CN1984925A - 前列腺癌相关的基因和多肽 - Google Patents

Abstract

本申请提供了新的人类基因CCDC4，其表达在前列腺癌中显著增高。例如，该基因及其编码的多肽可用于前列腺癌的诊断，用作研制针对这种疾病的药物的靶分子，以及用于减缓前列腺癌的细胞生长。

Description

前列腺癌相关的基因和多肽

本申请要求2004年3月23日提交的美国临时申请流水号60/555,810的权利，在此完整引入其内容作为参考。

技术领域

本发明涉及生物科学领域，具体涉及癌症的治疗和诊断领域。具体地说，本发明涉及前列腺癌相关的新基因B3537(CCDC4)所编码的新多肽。更进一步地，本发明涉及新基因CCDC4。例如，本发明之基因和多肽可用于前列腺癌的诊断，用作开发针对此疾病的药物的靶分子，以及用于减缓前列腺癌的细胞生长。

技术背景

前列腺癌是西方国家男性最常见的癌症之一(Gronberg，Lancet 361：859-64(2003))。在发达国家，由于西方的饮食习惯及人口的老年化，前列腺癌的发病率正稳步增高。通过检测血清中前列腺特异抗原(PSA)可早期诊断前列腺癌，从而取得进行治疗性手术的机会，这已经明显改善了前列腺癌的预后。然而，可达30％的患者在接受根治性前列腺切除术后复发癌症(Han et al.，J Urol 166：416-9(2001))。多数复发的或晚期的癌症对雄激素消融疗法(androgen ablation therapy)有反应，因为前列腺癌的生长在初始阶段依赖雄激素。但是，多数接受这种治疗的患者最终进入雄激素非依赖期，这时他们对这种疗法就不再有反应。前列腺癌最严重的临床难题就是雄激素非依赖性前列腺癌对任何其它疗法都没有反应(Gronberg，Lancet 361：859-64(2003))。因此，建立不同于雄激素消融疗法的针对前列腺癌的新疗法已经成为前列腺癌处理中的一个急迫问题。

cDNA微阵技术提供了正常和恶性肿瘤细胞中基因表达的综合信息，以及比较恶性肿瘤和相应正常细胞中基因表达的能力(Okabe et al.，Cancer Res61：2129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 62：7012-7(2002))。这种方法使得人们能够了解癌细胞的复杂本质，也有助于理解致癌机理。肿瘤中失调基因的鉴定有助于更加准确地和精确地诊断各种肿瘤，并寻找新的治疗靶(Bienz and Clevers，Cell 103：311-20(2002))。为了从全基因组的角度来揭示肿瘤机制，发现诊断的靶分子，并研制新的治疗药物，本发明人使用23040个基因的cDNA微阵，分析了肿瘤细胞的表达谱(Okabe et al.，Cancer Res 61：2129-37(2001)；Kitahara et al.，Cancer Res 61：3544-9(2001)；Lin et al.，Oncogene 21：4120-8(2002)；Hasegawa et al.，Cancer Res 62：7012-7(2002))。

研究致癌机理对鉴定抗肿瘤剂的分子靶很有帮助。例如，法尼基转移酶(FTI)抑制剂最早用于抑制Ras相关生长信号传导途径，Ras的激活依赖翻译后法尼基化，现用于治疗动物模型的Ras依赖性肿瘤取得良好效果(He et al.，Cell 99：335-45(1999))。在人体临床试验中采用了组合疗法或抗癌药物加抗HER2单克隆抗体trastuzumab来拮抗原癌基因受体HER2/neu；且已经在乳癌患者中取得了有所改善的临床反应和整体存活率(Lin et al.，Cancer Res 61：6345-9(2001))。由于bcr-abl酪氨酸激酶的组成性激活在白细胞的转化中起重要作用，能选择性灭活bcr-abl融合蛋白的一种酪氨酸激酶抑制剂STI-571已用于治疗慢性髓细胞性白血病。这一类的药物设计用于抑制特异基因产物的致癌作用(Fujita et al.，Cancer Res 61：7722-6(2001))。因此，癌细胞中常常上调的基因产物可作为研究新抗癌药物的潜在靶。事实上，以能导致癌生长和发展的异常表达分子为靶的新药已经证实对某些类型的癌症有效。此类药物包括用于乳癌的Herceptin，用于慢性髓细胞性白血病的Glivec(STI571)，及用于非小细胞肺癌的Iressa(ZD1839)。

已知有几种分子在前列腺癌中过度表达，因而鉴定为前列腺癌的治疗靶或标志物(Xu et al.，Cancer Res 60：6568-72(2002)；Luo et a1.，Cancer Res62：2220-6(2002))。然而，这些分子多数在其它主要器官中同样高表达。这样，以这些分子为靶的药物可能对癌细胞是有毒的，但同样可能对其它器官的正常生长细胞造成损害。

研究显示，CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)能识别MHC I型分子上呈递的衍生自肿瘤相关抗原(TAA)的表位肽，并溶解肿瘤细胞。自第一个肿瘤相关抗原MAGE家族发现以来，使用免疫学方法发现了许多其它肿瘤相关抗原(Boon，Int J Cancer 54：177-80(1993)；Boon and van der Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J ExpMed 180：347-52(1994))。有些已发现的肿瘤相关抗原成为了免疫疗法的靶，现正在临床试验阶段。至今发现的肿瘤相关抗原包括MAGE(van derBruggen et al.，Science 254：1643-7(1991))，gp100(Kawakami et al.，J ExpMed 180：347-52(1994))，SART(Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998))，及NY-ESO-1(Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997))。另一方面，以前证实在肿瘤细胞中特异性过度表达的基因产物已发现能被识别为靶，诱导细胞免疫反应。此类基因产物包括p53(Umano etal.，Brit J Cancer 84：1052-7(2001))，HER2/neu(Tanaka et al.，Brit J Cancer 84：94-9(2001))，CEA(Nukaya et al.，Int J Cancer 80：92-7(1999))，等等。

尽管肿瘤相关抗原的基础和临床研究取得了显著进展(Rosenberg et al.，Nature Med 4：321-7(1998)；Mukherji et al.，Proc Natl Acad Sci USA 92：8078-82(1995)；Hu et al.，Cancer Res 56：2479-83(1996))，用于治疗包括结肠直肠癌在内的腺癌的候选肿瘤相关抗原只有为数不多的几个。在癌细胞中大量表达同时仅在癌细胞中表达的肿瘤相关抗原有希望成为免疫疗法的候选靶。此外，寻找新的能诱导有力的和特异的抗肿瘤免疫反应的肿瘤相关抗原将极大地激励在各种癌症中临床运用肽免疫接种策略(Boon and vander Bruggen，J Exp Med 183：725-9(1996)；van der Bruggen et al.，Science 254：1643-7(1991)；Brichard et al.，J Exp Med 178：489-95(1993)；Kawakami et al.，J Exp Med 180：347-52(1994)；Shichijo et al.，J Exp Med 187：277-88(1998)；Chen et al.，Proc Natl Acad Sci USA 94：1914-8(1997)；Harris，J Natl CancerInst 88：1442-5(1996)；Butterfield et al.，Cancer Res 59：3134-42(1999)；Vissers et al.，Cancer Res 59：5554-9(1999)；van der Burg et al.，J Immunol 156：3308-14(1996)；Tanaka et al.，Cancer Res 57：4465-8(1997)；Fujie et al.，Int JCancer80：169-72(1999)；Kikuchi et al.，Int J Cancer 81：459-66(1999)；Osio etal.，Int J Cancer 81：387-94(1999))。

有多次报道显示，从某些健康供体获得的受肽刺激的外周血单核细胞(PBMC)在受到肽刺激后产生相当高水平的IFN-γ，但在⁵¹Cr释放测定法中几乎不以HLA-A24或-A0201限制方式对肿瘤细胞产生细胞毒性作用(Kawano et al.，Cancer Res 60：3550-8(2000)；Nishizaka et al.，Cancer Res 60：4830-7(2000)；Tamura et al.，Jpn J Cancer Res 92：762-7(2001))。然而，HLA-A24和-A0201都是日本人及高加索人中常见的HLA等位基因之一(Date et al.，Tissue Antigens 47：93-101(1996)；Kondo et al.，J Immunol155：4307-12(1995)；Kubo et al.，J Immunol 152：3913-24(1994)；Imanishi et al.，Proceeding of the eleventh International Histocompatibility Workshop andConference Oxford University Press，Oxford，1065(1992)；Williams et al.，Tissue Antigens 49：129(1997))。因此，由这些HLA呈递的癌抗原肽对治疗日本人及高加索人的癌症可能尤为重要。此外，已知体外诱导低亲和力的细胞毒性T淋巴细胞通常需要高浓度的肽，在抗原呈递细胞(APC)上形成高水平的特异肽/MHC复合物，才能有效激活这些细胞毒性T淋巴细胞(Alexander-Miller et al.，Proc Natl Acad Sci USA 93：4102-7(1996))。

发明概述

为了揭示前列腺癌的发病机理，鉴定新的诊断标志物和/或治疗这些肿瘤的药物靶，本发明人使用全基因组cDNA微阵结合激光微光束显微切割技术，分析了前列腺癌的基因表达谱。在前述研究中，通过将激光显微切割与全基因组cDNA微阵结合，获得了前列腺癌细胞(PRC)和非侵入性前体细胞(PIN)的精确表达谱。将侵入性PRC的表达谱与正常前列腺上皮或非侵入性前体PIN相比较，本发明人鉴定了侵入性PRC和前体PIN所共有的88个上调基因和207个下调基因。在本发明中，本发明人着重于一个表达序列标签(EST)，并鉴定了在前列腺癌细胞中过度表达的一个新基因，CCDC4。

结果，CCDC4鉴定为在前列腺癌细胞中特异性过度表达。本发明人显示了通过siRNA获得的CCDC4抑制效果减缓前列腺癌细胞的生长，而且这个分子可能成为前列腺癌新疗法的药物设计的潜在靶。

CCDC4编码包含卷曲螺旋域、有530个氨基酸的蛋白质。根据Northern印迹分析，CCDC4的表达仅限于睾丸和前列腺。

许多抗癌药物不仅对癌细胞有毒，对正常生长细胞同样有毒。然而，基于CCDC4的正常表达仅限于睾丸和前列腺的事实，抑制CCDC4表达的药物可能不会对其它器官有不良作用，因而可方便地用于治疗或预防前列腺癌。因此，本发明提供了分离的基因，CCDC4，它可作为前列腺癌的候选诊断标志物，以及开发新诊断策略和有效抗癌药物的有希望的潜在靶。此外，本发明提供了由该基因编码的多肽，及其生产和使用。更具体地，本发明提供了新的人类多肽，CCDC4或其功能等同物，其表达在前列腺癌细胞中是增高的。

在一个优选的实施方案中，CCDC4多肽包含由开放读码框SEQ ID NO：1编码的530个氨基酸的蛋白质，或是由开放读码框SEQ ID NO：3编码的437个氨基酸的蛋白质。CCDC4多肽优选包含SEQ ID NO：2(Gene Bank编号：AB126828)或SEQ ID NO：4(Gene Bank编号：AB126829)所列氨基酸序列。本申请还提供了由至少部分CCDC4多核苷酸序列或是与SEQ IDNO：1或3所列序列至少15％且更优选至少25％互补的多核苷酸序列编码的分离的蛋白质。

本发明进一步提供了新的人类基因，CCDC4，其表达在绝大多数前列腺癌中较相应的非癌前列腺管上皮明显增高。分离的CCDC4基因包含SEQID NO：1或3所述多核苷酸序列。尤其，CCDC4 cDNA包含8763个核苷酸，其中包含1593个核苷酸的开放读码框(SEQ ID NO：1)，或是8692个核苷酸，其中包含1314个核苷酸的开放读码框(SEQ ID NO：3)。本发明还涵盖能与SEQ ID NO：1或3所列多核苷酸序列杂交且至少15％且更优选至少25％互补的多核苷酸，以至于它们编码CCDC4蛋白质或其功能等同物。此类多核苷酸的例子是由序列SEQ ID NO：1或3编码的CCDC4的简并或等位基因突变体。

如这里所用，分离的基因是指在结构上不同于任何自然存在的多核苷酸或者自然存在并跨越3个以上分开基因的基因组多核苷酸的任何片段的多核苷酸。因此，该术语包括，例如：(a)DNA，其序列是自然存在的基因组DNA分子的一部分，该分子在它所自然存在的生物体的基因组中；(b)多核苷酸，掺入到载体或者原核生物或真核生物的基因组DNA中，以至于得到的分子不同于任何自然存在的载体或基因组DNA；(c)分开的分子诸如cDNA、基因组片段、聚合酶链反应(PCR)所产生的片段、或限制性片段；和(d)作为杂合基因即编码融合多肽的基因一部分的重组核苷酸序列。

据此，在一方面，本发明提供了编码本文所述多肽或其片段的分离的多核苷酸。优选地，分离的多核苷酸包含与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列至少60％相同的核苷酸序列。更优选地，分离的核酸分子与SEQ ID NO：1或3所示核苷酸序列至少65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或以上相同。如果分离的多核苷酸在长度上比参考序列，如SEQ ID NO：1或3更长或同样长，用全长参考序列进行比较。当分离的多核苷酸比参考基因短，如比SEQ ID NO：1或3短，用相同长度的一段参考序列进行比较(排除同源性计算要求的任何环)。

本发明还提供了以编码CCDC4蛋白质的多核苷酸序列转染或转化宿主细胞并表达该多核苷酸序列来生产蛋白质的方法。加之，本发明提供了包含编码CCDC4蛋白质的多核苷酸序列的载体和包含编码CCDC4蛋白质的多核苷酸的宿主细胞。此类载体和宿主细胞可用于生产CCDC4蛋白质。

本申请还提供了能特异识别CCDC4蛋白质的结合剂。例如，结合剂可以是针对CCDC4蛋白质诱导的抗体。或者，结合剂可以是对该蛋白质特异的配体，或是能与该蛋白质特异结合的人工合成多肽(参见如WO2004044011)。还提供了CCDC4基因的反义多核苷酸(如反义DNA)、核酶、和siRNA(小干扰RNA)。

本发明还提供了用于诊断前列腺癌的方法，它包括以下步骤：测定受试者生物样本中该基因的表达水平，与正常样本比较CCDC4基因的表达水平，并确定样本中CCDC4基因的高表达水平说明该受试者患有前列腺癌或者有发展为前列腺癌的危险。

此外，本发明还提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法。该方法包括使CCDC4多肽与测试化合物接触，并选择与CCDC4多肽结合或改变CCDC4生物学活性的测试化合物。

本发明还提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，其中该方法包括使测试化合物与表达CCDC4多肽或者导入了下述载体的细胞接触，所述载体在报道基因上游包含CCDC4的转录调控区，并选择抑制CCDC4多肽的表达水平的测试化合物。

本申请还提供了用于治疗或预防前列腺癌的药用组合物。该药用组合物可以是例如抗癌药物。该药用组合物可包含针对SEQ ID NO：1和3各自所示和所述CCDC4多核苷酸序列的反义S-寡核苷酸、siRNA分子或核酶的至少一部分。适当的siRNA以序列SEQ ID NO：8为靶。因此，本发明之siRNA包含来自SEQ ID NO：8的核苷酸序列。根据本发明，这可优选地选作治疗或预防前列腺癌的靶。所述药用组合物还可以是包含通过本发明之筛选用于治疗或预防细胞增殖性疾病诸如前列腺癌的化合物的方法选择的化合物的药用组合物。

所述药用组合物的作用过程最好是抑制癌细胞诸如前列腺癌细胞的生长。所述药用组合物可用于包括人类和已驯化哺乳动物在内的哺乳动物。

本发明还提供了用本发明所提供的药用组合物治疗或预防前列腺癌的方法。

此外，本发明还提供了用于治疗或预防癌症的方法，该方法包括的步骤有施用CCDC4多肽。期望通过施用CCDC4多肽能诱导抗肿瘤免疫。因此，本发明还提供了用于诱导抗肿瘤免疫的方法，该方法包括的步骤有施用CCDC4，以及包含CCDC4多肽的用于治疗或预防癌症的药用组合物。

应该理解的是前述的发明概述及以下的详细说明都是优选的实施方案，并不限制本发明或本发明的其它可选实施方案。

附图简述

图1(A)是描述半定量PCR结果的照片。CCDC4在从人前列腺癌组织显微切割的前列腺癌细胞中过度表达。图1(B)是描述显示CCDC4在正常组织中表达谱的Northern印迹分析的照片。CCDC4的8.7kb转录本只限于在成人睾丸和前列腺中表达。

图2显示了通过siRNA抑制前列腺癌细胞系PRC3中内源性CCDC4的效果。图2(A)是显示RT-PCR结果的照片。该照片证实了转染siRNA表达载体si#1抑制CCDC4 mRNA的效果。si#1是专为CCDC4 mRNA序列设计的，而siEGFP是为EGFP mRNA序列设计的。转染后48小时收获并分析RNA。ACTB用于使输入cDNA标准化。图2(B)是显示集落形成实验结果的照片。该照片显示了经RT-PCR证实能有效抑制CCDC4的si#1转染后一周，PRC3细胞的集落数明显减少。图2(C)是显示MTT实验结果的条形图。该实验同样显示了转染si#1后生长细胞数的显著减少。

发明详述

这里所用的词语“一个/种”和“这个/种”是指“至少一个/种”，除非另有说明。

为了揭示前列腺癌的机制及鉴定新的诊断标志物和/或用于治疗和/或预防这些肿瘤的药靶，本发明人使用全基因组cDNA微阵结合激光微光束显微切割，分析了前列腺癌中的基因表达谱。结果表明，CCDC4特异地在前列腺癌细胞中过度表达。而且，用小干扰RNA(siRNA)抑制CCDC4基因表达导致明显的癌细胞生长抑制。这些发现提示CCDC4致使癌细胞具有致瘤作用，而且抑制这些蛋白质的活性可作为治疗和预防增殖性疾病诸如前列腺癌的有希望的策略。

CCDC4

根据本发明，鉴定了具有相似序列的两个基因，它们编码CCDC4的变体。较长变体的cDNA由8763个核苷酸组成，含有1593个核苷酸的开放读码框(SEQ ID NO：1)，而较短的变体由8692个核苷酸组成，含有1314个核苷酸的开放读码框(SEQ ID NO：3)。这些开放读码框分别编码530个氨基酸的蛋白质和437个氨基酸的蛋白质。

因此，本发明提供了基本上纯的由这些基因编码的多肽，包括包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽及其功能等同物，只要它们编码CCDC4蛋白质。在功能上与CCDC4等同的多肽的例子包括，例如其它生物体对应于人CCDC4蛋白质的同源蛋白，以及人CCDC4蛋白质的突变体。

在本发明中，术语“功能上等同的”是指目标多肽具有类似CCDC4蛋白质的促进细胞增殖和授予癌细胞致癌活性的作用。目标多肽是否具有细胞增殖活性可以通过将编码目标多肽的DNA导入细胞，表达相应多肽并检测其对细胞增殖的促进或集落形成活性的增高来判断。此类细胞包括，例如，NIH3T3、COS7和HEK293。

用于制备功能上与指定蛋白质等同的多肽的方法为本领域技术人员所熟知，包括将突变引入蛋白质的已知方法。例如，本领域技术人员可通过定点突变将适当的突变引入这些蛋白质的氨基酸序列来制备功能上与人CCDC4蛋白质等同的多肽(Hashimoto-Gotoh et al.，Gene 152：271-5(1995)；Zoller and Smith，Methods Enzymol 100：468-500(1983)；Kramer et al.，NucleicAcid Res 12：9441-9456(1984)；Kramer and Fritz，Methods Enzymol 154：350-67(1987)；Kunkel，Proc Natl Acad Sci USA 82：488-92(1985)；Kunkel，Methods Enzymol 85：2763-6(1988))。氨基酸突变也可能自然发生。本发明之多肽包括具有人CCDC4蛋白质的氨基酸序列但其中一个或多个氨基酸发生突变的蛋白质，只要得到的突变多肽在功能上等同于人CCDC4蛋白质。此类突变体中的突变氨基酸数目通常为10个氨基酸或更少，优选6个氨基酸或更少，更优选3个氨基酸或更少。

已知突变的或修饰的蛋白质，具有在某种氨基酸序列上通过替代、删除、插入和/或添加一个或多个氨基酸残基而修饰的氨基酸序列的蛋白质，能保留原有的生物学活性(Mark et al.，Proc Natl Acad Sci USA 81：5662-6(1984)；Zoller and Smith，Nucleic Acid Res 10：6487-500(1982)；Dalbadie-McFarland et al.，Proc Natl Acad Sci USA 79：6409-13(1982))。

突变氨基酸残基优选突变为不同氨基酸残基，其中氨基酸侧链的特性不变(一个称为保守氨基酸替代的过程)。氨基酸侧链的特性的例子包括疏水性氨基酸(A，I，L，M，F，P，W，Y，V)，亲水性氨基酸(R，D，N，C，E，Q，G，H，K，S，T)，和带有以下共同官能基或特征的侧链：脂肪族侧链(G，A，V，L，I，P)；含羟基侧链(S，T，Y)；含硫原子侧链(C，M)；含羧酸和酰胺侧链(D，N，E，Q)；含碱基侧链(R，K，H)；及含芳香族侧链(H，F，Y，W)。注意，附带说明的字母指的是氨基酸的单字母代码。

将一个或多个氨基酸残基加到人CCDC4蛋白质的氨基酸序列中所得到的多肽的一个例子是包含人CCDC4蛋白质的融合蛋白。融合蛋白，人CCDC4蛋白质与其它肽或蛋白质的融合体，包含在本发明中。融合蛋白可通过本领域技术人员所熟知的技术来制备，诸如将编码本发明之人CCDC4蛋白质的DNA与编码其它肽或蛋白质的DNA连接在一起，并保证读码框正确，将融合DNA插入表达载体并在宿主中表达。对与本发明之蛋白质融合的肽或蛋白质不作限制。

可用作与本发明之蛋白质融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hoppet al.，Biotechnology 6：1204-10(1988))，含6个His(组氨酸)残基的6xHis，10xHis，流感凝集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，p18 HIV片段，T7标签，HSV标签，E标签，SV40 T抗原片段，lck标签，α-微管蛋白片段，B标签，蛋白质C片段等等。可与本发明之蛋白质融合的蛋白质的例子包括GST(谷胱苷肽-S-转移酶)，流感凝集素(HA)，免疫球蛋白恒定区，β-半乳糖苷酶，MBP(麦芽糖结合蛋白)等等。

融合蛋白可通过将编码上述融合肽或蛋白质的市售DNA与编码本发明之多肽的DNA融合并表达所得融合DNA来制备。

在本领域已知的可供选择的分离功能等同多肽的方法是，例如，运用杂交技术的方法(Sambrook et al.，Molecular Cloning 2nd ed。9.47-9.58，ColdSpring Harbor Lab.Press(1989))。本领域技术人员能轻易地分离出与编码人CCDC4蛋白质的整个或部分DNA序列(即SEQ ID NO：1或3)具有高度同源性的DNA，并由分离的DNA分离人CCDC4蛋白质的功能等同多肽。本发明之多肽包括由能与编码人CCDC4蛋白质的整个或部分DNA序列杂交的DNA编码且在功能上等同于人CCDC4蛋白质的多肽。这些多肽包括对应于衍生自人类的蛋白质的哺乳动物同系物(例如由猴、大鼠、兔和牛基因编码的多肽)。在从动物分离与编码人CCDC4蛋白质的DNA高度同源的cDNA时，使用来自睾丸或前列腺的组织是特别优选的。

用于分离编码在功能上与人CCDC4蛋白质等同的多肽的DNA的杂交条件可由本领域技术人员按常规作出选择。例如，杂交可如下进行：用“快速杂交缓冲液”(Amersham LIFE SCIENCE)于68℃预杂交30分钟或更长，加入已标记探针，并于68℃保温1小时或更长。以下清洗步骤可在例如低严格性条件下进行。低严格性条件是例如42℃，2X SSC，0.1％SDS，或是优选50℃，2X SSC，0.1％SDS。更优选使用高严格性条件。高严格性条件是例如于室温在2X SSC，0.01％SDS中洗三次，20分钟；然后于37℃在1X SSC，0.1％SDS中洗三次，20分钟；再然后于50℃，在1X SSC，0.1％SDS中洗两次，20分钟。然而，有些因素，诸如温度和盐浓度，能影响杂交的严格度，而本领域技术人员能选择合适的条件以达到所需的严格度。

可采用基因扩增的方法，例如聚合酶链反应(PCR)方法代替杂交用于分离编码在功能上与人CCDC4蛋白质等同的多肽的DNA，所用引物是根据编码该蛋白质的DNA(SEQ ID NO：1或3)的序列信息合成的。

由前述的杂交技术或基因扩增技术分离的DNA所编码的在功能上与人CCDC4蛋白质等同的多肽通常与人CCDC4蛋白质的氨基酸序列具有高度同源性。“高度同源性”一般是指一种多肽序列或一种多核苷酸序列与参考序列之间40％或更高同源性，优选60％或更高，更优选80％或更高，甚至更优选85％，90％，93％，95％，98％，99％或更高。同源性百分比(也称为同一性百分比)通常在两个最佳比对的序列之间进行。为比较而进行的序列比对方法在本领域是众所周知的。序列的最佳比对和比较可按照例如“Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80：726-30(1983)”中的算法进行。

根据用于生成本发明之多肽的细胞或宿主或是所采用的纯化方法，其氨基酸序列、分子量、等电点、是否有糖链、或者型方面有差异。无论怎样，只要它具有与本发明之人CCDC4蛋白质等同的功能，它就包含在本发明的范围内。

本发明之多肽可通过本领域技术人员熟知的方法以重组蛋白或天然蛋白的形式制备。重组蛋白的制备可通过将编码本发明之多肽的DNA(例如包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的DNA)插入适当的表达载体，将载体导入适当的宿主细胞，收获提取物，并通过将提取物层析来纯化多肽，层析例如离子交换层析、反相层析、凝胶过滤或亲和层析，即利用固定有针对本发明之蛋白质的抗体的柱子进行的层析，或者结合一种以上上述柱子的层析。

同样，当本发明之多肽在宿主细胞(例如动物细胞和大肠杆菌)中作为与谷胱甘肽-S-转移酶蛋白质的融合蛋白或补充了多个组氨酸的重组蛋白的形式表达时，表达的重组蛋白可用谷胱甘肽柱或镍柱进行纯化。或者，当本发明之多肽以标有c-myc、多个组氨酸或FLAG的蛋白质的形式表达时，可用针对c-myc、His或FLAG的相应抗体检测和纯化该蛋白质。

融合蛋白质纯化以后，还可能根据需要用凝血酶或Xa因子切除目标多肽以外的区域。

天然蛋白的分离可通过本领域技术人员熟知的方法进行，例如让表达本发明之多肽的组织或细胞的提取物经过附着有如下所述的能与CCDC4蛋白质结合的抗体的亲和柱。该抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。

本发明还涵盖本发明之多肽的部分肽段。部分肽段具有本发明之多肽的特异氨基酸序列并由至少7个氨基酸组成，优选8个氨基酸或更多，更优选9个氨基酸或更多。部分肽段可用于例如制备针对本发明之多肽的抗体，筛选能与本发明之多肽结合的化合物，及筛选本发明之多肽的抑制剂。

本发明之部分肽段可通过基因工程，通过已知的肽合成或通过用适当的肽酶消化本发明之多肽来生成。对于肽合成，例如，可用固相合成或液相合成。

本发明进一步提供了编码上述CCDC4多肽的多核苷酸。本发明之多核苷酸可用于在体内或体外生成如上所述的本发明之多肽，或者可用于可归因于编码本发明之蛋白质的基因中遗传异常的疾病的基因疗法。本发明之多核苷酸的任何形式都可使用，只要它编码本发明之多肽，包括mRNA、RNA、cDNA、基因组DNA、及化学合成的多核苷酸。本发明之多核苷酸包括包含指定核苷酸序列及其简并序列的DNA，只要所得DNA编码本发明之多肽。

本发明之多核苷酸可通过本领域技术人员知道的方法来制备。例如，本发明之多核苷酸可如下制备：从表达本发明之多肽的细胞制备cDNA文库，并以本发明之DNA(例如SEQ ID NO：1或3)的部分序列作为探针进行杂交。cDNA文库的制备可采用，例如，Sambrook等编写的《分子克隆》，冷泉港实验室出版社(1989)中所描述的方法；或者，可采用市售cDNA文库。cDNA文库还可如下制备：从表达本发明之多肽的细胞提取RNA，根据本发明之DNA的序列(例如SEQ ID NO：1或3)合成寡DNA，以所述寡DNA为引物进行PCR，并扩增编码本发明之蛋白质的cDNA。

另外，通过对所得cDNA的核苷酸测序，可常规确定由所述cDNA编码的翻译区，且能容易地得到本发明之多肽的氨基酸序列。还有，以得到的cDNA或其部分作为探针，筛选基因组DNA文库，就能分离得到基因组DNA。

更具体地说，首先可从表达本发明之多肽的细胞、组织或器官(如睾丸或前列腺)制备mRNA。可使用已知方法来分离mRNA；例如通过胍超速离心(Chirgwin et al.，Biochemistry 18：5294-9(1979))或AGPC法(Chomczynski and Sacchi，Anal Biochem 162：156-9(1987))制备总RNA。此外，可用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)和类似的试剂盒从总RNA纯化mRNA。或者，可以用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接纯化mRNA。

使用逆转录酶从所得mRNA合成cDNA。cDNA的合成可采用市售试剂盒，诸如AMV逆转录酶cDNA第一链合成试剂盒(Seikagaku Kogyo)。或者，cDNA可遵循5′-RACE法用这里所描述的引物和类似的引物、5′-AmpliFINDER RACE试剂盒(Clontech)、及聚合酶链反应(PCR)合成和扩增(Frohman et al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：8998-9002(1998)；Belyavsky etal.，Nucleic Acid Res 17：2919-32(1989))。

从PCR产物中制备所需DNA片段并与载体DNA连接。将重组载体用于转染大肠杆菌之类，并从选出的菌落制备所需重组载体。所需DNA的核苷酸序列可经常规方法鉴定，诸如双脱氧核糖核酸链终止法。

本发明之多核苷酸的核苷酸序列可在设计时考虑表达所用宿主细胞的密码子使用频率以提高表达效率(Grantham et al.，Nucleic Acid Res 9：43-74(1981))。本发明之多核苷酸的序列可用市售试剂盒或常规方法来改变。例如，为改变序列，可用限制酶消化序列，插入合成的寡核苷酸或适当的多核苷酸片段，掺入接头，或插入起始密码子(ATG)和/或终止密码子(TAA，TGA或TAG)。

具体而言，本发明之多核苷酸涵盖包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的DNA。

而且，本发明提供了能在高严格度条件下与具有核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的多核苷酸杂交并编码在功能上与如前所述本发明之CCDC4蛋白质等同的多肽的多核苷酸。本领域技术人员可选择适宜的严格度条件。例如，可使用低严格度条件。更优选地，可使用高严格度条件。这些条件与前述的相同。上述杂交DNA优选cDNA或染色体DNA。

本发明还提供了与编码人CCDC4蛋白质的多核苷酸(SEQ ID NO：1或3)或其互补链互补且包含至少15个核苷酸的多核苷酸。本发明之多核苷酸优选能与编码本发明之CCDC4多肽的DNA特异杂交的多核苷酸。这里所用的术语“特异杂交”是指在通常杂交条件下，优选在高严格度杂交条件下，与编码其他蛋白质的DNA无明显交叉杂交发生。此类多核苷酸包括能与编码本发明之多肽的DNA或其互补链特异杂交的探针、引物、核苷酸及核苷酸衍生物(例如反义寡核苷酸和核酶)。此外，此类多核苷酸可用于制备DNA芯片。

载体和宿主细胞

本发明还提供了导入了本发明之多核苷酸的载体和宿主细胞。本发明之载体可用于在宿主细胞中保存本发明之多核苷酸，尤其是DNA，表达本发明之多肽，或在基因疗法中施用本发明之多核苷酸。

当宿主细胞是大肠杆菌且载体在大肠杆菌(如JM109，DH5α，HB101，或XL1 Blue)中大量扩增和生成时，载体须具有在大肠杆菌中扩增的“起点”及标志基因以便筛选受到转化的大肠杆菌(如能由诸如氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、氯霉素等药物筛选的抗药基因)。例如，可使用M13系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等。此外，pGEM-T、pDIRECT和pT7及上述载体可用于亚克隆和提取cDNA。当载体是用于生产本发明之蛋白质时，表达载体尤其有用。例如，在大肠杆菌中表达的表达载体须具备上述在大肠杆菌中扩增的特征。当使用大肠杆菌，诸如JM109，DH5α，HB101或XL1 Blue作为宿主细胞时，载体必包含能在大肠杆菌中高效表达所需基因的启动子，例如lacZ启动子(Ward et al.，Nature 341：544-6(1989)；FASEB J 6：2422-7(1992))，araB启动子(Better etal.，Science 240：1041-3(1988))，T7启动子等等。从这一点出发，可使用例如pGEX-5X-1(Pharmacia)，“QIAexpress系统”(Qiagen)，pEGFP和pET(在这种情况中，宿主优选表达T7 RNA聚合酶的BL21)替代上述载体。此外，载体还可包含多肽分泌所需的信号序列。引导多肽分泌到大肠杆菌周质的例示性信号序列是pelB信号序列(Lei et al.，J Bacteriol 169：4379(1987))。用于将载体导入靶宿主细胞的手段包括，例如氯化钙法和电穿孔法。

除大肠杆菌以外，例如，可使用衍生自哺乳动物的表达载体(例如pcDNA3(Invitrogen)和pEGF-BOS(Nucleic Acid Res 18(17)：5322(1990))，pEF，pCDM8)，衍生自昆虫细胞的表达载体(例如“Bac-to-BAC杆状病毒表达系统”(GIBCO BRL)，pBacPAK8)，衍生自植物的表达载体(如pMH1，pMH2)，衍生自动物病毒的表达载体(如pHSV，pMV，pAdexLcw)，衍生自逆转录病毒的表达载体(如pZIpneo)，衍生自酵母的表达载体(如“毕赤酵母表达试剂盒”(Invitrogen)，pNV11，SP-Q01)，及衍生自枯草芽孢杆菌的表达载体(如pPL608，pKTH50)来生产本发明之多肽。

为了在哺乳动物细胞，诸如CHO、COS和NIH3T3细胞中表达载体，载体须含有在此类细胞中表达所必需的启动子，例如SV40启动子(Mulliganet al.，Nature 277：108(1979))，MMLV-LTR启动子，EFlα启动子(Mizushimaet al.，Nucleic Acid Res 18：5322(1990))，CMV启动子等等，并且优选含有用于筛选转化子的标志基因(例如可由药物(如新霉素，G418)筛选的抗药基因)。具备这些特征的已知载体的例子包括例如pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV和pOP13。

生产多肽

此外，本发明还提供了用于生产本发明之多肽的方法。为了制备多肽，可培养含有下述表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码所述多肽的基因。根据需要，这些方法可用于稳定地表达基因，同时在细胞中增加其拷贝数。例如，可将包含互补DHFR基因的载体(如pCHOI)导入核酸合成途径遭到删除的CHO细胞，并用氨甲蝶呤(MTX)扩增。而且，在短暂表达基因的情况中，可运用将含有SV40复制起点的载体(pcD等)转化到染色体中包含SV40 T抗原表达基因的COS细胞中的方法。

按上述方法所获得的本发明之多肽可从宿主细胞内或细胞外(诸如培养基)分离，并纯化成基本上纯的均质多肽。这里所用关系到指定多肽的术语“基本上纯的”是指该多肽基本上不含其他生物学大分子。基本上纯的多肽在干重中达到至少75％(如至少80，85，95或99％)的纯度。纯度可用适当的标准方法来测量，例如柱层析，聚丙烯酰胺凝胶电泳，或HPLC分析。多肽分离和纯化的方法不限于任何特定的方法；事实上，可采用任何标准方法。

例如，柱层析，过滤，超滤，盐沉淀，溶剂沉淀，溶剂提取，蒸馏，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，等电点电泳，透析，和重结晶，均可恰当选择并结合起来以分离和纯化多肽。

层析的例子包括，例如亲和层析，离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸收层析，等等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed.Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。这些层析可用液相层析来进行，诸如HPLC和FPLC。这样，本发明提供了通过以上方法制备的高度纯化的多肽。

本发明之多肽可任选在纯化前或纯化后通过用适当的蛋白质修饰酶进行处理来修饰或者部分删除。有用的蛋白质修饰酶包括，但不限于，胰蛋白酶，糜蛋白酶，赖氨酰内肽酶，蛋白激酶，葡萄糖苷酶等等。

抗体

本发明提供了能与本发明之多肽结合的抗体。本发明之抗体可以任何形式使用，诸如单克隆或多克隆抗体，并包括通过用本发明之多肽免疫动物，诸如兔所获得的抗血清，所有类别的多克隆和单克隆抗体，人源抗体和通过基因重组生成的人源化抗体。

作为抗原用于获得抗体的本发明之多肽可以是衍生自任何动物物种，但优选衍生自哺乳动物，诸如人、小鼠或大鼠，更优选衍生自人。衍生自人的多肽可通过本发明所公开的核苷酸或氨基酸序列获得。根据本发明，用作免疫抗原的多肽可以是完整的蛋白质或蛋白质的部分肽段。部分肽段可包含，例如本发明之多肽的氨基末端(N端)或羧基末端(C端)片段。

在这里，抗体定义为能与本发明之多肽的全长或片段发生反应的蛋白质。

可将编码本发明之多肽或其片段的基因插入已知的表达载体，然后用于转化本文所述的宿主细胞。所需多肽或其片段可通过任何标准方法从宿主细胞内或细胞外回收，然后可用作抗原。或者，可使用表达多肽的整个细胞或其裂解物，或是化学合成的多肽作为抗原。

任何哺乳动物都可用该抗原免疫，但优选考虑其与细胞融合所用亲本细胞的相容性。通常选用啮齿目(Rodentia)、兔形目(Lagomorpha)或灵长目(Primate)的动物。啮齿目动物包括例如小鼠，大鼠和仓鼠。兔形目动物包括例如兔。灵长目动物包括例如狭鼻类的猴(旧世纪猴)，诸如食蟹猴(Macaca fascicularis)，猕猴，狒狒和黑猩猩。

用抗原免疫动物的方法是本领域已知的。腹膜内注射或皮下注射抗原是免疫哺乳动物的标准方法。更详细地说，将抗原用适量的磷酸盐缓冲盐水(PBS)、生理盐水等稀释和悬浮。如需要，抗原悬浮液可与适量的标准佐剂混和，诸如弗氏完全佐剂，形成乳状液，然后施用于哺乳动物。优选地，随后每4到21天施用抗原与适量弗氏不完全佐剂的混合物，重复多次。适当的载体也可用于免疫。如上所述免疫后，通过标准方法检验血清中所需抗体水平的增加。

针对本发明之多肽的多克隆抗体可通过从血清中所需抗体水平检验到增高的被免疫哺乳动物采集血液，并运用任何常规方法从血液分离血清来制备。多克隆抗体包括含有多克隆抗体的血清，以及从血清中分离出来的含多克隆抗体的级分。免疫球蛋白G或M可从只识别本发明之多肽的级分制备，例如使用偶联了本发明之多肽的亲和柱，并进一步用蛋白质A或蛋白质G柱纯化这一级分。

为了制备单克隆抗体，从用抗原免疫的哺乳动物收集免疫细胞，如上所述检查血清中所需抗体水平的增高，再进行细胞融合。用于细胞融合的免疫细胞优选从脾获得。其它优选的与上述免疫细胞融合的亲本细胞包括例如哺乳动物的骨髓瘤细胞，更优选具有用药物筛选融合细胞的获得性特征的骨髓瘤细胞。

上述免疫细胞和骨髓瘤细胞可通过已知方法融合，例如Milstein等的方法(Galfre and Milstein，Methods Enzymol 73：3-46(1981))。

通过细胞融合所获得的杂交瘤可通过在标准筛选培养基中培养来筛选，诸如HAT培养基(含次黄嘌呤，氨基喋呤和胸腺嘧啶的培养基)。通常细胞在HAT培养基中培养数天至数周，时间长到足以使除所需杂交瘤以外的所有其它细胞(非融合细胞)死亡。然后，进行标准有限稀释以筛选并克隆产生所需抗体的杂交瘤细胞。

除上述方法，即用抗原免疫非人动物以制备杂交瘤，人淋巴细胞诸如感染了EB病毒的细胞，亦可用多肽，表达多肽的细胞或其体外裂解物进行免疫。接着，将免疫的淋巴细胞与衍生自人的能够无限分裂的骨髓瘤细胞，诸如U266融合，得到产生能与多肽结合的所需人源抗体的杂交瘤细胞(未经审查、已公开的日本专利申请号(JP-A)Sho 63-17688)。

随后将所获得的杂交瘤植入小鼠腹腔，然后抽取腹水。所获得的单克隆抗体可通过例如硫酸铵沉淀，蛋白质A或蛋白质G柱，DEAE离子交换柱或偶联了本发明之多肽的亲和柱来纯化。本发明之抗体不仅可用于本发明之多肽的纯化和检测，还可作为本发明之多肽的激动剂和拮抗剂的候选物。另外，这一抗体可用于与本发明之多肽相关的疾病的抗体治疗。在将所得到的抗体注射到人体中时(抗体治疗)，优选人源抗体或人源化抗体以降低免疫原性。

例如，可用选自多肽，表达多肽的细胞或其裂解物的抗原免疫具有人抗体基因全集的转基因动物。随后从动物收集产生抗体的细胞并与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤，可从后者制备针对所述多肽的人源抗体(参见WO92-03918，WO93-2227，WO94-02602，WO94-25585，WO96-33735和WO96-34096)。

或者，可用癌基因使产生抗体的免疫细胞，诸如经免疫淋巴细胞永生化，并用于制备单克隆抗体。

这样获得的单克隆抗体也可通过基因工程技术重组制备(参见例如Borrebaeck and Larrick，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in theUnited Kingdom by MacMillan Publishers LTD(1990))。例如，可从产生抗体的免疫细胞，诸如杂交瘤或经免疫淋巴细胞克隆得到编码抗体的DNA，插入适当的载体，并导入宿主细胞以制备重组抗体。本发明还提供了用上述方法制备的重组抗体。

另外，本发明之抗体可以是抗体的片段或经修饰的抗体，只要它能与本发明之一种或多种多肽结合。例如，抗体片段可以是Fab，F(ab’)₂，Fv或单链Fv(scFv)，其中来自H和L链的Fv片段通过适当的接头相连(Hustonet al.，Proc Natl Acad Sci USA 85：5879-83(1988))。更详细地说，抗体片段可通过用酶处理抗体来制备，诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶。或者，可以构建编码抗体片段的基因，插入表达载体并在适当的宿主细胞中表达(参见例如Co et al.，J Immunol 152：2968-76(1994)；Better and Horwitz，MothedsEnzymol 178：476-96(1989)；Pluckthun and Skerra，Methods Enzymol 178：497-515(1989)；Lamoyi，Methods Enzymol 121：652-63(1986)；Rousseaux etal.，Methods Enzymol 121：663-9(1986)；Bird and Walker，Trends Biotechnol9：132-7(1991))。

抗体可通过缀合各种分子，诸如聚乙二醇(PEG)来修饰。本发明提供了此类修饰抗体。修饰抗体可通过化学修饰抗体来获得。这些修饰方法在本领域是常规的。

或者，本发明之抗体可以衍生自非人抗体的可变区与衍生自人源抗体的恒定区之间的嵌合抗体，或是包含衍生自非人抗体的互补决定区(CDR)、衍生自人源抗体的框架区(FR)和恒定区的人源化抗体的形式来获得。此类抗体可根据已知技术制备。人源化可通过用啮齿类CDR或CDR序列替代人源抗体的相应序列来进行(参见如Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))。相应地，此类人源化抗体是嵌合抗体，其中基本上少于完整人源可变区用来源于非人物种的相应序列所替代。

还可采用在人源框架区和恒定区之外包含人源可变区的完全人源抗体。此类抗体的生产可运用本领域已知的多种技术。例如，体外的方法涉及使用展示于噬菌体上的人源抗体片段的重组文库(例如Hoogenboom&Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991))。类似的，生产人源抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入转基因动物，如小鼠，其本身的内源性免疫球蛋白基因已经部分或全部灭活了。这一方法在美国专利号6,150,584；5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016中进行了描述。

可将如上所述得到的抗体纯化至均质。例如，抗体的分离和纯化可采用普通蛋白质的分离和纯化方法。例如，通过恰当的选择并结合使用柱层析，诸如亲和层析、过滤、超滤、盐析、透析、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦的方法分离抗体(Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlowand David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但并不限于这些方法。蛋白质A柱和蛋白质G柱可用作亲和柱。使用的例示性蛋白质A柱包含例如Hyper D，POROS和Sepharose F.F.(Pharmacia)。

除亲和层析以外的例示性层析包括例如离子交换层析，疏水层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(Strategies for Protein Purification andCharacterization：A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshak et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996))。层析流程可通过液相层析进行，诸如HPLC和FPLC。

例如，吸光率测量，酶联免疫吸附测定法(ELISA)，酶免疫测定法(EIA)，放射免疫测定法(RIA)和/或免疫荧光技术可用于测量本发明之抗体的抗原结合活性。在ELISA中，将本发明之抗体固定在平板上，将本发明之多肽加到平板中，随后加入含目标抗体的样品，诸如产生抗体的细胞的培养物上清液或纯化的抗体。然后加入能识别一抗并标记有酶诸如碱性磷酸酶的二抗，并将平板保温。接着，清洗之后向平板中加入酶底物，诸如对硝基苯磷酸，并测量吸光度以评估样品的抗原结合活性。多肽片段，诸如C端或N端片段，可用作抗原来评估抗体的结合活性。BIAcore(Pharmacia)可用于评估依照本发明之抗体的活性。

上述方法使本发明之多肽的检测或测量成为可能，即将本发明之抗体暴露于假设含有本发明之多肽的样品，并检测或测量抗体与多肽所形成的免疫复合物。

由于依照本发明之多肽的检测或测量方法能特异地检测或测量多肽，因此这种方法可用于使用该多肽的许多实验。

反义多核苷酸，小干扰RNA和核酶

本发明包括能与核苷酸序列SEQ ID NO：1或3中任何位点杂交的反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸优选针对核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的至少约15个连续核苷酸。甚至更优选在上述至少15个连续核苷酸中包含起始密码子的上述反义寡核苷酸。

反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物也可用作反义寡核苷酸。此类修饰产物的例子包括低级烷基磷酸酯修饰诸如磷酸甲酯型或磷酸乙酯型，硫代磷酸酯修饰和磷酰胺酯(phosphoroamidate)修饰。

这里所用术语“反义寡核苷酸”不仅是指与构成DNA或mRNA特定区域的核苷酸对应的核苷酸完全互补的寡核苷酸，还指有一个或多个核苷酸错配的寡核苷酸，只要所述DNA或mRNA和反义寡核苷酸能与核苷酸序列SEQ ID NO：1或3特异杂交。

本发明包括此类多核苷酸，即在“至少约15个连续核苷酸序列区域”中具有至少70％或更高，优选80％或更高，更优选约90％或更高，甚至更优选约95％或更高同源性的多核苷酸。可使用这里阐述的算法来确定同源性。可使用本领域已知的算法来确定同源性。而且，反义寡核苷酸的衍生物或修饰产物在本发明中也可用作反义寡核苷酸。此类修饰产物的例子包括低级烷基磷酸酯修饰诸如磷酸甲酯型或磷酸乙酯型，硫代磷酸酯修饰和磷酰胺酯修饰。

此类反义多核苷酸可作为探针用于分离或检测编码本发明之多肽的DNA，或是作为引物用于扩增。

本发明之反义寡核苷酸衍生物作用于产生本发明之多肽的细胞是通过结合编码所述多肽的DNA或mRNA，抑制其转录或翻译，促进mRNA的降解，和抑制本发明之多肽的表达，从而导致所述多肽功能的抑制。

本发明还包括包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的有义链核酸和反义链核酸的组合的小干扰RNA(siRNA)。更详细地说，用于抑制CCDC4表达的此类siRNA包括以核苷酸序列SEQ ID NO：8为靶的siRNA。

术语“siRNA”是指能阻止靶mRNA翻译的双链RNA分子。运用标准技术将siRNA导入细胞，包括以DNA为模板转录RNA的细胞。siRNA包含编码人CCDC4蛋白质的多核苷酸(SEQ ID NO：1或3)的有义核酸序列和反义核酸序列。siRNA构建成具有靶基因的有义和互补反义序列的单一转录本(双链RNA)，如发卡结构。

靶细胞中siRNA与对应于CCDC4的转录本的结合导致细胞的蛋白质产量下降。寡核苷酸的长度为至少10个核苷酸，也可像天然存在转录本一样长。优选寡核苷酸的长度为约19个至约25个核苷酸。更优选寡核苷酸的长度少于约75个，约50个，约25个核苷酸。抑制癌细胞生长的CCDC4siRNA寡核苷酸的例子包括含有SEQ ID NO：8的靶序列。另外，为了增强siRNA的抑制作用，可在靶序列反义链的3′端添加核苷酸“u”。所加核苷酸“u”的数目至少是约2个，通常是约2个至约10个，优选约2个至约5个。所加“u”在siRNA反义链的3’端形成单链。

将CCDC4 siRNA以能够与mRNA转录本结合的形式直接导入细胞。在这些实施方案中，本发明之siRNA分子通常按上文关于反义分子所述进行修饰。其它修饰也是可能的，例如缀合有胆固醇的siRNA已证明具有改良的药理性质(Song et al.，Nature Med.9：347-351(2003))。或者，编码CCDC4 siRNA的DNA在载体中。

载体的构建，例如，通过将CCDC4靶序列克隆到表达载体中，CCDC4序列的侧翼都操作连接调控序列，从而允许两条链的表达(通过DNA分子的转录)(Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P.，and Rossi，J.(2002)Expression of small interfering RNAs targeted againstHIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology 20：500-505)。CCDC4 mRNA的反义RNA分子由第一个启动子转录(如克隆DNA 3′端的启动子序列)，而CCDC4  mRNA的有义链则由第二个启动子转录(如克隆DNA 5′端的启动子序列)。有义链与反义链在体内杂交形成CCDC4基因沉默的siRNA产物。或者，可用两个构建物产生siRNA构建物的有义链和反义链。克隆的CCDC4可编码具有二级结构(如发卡结构)的构建物，其中一个转录本同时具有靶基因的有义序列和互补反义序列。

而且，为了形成发卡环状结构，可在有义序列与反义序列之间插入包含任意核苷酸序列的环状序列。这样，本发明还提供了具有通式5′-[A]-[B]-[A′]-3′的siRNA，其中[A]代表对应于与CCDC4的mRNA或cDNA特异杂交的序列的核糖核苷酸序列。在优选的实施方案中，[A]是对应于与SEQ ID NO：1或3的核苷酸1666-1684(SEQ ID NO：8)的核糖核苷酸序列，

[B]是由约3个至约23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，

[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。环状序列可由长度优选为3个至23个核苷酸的任意序列组成。环状序列，例如，可选自下列序列(http://www.ambion.com/techlib/tb/tb_506.html)。在本发明之siRNA中，可将核苷酸“u”加到[A′]的3′端，以增强siRNA的抑制作用。所加核苷酸“u”的数目至少是约2个，通常是约2个至约10个，优选约2个至约5个。此外，由23个核苷酸组成的环状序列也提供有活性的siRNA(Jacque，J.-M.，Triques，K.，and Stevenson，M.(2002)Modulation ofHIV-1 replication by RNA interference.Nature 418：435-438)。

CCC，CCACC或CCACACC：Jacque，J.M.，Triques，K.，and Stevenson，M.“Modulation of HIV-1 replication by RNA interference.”Nature，Vol.418：435-438(2002)；

UUCG：Lee，N.S.，Dohjima，T.，Bauer，G，Li，H.，Li，M.-J.，Ehsani，A.，Salvaterra，P，and Rossi，J.(2002)Expression of small interfering RNAs targetedagainst HIV-1 rev transcripts in human cells.Nature Biotechnology 20：500-505；Fruscoloni，P.，Zamboni，M.，and Tocchini-Valentini，GP.“Exonucleolyticdegradation of double-stranded RNA by an activity in Xenopus laevis germinalvesicles.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100(4)：1639-1644(2003)；及

UUCAAGAGA：Dykxhoorn，D.M.，Novina，C.D.，and Sharp P.A.“Killingthe messenger：Short RNAs that silence gene expression.”Nature ReviewsMolecular Cell Biology 4：457-467(2002)。

例如，本发明之具有发卡结构的优选siRNA如下所示。在下面的结构中，环状序列可选自CCC，UUCG，CCACC，CCACACC，和UUCAAGAGA。优选的环状序列是UUCAAGAGA(在DNA中为“ttcaagaga”)。gaugguucugcagcaccac-[B]-guggugcugcagaaccauc(SEQ ID NO：8的靶序列)

CCDC4序列侧翼的调控序列可以是相同的或不同的，这样可以独立的，或以时间的或空间的方式调节它们的表达。通过将CCDC4基因模板克隆到包含如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III转录单位或人H1 RNA启动子的载体中，从而在细胞内转录siRNA。为了将载体导入细胞，可采用转染增强剂。FuGENE(Rochediagnostics)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，Oligofectamine(Invitrogen)，和Nucleofector(Wako Pure Chenical)是有用的转染增强剂。

siRNA的核苷酸序列可通过Ambion网站提供的siRNA设计计算机程序来设计(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder.html)。siRNA的核苷酸序列是按以下方案由计算机程序挑选的：

siRNA靶位点的选定：

1.从目标转录本的AUG起始密码子开始，向下游搜索AA双核苷酸序列。记录每个AA的出现及其3′相邻的19个核苷酸作为可能的siRNA靶位点。Tuschl，et al.Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro.Genes Dev 13(24)：3191-7(1999)，不推荐针对5′和3′非翻译区(UTR)和起始密码子邻近区域(75个碱基以内)设计siRNA，因为这些区域可能更加富含调控蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合体可能干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合。

2.将可能的靶位点与人类基因组数据库进行比较，去除与其它编码序列具有明显同源性的任何靶序列。同源性搜索可通过BLAST进行，该程序可在NCBI的服务器上找到：www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。

3.选择合乎标准的靶序列并合成。在Ambion，优选地顺着评估基因的全长选择数个靶序列。

按照标准方法，在体外对与CCDC4 mRNA各个部分互补的寡核苷酸和寡核苷酸测试它们在肿瘤细胞中降低CCDC4产量的能力(如采用PC3或DU145前列腺癌细胞系)。接触候选siRNA组合物的细胞中与缺乏候选组合物条件下培养的细胞中相比CCDC4基因产物的减少用CCDC4特异抗体或其它检测策略来检测。在基于细胞的或非细胞的体外测定法中能降低CCDC4产量的序列随后测试其抑制细胞生长的效果。在基于细胞的体外测定法中抑制细胞生长的序列再在大鼠或小鼠中进行体内测试，以验证在具有恶性赘生物的动物中CCDC4产量的降低和肿瘤细胞生长的降低。

本发明还包括包含靶序列的核酸序列，例如SEQ ID NO：1或3的核苷酸1666-1684(SEQ ID NO：8)的双链分子。在本发明中，该双链分子包含一条有义链和一条反义链，其中有义链包含对应于SEQ ID NO：8的核糖核苷酸序列，而反义链包含与所述有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所述有义链与所述反义链彼此杂交形成所述双链分子，且所述双链分子在导入表达CCDC4基因的细胞后抑制所述基因的表达。在本发明中，当分离的核酸是RNA或其衍生物时，核苷酸序列中的碱基“t”应用“u”替代。如本文所用术语“互补”是指核酸分子的核苷酸单元之间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对，而术语“结合”是指两种核酸或化合物或相关核酸或化合物或其组合之间的物理或化学相互作用。

互补核酸序列在适宜条件下杂交形成含少数错配或不含错配的稳定双链体。而且，本发明之分离核苷酸的有义链和反义链能通过杂交形成双链核苷酸或发卡环状结构。在一个优选的实施方案中，此类双链体每10个配对中包含不多于1个错配。在一个尤其优选的实施方案中，当双链体的两条链完全互补时，此类双链体不含错配。核酸分子的长度小于8763个核苷酸(对于SEQ ID NO：1)或8692个核苷酸(对于SEQ ID NO：3)。例如，核酸分子的长度小于500个，200个，或75个核苷酸。本发明还包括包含这里所描述的一种或多种核酸的载体，及含有这些载体的细胞。本发明之分离核酸对针对CCDC4的siRNA或编码该siRNA的DNA是有用的。当核酸用于siRNA或编码它的DNA时，有义链优选长于约19个核苷酸，更优选长于约21个核苷酸。

本发明之反义寡核苷酸或siRNA抑制本发明之多肽的表达，因而可用于抑制本发明之多肽的生物学活性。而且，包含本发明之反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂，由于它们能抑制本发明之多肽的生物学活性而有用。因此，包含本发明之反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗前列腺癌。抑制哺乳动物细胞中表达的CCDC4 siRNA寡核苷酸的例子包括包含SEQID NO：8的靶序列。此外，为了增强siRNA的抑制活性，可在靶序列反义链的3′端加上核苷酸“u”。添加“u”的数目至少是约2个，通常约2个至约10个，优选约2个至约5个。所加的“u”在siRNA反义链的3′端形成单链。

同样，包含本发明之反义寡核苷酸或siRNA的表达抑制剂，由于它们能抑制本发明之多肽的生物学活性而是有用的。因此，包含本发明之反义寡核苷酸或siRNA的组合物可用于治疗细胞增殖性疾病诸如前列腺癌。

而且，本发明提供了能抑制本发明之CCDC4多肽表达的核酶。

通常，核酶可分为大核酶和小核酶。大核酶已知是切割核酸磷酸脂键的一种酶。经与大核酶反应后，反应位点由5′-磷酸和3′-羟基组成。大核酶可进一步分为：(1)通过鸟苷酸在5′剪接位点催化酯交换的I组内含子RNA；(2)通过套索结构介导的两步反应催化自身剪接的II组内含子RNA；和(3)通过水解在5′位点切割tRNA前体的核糖核酸酶P的RNA成分。另一方面，小核酶较之大核酶更小(约40个碱基对)，它切割RNA产生5′-羟基和2′-3′环磷酸。小核酶包括锤头型核酶(Koizumi et al.，FEBS LErr 228：225(1988))和发夹型核酶(Buzayan，Nature 323：349(1986)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acid Res 19：6751(1992))。用于设计和构建核酶的方法是本领域已知的(参见Koizumi et al.，FEBS Lett 228：225(1988)；Koizumi et al.，NucleicAcids Res 17：7059(1989)；Kikuchi and Sasaki，Nucleic Acids Res 196751(1992))。因此，抑制本发明之多肽表达的核酶也可根据它们的序列信息(SEQ ID NO：1或3)和这些常规方法构建。

针对CCDC4基因的核酶抑制过度表达的CCDC4蛋白质的表达，因而可用于抑制该蛋白质的生物学活性。因此，这些核酶可用于治疗或预防前列腺癌。

诊断前列腺癌

另外，本发明提供了以本发明之基因的表达水平为诊断标志物的诊断细胞增殖性疾病，诸如前列腺癌的方法。

这一诊断方法包含以下步骤：(a)检测本发明之CCDC4基因的表达水平；并(b)将所述表达水平的增高与前列腺癌联系起来。

生物样本中CCDC4基因的表达水平可通过测定对应于CCDC4基因的mRNA或由CCDC4基因编码的蛋白质来评估。mRNA的定量方法为本领域技术人员所知道。例如，对应于CCDC4基因的mRNA水平可通过Northern印迹或RT-PCR来评估估算。由于CCDC4基因的全长核苷酸序列已显示于SEQ ID NO：1或3，任何本领域技术人员都能设计测定CCDC4基因所需探针或引物的核苷酸序列。

CCDC4基因的表达水平还可通过根据该基因所编码的蛋白质的活性或数量来分析。下文描述了用于测定CCDC4蛋白质数量的方法。例如，免疫测定法可用于测定生物材料中的蛋白质。任何生物材料都可作为测定蛋白质或其活性的生物样本，只要标志基因(CCDC4基因)在前列腺癌患者的样本中表达。例如，前列腺管上皮可作为此类生物样本。另外，体液诸如血液和尿液也可用于分析。另一方面，应根据待分析蛋白质的活性选择适当的方法测定CCDC4基因所编码的蛋白质的活性。

估算生物样本中CCDC4基因的表达水平并与正常样本(如衍生自未患病受试者的样本)比较。当此类比较显示靶基因的表达高于正常样本时，即判定该受试者患有前列腺癌。来自正常受试者和待诊断受试者的生物样本中CCDC4基因的表达水平可同时测定。或者，可根据以往从对照组收集的样本中基因表达水平的分析结果，用统计学方法确定表达水平的正常范围。将受试者样本所获得的结果与正常范围相比较；当结果不在正常范围内时，即判定该受试者患有或有可能发展成前列腺癌。

本发明还提供了用于诊断细胞增殖性疾病，诸如前列腺癌的诊断剂。本发明之诊断剂包含能与本发明之多核苷酸或多肽结合的化合物。优选地，可使用能与本发明之多核苷酸杂交的寡核苷酸或者能与本发明之多肽结合的抗体作为此类化合物。

这一诊断前列腺癌的方法可用于评估治疗受试者中前列腺癌的效果。根据该方法，从接受前列腺癌治疗的受试者获取生物样本，诸如测试细胞群。评估的方法可按照诊断前列腺癌的常规方法进行。

如果需要，在治疗前、治疗中或治疗后的不同时间点从受试者取得生物样本。随后测定生物样本中CCDC4基因的表达水平，并与衍生自例如参考细胞群，包括前列腺癌状况已知的细胞(即癌细胞或非癌细胞)的对照水平进行比较。对照水平是在未经治疗的生物样本中测定的。

如果对照水平衍生自不含癌细胞的生物样本，衍生自受试者的生物样本的表达水平与对照水平之间的相似性表明治疗有效。而衍生自受试者的生物样本中CCDC4基因的表达水平与对照水平之间的差异表明不太有利的临床效果或预后。

术语“有效”指的是治疗导致病理性上调基因(CCDC4基因)的表达降低，或受试者中前列腺癌细胞在尺寸、分布或增殖潜力的下降。在出于预防目的进行治疗时，“有效”指的是治疗延缓或防止前列腺癌的发生。对前列腺癌的评估可以是通过标准临床方案进行的。而且，治疗效果的测定可与诊断或治疗前列腺癌的任何已知方法联系起来。

此外，本发明之前列腺癌诊断方法还可通过比较衍生自患者的生物样本诸如测试细胞群中CCDC4基因的表达水平和对照水平，来评估患有前列腺癌的受试者的预后。或者，衍生自患者的生物样本中CCDC4基因的表达水平可在疾病阶段的一定范围测量以评估患者的预后。

CCDC4基因的表达水平较正常对照的增高表明不太有利的预后。CCDC4基因的表达水平下降表明患者的预后更为有利。

筛选化合物

运用CCDC4基因、该基因编码的蛋白质或该基因的转录调控区，可筛选能改变基因表达或基因编码的多肽的生物活性的化合物。此类化合物可作为治疗或预防前列腺癌的药物。

因此，本发明提供了用本发明之多肽筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法。这一筛选方法的实施方案包括以下步骤：(a)使测试化合物与本发明之多肽接触；(b)检测本发明之多肽与测试化合物之间的结合活性；并(c)选择与本发明之多肽结合的化合物。

用来进行筛选的本发明之多肽可以是重组多肽或来源于自然界的蛋白质及其部分肽段。与测试化合物接触的本发明之多肽可以是例如纯化的多肽、可溶性蛋白质、与载体结合的形式、或与其它多肽融合的融合蛋白。

作为利用本发明之多肽筛选蛋白质例如与本发明之多肽结合的蛋白质的方法，可以使用为本领域技术人员所熟知的许多方法。此类筛选可通过例如免疫沉淀法来完成，特别是按以下方式来进行。将编码本发明之多肽的基因插入表达外源基因的表达载体中，诸如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，并在宿主(如动物)细胞等中表达该基因。用来表达的启动子可以是任何常用的启动子，包括例如SV40早期启动子(Rigby in Williamson(ed.)，Genetic Engineering，vol.3.Academic Press，London，83-141(1982))，EF-α启动子(Kim et al.，Gene 91：217-23(1990))，CAG启动子(Niwa et al.，Gene 108：193-200 (1991))，RSV LTR启动子(Cullen，Methods in Enzymology 152：684-704(1987))，SRα启动子(Takebe et al.，MolCell Biol 8：466(1988))，CMV立即早期启动子(Seed and Aruffo，Proc NatlAcad Sci USA 84：3365-9(1987))，SV40晚期启动子(Gheysen and Fiers，J MolAppl Genet 1：385-94(1982))，腺病毒晚期启动子(Kaufman et al.，Mol CellBiol 9：946(1989))，HSV TK启动子等。将基因导入宿主细胞以表达外源基因可采用任何方法，例如电穿孔法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15：1311-26(1987))，磷酸钙法(Chen and Okayama，Mol Cell Biol 7：2745-52(1987))，DEAE右旋糖苷法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12：5707-17(1984)；Sussman and Milman，Mol Cell Biol 4：1642-3(1985))，脂转染法(Derijard，BCell 7：1025-37(1994)；Lamb et al.，Nature Genetics 5：22-30(1993)；Rabindranet al.，Science 259：230-4(1993))，等等。本发明之多肽可以以包含单克隆抗体的识别位点(表位)的融合蛋白的形式表达，通过将特异性经过验证的单克隆抗体的表位导入本发明之多肽的N端或C端。可使用市售的表位-抗体系统(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。能利用其多克隆位点表达与例如β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、谷胱苷肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)等融合的融合蛋白的载体可从商业途径购买。

还报道了只导入小表位制备的融合蛋白，所述小表位由几个至十几个氨基酸组成，因而不会在融合后改变本发明之多肽的特性。可使用诸如多组氨酸(His标签)，流感聚集物HA，人c-myc，FLAG，水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)，T7基因10蛋白(T7标签)，人类单纯泡疹病毒糖蛋白(HSV标签)，E标签(单克隆噬菌体上的一种表位)等表位及识别它们的单克隆抗体作为表位-抗体系统用于筛选与本发明之多肽结合的蛋白质(Experimental Medicine 13：85-90(1995))。

在免疫沉淀中，通过向使用适当去污剂制备的细胞裂解物中加入这些抗体形成免疫复合物。免疫复合物由本发明之多肽，具有与该多肽结合的能力的多肽，及抗体组成。除了可如上所述所制备的针对以上表位的抗体以外，免疫沉淀也可用针对本发明之多肽的抗体来进行。

当抗体是小鼠IgG抗体时，例如可使用蛋白质A sepharose或蛋白质Gsepharose沉淀免疫复合物。如果本发明之多肽是以具有表位诸如GST的融合蛋白的形式制备的，可以与采用针对本发明之多肽的抗体相同的方法形成免疫复合物，使用能与该表位特异结合的物质，诸如谷胱苷肽-Sepharose4B。

免疫沉淀可以遵循或依据例如文献(Harlow and Lane，Antibodies，511-52，Cold Spring Laboratory publication，New York(1988))中的方法来进行。

SDS-PAGE常用于分析免疫沉淀的蛋白质，且可使用适当浓度的凝胶对所结合的蛋白质分析分子量。因为用常规的染色方法，诸如考马斯染色或银染难以检测本发明之多肽所结合的蛋白质，可通过在含有放射性同位素(³⁵S-甲硫氨酸或³⁵S-半胱氨酸)的培养基中培养细胞，标记细胞中的蛋白质并检测蛋白质，从而提高检测该蛋白质的灵敏度。在揭示了蛋白质的分子量后，可以从SDS-聚丙烯酰胺凝胶中直接纯化靶蛋白质并测定其序列。

作为使用多肽筛选与本发明之多肽结合的蛋白质的方法，可用例如West-Western印迹分析法(Skolnik et al.，Cell 65：83-90(1991))。尤其可通过以下方法得到与本发明之多肽结合的蛋白质，利用噬菌体载体(如ZAP)由期望表达与本发明之多肽结合的蛋白质的细胞、组织、器官(例如诸如睾丸和前列腺之组织)、或培养细胞(如PC3，DUl45)制备cDNA文库，在LB-琼脂糖上表达蛋白质，将表达的蛋白质固定在滤膜上，使经纯化和标记的本发明之多肽与上述滤膜反应，并通过标记物检测表达本发明之多肽所结合的蛋白质的噬菌斑。可以利用生物素和亲合素之间的结合来标记本发明之多肽，或是利用能特异结合本发明之多肽的抗体，或是与本发明之多肽融合的肽或多肽(例如GST)。也可使用利用放射性同位素或荧光等等的方法。

或者，在本发明之筛选方法的另一个实施方案中，可以使用基于细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER双杂交系统”，“哺乳动物MATCHMARKER双杂交测定试剂盒”、“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参考文献“Daltonand Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet10：286-92(1994)”)。

在双杂交系统中，将本发明之多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合并在酵母细胞中表达。由期望表达能与本发明之多肽结合的蛋白质的细胞制备cDNA文库，使得该文库在表达时，与VP16或GAL4的转录激活区融合。然后将cDNA文库导入上述酵母细胞，并从检测到的阳性克隆分离由文库衍生的cDNA(当蛋白质与酵母细胞中表达的本发明之多肽结合时，两者的结合激活报道基因，使得阳性克隆能够被检测到)。通过将如上分离的cDNA导入大肠杆菌并表达蛋白质来制备由该cDNA编码的蛋白质。

作为报道基因，除HIS3基因外，可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

也可利用亲和层析来筛选与本发明之多肽结合的化合物。例如，可将本发明之多肽固定在亲和柱的载体上，并将含有能与本发明之多肽结合的蛋白质的测试化合物加载到柱子上。这里的测试化合物可以是例如细胞提取物、细胞裂解物等。在加载测试化合物后，洗柱，并制备与本发明之多肽结合的化合物。

当测试化合物是蛋白质时，分析得到的蛋白质的氨基酸序列，据此序列合成寡DNA，并以该寡DNA为探针筛选cDNA文库，从而得到编码该蛋白质的DNA。

在本发明中，可以基于表面激元共振现象的生物传感器作为手段来检测或测量所结合的化合物。在使用此类生物传感器时，只使用少量未标记的多肽就能通过表面激元共振信号实时观察本发明之多肽与测试化合物之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，有可能利用生物传感器诸如BIAcore来评价本发明之多肽与测试化合物之间的结合。

用于筛选将固定好的本发明之多肽暴露于合成的化学化合物、天然物质库或随机噬菌体肽展示库后发生结合的分子的方法，及基于组合化学技术的高通量筛选方法(Wrighton et al.，Science 273：458-64(1996)；Verdine，Nature 384：11-13(1996)；Hogan，Nature 384：17-9(1996))，不仅用于分离与本发明之蛋白质结合的蛋白质，还有化学化合物(包括激动剂和拮抗剂)，是本领域技术人员所熟知。

另外，本发明提供了利用本发明之多肽来筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，包括以下步骤：

(a)使测试化合物与本发明之多肽接触；

(b)检测步骤(a)中多肽的生物学活性；并

(c)选择与所述测试化合物缺失情况下检测到的生物学活性相比能抑制所述多肽生物学活性的化合物。

因为本发明之CCDC4蛋白质具有促进前列腺癌细胞的细胞增殖的活性，可以这一活性为指标，筛选能抑制本发明这种蛋白质的活性的化合物。

具有CCDC4蛋白质的活性的任何多肽均可用于筛选。此类生物学活性包括人类CCDC4蛋白质的细胞增殖活性。例如，可使用人类CCDC4蛋白质及在功能上与这些蛋白质等同的多肽。此类多肽可以由细胞内源性或外源性表达。

通过这种筛选分离的化合物即为本发明之多肽的激动剂或拮抗剂。术语“促效剂”指的是通过结合本发明之多肽来激活其功能的分子。类似的，术语“拮抗剂”指的是通过结合本发明之多肽来抑制其功能的分子。再者，通过这种筛选分离的化合物即为能在体内抑制本发明之多肽与分子(包括DNA和蛋白质)之间相互作用的候选化合物。

当本方法中检测的生物学活性是细胞增殖时，可以例如如下检测，制备表达本发明之多肽的细胞，在测试化合物存在的情况下培养细胞，并如实施例中所述测定细胞增殖的速度，测量细胞周期等，及测量集落形成活性。

在另一个实施方案中，本发明提供了筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法。如以上详细讨论的一样，通过控制CCDC4的表达水平，可以控制前列腺癌的发生和发展。这样，可通过利用CCDC4的表达水平作为指标的筛选方法来鉴定可用于治疗或预防前列腺癌的化合物。在本发明的内容中，此类筛选可包括例如以下步骤：

a)使表达CCDC4的细胞与测试化合物接触；并

b)选择与测试化合物缺失的情况下的表达水平相比能降低CCDC4表达水平的化合物。

表达至少一种CCDC4的细胞包括例如由前列腺癌建立的细胞系；这些细胞可用于本发明的上述筛选方法(如PC3，DU145)。表达水平可通过本领域技术人员熟知的方法来评估。在筛选方法中，可选择能降低CCDC4表达水平的化合物作为用于治疗或预防前列腺癌的候选药物。

或者，本发明的筛选方法可包括以下步骤：

a)使测试化合物与导入了下述载体的细胞接触，所述载体包含一种或多种标志基因的转录调控区及在该转录调控区控制下表达的报道基因，其中所说的一种或多种标志基因是CCDC4，

b)测量所说报道基因的表达水平；并

c)选择与对照相比能降低所说报道基因表达水平或活性的化合物。

合适的报道基因和宿主细胞为本领域所熟知。筛选所需的报道基因构建物可以用标志基因的转录调控区来构建。当标志基因的转录调控区为本领域技术人员所知时，可以用已知的序列信息来构建报道基因构建物。当标志基因的转录调控区尚未鉴定时，可以依据标志基因的核苷酸序列信息从基因组文库中分离含转录调控区的核苷酸区段。

可用于结合蛋白质的支持物的例子包括不溶性多糖，诸如琼脂糖、纤维素和右旋糖苷；合成树脂，诸如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、和硅；优选使用由以上材料制备的市售珠子和平板(如多孔板、生物传感器芯片等)。在使用珠子时，可将它们填到柱子中。

蛋白质与支持物的结合可按常规方法进行，诸如化学键合和物理吸附。或者，可通过特异识别蛋白质的抗体将该蛋白质结合到支持物上。再者，蛋白质与支持物的结合还可通过生物素和亲合素的手段来进行。

只要缓冲液不抑制蛋白质之间的结合，蛋白质之间的结合可以在缓冲液中进行，例如但不限于磷酸盐缓冲液和Tris缓冲液。

在本发明中，基于表面激元共振现象的生物传感器可用作检测或测量所结合蛋白质的方法。在使用此类生物传感器时，只使用少量未标记的多肽，就可通过表面激元共振信号实时观察蛋白质之间的相互作用(例如BIAcore，Pharmacia)。

或者，CCDC4多肽可进行标记，而所结合蛋白质的标记物可用于检测或测量所结合的蛋白质。具体而言，在预先标记一种蛋白质后，在测试化合物存在的情况下将已标记蛋白质与其它蛋白质接触，然后在清洗后根据标记物检测或测量所结合的蛋白质。

标记物质诸如放射性同位素(如³H，¹⁴C，³²P，³³P，³⁵S，¹²⁵I，¹³¹I)，酶(如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，β-半乳糖苷酶，β-葡萄糖苷酶)，荧光物质(如异硫氰酸荧光素(FITC)，罗丹明)，及生物素和亲合素，可用来标记本方法之蛋白质。在用放射性同位素标记蛋白质时，可通过液闪来进行检测或测量。或者，用酶标记的蛋白质的检测或测量可通过加入该酶的底物并检测底物在酶促条件下的变化来进行，诸如用吸收比色计检测颜色的产生。再者，在使用荧光物质作为标记物时，可用荧光光度计检测或测量所结合的蛋白质。

在使用抗体进行本筛选时，抗体优选用上述标记物之一进行标记，并根据标记物质进行检测或测量。或者，针对CCDC4多肽或肌动蛋白的抗体可作为一抗，利用用标记物质标记的二抗进行检测。再者，可以利用蛋白质G或蛋白质A柱检测或测量在本发明之筛选中与蛋白质结合的抗体。

或者，在本发明筛选方法的另一个实施方案中，可以使用基于细胞的双杂交系统(“MATCHMAKER双杂交系统”，“哺乳动物MATCHMARKER双杂交测定试剂盒”，“MATCHMAKER单杂交系统”(Clontech)；“HybriZAP双杂交载体系统”(Stratagene)；参考文献“Dalton and Treisman，Cell 68：597-612(1992)”，“Fields and Sternglanz，Trends Genet 10：286-92(1994)”)。

在双杂交系统中，将本发明之CCDC4多肽与SRF结合区或GAL4结合区融合，并在酵母细胞中表达。

作为报道基因，除HIS3基因外，可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、萤光素酶基因等。

任何测试化合物，例如细胞提取物，细胞培养物上清液，发酵微生物产物，海洋生物提取物，植物提取物，纯化的或粗制的蛋白质，肽，非肽化合物，合成微分子(micromolecular)化合物，及天然化合物均可用于本发明之筛选方法。本发明之测试化合物也可利用本领域所知的多种组合文库方法中的任何一种来得到，包括：(1)生物文库，(2)空间可寻址的平行固相或液相文库，(3)需要解卷积(deconvolution)的合成文库法，(4)“一珠一化合物”文库法，和(5)利用亲和层析选择的合成文库法。利用亲和层析选择的生物文库法仅限于肽库，而其它四种方法可用于肽，非肽寡聚物，或小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des.12：145)。在本领域中可以找到合成小分子文库的方法的例子(DeWitt et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909；Erb et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Zuckermann et al.(1994)J.Med.Chem.37：2678；Cho et al.(1993)Science 261：1303；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059；Carell et al.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2061；Gallop et al.(1994)J.Med.Chem.37：1233)。化合物文库可以存在于溶液中(参见Houghten(1992)Bio/Techniques 13：412)，或是在珠子上(Lam(1991)Nature 354：82)，芯片上(Fodor(1993) Nature 364：555)，细菌上(US Pat.No.5,223,409)，孢子上(US Pat.No.5,571,698；5,403,484；和5,223,409)，质粒上(Cull et al.(1992)Proc.Natl.Acac.Sci.USA 89：1865)，或噬菌体上(Scott and Smith (1990)Science 249：386；Delvin(1990)science 249：404；Cwirla et al.(1990)Proc.Natl.Acac.Sci.USA 87：6378；Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301；US Pat.Application 2002103360)。

通过本发明之筛选方法分离的化合物是能抑制本发明之多肽活性的候选药物，用于治疗或预防例如由细胞增殖疾病而导致的疾病，诸如前列腺癌。通过本发明之筛选方法得到的化合物包括对通过本发明之本筛选方法得到的，其中部分结构通过添加、删除和/或替换而进行转变的化合物。

用于治疗或预防前列腺癌的药物组合物

本发明提供了用于治疗或预防前列腺癌的组合物，其中包含通过本发明之筛选方法选出的任何化合物。

在将通过本发明之筛选方法分离的化合物作为药物施用于人或其它哺乳动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、犬、绵羊、猪、牛、猴、狒狒、黑猩猩以治疗细胞增殖性疾病(如前列腺癌)时，分离的化合物可直接施用或者可利用已知的药物制备方法配制成剂量形式。例如，根据需要，药物可以口服，制成糖衣片、胶囊、酏剂和微胶囊；或非口服，注射水或任何其它制药学可接受液体的无菌溶剂或悬浮液的形式。例如，化合物可与制药学可接受载体或介质混合成普遍可接受的药物执行中的单位剂量形式，具体有灭菌水，生理盐水，植物油，乳化剂，悬浮剂，表面活性剂，稳定剂，芳香剂，赋形剂，媒介剂，防腐剂，粘结剂等。这些制剂中活性成分的数量处于所示所需范围内的合适剂量。

可制成片剂或胶囊所用添加剂的例子是，粘结剂诸如明胶，玉米淀粉，黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂诸如结晶纤维素；膨胀剂诸如玉米淀粉，明胶和褐藻酸；润滑剂诸如硬脂酸镁；甜味剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；芳香剂诸如胡椒薄荷，玉山白株树(Gaultheria adenothrix)油和樱桃。当单位剂量形式为微胶囊时，上述成分中还可包括液相载体，诸如油。注射用无菌组合物(composite)可遵循常规的药物执行用媒介剂诸如注射用蒸馏水配制。

生理盐水，葡萄糖，和其它等渗液体包括佐剂，诸如D-山梨糖醇，D-甘露糖，D-甘露醇和氯化钠，可用作注射用水溶液。这些可以与适当的增溶剂结合使用，诸如醇类，具体如乙醇，多元醇类诸如丙二醇和聚乙二醇，非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯80(TM)和HCO-50。

芝麻油或大豆油可用作油性液体，并可与作为增溶剂的苯甲酸苄酯，苯甲醇结合使用，且可与缓冲液诸如磷酸盐缓冲液，乙酸纳缓冲液；止痛剂，诸如盐酸普鲁卡因；稳定剂，诸如苯甲醇，酚；和抗氧化剂一起配制。制备的注射液可装入合适的安瓿中。

可使用本领域技术人员熟知的方法将本发明的药用化合物施用于患者，例如动脉内，静脉内，经皮注射，以及鼻内，经支气管，肌肉内或口服施用。剂量和施用方法根据患者的体重和年龄及施用方法而变化；而本领域技术人员可按常规进行选择。如果所说的化合物可由DNA编码的话，可将该DNA插入用于基因疗法的载体并施用该载体以进行治疗。剂量和施用方法因患者的体重、年龄、和症状而异，但可由本领域技术人员进行适当的选择。

例如，虽然根据症状会有所差异，当口服施用于普通成人(体重60公斤)时，与本发明之多肽结合并调节其活性的化合物的剂量为每天约0.1毫克至约100毫克，优选每天约1.0毫克至约50毫克，而更优选每天约1.0毫克至约20毫克。

当以注射形式肠胃外施用于普通成人(体重60公斤)时，虽然根据患者、靶器官、症状和施用方法而有所差别，方便的是每天静脉内注射约0.01毫克至约30毫克的剂量，优选每天约0.1至约20毫克，更优选每天约0.1至约10毫克。同样，在其它动物的情况中也是如此，有可能施用转变成60公斤体重的数量。

再者，本发明提供了用于治疗或预防前列腺癌的药用组合物，它包含能抑制CCDC4基因表达的活性成分。此类活性成分包括针对CCDC4基因的反义多核苷酸、siRNA或核酶或其衍生物，诸如反义多核苷酸、siRNA或核酶的表达载体。

这些活性成分可与对衍生物不具活性的适当基础物质混合制成外用制剂，诸如搽剂和敷剂。同样，如果需要，它们也可通过添加赋形剂、等渗剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、止痛剂等配制成片剂、粉剂、颗粒、胶囊、脂质体胶囊、注射剂、溶液、滴鼻剂和冻干剂。这些可通过常规方法制备。

活性成分可以直接施用于患处或注射到血管中使其到达患处而给予患者。还可用封固介质来提高持久性和膜通透性。封固介质的例子包括脂质体、多L-赖氨酸、脂质、胆固醇、脂转染试剂或其衍生物。

本发明这些组合物的剂量可根据患者的状况进行适当的调整，以期望的数量使用。例如，可施用每公斤体重0.1至100毫克，优选每公斤体重0.1至50毫克的剂量范围。

本发明的另一个实施方案是用于治疗或预防前列腺癌的组合物，它包含针对CCDC4基因编码的蛋白质的抗体或该抗体之结合该蛋白质的片段。

虽然根据症状会有所不同，当口服施用于普通成人(体重60公斤)时，用于治疗或预防前列腺癌的抗体或其片段的剂量是每天约0.1毫克至约100毫克，优选每天约1.0毫克至约50毫克，更优选每天约1.0毫克至约20毫克。

当以注射形式肠胃外施用于普通成人(体重60公斤)时，虽然根据患者的状况、疾病的症状和施用方法有所差别，方便的是每天静脉内注射约0.01毫克至约30毫克，优选每天约0.1至约20毫克，更优选每天约0.1至约10毫克的剂量。同样，在其它动物的情况中也是如此，有可能施用转变成60公斤体重的数量。

用于治疗或预防前列腺癌的方法

本发明提供了用于在受试者中治疗或预防前列腺癌的方法。为了预防或治疗目的将治疗性化合物施用于患有或有风险(或易于)发展成前列腺癌的受试者。此类受试者是通过标准临床方法或通过检测CCDC4的异常表达水平或活性得到鉴定的。预防性施用发生在疾病的明显临床症状出现以前，从而预防疾病或紊乱，或延缓其进程。

治疗性方法包括降低CCDC4基因的表达或功能。在这些方法中，受试者接受有效量化合物的治疗，以降低受试者中过度表达的基因(CCDC4基因)。施药可以是全身的或局部的。治疗性化合物包括能降低在前列腺癌细胞中内源性存在的此类基因的表达水平的化合物(即下调过度表达基因的表达的化合物)。施用此类治疗性化合物抵消受试者细胞中异常过度表达基因的效果，并期望能改善受试者的临床状况。此类化合物可通过上文所述本发明之筛选方法得到。

CCDC4基因的表达还可通过本领域已知的数种方式进行抑制，包括对受试者施用能抑制或拮抗基因表达的核酸。能破坏基因表达的反义寡核苷酸、小干扰RNA或核酶可用于抑制基因的表达。

如前所述，对应于CCDC4基因核酸序列的反义寡核苷酸可用于降低CCDC4基因的表达水平。具体地，本发明之反义寡核苷酸可通过结合CCDC4基因编码的任何多肽或与其对应的mRNA，从而抑制基因的转录或翻译，促进mRNA的降解，和/或抑制由基因编码的蛋白质的表达，及最终抑制CCDC4蛋白质的功能来起作用。

通过与对衍生物无活性的适当基础材料混合，反义寡核苷酸及其衍生物可制成外用制剂，诸如搽剂或敷剂，用于本发明中治疗或预防前列腺癌的方法。

抑制过度表达基因的一种或多种基因产物的核酸还包括小干扰RNA(siRNA)，它包含编码CCDC4基因的核苷酸序列的有义链核酸和反义链核酸的组合体。将siRNA导入细胞的标准技术可用于本发明中的治疗和预防，包括以DNA为模板转录得到RNA的方法。siRNA构建成包含来自靶基因的有义序列和互补反义序列的单一转录本，如发夹结构。

本方法用于抑制CCDC4基因表达上调的细胞中的基因表达。siRNA与靶细胞中CCDC4基因转录本的结合导致该细胞中CCDC4蛋白质产量下降。

抑制过度表达基因的一种或多种基因产物的核酸还包括针对过度表达基因(CCDC4基因)的核酶。

此外，本发明提供了使用针对本发明之多肽的抗体来治疗或预防细胞增殖性疾病，诸如前列腺癌的方法。依据此方法，施用制药学有效量的针对本发明之多肽的抗体。因为CCDC4蛋白质的表达在前列腺癌细胞中上调，并且抑制这些蛋白质的表达会导致细胞增殖活性降低，预期可通过抗体与这些蛋白质的结合来治疗或预防细胞增殖性疾病。这样，以足以降低本发明之多肽的活性的剂量施用针对本发明之多肽的抗体，其范围是每天0.1至约250毫克/公斤体重。成人的剂量范围通常为每天约5毫克至约17.5克，优选每天约5毫克至约10克，最优选每天约100毫克至约3克。

或者，使用能与肿瘤细胞特异的细胞表面标记物结合的抗体作为药物投递的工具。例如，以足以伤害肿瘤细胞的剂量与胞毒剂偶联的抗体。

本发明还涉及诱导抗肿瘤免疫的方法，包括的步骤有施用CCDC4蛋白质或其免疫学活性片段，或者编码该蛋白质或其片段的多核苷酸。因而CCDC4蛋白质或其免疫学活性片段可用作针对细胞增殖性疾病诸如前列腺癌的疫苗。在有些情况中，蛋白质或其片段可以与T细胞受体(TCR)结合或由抗原呈递细胞(APC)诸如巨噬细胞、树突状细胞(DC)、或B细胞呈递的形式施用。鉴于树突状细胞的强抗原呈递能力，树突状细胞是最优选使用的抗原呈递细胞。

在本发明中，针对细胞增殖性疾病的疫苗是指具有在接种动物后诱导抗肿瘤免疫的功能的物质。一般来说，抗肿瘤免疫包括诸如以下之免疫反应：

-诱导针对肿瘤的细胞毒性淋巴细胞，

-诱导识别肿瘤的抗体，和

-诱导抗肿瘤细胞因子产生。

因而，当某种蛋白质在接种动物后诱导这些免疫反应中的任何一种时，就认为该蛋白质具有诱导抗肿瘤免疫反应的效果。通过在体内或在体外观察宿主中免疫系统针对该蛋白质的反应就能检测由蛋白质对抗肿瘤免疫的诱导。

例如，用来检测细胞毒性T淋巴细胞诱导的方法是众所周知的。进入活体的外源物质通过抗原呈递细胞(APC)的作用呈递给T细胞或B细胞。由于抗原的刺激，T细胞对由抗原呈递细胞呈递的抗原发生反应，以抗原特异的方式分化成细胞毒性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞，CTL)，并随后扩增(这个过程称为T细胞活化)。于是，将肽经抗原呈递细胞呈递给T细胞并检测CTL的诱导就可对该肽的CTL诱导进行评价。更进一步，抗原呈递细胞还有激活CD4+T细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞、噬曙红细胞和NK细胞的作用。因为CD4+T细胞和CD8+T细胞在抗肿瘤免疫中也是重要的，肽对抗肿瘤免疫的诱导作用也可用这些细胞的激活作用作为指标来评价。

本领域众所周知利用树突状细胞(DC)作为APC来评价CTL的诱导作用的方法。DC是在APC中具有最强CTL诱导作用的代表性APC。在这种方法中，首先使测试多肽与DC接触，然后使该DC接触T细胞。在接触DC后检测到T细胞具有针对目的细胞的细胞毒性效应就说明所述测试多肽具有诱导细胞毒性T细胞的活性。针对肿瘤的CTL活性可使用例如⁵¹Cr标记的肿瘤细胞的裂解作为指标来检测。或者，使用³H-胸苷摄入活性或LHD(乳糖脱氢酶)释放作为指标来评估肿瘤细胞损伤程度的方法也是众所周知的。

除DC以外，外周血单核细胞(PBMC)也可用作抗原呈递细胞。据报道，CTL的诱导可通过在GM-CSF和IL-4存在的情况下培养PBMC而加强。类似的，已证明CTL通过在匙孔血蓝蛋白(KLH)和IL-7存在的情况下培养PBMC而诱导。

经这些方法证实具有CTL诱导活性的测试多肽即具有DC激活效果及后续CTL诱导活性的多肽。因此，能诱导针对肿瘤细胞的CTL的多肽可用作针对肿瘤的疫苗。此外，通过与多肽接触而获得诱导针对肿瘤的CTL能力的APC可用作针对肿瘤的疫苗。再者，由于APC呈递的多肽抗原而获得细胞毒性的CTL也可用作针对肿瘤的疫苗。利用源于APC和CTL的抗肿瘤免疫的此类肿瘤治疗方法称为细胞免疫疗法。

通常，在将多肽用于细胞免疫疗法时，已知联合多种结构不同的多肽并使它们与DC接触能加强CTL诱导的效率。所以，在用蛋白质片段刺激DC时，使用多种类型片段的混合物是有利的。

或者，可以通过观察针对肿瘤的抗体生成的诱导来证实多肽对抗肿瘤免疫的诱导。例如，在经多肽免疫的实验动物中诱导产生针对该多肽的抗体时，及肿瘤细胞的生长受到那些抗体的抑制时，就确定该多肽具有诱导抗肿瘤免疫的能力。

施用本发明之疫苗能诱导抗肿瘤免疫，而抗肿瘤免疫的诱导能治疗或预防细胞增殖性疾病，诸如前列腺癌。针对癌症的疗法或癌症发生的预防包括任何步骤，诸如抑制癌细胞的生长，肿瘤的消退及抑制癌症的发生。治疗或预防癌症的效果还包括降低癌症患者的死亡率，降低血液中的肿瘤标志物，减轻癌症伴随的可检测症状等等。此类治疗和预防效果优选具有统计学显著性。例如，与没有施用疫苗的对照相比，观察到针对细胞增殖性疾病的疫苗的治疗或预防效果的显著性水平为5％或更低。例如，Student氏t检验，Mann-Whitney U检验或ANOVA均可用于统计学分析。

上述具有免疫学活性的蛋白质或编码该蛋白质的载体可与佐剂联合。佐剂指的是在与具有免疫学活性的蛋白质一起(或相继)施用时能增强针对该蛋白质的免疫反应的化合物。佐剂的例子包括但不限于霍乱毒素、沙门氏菌毒素、明矾等。另外，本发明之疫苗可适当联合制药学可接受载体。此类载体包括灭菌水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、培养液等。另外，如果需要，疫苗可含有稳定剂、悬浮液、防腐剂、表面活性剂等。疫苗可系统或局部施用。疫苗施用可通过单次施用来进行，或通过多次施用来增强。

在以APC或CTL作为本发明之疫苗时，可通过例如回体(ex vivo)方法来治疗或预防肿瘤。更具体地，收集接受治疗或预防处理的受试者的PBMC，使这些细胞以回体方式与多肽接触，并在诱导APC或TCL后，可将这些细胞施用于受试者。还可在体外通过将编码多肽的载体导入PBMC来诱导APC。可在施用前克隆在体外诱导的APC或TCL。通过克隆和培养对靶细胞具有高杀伤活性的细胞，能增强细胞免疫疗法的效果。而且，以这种方式分离的APC和CTL可用于细胞免疫疗法，不仅针对细胞来源的个体，而且针对来自不同个体的相似类型肿瘤。

再者，本发明提供了用于治疗或预防细胞增殖性疾病诸如前列腺癌的药用组合物，它包含制药学有效量的CCDC4多肽。该药用组合物可用来引发抗肿瘤免疫。CCDC4的正常表达局限于睾丸和前列腺。所以，抑制这种基因的表达可能不会对其它器官起负面作用。这样，CCDC4多肽优选用于治疗细胞增殖性疾病，尤其是前列腺癌。另外，因为已表明在癌细胞中特异表达的蛋白质的肽片段能诱导针对癌的免疫反应，所以CCDC4的肽片段也可用在用于治疗或预防细胞增殖性疾病诸如前列腺癌的药用组合物。在本发明中，多肽或其片段以足以诱导抗肿瘤免疫的剂量施用，所述剂量在0.1毫克至10毫克，优选0.3毫克至5毫克，更优选0.8毫克至1.5毫克的范围内。可重复施用。例如，1mg的肽或其片段可每两周施用4次以诱导抗肿瘤免疫。

另外，编码CCDC4或其片段的多核苷酸可用于引发抗肿瘤免疫。此类多核苷酸可掺入表达载体中从而在待治疗的受试者中表达CCDC4或其片段。这样，本发明涵盖诱导抗肿瘤免疫的方法，其中将编码CCDC4或其片段的多核苷酸施用于患有或有风险发展成细胞增殖性疾病诸如前列腺癌的受试者。

提供下面的实施例是用来说明本发明并帮助本领域普通技术人员制造和使用本发明。这些实施例不应以任何方式限制本发明的范围。

除非另外定义，这里使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员的通常理解相同的含义。虽然与这里所描述的方法和材料相同或等同的方法和材料可用来实施或测试本发明，下文描述了合适的方法和材料。收录这里引用的任何专利、专利申请和出版物作为参考。

实现本发明的最优模式

下面的实施例详细例示了本发明，但本发明不限于这些实施例。

(1)cDNA微阵和激光微光束显微切割

cDNA微阵玻片的制造已有描述(Ono et al.，Cancer Res，60：5007-5011，2000)。为了降低实验波动，本发明人为每一个表达谱的分析准备了两套一样的cDNA微阵玻片，各包含23,040个cDNA点。简而言之，对20个前列腺癌组织进行激光微光束显微切割，得到前列腺癌细胞、PIN细胞和正常前列腺管上皮细胞并纯化总RNA。进行基于T7的RNA扩增以得到足够的RNA进行微阵实验。将从前列腺癌细胞和正常导管上皮细胞扩增得到的一份RNA通过逆转录分别用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP进行标记(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)。如前所述进行杂交、清洗和检测(Ono etal.，2000)。

(2)新基因CCDC4的鉴定(含卷曲螺旋结构域4，coiled-coil domaincontaining 4)

根据我们的全基因组cDNA微阵，本发明人鉴定了一个上调的点，内部编号(housing name)为B3537，它代表一个EST(人类cDNA FLJ35632)。综合其它EST信息及由前列腺癌cDNA的RACE得到的序列，我们鉴跫了一个新基因CCDC4。

(3)Northern印迹分析

将人多组织Northern印迹(Clontech，Palo Alto，CA)与[α-³²P]dCTP标记的B3537 PCR产物进行杂交。利用引物

(5′-GTGACAAATCCATTGATCCTGA-3′，SEQ ID NO：5和

5′-GAACACGTGGCATTCTAGAGGTA-3′，SEQ ID NO：6)通过PCR制备361bp的PCR产物。根据供应商的建议进行预杂交、杂交和洗膜。将印迹在-80℃用增强屏自显影7天。

通过RT-PCR分析验证了CCDC4在前列腺癌细胞中的过度表达(图1A)。Northern印迹分析(图1B)显示该转录本长约8.7kb，由6个外显子组成，编码530个氨基酸、具有卷曲螺旋域的蛋白质(Gene Bank编号：AB126828)(SEQ ID NO：2)。还鉴定了一个可选剪接形式，它预期产生缺失长型C端区的437个氨基酸的短型同种型(Gene Bank编号：AB126829)(SEQ ID NO：4)。如Northern印迹分析所示，该基因的表达限制于正常睾丸和前列腺(图1B)，表明针对此分子对正常人体器官预期产生很小的毒性。

(4)siRNA表达构建物和集落形成/MTT测定法

本发明人利用siRNA表达载体(psiU6BX)分析靶基因的RNA干扰作用。将U6启动子克隆到基因特异序列的上游(来自靶转录本的19个核苷酸序列，以一个短间隔序列TTCAAGAGA(SEQ ID NO：7)与其自身的反向互补序列分开)，并以5个胸苷作为终止信号；此外，整合neo盒，使其对遗传霉素(Sigma)产生抗性。CCDC4基因的靶序列为

5′-GATGGTTCTGCAGCACCAC-3′(SEQ ID NO：8)(Si#1)，而阴性对照为

5′-GAAGCAGCACGACTTCTTC-3′(SEQ ID NO：9)(siEGFP)。

用于CCDC4 siRNA的寡核苷酸如下所示。通过将下述双链寡核苷酸克隆到psiU6BX载体的BbsI位点来构建si#1。相对于CCDC4核酸序列SEQ IDNO：1或3的对应核苷酸位置如下所示。寡核苷酸是CCDC4靶序列的有义核苷酸序列和反义核苷酸序列的组合体。si#1的发夹环结构的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(内切核酸酶识别位点已从每个发夹环结构序列中除去)。

si#1(SEQ ID NO：1或3的核苷酸1666-1684/SEQ ID NO：8)

5′-caccgatggt tctgcagcac cacttcaaga gagtggtgct gcagaaccat c-3′(SEQ ID NO：11)

5′-aaaagatggt tctgcagcac cactctcttg aagtggtgct gcagaaccat c-3′(SEQ ID NO：12)

将前列腺癌细胞系PC3和DU145接种到10cm培养皿中(5x10⁵细胞/盘)，并用Lipofectamine 2000(Invitrogen)根据制造商的指示用含有EGFP靶序列(EGFP)的psiU6BX和含有CCDC4靶序列的psiU6BX转染细胞。细胞用500mg/mL遗传霉素筛选一周，转染后48小时收集初级细胞并通过RT-PCT验证CCDC4的抑制效果。RT-PCT的引物如前所述。用吉姆萨溶液染色并进行MTT反应，分别评估集落形成和细胞数。

RT-PCT验证了CCDC4 mRNA能被转染的siRNA表达载体si#1所抑制，但不能被siEGFP抑制。集落形成测定法表明在经RT-PCR验证有效抑制CCDC4的si#1转染细胞中，集落数目显著减少。MTT测定法也表明用si#1转染的培养细胞的数目显著减少。这些发现强烈支持CCDC4对PRC细胞生长是必需的，且CCDC4的分子靶向是开发PRC新疗法的有希望的途径。

psiU6BX3.0载体的构建

在以下质粒序列中(SEQ ID NO：13)，编码siRNA的DNA片段插入位于核苷酸485-490的缺口中，以(-)表示。

GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGGAT

CCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGGCTTGGGGATCAGCGTTTGAGTAAGA

GCCCGCGTCTGAACCCTCCGCGCCGCCCCGGCCCCAGTGGAAAGACGCGCAGGCAAAACG

CACCACGTGACGGAGCGTGACCGCGCGCCGAGCGCGCGCCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGG

CCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAAT

TAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTA

ATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCT

TACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAA

CACC------TTTTTACATCAGGTTGTTTTTCTGTTTGGTTTTTTTTTTACACCACGTTT

ATACGCCGGTGCACGGTTTACCACTGAAAACACCTTTCATCTACAGGTGATATCTTTTAA

CACAAATAAAATGTAGTAGTCCTAGGAGACGGAATAGAAGGAGGTGGGGCCTAAAGCCGA

ATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCGCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGG

GCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGG

TTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCT

TCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCC

CTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTG

ATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGT

CCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGG

TCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGC

TGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGG

AAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGC

AACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCT

CAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCC

CAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGA

GGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGG

CTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGG

ATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTG

GGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGC

CGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGG

TGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGT

TCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGG

CGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAA AGTATCCAT

CATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCA

CCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCA

GGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAA

GGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAA

TATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGC

GGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGA

ATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGC

CTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGAC

CAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGG

TTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTC

ATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAA

AGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGT

TTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGC

TTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCA

CACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAA

CTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG

CTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCC

GCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCT

CACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATG

TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTC

CATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGA

AACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCT

CCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTG

GCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAG

CTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTAT

CGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAAC

AGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAAC

TACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTC

GGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTT

GTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTT

TCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGA

TTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATC

TAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCT

ATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATA

ACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCA

CGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGA

AGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGA

GTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTG

GTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGA

GTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTT

GTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCT

CTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCA

TTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAAT

ACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGA

AAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCC

AACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGG

CAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTC

CTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTT

GAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCA

CCTGACGTC

据报道，snRNAU6基因由RNA聚合酶III转录，产生短的转录本，其3′端为尿苷。以人胎盘DNA为模板，用以下引物对通过PCR扩增含启动子区的snRNA U6基因组片段，

5′-GGGGATCAGCGTTTGAGTAA-3′(SEQ ID NO：14)，和

5′-TAGGCCCCACCTCCTTCTAT-3′(SEQ ID NO：15)。采用TA克隆试剂盒根据供应商的方案(Invitrogen)将产物纯化，并克隆到pCR质粒载体中。纯化含有snRNA U6基因的BamHI、XhoI片段，并克隆到pcDNA3.1(+)质粒的核苷酸1257至65片段中，该片段是用以下引物对通过PCR扩增得到的，

5′-TGCGGATCCAGAGCAGATTGTACTGAGAGT-3′(SEQ ID NO：16)和

5′-CTCTATCTCGAGTGAGGCGGAAAGAACCA-3′(SEQ ID NO：17)。将连接的DNA作为模板用于以下引物对的PCR，

5′-TTTAAGCTTGAAGACTATTTTTACATCAGGTTGTTTTTCT-3′(SEQ IDNO：18)，和

5′-TTTAAGCTTGAAGACACGGTGTTTCGTCCTTTCCACA-3′(SEQ ID NO：

19)。产物经HindIII消化后自连形成psiU6BX载体质粒。作为对照，将以下双链寡核苷酸克隆到psiU6BX载体的BbsI位点中形成psiU6BX-EGFP，

5′-CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3′(SEQ ID NO：20)，和

5′-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3′(SEQ ID NO：21)。

工业应用性

与非癌性前列腺管上皮细胞相比，人CCDC4基因在前列腺癌中的表达显著升高。据此，该基因可作为前列腺癌的诊断标志，而其编码的蛋白质可用于前列腺癌的诊断分析。

本发明人还显示了新蛋白质CCDC4的表达促进细胞生长，而所述细胞生长可被对应于CCDC4基因的小干扰RNA抑制。这些发现表明CCDC4蛋白质刺激致癌活性。因而，这些新的致癌蛋白质中的每一种都可作为研发抗癌药物的靶。例如，阻断CCDC4表达或阻止其活性的试剂在治疗上可作为抗癌药物，特别是用于治疗前列腺癌的抗癌药物。此类试剂的实例包括针对CCDC4基因的反义寡核苷酸、小干扰RNA、和核酶，及识别CCDC4的抗体。

尽管已经参照具体实施方案详细地说明了本发明，对本领域技术人员来说，显而易见的是可在不偏离本发明的精神和范围的前题下对本发明进行多种改变和修改。

序列表

<110>肿瘤疗法科学股份有限公司

<120>前列腺癌相关的基因和多肽

<130>ONC-A0404P

<150>US60/555,810

<151>2004-03-23

<160>21

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>8763

<212>DNA

<213>人类(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(593)..(2185)

<223>

<400>1

gcgatgctcg gggaaagcag gaccccaaag ccccgtaaac accgcgcgac cacccgggcc     60

aagatcttca agaggttctt ttcagaagga tcggagagca attcccgatt ggtagaagaa    120

cttgctgtaa tacacacgta ctctgacgac cccgccccaa cgactagccc ctcctctgtg    180

caaccccgag agtttggggt catgcagggg gcgccacgag ctcgtttcgg aagccggacc    240

ccgcccgcag ccgcagaagc ctcgagtcca catctgggtc tctaaagtct cgccgtagcc    300

agatcccgga tccccacctt cttcaccagt tcccgggcgt cctccaggca ttggcgaggc    360

agcctgtcaa tcaggagctc gggcggcagc cccccgcgcg ggggctcggc gatgccagcc    420

tcagcgacag gcggcggcgg cggcggccac ggcacagaca cacaccctcc cacacgcgcg    480

caccagggca gacccggcgg gcaggcggcg gaggcaccct cggagcccgg cgcccggcgg    540

ggaggggacg tgctccgagg gaccggcccc gaggcgccgg atggaggaag ag atg cag   598

                                                          Met Gln

                                                          1

ccg gca gag gag ggg ccc agc gtc ccc aaa atc tac aag cag cgc agc     646

Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys Ile Tyr Lys Gln Arg Ser

        5                   10                  15

ccc tac agc gtc ctc aag acg ttc ccc agc aag aga ccg gcg ctg gcc     694

Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala Leu Ala

    20                  25                  30

aag cgc tac gag cga ccc acc ctg gtg gag ctg ccg cac gtg cgg gcg     742

Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val Arg Ala

35                  40                  45                  50

ccc ccg ccg ccc ccg ccg ccc ttc gcg ccg cac gcc gcc gtc tcc atc     790

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val Ser Ile

                55                  60                  65

agc agc agc gag ccg ccg ccg cag cag ttc cag gcg cag agc tcc tac     838

Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gln Gln Phe Gln Ala Gln Ser Ser Tyr

            70                  75                  80

ccc ccc ggg ccc ggc cgg gcc gcc gcc gcc gct tcg tcg tcg tcg ccg     886

Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Pro

        85                  90                  95

tcc tgc acg ccc gcc aca tcc cag ggc cac ttg agg act ccg gcg cag     934

Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gln Gly His Leu Arg Thr Pro Ala Gln

    100                 105                 110

ccg ccg ccc gcg tcc ccc gcc gcc tcc tcg tcg tct tcg ttc gcc gct     982

Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ala Ala

115                 120                 125                 130

gtc gtc agg tat ggc cca ggc gcg gcg gcg gcc gcc ggc acc ggc ggc    1030

Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly

                135                 140                 145

acg ggt agc gac agc gcc agc ctg gag ctc agc gca gag agt cga atg    1078

Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser Arg Met

            150                 155                 160

atc ttg gat gcc ttt gcc cag cag tgc agt cga gtt ctt agc ctc tta    1126

Ile Leu Asp Ala Phe Ala Gln Gln Cys Ser Arg Val Leu Ser Leu Leu

        165                 170                 175

aat tgt gga gga aaa ctc ctg gac tcc aac cat tct cag tcc atg att    1174

Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gln Ser Met Ile

    180                 185                 190

tct tgc gta aag cag gaa ggc tca agt tac aac gaa aga cag gag cac    1222

Ser Cys Val Lys Gln Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gln Glu His

195                 200                 205                 210

tgt cac att ggg aaa ggg gtc cac agt cag acc tca gac aat gta gac    1270

Cys His Ile Gly Lys Gly Val His Ser Gln Thr Ser Asp Asn Val Asp

                215                 220                 225

ata gag atg cag tat atg caa agg aaa caa caa act tct gcc ttt ttg    1318

Ile Glu Met Gln Tyr Met Gln Arg Lys Gln Gln Thr Ser Ala Phe Leu

            230                 235                 240

agg gtt ttc act gac tct cta caa aat tac ctg ctc tcg gga agc ttt    1366

Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gln Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Phe

        245                 250                 255

cca act cca aac ccc tcg tca gcc agt gaa tat ggc cat ctg gcc gac    1414

Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu Ala Asp

    260                 265                 270

gtg gat cct ctg tca acc tct cct gtg cat aca tta ggt ggc tgg act    1462

Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly Trp Thr

275                 280                 285                 290

tcc cca gca acg tcc gaa tcc cat ggc cac cca tct tca tct aca ctg    1510

Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser Thr Leu

                295                 300                 305

cca gaa gag gag gag gag gag gac gag gaa ggc tat tgt cct cga tgc    1558

Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro Arg Cys

            310                 315                 320

caa gag ctg gag cag gag gtt att tca ctg caa caa gaa aat gaa gag    1606

Gln Glu Leu Glu Gln Glu Val Ile Ser Leu Gln Gln Glu Asn Glu Glu

        325                 330                 335

ctc aga agg aaa tta gag agc atc cca gtg ccc tgc cag acc gtt tta    1654

Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser Ile Pro Val Pro Cys Gln Thr Val Leu

    340                 345                 350

gat tac ttg aag atg gtt ctg cag cac cac aac caa ctc ctg ata cca    1702

Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gln His His Asn Gln Leu Leu Ile Pro

355                 360                 365                 370

 cag cca gct gac cag ccg aca gag gga agc aag cag ctg ttg aac aac    1750

Gln Pro Ala Asp Gln Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gln Leu Leu Asn Asn

                375                 380                 385

tat cct gtc tac ata acg agc aaa cag tgg gat gag gct gta aat tct    1798

Tyr Pro Val Tyr Ile Thr Ser Lys Gln Trp Asp Glu Ala Val Asn Ser

            390                 395                 400

tca aag aaa gat ggg aga cgg ctc ctt cga tac ctc atc aga ttt gtt    1846

Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu Ile Arg Phe Val

        405                 410                 415

ttc aca acc gat gag ctt aag tac tca tgc ggc ctt ggg aaa agg aaa    1894

Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys Arg Lys

    420                 425                 430

agg tca gtg cag tca gga gag aca ggt ccc gaa aga cgc cct ctg gat    1942

Arg Ser Val Gln Ser Gly Glu Thr Gly Pro Glu Arg Arg Pro Leu Asp

435                 440                 445                 450

cca gtt aaa gta aca tgc ctc cga gaa ttc att agg atg cat tgt acc    1990

Pro Val Lys Val Thr Cys Leu Arg Glu Phe Ile Arg Met His Cys Thr

                455                 460                 465

tcc aac ccc gat tgg tgg atg ccc tcg gaa gag cag ata aac aaa gtg    2038

Ser Asn Pro Asp Trp Trp Met Pro Ser Glu Glu Gln Ile Asn Lys Val

            470                 475                 480

ttc agc gac gct gtc ggt cac gcc cga cag ggg cgg gcg gtg ggg act    2086

Phe Ser Asp Ala Val Gly His Ala Arg Gln Gly Arg Ala Val Gly Thr

        485                 490                 495

ttc ctg cac aac ggt ggc tca ttt tat gaa ggg atc gat cac cag gct    2134

Phe Leu His Asn Gly Gly Ser Phe Tyr Glu Gly Ile Asp His Gln Ala

    500                 505                 510

tct cag gat gaa gtc ttc aat aaa agt tcc cag gat gga tct ggg gat       2182

Ser Gln Asp Glu Val Phe Asn Lys Ser Ser Gln Asp Gly Ser Gly Asp

515                 520                 525                 530

tag tggacagaat cttcctgttg tagcagctgg tcctctcaag agttccaatt            2235

gtgaatgtcc  tgttcctgtc acctgagagt ccaaagcctg tcattctgcc atagtctaca    2295

cattctcagc  tgccacagta cccaaataga aatccatttt agggttgttt gggaagtctg    2355

tggcacctac  aacagacttt tggaatatta tattataaaa agaaaaaact acatctgatt    2415

tttaaatgat  tactagctag atcatgaggg tgaaaaaata ggtgagctcc tagttacctt    2475

tctgaaatct  tcaaactctg ctacctgggc agagatagtc cccaaggtag gctggggtag    2535

tgtttctgcc  catgggagaa ggtggagaca tggagttgtg ttaagggaca agaagcaaac    2595

attctcttaa  ttcaaataag ttgtctttat gttttccaaa gacttgactt catatttctc    2655

ggcaaagaca  taggatagat gacatcatat accattttga cattaataat gtctattact    2715

aaaaggaaac  cagagaacag aggcaacatc tgcagacagt gattaattac aggtcaactg    2775

tttttctgtt  gtttaaaaac cactgtgttg atcaagaagg cactatttga tctctggagt    2835

ttacaaacag  tagtcatttt tcattgttag tcaagaaaca tccaaagatc caaaaccatt    2895

ttcaaatgct  cagttttgta ggttaataaa tccgcagttt ccatagcctt aaatcaggct    2955

ttgttgacac  aatgccaaag tgatgggtag aacaatgaaa atttaaagca attagttgtt    3015

tggtgcactg  aagaccaaac aagtggtgtg actgatggta ttcgctgaat tgactagatg    3075

ttctggcatt  gtatacacac agcttcaagg cgattctgac aactatgcaa tgggcttgtc    3135

agtaattgct  ctgaaatttg agggtctttc tctgctgagc tgatctttag aatttgtatg    3195

aaacttgttt  cccattgtcc ttgatgaaaa catttcatcc cctccgtgcc tcctttaccc    3255

caatgtaccc  cttagctatg gctaagtcag cactgtgccg ctatcccctg gttaatttgt    3315

tgagttccat  atgtgaaatt agtggtatct ttggaaactt tccatattgg caaatgctat    3375

agaggtgcta gagtcatcat ttctgagggc ttcctgtttg gactcaggag aggctttctt    3435

taccaaacta gtccagatta ctacattctt tgtagagcaa agggctaaat ggacagcgtt    3495

tattgaaggc tactaatgtc atctacagac atgaccaagg gtttttgaaa attggttgga    3555

gattcaggtt aatgagcatc cattgataaa gggtttttgg gctatttttg tcaacataaa    3615

ctcataaatt gtcctttaga tttaatattt agtttgtatt cactatatac aaagtcctag    3675

aaacaggtct ttctgtagct tttgtttatt agcttttttg tattactaga attcatccat    3735

tgaaaagttt aatgtttatg gaggtggtca tctgtcagat ctgctcaatg atgtagtggg    3795

cactaatatt tcaatcctgt tttgagaaaa ttaactaaaa tttgtcatat cattcaatgg    3855

aatagggaga accaatattc aattctattt ggggcaaatt agctaaaatt tggaagtaaa    3915

agaaatgata tgggcaaatg ccatgttctt acggcagcca tgagaccagt ctctttggct    3975

ctccaaggaa gaaagatacc tcttaaagca ttttttagag gtccgagaag tcagtgtctg    4035

tcttataaga ttctttgaca acatgacatc ttcgctagaa gaaaaacacc accatagcct    4095

catctgtttt tccatcttac cttaattttt cattggcctt aagttgtcct tactgctgaa    4155

tacatcgttc tgtttttcta aagcaacaat atttgatcac tgcttttaag aaaaacagac    4215

tagcccttct tgtttttctg gaagtttgag agtcctgaat atttcttcat atccaaatat    4275

catcttggag ccctatcgtg ctggtcttcg ctgaggctga tgagagcact ttctgcaccc    4335

ctgctccatg gccgtacatg acaacgcacc tgcaccactg ctgcaagggc ggggggcagc    4395

agcctgtgtt ttggctgtca ctgttacctc ctgagaaggc tgctgtccca ggtttgcaca    4455

ccacttttgt tccaaagtta cacatggtct cttcctccct cgcacccatt ccaggttaat    4515

catttctcta tcagctgttt ctccatccac agattctgaa tgttgagact aattgttggg    4575

catctctttt gcacaaggct gacagactcc atactcagca tcgcacagcc agttctaact    4635

cctctgctgg gtctcggacc tacagctttt gcctgagtga aatgttccta cgacttttgc    4695

tcctgagtga gatattccat tgtacttcta ctgtttgtgt atctgctggg ttcctttagc    4755

caagcctagc gtctgacgca ggcactagcc gccactgagg ccgtgataca gcatcactgt    4815

ggacactgct ggctcctctc cttgggacat atccacactg ccccttgagc ttcaccttta    4875

aggctggtat gtacgtaagt tcacggtggt cgtctgcatg gtctcctctt gtttaaatca    4935

ggaccaacaa aggatgttca tttgtatttt ggcaaggccc attgggcctc tgtgtagcca    4995

ggttaaaagc tcactcacta ggatcggatg ctgtcattgc tctgtgagcc tttcagttga    5055

aatccttgga gacttgaagg tgttgcttat tattttgatt tgattttctg catctttatc    5115

tggcaaatgg acagattgct ctcacaagaa acttagtcat gtcagctttt agagtccttc    5175

ttgagtcatg ttagcattgg tagtgtaaaa tagattgagt taaaacagct caggatgcag    5235

ctgtgccccc acttaattgg tgagaggagg aggtcacggg gctggcttga caacaaagac    5295

taaatgtggc ttttttgtcg gtgactaggt gtggtccata agcagaagag ccatacctac    5355

aaaaagtgac aactgtcctg tgttttccaa attaaaatct tgttacaaag atcatgccgg    5415

cttttcgcag tgagttgaag ccccaagctc agttccagcc aggctcagga tgaccctcaa    5475

atgatatgta ttggatagtg taggtcagga gcctgtggag gggaccagta ttttgcaagc    5535

agttactaaa gtcacatttc tcactgactc ttgacggtgc attgttcaaa atctcatggc    5595

ttaaccttag tgttaaatgc tttcaagaaa aactgtaacc atttcaattt tacaagtact    5655

ttctcatttt acttgaacat tttacaagta ctttctgtat ttacttgtaa atatttcctc    5715

tagcccttga acccgcgcat cacttttttg gttttcctca ttccaccaca gcatttaggt    5775

gaccgttacc atttatgttt cattaagctt cactaggaat gtaaggataa tattagagca    5835

tttgcagaaa attgttatct ccttttgtag gggattcgag acatatttgt agctacttca    5895

cggctgtaga gttagtgggt gatcgggtat tctgcattgt tccttatccc tttgtcagtg    5955

acagacacat tgacataaga gattcctaca ggattataag gagagataaa ttattaacca    6015

tttttttact tgatccaact actccatgtc ccatcaacta gtggtaactg atgttgatag    6075

gatttttttt aagtccagta actattcttg cagtatcaga tgtttacccc aaattaggca    6135

ataacccaga cttcgaatct gtaggtttat gattcctaca ttcccctgcc gctctcaatg    6195

gcttgttgcc tcccttctgt tgctctcaga aaacagatgg agatcaggta aagatgaaac    6255

gtgcactata tgttcagaaa agcaaacatc cattgtcctc atttagattc catccttcaa    6315

tttatgctct agaacctaaa cctaataccc attgactacc tcctgagttt cttaggtttc    6375

aattattttt ttgaaatgtc atccatggat aatagcttca attttaggaa agatttaaat    6435

gtataacttt cctcattcag tgctgtgtca tttcacagta cagatctgcg ttaatttttg    6495

acagctcata tatacagatt tttagaaatg taatagaaaa tgattttgca catatggtgc    6555

aagtcttgct ggtgtatgtt taatgtggca acacgtgcca gaactgtttg gcaaaacatg    6615

tcaaatggag tgcttgagtc agaactctaa tgtaaatgtg tctaaacagc agtatgtatc    6675

attatgatgt atttttgtaa acatagtgat ggctgctttc agtcatgtaa gtgctggata    6735

aaaataacca cttcagttgg agtaatgtag gaaaacgtca cccagcagat gggtagtcct    6795

ctgcaaagtt acactgtcag ccagtggcac tggttctttt atttatgttg ggtttttgtt    6855

ttttttttag aggagagtga agaattgaca tcagacaaca tggagtgcaa aaataataac    6915

ccatcaatat ttgccttcta aatgtaaaat gtaaaagttt aactgatctg tgtacacatt    6975

agagaccact ttcacacgcc acaatatgtt cagttgcagg ttaacactga gaggttgaga    7035

cttccctcat ctgatgacca gcttggttaa tttgacttct gaaggcacta aattaccaag    7095

tatttgcagt aatggggacc ggattaattt tcctcacaat tctctatagc tgtctgatat    7155

aagggctgtg tttttattga atcacagatc ctcaaattac agtgaaagca tgtcttgcta    7215

gtaagactca tttgaaaacc tctttattct tggaataatt gggccagtac aagtggccag    7275

atgtatcctg gccacattgg aaaactattt gggcccgttc agaaccactt aactgcaaca    7335

acagtagtaa ctatagttaa tatctatcta ttgagttatt gtgtgacagt tacttggata    7395

agtactttaa tgcattctca ttttaatcct cacagctacc ctatgaggct gttactgttc    7455

ttatccccat tgtattgata aggaaactgc ccagggtact cagctaagaa gaggattgct    7515

ttgggcatag gaagcagaat gacgagttca gtcttcctca gtagttggag cacagttctc    7575

aaagcccatc aacactttgg aatggatttg ttgttttatt tatgccatca agggagagtt    7635

gatatttgtg tattgctaaa aactactaaa gtatgtcgat gcttaggtag gaacatacaa    7695

accatatatc ctctgggatc tgcccaggtt tctgtataag gcttgaccta cgtaagatcc    7755

tatgatgaag accagaaaac tttttttaaa agtaggtaaa ttaaaattaa aatcacgagt    7815

ttgttcacat ttgtcccata ggttcctagt gcaaaaa tgcagggagataa aagcaaacat    7875

ttgaactcag tgaagtgaga gtctttggga actcctagat gttagaaata gcaccggggc    7935

atcaggtagc caacgttcaa ttcacttttc acgtttgtgt ctttgtagct  ttagagctga   7995

tgagtctgat tggtttggaa gagagagttt taatttatga tgtcactgtg agaactgttg    8055

tgaaaatttt gtaagaaaat acagtaatct gttgattttt tcctgtagtt ttggctttca    8115

catccctttg gctgtgttta agttcaagag catgccaagg ccatgagggt cctggcttgc    8175

acttcttggg aacagggcat gctagaggtg ggtcatgaag ctttcaaggt cactgttcca    8235

gcccgaccct gcgcaattta ggcattgcct ttatgtctct cctctctgga acttcatgta    8295

gcagcctaac accggggccg agttgccttt actctatttt ctatgatgaa tacttgtgga    8355

gaaactgtga caaatccatt gatcctgata tttttattgt tggagtcttg ttgattctct    8415

atgaataatt tctatttgat tgtactgtgt agagttaata cccactaggg atatgttaat    8475

aaagctacaa atgcatagtg taatatagaa tagcaagatt tttttgtgaa caatttatat    8535

agaagagtaa gttgtttttt aagtgttagg ctcatttctt ttagaaactt aaaatgttat    8595

aaaagttttt taaacattca atatttttaa ttataagaga catttgttac tagagccaat    8655

tatttcaggt gttctaattg gagtgttgat tttattacct catatacctc tagaatgcca  8715

cgtgttctgt tggggataaa attgcacaat aaatgtcaag tctctgtt               8763

<210>2

<211>530

<212>PRT

<213>人类

<400>2

Met Gln Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys Ile Tyr Lys Gln

1               5                   10                  15

Arg Ser Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala

            20                  25                  30

Leu Ala Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val

        35                  40                  45

Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val

    50                  55                  60

Ser Ile Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gln Gln Phe Gln Ala Gln Ser

65                  70                  75                  80

Ser Tyr Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser

                85                  90                  95

Ser Pro Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gln Gly His Leu Arg Thr Pro

            100                 105                 110

Ala Gln Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe

        115                 120                 125

Ala Ala Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr

    130                 135                 140

Gly Gly Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser

145                 150                 155                 160

Arg Met Ile Leu Asp Ala Phe Ala Gln Gln Cys Ser Arg Val Leu Ser

                165                 170                 175

Leu Leu Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gln Ser

            180                 185                 190

Met Ile Ser Cys Val Lys Gln Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gln

        195                 200                 205

Glu His Cys His Ile Gly Lys Gly Val His Ser Gln Thr Ser Asp Asn

    210                 215                 220

Val Asp Ile Glu Met Gln Tyr Met Gln Arg Lys Gln Gln Thr Ser Ala

225                 230                 235                 240

Phe Leu Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gln Asn Tyr Leu Leu Ser Gly

                245                 250                 255

Ser Phe Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu

            260                 265                 270

Ala Asp Val  Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly

        275                  280                 285

Trp Thr Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser

    290                 295                 300

Thr Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro

305                 310                 315                 320

Arg Cys Gln Glu Leu Glu Gln Glu Val Ile Ser Leu Gln Gln Glu Asn

                325                 330                 335

Glu Glu Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser Ile Pro Val Pro Cys Gln Thr

            340                 345                 350

Val Leu Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gln His His Asn Gln Leu Leu

        355                 360                 365

Ile Pro Gln Pro Ala Asp Gln Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gln Leu Leu

    370                 375                 380

Asn Asn Tyr Pro Val Tyr Ile Thr Ser Lys Gln Trp Asp Glu Ala Val

385                 390                 395                 400

Asn Ser Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu Ile Arg

                405                 410                 415

Phe Val Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys

            420                 425                 430

Arg Lys Arg Ser Val Gln Ser Gly Glu Thr Gly Pro Glu Arg Arg Pro

        435                 440                 445

Leu Asp Pro Val Lys Val Thr Cys Leu Arg Glu Phe Ile Arg Met His

    450                 455                 460

Cys Thr Ser Asn Pro Asp Trp Trp Met Pro Ser Glu Glu Gln Ile Asn

465                 470                 475                 480

Lys Val Phe Ser Asp Ala Val6ly His Ala Arg Gln Gly Arg Ala Val

                485                490                 495

Gly Thr Phe Leu His Asn Gly Gly Ser Phe Tyr Glu Gly Ile Asp His

            500                 505                 510

Gln Ala Ser Gln Asp Glu Val Phe Asn Lys Ser Ser Gln Asp Gly Ser

        515                 520                 525

Gly Asp

    530

<210>3

<211>8692

<212>DNA

<213>人类

<220>

<221>CDS

<222>(593)..(1906)

<223>

<400>3

gcgatgctcg gggaaagcag gaccccaaag ccccgtaaac accgcgcgac cacccgggcc     60

aagatcttca agaggttctt ttcagaagga tcggagagca attcccgatt ggtagaagaa    120

cttgctgtaa tacacacgta ctctgacgac cccgccccaa cgactagccc ctcctctgtg    180

caaccccgag agtttggggt catgcagggg gcgccacgag ctcgtttcgg aagccggacc    240

ccgcccgcag ccgcagaagc ctcgagtcca catctgggtc tctaaagtct cgccgtagcc    300

agatcccgga tccccacctt cttcaccagt tcccgggcgt cctccaggca ttggcgaggc    360

agcctgtcaa tcaggagctc gggcggcagc cccccgcgcg ggggctcggc gatgccagcc    420

tcagcgacag gcggcggcgg cggcggccac ggcacagaca cacaccctcc cacacgcgcg    480

caccagggca gacccggcgg gcaggcggcg gaggcaccct cggagcccgg cgcccggcgg    540

ggaggggacg tgctccgagg gaccggcccc gaggcgccgg atggaggaag ag atg cag    598

                                                          Met Gln

                                                          1

ccg gca gag gag ggg ccc agc gtc ccc aaa atc tac aag cag cgc agc      646

Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys Ile Tyr Lys Gln Arg Ser

            5               10                  15

ccc tac agc gtc ctc aag acg ttc ccc agc aag aga ccg gcg ctg gcc      694

Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala Leu Ala

        20              25                  30

aag cgc tac gag cga ccc acc ctg gtg gag ctg ccg cac gtg cgg gcg      742

Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val Arg Ala

35                  40                  45                  50

ccc ccg ccg ccc ccg ccg ccc ttc gcg ccg cac gcc gcc gtc tcc atc       790

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val Ser Ile

                55                  60                  65

agc agc agc gag ccg ccg ccg cag cag ttc cag gcg cag agc tcc tac      838

Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gln Gln Phe Gln Ala Gln Ser Ser Tyr

            70                  75                  80

ccc ccc ggg ccc ggc cgg gcc gcc gcc gcc gct tcg tcg tcg tcg ccg      886

Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser Ser Pro

        85                  90                  95

tcc tgc acg ccc gcc aca tcc cag ggc cac ttg agg act ccg gcg cag      934

Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gln Gly His Leu Arg Thr Pro Ala Gln

    100                 105                 110

ccg ccg ccc gcg tcc ccc gcc gcc tcc tcg tcg tct tcg ttc gcc gct      982

Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Ala Ala

115                 120                 125                 130

gtc gtc agg tat ggc cca ggc gcg gcg gcg gcc gcc ggc acc ggc ggc     1030

Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly

                135                 140                 145

acg ggt agc gac agc gcc agc ctg gag ctc agc gca gag agt cga atg     1078

Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser Arg Met

            150                 155                 160

atc ttg gat gcc ttt gcc cag cag tgc agt cga gtt ctt agc ctc tta     1126

Ile Leu Asp Ala Phe Ala Gln Gln Cys Ser Arg Val Leu Ser Leu Leu

        165                 170                 175

aat tgt gga gga aaa ctc ctg gac tcc aac cat tct cag tcc atg att     1174

Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gln Ser Met Ile

    180                 185                 190

tct tgc gta aag cag gaa ggc tca agt tac aac gaa aga cag gag cac     1222

Ser Cys Val Lys Gln Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gln Glu His

195                 200                 205                                      210

tgt cac att ggg aaa ggg gtc cac agt cag acc tca gac aat gta gac     1270

Cys His Ile Gly Lys Gly Val His Ser Gln Thr Ser Asp Asn Val Asp

                215                 220                 225

ata gag atg cag tat atg caa agg aaa caa caa act tct gcc ttt ttg     1318

Ile Glu Met Gln Tyr Met Gln Arg Lys Gln Gln Thr Ser Ala Phe Leu

            230                 235                 240

agg gtt ttc act gac tct cta caa aat tac ctg ctc tcg gga agc ttt     1366

Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gln Asn Tyr Leu Leu Ser Gly Ser Phe

        245                 250                 255

cca act cca aac ccc tcg tca gcc agt gaa tat ggc cat ctg gcc gac     1414

Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly His Leu Ala Asp

    260                 265                 270

gtg gat cct ctg tca acc tct cct gtg cat aca tta ggt ggc tgg act     1462

Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly Trp Thr

275                 280                 285                 290

tcc cca gca acg tcc gaa tcc cat ggc cac cca tct tca tct aca ctg     1510

Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser Thr Leu

                295                 300                 305

cca gaa gag gag gag gag gag gac gag gaa ggc tat tgt cct cga tgc     1558

Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro Arg Cys

            310                 315                 320

caa gag ctg gag cag gag gtt att tca ctg caa caa gaa aat gaa gag     1606

Gln Glu Leu Glu Gln Glu Val Ile Ser Leu Gln Gln Glu Asn Glu Glu

        325                 330                 335

ctc aga agg aaa tta gag agc atc cca gtg ccc tgc cag acc gtt tta     1654

Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser Ile Pro Val Pro Cys Gln Thr Val Leu

    340                 345                 350

gat tac ttg aag atg gtt ctg cag cac cac aac caa ctc ctg ata cca     1702

Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gln His His Asn Gln Leu Leu Ile Pro

355                 360                 365                 370

cag cca gct gac cag ccg aca gag gga agc aag cag ctg ttg aac aac     1750

Gln Pro Ala Asp Gln Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gln Leu Leu Asn Asn

                375                 380                 385

tat cct gtc tac ata acg agc aaa cag tgg gat gag gct gta aat tct     1798

Tyr Pro Val Tyr Ile Thr Ser Lys Gln Trp Asp Glu Ala Val Asn Ser

            390                 395                 400

tca aag aaa gat ggg aga cgg ctc ctt cga tac ctc atc aga ttt gtt     1846

Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu Ile Arg Phe Val

        405                 410                 415

ttc aca acc gat gag ctt aag tac tca tgc ggc ctt ggg aaa agg aaa     1894

Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys Arg Lys

    420                 425                 430

aga att cat tag gatgcattgt acctccaacc ccgattggtg gatgccctcg         1946

Arg Ile His

435

gaagagcaga taaacaaagt gttcagcgac gctgtcggtc acgcccgaca ggggcgggcg   2006

gtggggactt tcctgcacaa cggtggctca ttttatgaag ggatcgatca ccaggcttct   2066

caggatgaag tcttcaataa aagttcccag gatggatctg gggattagtg gacagaatct   2126

tcctgttgta gcagctggtc ctctcaagag ttccaattgt gaatgtcctg ttcctgtcac   2186

ctgagagtcc aaagcctgtc attctgccat agtctacaca ttctcagctg ccacagtacc   2246

caaatagaaa tccattttag ggttgtttgg gaagtctgtg gcacctacaa cagacttttg   2306

gaatattata ttataaaaag aaaaaactac atctgatttt taaatgatta ctagctagat   2366

catgagggtg aaaaaatagg tgagctccta gttacctttc tgaaatcttc aaactctgct   2426

acctgggcag agatagtccc caaggtaggc tggggtagtg tttctgccca tgggagaagg   2486

tggagacatg gagttgtgtt aagggacaag aagcaaacat tctcttaatt caaataagtt   2546

gtctttatgt tttccaaaga cttgacttca tatttctcgg caaagacata ggatagatga   2606

catcatatac cattttgaca ttaataatgt ctattactaa aaggaaacca gagaacagag   2666

gcaacatctg cagacagtga ttaattacag gtcaactgtt tttctgttgt ttaaaaacca   2726

ctgtgttgat caagaaggca ctatttgatc tctggagttt acaaacagta gtcatttttc   2786

attgttagtc aagaaacatc caaagatcca aaaccatttt caaatgctca gttttgtagg   2846

ttaataaatc cgcagtttcc atagccttaa atcaggcttt gttgacacaa tgccaaagtg   2906

atgggtagaa caatgaaaat ttaaagcaat tagttgtttg gtgcactgaa gaccaaacaa   2966

gtggtgtgac tgatggtatt cgctgaattg actagatgtt ctggcattgt atacacacag   3026

cttcaaggcg attctgacaa ctatgcaatg ggcttgtcag taattgctct gaaatttgag   3086

ggtctttctc tgctgagctg atctttagaa tttgtatgaa acttgtttcc cattgtcctt   3146

gatgaaaaca tttcatcccc tccgtgcctc ctttacccca atgtacccct tagctatggc   3206

taagtcagca ctgtgccgct atcccctggt taatttgttg agttccatat gtgaaattag   3266

tggtatcttt ggaaactttc catattggca aatgctatag aggtgctaga gtcatcattt   3326

ctgagggctt cctgtttgga ctcaggagag gctttcttta ccaaactagt ccagattact   3386

acattctttg tagagcaaag ggctaaatgg acagcgttta ttgaaggcta ctaatgtcat   3446

ctacagacat gaccaagggt ttttgaaaat tggttggaga ttcaggttaa tgagcatcca   3506

ttgataaagg gtttttgggc tatttttgtc aacataaact cataaattgt cctttagatt   3566

taatatttag tttgtattca ctatatacaa agtcctagaa acaggtcttt ctgtagcttt   3626

tgtttattag cttttttgta ttactagaat tcatccattg aaaagtttaa tgtttatgga   3686

ggtggtcatc tgtcagatct gctcaatgat gtagtgggca ctaatatttc aatcctgttt   3746

tgagaaaatt aactaaaatt tgtcatatca ttcaatggaa tagggagaac caatattcaa   3806

ttctatttgg ggcaaattag ctaaaatttg gaagtaaaag aaatgatatg ggcaaatgcc   3866

atgttcttac ggcagccatg agaccagtct ctttggctct ccaaggaaga aagatacctc   3926

ttaaagcatt ttttagaggt ccgagaagtc agtgtctgtc ttataagatt ctttgacaac   3986

atgacatctt cgctagaaga aaaacaccac catagcctca tctgtttttc catcttacct   4046

taatttttca ttggccttaa gttgtcctta ctgctgaata catcgttctg tttttctaaa   4106

gcaacaatat ttgatcactg cttttaagaa aaacagacta gcccttcttg tttttctgga   4166

agtttgagag tcctgaatat ttcttcatat ccaaatatca tcttggagcc ctatcgtgct   4226

ggtcttcgct gaggctgatg agagcacttt ctgcacccct gctccatggc cgtacatgac   4286

aacgcacctg caccactgct gcaagggcgg ggggcagcag cctgtgtttt ggctgtcact   4346

gttacctcct gagaaggctg ctgtcccagg tttgcacacc acttttgttc caaagttaca   4406

catggtctct tcctccctcg cacccattcc aggttaatca tttctctatc agctgtttct   4466

ccatccacag attctgaatg ttgagactaa ttgttgggca tctcttttgc acaaggctga   4526

cagactccat actcagcatc gcacagccag ttctaactcc tctgctgggt ctcggaccta   4586

cagcttttgc ctgagtgaaa tgttcctacg acttttgctc ctgagtgaga tattccattg   4646

tacttctact gtttgtgtat ctgctgggtt cctttagcca agcctagcgt ctgacgcagg   4706

cactagccgc cactgaggcc gtgatacagc atcactgtgg acactgctgg ctcctctcct   4766

tgggacatat ccacactgcc ccttgagctt cacctttaag gctggtatgt acgtaagttc   4826

acggtggtcg tctgcatggt ctcctcttgt ttaaatcagg accaacaaag gatgttcatt   4886

tgtattttgg caaggcccat tgggcctctg tgtagccagg ttaaaagctc actcactagg   4946

atcggatgct gtcattgctc tgtgagcctt tcagttgaaa tccttggaga cttgaaggtg   5006

ttgcttatta ttttgatttg attttctgca tctttatctg gcaaatggac agattgctct   5066

cacaagaaac ttagtcatgt cagcttttag agtccttctt gagtcatgtt agcattggta   5126

gtgtaaaata gattgagtta aaacagctca ggatgcagct gtgcccccac ttaattggtg   5186

agaggaggag gtcacggggc tggcttgaca acaaagacta aatgtggctt ttttgtcggt   5246

gactaggtgt ggtccataag cagaagagcc atacctacaa aaagtgacaa ctgtcctgtg   5306

ttttccaaat taaaatcttg ttacaaagat catgccggct tttcgcagtg agttgaagcc   5366

ccaagctcag ttccagccag gctcaggatg accctcaaat gatatgtatt ggatagtgta   5426

ggtcaggagc ctgtggaggg gaccagtatt ttgcaagcag ttactaaagt cacatttctc   5486

actgactctt gacggtgcat tgttcaaaat ctcatggctt aaccttagtg ttaaatgctt   5546

tcaagaaaaa ctgtaaccat ttcaatttta caagtacttt ctcattttac ttgaacattt   5606

tacaagtact ttctgtattt acttgtaaat atttcctcta gcccttgaac ccgcgcatca   5666

cttttttggt tttcctcatt ccaccacagc atttaggtga ccgttaccat ttatgtttca   5726

ttaagcttca ctaggaatgt aaggataata ttagagcatt tgcagaaaat tgttatctcc   5786

ttttgtaggg gattcgagac atatttgtag ctacttcacg gctgtagagt tagtgggtga   5846

tcgggtattc tgcattgttc cttatccctt tgtcagtgac agacacattg acataagaga   5906

ttcctacagg attataagga gagataaatt attaaccatt tttttacttg atccaactac   5966

tccatgtccc atcaactagt ggtaactgat gttgatagga ttttttttaa gtccagtaac   6026

tattcttgca gtatcagatg tttaccccaa attaggcaat aacccagact tcgaatctgt   6086

aggtttatga ttcctacatt cccctgccgc tctcaatggc ttgttgcctc ccttctgttg   6146

ctctcagaaa acagatggag atcaggtaaa gatgaaacgt gcactatatg ttcagaaaag   6206

caaacatcca ttgtcctcat ttagattcca tccttcaatt tatgctctag aacctaaacc   6266

taatacccat tgactacctc ctgagtttct taggtttcaa ttattttttt gaaatgtcat   6326

ccatggataa tagcttcaat tttaggaaag atttaaatgt ataactttcc tcattcagtg   6386

ctgtgtcatt tcacagtaca gatctgcgtt aatttttgac agctcatata tacagatttt   6446

tagaaatgta atagaaaatg attttgcaca tatggtgcaa gtcttgctgg tgtatgttta   6506

atgtggcaac acgtgccaga actgtttggc aaaacatgtc aaatggagtg cttgagtcag   6566

aactctaatg taaatgtgtc taaacagcag tatgtatcat tatgatgtat ttttgtaaac   6626

atagtgatgg ctgctttcag tcatgtaagt gctggataaa aataaccact tcagttggag   6686

taatgtagga aaacgtcacc cagcagatgg gtagtcctct gcaaagttac actgtcagcc   6746

agtggcactg gttcttttat ttatgttggg tttttgtttt ttttttagag gagagtgaag   6806

aattgacatc agacaacatg gagtgcaaaa ataataaccc atcaatattt gccttctaaa   6866

tgtaaaatgt aaaagtttaa ctgatctgtg tacacattag agaccacttt cacacgccac   6926

aatatgttca gttgcaggtt aacactgaga ggttgagact tccctcatct gatgaccagc   6986

ttggttaatt tgacttctga aggcactaaa ttaccaagta tttgcagtaa tggggaccgg   7046

attaattttc ctcacaattc tctatagctg tctgatataa gggctgtgtt tttattgaat   7106

cacagatcct caaattacag tgaaagcatg tcttgctagt aagactcatt tgaaaacctc   7166

tttattcttg gaataattgg gccagtacaa gtggccagat gtatcctggc cacattggaa   7226

aactatttgg gcccgttcag aaccacttaa ctgcaacaac agtagtaact atagttaata   7286

tctatctatt gagttattgt gtgacagtta cttggataag tactttaatg cattctcatt   7346

ttaatcctca cagctaccct atgaggctgt tactgttctt atccccattg tattgataag   7406

gaaactgccc agggtactca gctaagaaga ggattgcttt gggcatagga agcagaatga   7466

cgagttcagt cttcctcagt agttggagca cagttctcaa agcccatcaa cactttggaa   7526

tggatttgtt gttttattta tgccatcaag ggagagttga tatttgtgta ttgctaaaaa   7586

ctactaaagt atgtcgatgc ttaggtagga acatacaaac catatatcct ctgggatctg   7646

cccaggtttc tgtataaggc ttgacctacg taagatccta tgatgaagac cagaaaactt   7706

tttttaaaag taggtaaatt aaaattaaaa tcacgagttt gttcacattt gtcccatagg   7766

ttcctagtgc aaaaatgcag ggagataaaa gcaaacattt gaactcagtg aagtgagagt   7826

ctttgggaac tcctagatgt tagaaatagc accggggcat caggtagcca acgttcaatt   7886

cacttttcac gtttgtgtct ttgtagcttt agagctgatg agtctgattg gtttggaaga   7946

gagagtttta atttatgatg tcactgtgag aactgttgtg aaaattttgt aagaaaatac   8006

agtaatctgt tgattttttc ctgtagtttt ggctttcaca tccctttggc tgtgtttaag   8066

ttcaagagca tgccaaggcc atgagggtcc tggcttgcac ttcttgggaa cagggcatgc   8126

tagaggtggg tcatgaagct ttcaaggtca ctgttccagc ccgaccctgc gcaatttagg   8186

cattgccttt atgtctctcc tctctggaac ttcatgtagc agcctaacac cggggccgag   8246

ttgcctttac tctattttct atgatgaata cttgtggaga aactgtgaca aatccattga   8306

tcctgatatt tttattgttg gagtcttgtt gattctctat gaataatttc tatttgattg   8366

tactgtgtag agttaatacc cactagggat atgttaataa agctacaaat gcatagtgta   8426

atatagaata gcaagatttt tttgtgaaca atttatatag aagagtaagt tgttttttaa   8486

gtgttaggct catttctttt agaaacttaa aatgttataa aagtttttta aacattcaat   8546

atttttaatt ataagagaca tttgttacta gagccaatta tttcaggtgt tctaattgga   8606

gtgttgattt tattacctca tatacctcta gaatgccacg tgttctgttg gggataaaat   8666

tgcacaataa atgtcaagtc tctgtt                                        8692

<210>4

<211>437

<212>PRT

<213>人类

<400>4

Met Gln Pro Ala Glu Glu Gly Pro Ser Val Pro Lys Ile Tyr Lys Gln

1               5                   10                  15

Arg Ser Pro Tyr Ser Val Leu Lys Thr Phe Pro Ser Lys Arg Pro Ala

            20                  25                  30

Leu Ala Lys Arg Tyr Glu Arg Pro Thr Leu Val Glu Leu Pro His Val

        35                  40                  45

Arg Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Phe Ala Pro His Ala Ala Val

    50                  55                  60

Ser Ile Ser Ser Ser Glu Pro Pro Pro Gln Gln Phe Gln Ala Gln Ser

65                  70                  75                  80

Ser Tyr Pro Pro Gly Pro Gly Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Ser

                85                  90                  95

Ser Pro Ser Cys Thr Pro Ala Thr Ser Gln Gly His Leu Arg Thr Pro

            100                 105                 110

Ala Gln Pro Pro Pro Ala Ser Pro Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe

        115                 120                 125

Ala Ala Val Val Arg Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala GlyThr

    130                 135                 140

Gly Gly Thr Gly Ser Asp Ser Ala Ser Leu Glu Leu Ser Ala Glu Ser

145                 150                 155                 160

Arg Met Ile Leu Asp Ala Phe Ala Gln Gln Cys Ser Arg Val Leu Ser

                165                 170                 175

Leu Leu Asn Cys Gly Gly Lys Leu Leu Asp Ser Asn His Ser Gln Ser

            180                 185                 190

Met Ile Ser Cys Val Lys Gln Glu Gly Ser Ser Tyr Asn Glu Arg Gln

        195                 200                 205

Glu His Cys His Ile Gly Lys Gly Val His Ser Gln Thr Ser Asp Asn

    210                 215                 220

Val Asp Ile Glu Met Gln Tyr Met Gln Arg Lys Gln Gln Thr Ser Ala

225                 230                 235                 240

Phe Leu Arg Val Phe Thr Asp Ser Leu Gln Asn Tyr Leu Leu Ser Gly

                245                250                  255

Ser Phe Pro Thr Pro Asn Pro Ser Ser Ala Ser Glu Tyr Gly Hi s Leu

            260                 265                 270

Ala Asp Val Asp Pro Leu Ser Thr Ser Pro Val His Thr Leu Gly Gly

        275                 280                 285

Trp Thr Ser Pro Ala Thr Ser Glu Ser His Gly His Pro Ser Ser Ser

    290                 295                 300

Thr Leu Pro Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Gly Tyr Cys Pro

305                 310                 315                 320

Arg Cys Gln Glu Leu Glu Gln Glu Val Ile Ser Leu Gln Gln Glu Asn

                325                 330                 335

Glu Glu Leu Arg Arg Lys Leu Glu Ser Ile Pro Val Pro Cys Gln Thr

            340                 345                 350

Val Leu Asp Tyr Leu Lys Met Val Leu Gln His His Asn Gln Leu Leu

        355                 360                 365

Ile Pro Gln Pro Ala Asp Gln Pro Thr Glu Gly Ser Lys Gln Leu Leu

    370                 375                 380

Asn Asn Tyr Pro Val Tyr Ile Thr Ser Lys Gln Trp Asp Glu Ala Val

385                 390                 395                 400

Asn Ser Ser Lys Lys Asp Gly Arg Arg Leu Leu Arg Tyr Leu Ile Arg

                405                 410                 415

Phe Val Phe Thr Thr Asp Glu Leu Lys Tyr Ser Cys Gly Leu Gly Lys

            420                 425                 430

Arg Lys Arg Ile His

        435

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>5

gtgacaaatc cattgatcct ga                                                22

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于RT-PCR的人工合成引物序列

<400>6

gaacacgtgg cattctagag gta                                            23

<210>7

<211>9

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成间隔序列

<400>7

ttcaagaga                                                            9

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>8

gatggttctg cagcaccac                                                 19

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成靶序列

<400>9

gaagcagcac gacttcttc                                                 19

<210>10

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于发夹siRNA的人工合成寡核苷酸序列

<400>10

gatggttctg cagcaccact tcaagagagt ggtgctgcag aaccatc                 47

<210>11

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸序列

<400>11

caccgatggt tctgcagcac cacttcaaga gagtggtgct gcagaaccat c            51

<210>12

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于构建siRNA表达载体的人工合成寡核苷酸序列

<400>12

aaaagatggt tctgcagcac cactctcttg aagtggtgct gcagaaccat c            51

<210>13

<211>4863

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>siRNA表达载体的人工构建质粒序列

<400>13

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctggat     60

ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttcggcttgg ggatcagcgt ttgagtaaga    120

gcccgcgtct gaaccctccg cgccgccccg gccccagtgg aaagacgcgc aggcaaaacg    180

caccacgtga cggagcgtga ccgcgcgccg agcgcgcgcc aaggtcgggc aggaagaggg    240

cctatttccc atgattcctt catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat    300

tagaattaat ttgactgtaa acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta    360

ataatttctt gggtagtttg cagttttaaa attatgtttt aaaatggact atcatatgct    420

taccgtaact tgaaagtatt tcgatttctt ggctttatat atcttgtgga aaggacgaaa    480

caccttttta catcaggttg tttttctgtt tggttttttt tttacaccac gtttatacgc    540

cggtgcacgg tttaccactg aaaacacctt tcatctacag gtgatatctt ttaacacaaa    600

taaaatgtag tagtcctagg agacggaata gaaggaggtg gggcctaaag ccgaattctg    660

cagatatcca tcacactggc ggccgctcga gtgaggcgga aagaaccagc tggggctcta    720

gggggtatcc ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc    780

gcagcgtgac cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt    840

cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag    900

ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt    960

cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt   1020

tctttaatag tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt   1080

cttttgattt ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt   1140

aacaaaaatt taacgcgaat taattctgtg gaatgtgtgt cagttagggt gtggaaagtc   1200

cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag   1260

gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta   1320

gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc   1380

cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc   1440

ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg   1500

caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg   1560

atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga   1620

gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt   1680

ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct   1740

gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg   1800

cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt   1860

gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc   1920

tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc   1980

gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga   2040

tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg   2100

catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat   2160

ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg   2220

ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc   2280

tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta   2340

tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg   2400

acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc   2460

ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg   2520

gagttcttcg cccaccccaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat   2580

agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc   2640

aaactcatca atgtatctta tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg   2700

taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac   2760

atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca   2820

ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat   2880

taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc   2940

tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca   3000

aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca   3060

aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg   3120

ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg   3180

acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt   3240

ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt   3300

tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc   3360

tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt   3420

gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt   3480

agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc   3540

tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa   3600

agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggttt ttttgtttgc   3660

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg   3720

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca   3780

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt   3840

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca   3900

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg   3960

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca   4020

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt   4080

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt   4140

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca   4200

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca   4260

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga   4320

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact   4380

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga   4440

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg   4500

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc   4560

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga   4620

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat   4680

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt   4740

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt   4800

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac   4860

gtc                                                                 4863

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>14

ggggatcagc gtttgagtaa                                                   20

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>15

taggccccac ctccttctat                                                20

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>16

tgcggatcca gagcagattg tactgagagt                                     30

<210>17

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>17

ctctatctcg agtgaggcgg aaagaacca                                      29

<210>18

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>18

tttaagcttg aagactattt ttacatcagg ttgtttttct                          40

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>19

tttaagcttg aagacacggt gtttcgtcct ttccaca                            37

<210>20

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>20

caccgaagca gcacgacttc ttcttcaaga gagaagaagt cgtgctgctt c            51

<210>21

<211>51

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>用于siRNA的人工合成序列

<400>21

aaaagaagca gcacgacttc ttctctcttg aagaagaagt cgtgctgctt c            51

Claims (42)

1.选自下组的基本上纯的多肽：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4或包含与SEQ ID NO：2或4具有至少约80％同源性的序列的多肽；和

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由SEQ ID NO：2或4任一的氨基酸序列组成的多肽等同的生物学活性。

2.编码权利要求1中所述多肽的分离的多核苷酸。

3.包含权利要求2中所述多核苷酸的载体。

4.包含权利要求2中所述多核苷酸或权利要求3中所述载体的宿主细胞。

5.用于生产权利要求1中所述多肽的方法，所说的方法包括以下步骤：

(a)培养权利要求4中所述的宿主细胞；

(b)使所述宿主细胞表达所述多肽；并

(c)收集表达的多肽。

6.能与权利要求1中所述多肽结合的抗体。

7.与编码权利要求1中所述多肽的多核苷酸或其互补链互补且包含至少15个核苷酸的多核苷酸。

8.针对编码权利要求1中所述多肽的多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA。

9.权利要求8中所述的小干扰RNA，其中它的有义链包含核苷酸序列SEQ ID NO：8作为靶序列且在长度上小于75个核苷酸。

10.用于诊断前列腺癌的方法，所说的方法包括以下步骤：

(a)检测生物样本中编码氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的基因的表达水平；并

(b)把所述表达水平的增高与所述疾病联系起来。

11.权利要求10中所述的方法，其中所述表达水平是通过选自下组的任一方法检测的：

(a)检测编码氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的mRNA，

(b)检测包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的蛋白质，和

(c)检测包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的蛋白质的生物学活性。

12.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所说的方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物与选自下组的多肽接触：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4或包含与SEQ ID NO：2或4具有至少约80％同源性的序列的多肽；和

(3)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的多肽等同的生物学活性；

(b)检测所述多肽与所述测试化合物之间的结合活性；并

(c)选择与所述多肽结合的化合物。

13.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所说的方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物与选自下组的多肽接触：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4或包含与SEQ ID NO：2或4具有至少约80％同源性的序列的多肽；和

(3)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的多肽等同的生物学活性；

(b)检测步骤(a)中所述多肽的生物学活性；并

(c)选择与所述测试化合物缺失情况下检测到的生物学活性相比抑制所述多肽生物学活性的化合物。

14.权利要求13中所述的方法，其中所述生物学活性是细胞增殖活性。

15.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所说的方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物与表达包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的一种或多种多核苷酸的细胞接触；并

(b)选择与所述测试化合物缺失情况下检测到的表达水平相比降低所述包含核苷酸序列SEQ ID NO：1或3的一种或多种多核苷酸的表达水平的化合物。

16.权利要求15中所述的方法，其中所述细胞是前列腺癌细胞。

17.筛选用于治疗或预防前列腺癌的化合物的方法，所说的方法包括以下步骤：

(a)使测试化合物与导入了下述载体的细胞接触，该载体包含一种或多种标志基因的转录调控区及在该转录调控区控制下表达的报道基因，其中所述一种或多种标志基因包含选自SEQ ID NO：1或3的任一核苷酸序列，

(b)测量所述报道基因的表达水平或活性；并

(c)选择与对照相比降低所述报道基因的表达水平或活性的化合物。

18.用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所说的组合物包含制药学有效量的针对下述多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA作为活性成分及制药学可接受载体，其中所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、删除、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的多肽；和

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：2或4组成的多肽等同的生物学活性，及制药学可接受载体。

19.权利要求18中所述的组合物，其中所说的小干扰RNA包含核苷酸序列SEQ ID NO：8作为靶序列。

20.权利要求19中所述的组合物，所说的小干扰RNA的通式为5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是对应于核苷酸序列SEQ ID NO：8的核糖核苷酸序列，

[B]是由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸序列，且

[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。

21.权利要求18中所述的组合物，其中所说的组合物包含转染增强剂。

22.用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所说的组合物包含制药学有效量的针对选自下组的多肽的抗体作为活性成分及制药学可接受载体：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、删除、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的多肽；和

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：2或4组成的多肽等同的生物学活性。

23.用于治疗或预防前列腺癌的组合物，所说的组合物包含制药学有效量的通过权利要求12至17任一项的方法选择的化合物作为活性成分及制药学可接受载体。

24.用于治疗或预防前列腺癌的方法，所说的方法包括的步骤有施用制药学有效量的针对下述多核苷酸的反义多核苷酸或小干扰RNA，其中所述多核苷酸编码选自下组的多肽：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、缺失、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的多肽；和

(3)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：2或4组成的多肽等同的生物学活性。

25.权利要求24中所述的方法，其中所说的小干扰RNA包含核苷酸序列SEQID NO：8作为靶序列。

26.权利要求25中所述的方法，所说的小干扰RNA的通式为5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是对应于核苷酸序列SEQ ID NO：8的核糖核苷酸序列，

[B]是由3至23个核苷酸组成的核糖核苷酸列，且

[A’]是由[A]的互补序列组成的核糖核苷酸序列。

27.权利要求24中所述的方法，其中所说的组合物包含转染增强剂。

28.用于治疗或预防前列腺癌的方法，所说的方法包括的步骤有施用制药学有效量的针对选自下组的多肽的抗体：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、删除、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的多肽；和

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ IDNO：2或4组成的多肽等同的生物学活性。

29.用于治疗或预防前列腺癌的方法，所说的方法包括的步骤有施用制药学有效量的通过权利要求12至17任一项的方法选择的化合物。

30.用于治疗或预防前列腺癌的方法，所说的方法包括的步骤有施用制药学有效量的选自(a)-(c)的多肽或是编码该多肽的多核苷酸：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽或其片段；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、删除、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成其中一个或多个氨基酸被替代、缺失、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的蛋白质等同的生物学活性的多肽；

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽或其片段，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的多肽等同的生物学活性。

31.用于诱导抗肿瘤免疫的方法，所说的方法包括的步骤有使选自(a)-(c)的多肽与抗原呈递细胞接触，或是将编码该多肽的多核苷酸或包含该多核苷酸的载体导入抗原呈递细胞：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽或其片段；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、删除、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的多肽；

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽或其片段，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的多肽等同的生物学活性。

32.权利要求31中所述诱导抗肿瘤免疫的方法，其中所述方法进一步包括的步骤有对受试者施用所述抗原呈递细胞。

33.用于治疗或预防前列腺癌的药物组合物，所说的组合物包含制药学有效量的选自(a)-(c)的多肽或是编码该多肽的多核苷酸作为活性成分及制药学可接受载体：

(a)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4的多肽或其片段；

(b)包含氨基酸序列SEQ ID NO：2或4，其中一个或多个氨基酸被替代、删除、插入和/或添加且具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的蛋白质等同的生物学活性的多肽；

(c)由能与由核苷酸序列SEQ ID NO：1或3组成的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸编码的多肽或其片段，其中该多肽具有与由氨基酸序列SEQ ID NO：2或4组成的多肽等同的生物学活性。

34.权利要求33中所述的药用组合物，其中所述多核苷酸掺入到表达载体中。

35.诊断剂，它包含能与编码权利要求1中所述多肽的多核苷酸杂交的寡核苷酸，或包含能与权利要求1中所述多肽结合的抗体。

36.包含有义链和反义链的双链分子，其中所述有义链包含对应于SEQID NO：8的核糖核苷酸序列，且其中所述反义链包含与所说的有义链互补的核糖核苷酸序列，其中所说的有义链与所说的反义链彼此杂交形成所说的双链分子，且其中所说的双链分子在导入表达CCDC4基因的细胞后能抑制所述基因的表达。

37.权利要求36中所述的双链分子，其中所说的有义链包含来自SEQID NO：1的约19个至约25个连续核苷酸。

38.权利要求36中所述的双链分子，其中所说的有义链由对应于SEQID NO：8的核糖核苷酸序列组成。

39.权利要求36中所述的双链分子，其中一条核糖核苷酸转录本包含有义链和反义链，所说的双链分子进一步包含连接所说的有义链和所说的反义链的单链核糖核苷酸序列。

40.编码权利要求36中所述双链分子的载体。

41.权利要求40中所述的载体，其中所述载体编码具有二级结构的转录本，其中所述转录本包含所述有义链和反义链。

42.权利要求40中所述的载体，其中所述转录本进一步包含连接所说的有义链和所说的反义链的单链核糖核苷酸序列。

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