Phe Leu His Asn Gly Gly Ser Phe Tyr Glu Gly lie Asp His 500 505 510
Gin Ala Ser Gin Asp Glu Val Phe Asn Lys Ser Ser Gin Asp Gly Ser 515 520 525
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0NC-A0404—TW 16/3 9
Gly Asp 530 <210〉 3 <211> 8692 <212> DNA 〈213〉 Homo sapiens <220〉
〈221〉 CDS 〈222〉 （593)..(1906) 〈223〉 <400> 3 gcgatgctcg gggaaagcag gaccccaaag ccccgtaaac accgcgcgac cacccgggcc aagatcttca agaggttctt ttcagaagga tcggagagca attcccgatt ggtagaagaa cttgctgtaa tacacacgta ctctgacgac cccgccccaa cgactagccc ctcctctgtg caaccccgag agtttggggt catgcagggg gcgccacgag ctcgtttcgg aagccggacc ccgcccgcag ccgcagaagc ctcgagtcca catctgggtc tctaaagtct cgccgtagcc agatcccgga tccccacctt cttcaccagt tcccgggcgt cctccaggca ttggcgaggc agcctgtcaa tcaggagctc gggcggcagc cccccgcgcg ggggctcggc gatgccagcc tcagcgacag gcggcggcgg cggcggccac ggcacagaca cacaccctcc cacacgcgcg caccagggca gacccggcgg gcaggcggcg gaggcaccct cggagcccgg cgcccggcgg ggaggggacg tgctccgagg gaccggcccc gaggcgccgg atggaggaag ag atg cag
Met Gin
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 60 120 180 240 300 360 420 480 540 598 200540183
0NC— A0404-TW 1 7/3 9 ccg gca gag gag ggg ccc age gtc ccc aaa ate tac aag cag ege age 646
Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys lie Tyr Lys Gin Arg Ser 5 10 15 ccc tac age gtc etc aag aeg ttc ccc age aag aga ccg geg ctg gee 694
Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala Leu Ala 20 25 30
-742 aag ege tac gag ega ccc acc ctg gtg gag ctg ccg cac gtg egg geg Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val Arg Ala 35 40 45 50 ccc ccg ccg ccc ccg ccg ccc ttc geg ccg cac gee gee gtc tee ate 790
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val Ser lie 55 60 65 age age age gag ccg ccg ccg cag cag ttc cag geg cag age tee tac 838
Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gin Gin Phe Gin Ala Gin Ser Ser Tyr 70 75 80
ccc ccc ggg cce ggc egg gee gee gee gee get teg teg teg teg ccg 886
Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Pro 85 90 95 tee tgc aeg ccc gee aca tee cag ggc cac ttg agg act ccg geg cag 934
Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gin Gly His Leu Arg Thr Pro Ala Gin 100 105 110 ccg ccg ccc geg tee ccc gee gee tee teg teg tet teg ttc gee get 982
Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ala Ala 115 120 125 130 gtc gtc agg tat ggc cca ggc geg geg geg gee gee ggc acc ggc ggc 1030
Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly
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0NC-A0404-TW 18/3 9 135 140 145 acg ggt age gac age gcc age ctg gag etc age gca gag agt ega atg 1078
Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser Arg Met 150 155 160 ate ttg gat gee ttt gee cag cag tgc agt ega gtt ett age etc tta 1126 lie Leu Asp Ala Phe Ala Gin Gin Cys Ser Arg Val Leu Ser Leu Leu 165 170 175
1174 aat tgt gga gga aaa etc ctg gac tee aac cat tet cag tee atg att Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gin Ser Met lie 180 185 190 tet tgc gta aag cag gaa ggc tea agt tac aac gaa aga cag gag cac 1222
Ser Cys Val Lys Gin Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gin Glu His 195 200 205 210 tgt cac att ggg aaa ggg gtc cac agt cag acc tea gac aat gta gac 1270
Cys His He Gly Lys Gly Val His Ser Gin Thr Ser Asp Asn Val Asp 215 220 225
1318 ata gag atg cag tat atg caa agg aaa caa caa act tet gee ttt ttg lie Glu Met Gin Tyr Met Gin Arg Lys Gin Gin Thr Ser Ala Phe Leu 230 235 240 agg gtt ttc act gac tet eta caa aat tac ctg etc teg gga age ttt 1366
Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gin Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Phe 245 250 255 cca act cca aac ccc teg tea gee agt gaa tat ggc cat ctg gee gac 1414
Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu Ala Asp 260 265 270 gtg .gat cct ctg tea acc tet cct gtg cat aca tta ggt ggc tgg act 1462
Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly Trp Thr
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS .200540183
ONC— A0404—TW 1 9/3 9 275 280 285 290 tcc cca gca acg tcc gaa tcc cat ggc cac cca tct tea tet aca ctg 1510
Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser Thr Leu 295 300 305 cca gaa gag gag gag gag gag gac gag gaa ggc tat tgt cct ega tgc 1558
Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro Arg Cys 310 315 320
1606 caa gag ctg gag cag gag gtt att tea ctg caa caa gaa aat gaa gag Gin Glu Leu Glu Gin Glu Val lie Ser Leu Gin Gin Glu Asn Glu Glu 325 330 335 etc aga agg aaa tta gag age ate cca gtg ccc tgc cag acc gtt tta 1654
Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser He Pro Val Pro Cys Gin Thr Val Leu 340 345 350 gat tac ttg aag atg gtt ctg cag cac cac aac caa etc ctg ata cca 1702
Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gin His His Asn Gin Leu Leu lie Pro 355 360 365 370
1750 cag cca get gac cag ccg aca gag gga age aag . cag ctg ttg aac aac Gin Pro Ala Asp Gin Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gin Leu Leu Asn Asn 375 380 385 tat cct gtc tac ata acg age aaa cag tgg gat gag get gta aat tct 1798
Tyr Pro Val Ίγτ lie Thr Ser Lys Gin Trp Asp Glu Ala Val Asn Ser 390 395 400 tea aag aaa gat ggg aga egg etc ett ega tac etc ate aga ttt gtt 1846
Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu lie Arg Phe Val 405 410 415 ttc aca acc gat gag ett aag tac tea tgc ggc ett ggg aaa agg aaa 1894
Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys Arg Lys
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC-A0404-TW 2 0/3 9 420 425 430
aga att cat tag gatgcattgt acctccaacc ccgattggtg gatgccctcg Arg He His 435 1946 gaagagcaga taaacaaagt gttcagcgac gctgtcggtc acgcccgaca ggggcgggcg 2006 tcctgcacaa cggtggctca ttttatgaag ggatcgatca ccaggcttct 2066 caggatgaag tcttcaataa aagttcccag gatggatctg gggattagtg gacagaatct 2126 tcctgttgta gcagctggtc ctctcaagag ttccaattgt gaatgtcctg ttcctgtcac 2186 ctgagagtcc aaagcctgtc attctgccat agtctacaca ttctcagctg ccacagtacc 2246 caaatagaaa tccattttag ggttgtttgg gaagtctgtg gcacctacaa cagacttttg 2306 gaatattata ttataaaaag aaaaaactac atctgatttt taaatgatta ctagctagat 2366 catgagggtg aaaaaatagg tgagctccta gttacctttc tgaaatcttc aaactctgct 2426 acctgggcag agatagtccc caaggtaggc tggggtagtg tttctgccca tgggagaagg 2486 tggagacatg gagttgtgtt aagggacaag aagcaaacat tctcttaatt caaataagtt 2546 gtctttatgt tttccaaaga cttgacttca tatttctcgg caaagacata ggatagatga 2606 catcatatac cattttgaca ttaataatgt ctattactaa aaggaaacca gagaacagag 2666 gcaacatctg cagacagtga ttaattacag gtcaactgtt tttctgttgt ttaaaaacca 2726 ctgtgttgat caagaaggca ctatttgatc tctggagttt acaaacagta gtcatttttc 2786 attgttagtc aagaaacatc caaagatcca aaaccatttt caaatgctca gttttgtagg 2846 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC-A0404-TW 2 1/3 9
ttaataaatc cgcagtttcc atagccttaa atcaggcttt gttgacacaa tgccaaagtg 2906 atgggtagaa caatgaaaat ttaaagcaat tagttgtttg gtgcactgaa gaccaaacaa 2966 gtggtgtgac tgatggtatt cgctgaattg actagatgtt ctggcattgt atacacacag 3026 cttcaaggcg attctgacaa ctatgcaatg ggcttgtcag taattgctct gaaatttgag 3086 ggtctttGtc tgctgagctg atctttagaa tttgtatgaa acttgtttcc cattgtcctt 3146 gatgaaaaca tttcatcccc tccgtgcctc ctttacccca atgtacccct tagctatggc 3206 taagtcagca ctgtgccgct atcccctggt taatttgttg agttccatat gtgaaattag 3266 tggtatcttt ggaaactttc catattggca aatgctatag aggtgctaga gtcatcattt 3326 ctgagggctt cctgtttgga ctcaggagag gctttcttta ccaaactagt ccagattact 3386 acattctttg tagagcaaag ggctaaatgg acagcgttta ttgaaggcta ctaatgtcat 3446 ctacagacat gaccaagggt ttttgaaaat tggttggaga ttcaggttaa tgagcatcca 3506 ttgataaagg gtttttgggc tatttttgtc aacataaact cataaattgt cctttagatt 3566 taatatttag tttgtattca ctatatacaa agtcctagaa acaggtcttt ctgtagcttt 3626 tgtttattag cttttttgta ttactagaat tcatccattg aaaagtttaa tgtttatgga 3686 ggtggtcatc tgtcagatct gctcaatgat gtagtgggca ctaatatttc aatcctgttt 3746 tgagaaaatt aactaaaatt tgtcatatca ttcaatggaa tagggagaac caatattcaa 3806 ttctatttgg ggcaaattag ctaaaatttg gaagtaaaag aaatgatatg ggcaaatgcc 3866 atgttcttac ggcagccatg agaccagtct ctttggctct ccaaggaaga aagatacctc 3926 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183 0NOA0404 - Τ¥ 2 2/3 9 ttaaagcatt ttttagaggt ccgagaagtc agtgtctgtc ttataagatt ctttgacaac 3986 atgacatctt cgctagaaga aaaacaccac catagcctca tctgtttttc catcttacct 4046 taatttttca ttggccttaa gttgtcctta ctgctgaata catcgttctg tttttctaaa 4106 gcaacaatat ttgatcactg cttttaagaa aaacagacta gcccttcttg tttttctgga 4166 agtttgagag tcctgaatat ttcttcatat ccaaatatca tcttggagcc ctatcgtgct 4226 ggtcttcgct gaggctgatg agagcacttt ctgcacccct gctccatggc cgtacatgac 4286 aacgcacctg caccactgct gcaagggcgg ggggcagcag cctgtgtttt ggctgtcact 4346 gttacctcct gagaaggctg ctgtcccagg tttgcacacc acttttgttc caaagttaca 4406 catggtctct tcctccctcg cacccattcc aggttaatca tttctotatc agctgtttct 4466 ccatccacag attctgaatg ttgagactaa ttgttgggca tctcttttgc acaaggctga 4526 cagactccat actcagcatc gcacagccag ttctaactcc tctgctgggt ctcggaccta 4586 cagcttttgc ctgagtgaaa tgttcctacg aettttgctc ctgagtgaga tattccattg 4646 tacttctact gtttgtgtat ctgctgggtt cctttagcca agcctagcgt ctgacgcagg 4706 cactagccgc cactgaggcc gtgatacagc atcactgtgg acactgctgg ctcctctcct 4766 tgggacatat ccacactgcc ccttgagctt cacctttaag gctggtatgt acgtaagttc 4826 acggtggtcg tctgcatggt ctcctcttgt ttaaatcagg accaacaaag gatgttcatt 4886 tgtattttgg caaggcccat tgggcctctg tgtagccagg ttaaaagctc actcactagg 4946 atcggatgct gtcattgctc tgtgagcctt tcagttgaaa tccttggaga cttgaaggtg 5006
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
ONC-A0404-TW 2 3/3 9
ttgcttatta ttttgatttg attttctgca tctttatctg gcaaatggac agattgctct 5066 cacaagaaac ttagtcatgt cagcttttag agtccttctt gagtcatgtt agcattggta 5126 gtgtaaaata gattgagtta aaacagctca ggatgcagct gtgcccccac ttaattggtg 5186 agaggaggag gtcacggggc tggcttgaca acaaagacta aatgtggctt ttttgtcggt 5246 gactaggtgt ggtccataag cagaagagcc atacctacaa aaagtgacaa ctgtcctgtg 5306 ttttccaaat taaaatcttg ttacaaagat catgccggct tttcgcagtg agttgaagcc 5366 ccaagctcag ttccagccag gctcaggatg accctcaaat gatatgtatt ggatagtgta 5426 ggtcaggagc ctgtggaggg gaccagtatt ttgcaagcag ttactaaagt cacatttctc 5486 actgactctt gacggtgcat tgttcaaaat ctcatggctt aaccttagtg ttaaatgctt 5546 tcaagaaaaa ctgtaaccat ttcaatttta caagtacttt ctcattttac ttgaacattt 5606 tacaagtact ttctgtattt acttgtaaat atttcctcta gcccttgaac ccgcgcatca 5666 cttttttggt tttcetcatt ccaccacagc atttaggtga ccgttaccat ttatgtttca 5726 ttaagcttca ctaggaatgt aaggataata ttagagcatt tgcagaaaat tgttatctcc 5786 ttttgtaggg gattcgagac atatttgtag ctacttcacg gctgtagagt tagtgggtga 5846 tcgggtattc tgcattgttc cttatccctt tgtcagtgac agacacattg acataagaga 5906 ttcctacagg attataagga gagataaatt attaaccatt tttttacttg atccaactac 5966 tccatgtccc atcaactagt ggtaactgat gttgatagga ttttttttaa gtccagtaac 6026 tattcttgca gtatcagatg tttaccccaa attaggcaat aacccagact tcgaatctgt 6086 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS •200540183
0NOA0404- TW 2 4/3 9 aggtttatga ttcctacatt cccctgccgc tctcaatggc ttgttgcctc ccttctgttg 6146 ctctcagaaa acagatggag atcaggtaaa gatgaaacgt gcactatatg ttcagaaaag 6206 caaacatcca ttgtcctcat ttagattcca tccttcaatt tatgctctag aacctaaacc 6266 taatacccat tgactacctc ctgagtttct taggtttcaa ttattttttt gaaatgtcat 6326 ccatggataa tagcttcaat tttaggaaag atttaaatgt ataactttcc tcattcagtg 6386 ctgtgtcatt tcacagtaca gatctgcgtt aatttttgac agetcatata tacagatttt 6446 tagaaatgta atagaaaatg attttgcaca tatggtgcaa gtcttgctgg tgtatgttta 6506 atgtggcaac acgtgccaga actgtttggc aaaacatgtc aaatggagtg cttgagtcag 6566 aactctaatg taaatgtgtc taaacagcag tatgtatcat tatgatgtat ttttgtaaac 6626 atagtgatgg ctgctttcag tcatgtaagt gctggataaa aataaccact tcagttggag 6686 taatgtagga aaacgtcacc cagcagatgg gtagtcctct gcaaagttac actgtcagcc 6746 agtggcactg gttcttttat ttatgttggg tttttgtttt ttttttagag gagagtgaag 6806 aattgacatc agacaacatg gagtgcaaaa ataataaccc atcaatattt gccttctaaa 6866 tgtaaaatgt aaaagtttaa ctgatctgtg tacacattag agaccacttt cacacgccac 6926 aatatgttca gttgcaggtt aacactgaga ggttgagact tccctcatct gatgaccagc 6986 ttggttaatt tgacttctga aggcactaaa ttaccaagta tttgcagtaa tggggaccgg 7046 attaattttc ctcacaattc tctatagctg tctgatataa gggctgtgtt tttattgaat 7106 cacagatcct caaattacag tgaaagcatg tcttgctagt aagactcatt tgaaaacctc 7166
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS β 200540183
0NC -A0404-TTW 2 5/3 9 tttattcttg gaataattgg gccagtacaa gtggccagat gtatcctggc cacattggaa 7226 aactatttgg gcccgttcag aaecacttaa ctgcaacaac agtagtaact atagttaata 7286 tctatctatt gagttattgt gtgacagtta cttggataag tactttaatg cattctcatt 7346 ttaatcctca cagctaccct atgaggctgt tactgttctt atccccattg tattgataag 7406 gaaactgccc agggtactca gctaagaaga ggattgcttt gggcatagga agcagaatga 7466 cgagttcagt cttcctcagt agttggagca cagttctcaa agcccatcaa cactttggaa 7526 tggatttgtt gttttattta tgccatcaag ggagagttga tatttgtgta ttgctaaaaa 7586 ctactaaagt atgtcgatgc ttaggtagga acatacaaac catatatcct ctgggatctg 7646 cccaggtttc tgtataaggc ttgacctacg taagatccta tgatgaagac cagaaaactt 7706 tttttaaaag taggtaaatt aaaattaaaa tcacgagttt gttcacattt gtcccatagg 7766 ttcctagtgc aaaaatgcag ggagataaaa gcaaacattt gaactcagtg aagtgagagt 7826 ctttgggaac tcctagatgt tagaaatagc accggggcat caggtagcca acgttcaatt · 7886 cacttttcac gtttgtgtct ttgtagcttt agagctgatg agtctgattg gtttggaaga 7946 gagagtttta atttatgatg tcactgtgag aactgttgtg aaaattttgt aagaaaatac 8006 agtaatctgt tgattttttc ctgtagtttt ggctttcaca tccctttggc tgtgtttaag 8066 ttcaagagca tgccaaggcc atgagggtcc tggcttgcac ttcttgggaa cagggcatgc 8126 tagaggtggg tcatgaagct ttcaaggtca ctgttccagc ccgaccctgc gcaatttagg 8186 cattgccttt atgtctctcc tctctggaac ttcatgtagc agcctaacac cggg-gccgag^· 8246
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC- A0404-TW 2 6/3 9 ttgcctttac tctattttct atgatgaata cttgtggaga aactgtgaca aatccattga 8306 tcctgatatt tttattgttg gagtcttgtt gattctctat gaataatttc tatttgattg 8366 tactgtgtag agttaatacc cactagggat atgttaataa agctacaaat gcatagtgta 8426 atatagaata gcaagatttt tttgtgaaca atttatatag aagagtaagt tgttttttaa 8486 gtgttaggct catttctttt agaaacttaa aatgttataa aagtttttta aacattcaat 8546
atttttaatt ataagagaca tttgttacta gagccaatta tttcaggtgt tctaattgga 8606 gtgttgattt tattacctca tatacctcta gaatgccacg tgttctgttg gggataaaat 8666 tgcacaataa atgtcaagtc tctgtt 8692 <210> 4 <211> 437 <212> PRT <213〉 Homo sapiens
<400> 4
Met Gin Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys lie Tyr Lys Gin 15 10 15
Arg Ser Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala 20 25 30
Leu Ala Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val 35 40 45
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC-A0404-TW 2 7/3 9
Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val 50 55 60
Ser He Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gin Gin Phe Gin Ala Gin Ser 65 70 75 80
Ser Tyr Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser 85 90 95
Ser Pro Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gin Gly His Leu Arg Thr Pro 100 105 110
Ala Gin Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe 115 120 125
Ala Ala Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr 130 135 140
Gly Gly Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser 145 150 155 160
Arg Met lie Leu Asp Ala Phe Ala Gin Gin Cys Ser Arg Val Leu Ser 165 170 175
Leu Leu Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gin Ser 180 185 190
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC-A0404-TW 2 8/3 9
Met lie Ser Cys Val Lys Gin Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gin 195 200 205
Glu His Cys His lie Gly Lys Gly Val His Ser Gin Thr Ser Asp Asn 210 215 220
Val Asp lie Glu Met Gin Tyr Met Gin Arg Lys Gin Gin Thr Ser Ala 225 230 235 240
Phe Leu Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gin Asn Tyr Leu Leu Ser Gly 245 250 255
Ser Phe Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu 260 265 270
Ala Asp Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly 275 280 285
Trp Thr Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser 290 295 300
Thr Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro 305 310 315 320
Arg Cys Gin Glu Leu Glu Gin Glu Val lie Ser Leu Gin Gin Glu Asn 325 330 335
GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC- A0404—TW 2 9/3 9
Glu Glu Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser lie Pro Val Pro Cys Gin Thr 340 345 350
Val Leu Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gin His His Asn Gin Leu Leu 355 360 365 lie Pro Gin Pro Ala Asp Gin Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gin Leu Leu 370 375 380
Asn Asn Tyr Pro Val Tyr lie Thr Ser Lys Gin Trp Asp Glu Ala Val 385 390 - 395 400
Asn Ser Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu lie Arg 405 410 415
Phe Val Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys 420 425 430
Arg Lys Arg He His 435 〈210〉 5 <211〉 22 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉
<223> An artificially synthesized primer sequence for RT-PCR
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ONC— A0404—TW 3 0/3 9 <400〉 5 22 gtgacaaatc cattgatcct ga <210> 6 <211〉 23 <212〉 DNA <213〉 Artificial 〈220〉
〈223〉 An artificially synthesized primer sequence for RT- PCR <400> 6 23 gaacacgtgg cattctagag gta <210〉 7 <211> 9 <212> DNA <213〉 Artificial <220>
<223> An artificially synthesized spacer sequence for siRNA <400> 7 ttcaagaga 〈210〉 8 <211〉 19 <212〉 DNA <213〉 Artificial 〈220〉
<223> An artificially synthesized target sequence for siRNA
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0NC-A0404-TW 3 1/3 9 <400> 8 gatggttctg cagcaccac 19 <210〉 9 <211〉 19 <212> DNA <213〉 Artificial <220〉
<223> An artificially synthesized target sequence for siRNA <400> 9 19 gaagcagcac gacttcttc 〈210〉 10 <211> 47 <212> DNA <213〉 Artificial <220>
<223> An artificially synthesized origonucleotide sequence for hairpin siRNA <400> 10 gatggttctg cagcaccact tcaagagagt ggtgctgcag aaccatc 47 <210〉 11 〈211〉 51 <212> DNA <213〉 Artificial 〈220〉
<223> An artificially synthesized origonucleotide sequence for construe GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC—A0404-TW 3 2/3 9 tion of siRNA expression vector. <400〉 11 caccgatggt tctgcagcac cacttcaaga gagtggtgct gcagaaccat c 51 <210> 12 <211〉 51 <212〉 DNA <213〉 Artificial
<220〉 <223> An artificially synthesized origonucleotide sequence for construe .tion of siRNA expression vector. <400〉 12 aaaagatggt tctgcagcac cactctcttg aagtggtgct gcagaaccat c 51 <210〉 13
<211> 4863 <212〉 DNA <213〉 Artificial <220〉 <223〉 An artificially constructed plasmid sequence of siRNA expression vector. <400〉 13 gaeggategg gagatctccc ccactagtaa cggccgccag gcccgcgtct gaaccctccg caccacgtga cggagcgtga 60 120 180 gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctggat tgtgctggaa ttcggcttgg ggatcagcgt ttgagtaaga cgccgccccg gcoccagtgg aaagaegege aggcaaaacg ccgcgcgccg agcgcgcgcc aaggtcgggc aggaagaggg
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0NC-A0404-TW 3 3/3 9 cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat 300 tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta 360 ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct 420 taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa 480 caccttttta catcaggttg tttttctgtt tggttttttt tttacaccac gtttatacgc 540 cggtgcacgg tttaccactg aaaacacctt tcatctacag gtgatatctt ttaacacaaa 600 taaaatgtag tagtcctagg agacggaata gaaggaggtg gggcctaaag ccgaattctg 660 cagatatcca tcacactggc ggccgctcga gtgaggcgga aagaaccagc tggggctcta 720 gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc 780 gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt 840 cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag 900 ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt 960 cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt 1020 tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt 1080 cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt 1140 aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc 1200 cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag 1260 gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 1320
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gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 1380 cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 1440 ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 1500 caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg 1560 atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga 1620 gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt 1680 ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct 1740 gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg 1800 cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgotat tgggcgaagt 1860 gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc 1920 tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc 1980 gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga 2040 tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg 2100 catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat 2160 ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg 2220 ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc 2280 tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta 2340 tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg 2400 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
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acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc 2460 ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg 2520 gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat 2580 agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc 2640 aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg 2700 taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 2760 atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 2820 ttaattgcgt tgcgctcact-gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 2880 taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 2940 tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 3000 aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 3060 aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 3120 ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gteagaggtg gcgaaacccg 3180 acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 3240 ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 3300 tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 3360 tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 3420 gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt 3480 GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 200540183
0NC- A0404-TW 3 6/3 9 agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 3540 tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 3600 agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggttt ttttgtttgc 3660 aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 3720 gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 3780 aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 3840 atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 3900 gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 3960 atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 4020 ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 4080 cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 4140 agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 4200 cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 4260 tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 4320 agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 4380 gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 4440 gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 4500 ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 4560
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0NC— A0404—TW 3 7/3 9 tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 4620 tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 4680 gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 4740 caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 4800 atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac 4860
gtc 4863 <210> 14 <211〉 20 <212> DNA <213> artificial <220〉 <223> An artificially synthesized primer sequence pj^'--，
<400〉 14 ggggatcagc gtttgagtaa 20 <210> 15 <211〉 20 <212〉 DNA <213〉 artificial 〈220〉 。 <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 15 taggccccac ctccttctat 20
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0NC-A0404-TW 3 8/3 9 <210> 16 <211〉 30 〈212> DNA <213〉 artificial <220〉 <223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 16 tgcggatcca gagcagattg tactgagagt 30 <210〉 17 <211〉 29 <212〉 DNA <213> artificial <220〉 <223> An artificially synthesized primer sequence
<400> 17 ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca 29 <210> 18 <211〉 40 <212> DNA <213> artificial <220〉 <223> An artificially synthesized primer sequence <400> 18 tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct 40
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ONC- A0404-TW 3 9/3 9 <210> 19 〈211〉 37 〈212〉 DNA 〈213〉 artificial <220〉 〈223〉 An artificially synthesized primer sequence 〈400〉 19 tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca <210> 20 <211> 51 <212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 An artificially synthesized sequence for siRNA <400> 20 caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt 〈210〉 21 <211> 51 〈212〉 DNA <213〉 artificial <220〉 <223〉 An artificially synthesized sequence for siENA <400> 21 37 51
aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c GENES AND POLYPEPTIDES RELATING TO PROSTATE CANCERS 51

Claims (1)

  1. 200540183 十、申請專利範圍： 1. 一種實質上純化的多肽，係選自以下組成之群組： (a) —含有SEQ ID N0: 2或4胺基酸序列之多肽； (b) —含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列或與Seq Π) N0:2或4之序列具有80%以上同源性之多肽；以及 (〇—多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 環境下與含有SEQ ID N0 ··；!或3之多核苷酸進行雜交，且 該多肽與任何含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之多肽之 籲生物活性相等。 2. —種分離的多核普酸’其可編碼申請專利範圍第1 項所述多肽。 3· —種載體，其含有申請專利範圍第2項所述多核苷 酸。 4. 一種宿主細胞，其含有申請專利範圍第2項所述多 核苷酸或如申請專利範圍第3項所述載體。 φ 5· 一種製造申請專利範圍第1項所述之多肽之方法， 其包含下列步驟： (a) 培養如申請專利範圍第4項所述之宿主細胞； (b) 使該宿主細胞表現該多肽；以及 (c) 收集該表現的多肽。 6· —種抗體’其可與申請專利範圍第1項所述之多肽 結合。 7· 一種多核昏酸，其與編碼申請專利範酊第1項之多 狀之多核脊酸互補或與該多核苷酸之互補股互補，且其至 212 5-6 9 5 9-PF；Chiumeow 84 200540183 • 少包括15個核穿酸。 8· 一種反義多核苷酸或小型干擾RNA，其可對抗編碼 申請專利範圍第1項之多肽之多核苷酸。 9.如申請專利範圍第8項所述之小型干擾rna，其正 義股包含作為目標序列的SEQ ID N0 ·· 8核苷酸序列，且其 長度小於75個核脊酸。 I 0 _ —種診斷攝護腺癌之方法，包含下列步驟： (a) 偵測取自一生物樣本中的編碼SEq π N0 :2或4胺 # 基酸序列的基因表現量；以及 (b) 該基因表現量的提高代表與疾病有關。 II ·如申請專利範圍第1 〇項所述之方法，該表現量可 藉由任何選自下列群組的方法偵測，包含·· (a) 偵測編碼SEQ ID N0:2或4胺基酸序列的mRNA ; (b) 偵測含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列的蛋白質； 以及 _ (c)债測含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列的蛋白質生 物活性。 12· —種篩選可用來治療或預防攝護腺癌之化合物之 方法，其包含下列步驟： (a)將測試化合物與選自以下組成之群組的多肽接觸： (1) 一含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之多肽； (2) —含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列或與SEQ ID NO:2或4之序列具有8〇%以上同源性之多肽；以及 (3) —多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 2l25~6959-PF；chiume〇w 85 200540183 環境下與含有SEQ ID N0:1或3之多核苷酸進行雜交，且 該多肚與任何含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列之$狀之 生物活性相等； ' (b) 測試該多肽與測試化合物之間的結合活性；以及 (c) 選擇可與該多肽結合之測試化合物。 13. —種蒒選可用來治療或預防攝護腺癌之化合物之 方法，其包含下列步驟： (a)將測試化合物與選自以下組成之群組的多肽接觸： (1) 一含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列之多肽； (2) —含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列或與SEQ ID N0:2或4之序列具有80%以上同源性之多肽；以及 (3) —多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 裱境下與含有SEQ ID N0:1或3之多核苷酸進行雜交，且 該多肽與任何含有SEq ID N〇:2或4胺基酸序列之多肽之 生物活性相等； (b )偵測步驟（a )之多肽之生物活性；以及 (c)與未接觸測試化合物的多肽的生物活性相比較，選 擇一可抑制該多肽之生物活性之化合物。 14·如申請專利範圍第13項所述之方法，該生物活性 為細胞增生活性。 1 5 · —種筛選可用來治療或預防攝護腺癌之化合物之 方法，其包含下列步驟： ()將測”式化σ物與一細胞接觸，其中該細胞表現一或 多種含有SEQ ID N〇:l或3序列之多核苷酸；以及 2125-6959-PF；Chiumeow 200540183 (b ) /、未接觸測試化合物的表現量相比較，選擇可減少 或多種含有SEQ ID NO: 1或3核苷酸序列之多核苷酸之 表現量之化合物。 16·如申請專利範圍第15項所述之方法，其中該細胞 為攝護腺癌細胞。 1 7· 一種篩選可用來治療或預防攝護腺癌之化合物之 方法’其包含下列步驟： (a) 將測試化合物與一細胞接觸，其中該細胞係導入一 載體，該載體含有一或多個標記基因的轉錄調節區域，以 及一党到該轉錄調節區域控制的報導基因，其中該一或多 個標記基因包含任一選自包含SEQ ID Ν〇:ι及3之群組的 核苔酸序列； (b) 測量該報導基因的表現量或活性；以及 (c) 與控制組相比較，選擇可抑制該報導基因的表現量 或活性的化合物。 18.—種治療或預防攝護腺癌之醫藥組合物，該醫藥組 合物包含-可對抗-多核：g：酸之醫藥有效量之反義多核苷 酸或小型干i RNA #為活性成&，以及一 |藥可接受之載 劑，該多核杳酸可編碼選自以下組成之群組之多肽： (a) —含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列之多肽； (b) —含有SEQ ID Ν0:2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的-或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ ID Ν0: 2或4胺基酸，序列之蛋白質之生物 活性相等；以及 2125-6959-PP；Chiumeow 87 200540183 (C)一多核苔酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 壞境下與含有SEQ ID N〇:l或3核苷酸序列之多核苷酸進 打雜交’且該多肽與任何含有SEQ ID No』或4胺基酸序 列之多肽之生物活性相等。 19_如申請專利範圍第18項所述之醫藥組合物，其中 該小型干擾RNA含有SEq id Ν0·· 8的核苷酸序列作為目標 序列。 20·如申請專利範圍第1 9項所述之醫藥組合物，該小 _型干擾RNA的一般通式為5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中 [A]為對應至SEQ Π) Ν0··8核苷酸序列之核糖核苷酸序列， [Β]為一含有約3至23個核苷酸之核糖核苷酸序列， 以及 [Α’ ]為一與序列[Α]互補的核糖核苷酸序列。 21 ·如申請專利範圍第18項所述之醫藥組合物，該醫 藥組合物包含一轉染強化劑。 φ 22· 一種治療或預防攝護腺癌之醫藥組合物，該醫藥組 合物包含一醫藥有效量之抗體作為活性成分，以及一醫藥 可接受之載劑，其中該抗體可對抗選自以下組成之群組之 多肽： (a) —含有SEQ ID Ν0:2或4胺基酸序列之多肽； (b) —含有SEQ ID Ν0: 2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的一或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之蛋白質之生物 活性相等；以及 212 5-6 95 9-PF；Chiumeow 88 200540183 (C)一多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 環境下與含有SEQ ID N0:1或3之多核苷酸進行雜交嚴且 該多肽與任何含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之=肽之 生物活性相等。 ' 23·—種治療或預防攝護腺癌之醫藥組合物，該醫藥组 合物包含一醫藥有效量之化合物作為活性成分，^及二醫 藥可接受之載劑，#中該化合物可以利用中請專利範圍第 12項至第17項中任一項之方法所選出。 24.-種治療或預防攝護腺癌之方法，該方法包含施用 一可對抗-多核㈣之錢有效量之反義多核»或小型 干擾RNA，其中該多核苷酸可編碼選自以下組成之群組之 多肽： / (1) 一含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列之多肽； (2) —含有SEQ ID Ν0:2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的一或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ Ν〇:2或4胺基酸序列之蛋白質之胃生物 活性相等；以及 (3) —多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 環境下與含有SEQ ID Ν0:1或3核苷酸序列之多核苷酸進 行雜交，且該多肽與任何含有SEQ ID Ν〇:2或4胺基酸序 列之多肽之生物活性相等。 25.如申請專利範圍第24項所述之方法，其中該小型 干擾RNA a有SEQ ID Ν0: 8的核苔酸序列作為目標序列。 26·如申請專利範圍第25項所述之方法，其中該小型 2125-6959-PF;Chiumeow 89 200540183 干擾RNA的一般通式為5，—[a] 一 [B]-[A，]一3，，其中[A] 為對應至SEQ ID NO : 8核脊酸序列之核糖核有:酸序列， [B]為一含有約3至23個核苷酸之核糖核苷酸序列， 以及 [A’ ]為一與序列[幻互補的核糖核苷酸序列。 27·如申請專利範圍第24項所述之方法，該組合物包 含一轉染強化劑。 28·種冶療或預防攝護腺癌之方法，該方法包含施用 •醫藥有效量之抗體，其中該抗體可對抗選自以下組成之 群組之多肽： (a) —含有SEQ ID N0 或4胺基酸序列之多肽； (b) —含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的一或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ ID肋：2或4胺基酸序列之蛋白質之生物 活性相等；以及 φ ^ (C)—多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 壞境下與含有SEQ ID N〇:1或3核脊酸序列之多核苔酸進 灯雜父，且該多肽與任何含有SEQ ID Ν〇··2或4胺基酸序 列之多肽之生物活性相等。 —29· —種治療或預防攝護腺癌之方法，該方法包含一醫 藥有效量之化口物作為活性成分，其中該化合物可以利用 申請專利範圍第12項至第17項中任一項之方法所選出。 一種治療或預防攝護腺癌之方法，該方法包、含施用 醫藥有效量之多肽，或是編碼該多肽之多核苷酸，其中 2125-6959-PF;Chiumeow 90 200540183 - 該多肽可選自以下（a)至（c)組成的群組： (a) —含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列或其片段之多 肽； (b) —含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的一或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ Ν0··2或4胺基酸序列之蛋白質之3生物 活性相等；以及 (c) 一多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 •環境下與含有SEQ ID Ν0:1或3核苷酸序列之多核苷酸進 行雜交，且該多肽與任何含有SEQ ID Ν〇:2或4胺基酸序 列之多肽或其片段之生物活性相等。 31. —種誘發抗腫瘤免疫性之方法，該方法為將一抗原 表現細胞與-多肽、編碼該多肚之多核普酸或含有該多核 普酸的載體接觸’其中該多肽選自下列⑷至⑷組成的群 組： (a) 一含有SEQ ID肋：2或4胺基酸序列或其片段之多 肽； (b) —含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的一或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列之蛋白質之生物 活性相等；以及 (c) 一多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 環境下與含有SEQ ID Ν0··1或3核苷酸序列之多校杳酸進 行雜交，且該多肽與任何含有卿工請义以胺基酸序 2125-6959-PP；Chiumeow 91 4 200540183 列之多狀或其片段之生物活性相等。 d Z ·如甲請專利範圍第 包括將該抗原表現細胞施用至一對象之步 33.—種治療或預防攝護腺癌之醫藥組合物，該醫藥组 合物包含-醫藥有效量之多肽或編㈣多肽之多核苔酸作 為活性成分’以及一醫藥可接受载劑，其中該多肽選自下 列（a)至（c )組成的群組： (a) —含有SEQ ID Ν0··2或4胺基酸序列或其片段之多 • 肽； (b) —含有SEQ ID NO: 2或4胺基酸序列之多肽，其中 該多肽的一或多個胺基酸被取代、刪除、插入及/或增加， 並且與含有SEQ ID N0:2或4胺基酸序列之蛋白質之生物 活性相等；以及 (c) 一多核苷酸編碼之多肽，其中該多核苷酸可在嚴格 環境下與含有SEQ ID N0:1或3核苷酸序列之多核苷酸進 行雜交’且該多肽與任何含有SEQ Π) N0:2或4胺基酸序 列之夕狀或其片段之生物活性相等。 34·如申請專利範圍第33項所述之醫藥組合物，該多 核普酸為插入一表現載體中。 35. —種診斷試劑，包含一寡核苷酸或一抗體，其中該 券核普酸可與編碼申請專利範圍第1項之多肽之多核脊酸 雜交’該抗體可與申請專利範圍第1項之多肽結合。 3 6 · —種含有正義股及反義股之雙股分子，該正義股包 含一對應至SEQ ID NO: 8之核糖核苔酸序列，該反義股包 2125-6959-pf；Chiumeow 92 200540183 含一與正義股互補之核糖核苷酸序列，其中該正義股及反 義股互相雜交以形成雙股分子，且當將該雙股分子送入表 現CCDC4基因的細胞中’其可抑制該基因之表現。 37·如申請專利範圍第36項所述之雙股分子，其正義 股含有SEQ ID Ν0··1序列中約19至約25個連續核脊酸。 38·如申請專利範圍第36項所述之雙股分子，其正義 股含有對應至SEQ ID Ν0:8之核糖核苷酸序列。 39·如申請專利範圍第36項所述之雙股分子，當單一
    核糖核脊酸轉錄子包含正義股及反義股時，該雙股:子進 一步包含一單股核糖核苷酸序 πW以連結該正義股及該反義 股。 40· —種載體 股分子。 ’其編碼申請專利範 圍第36項所述之雙 項所述之載體，其中該載體 ，謗轉錄子含有一正義股及 41.如申請專利範圍第4〇 編碼一含有二級結構的轉錄子 一反義股。
    42·如申請專利範圍第4〇項 子進一步包含一單股核糖核苷酸序 ’其中該轉錄 反義股。 彳以連結該正義股及該 2125-6959-PF;Chiumeow
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