TW200531978A - Removal of n-terminal methionine from proteins by engineered methionine aminopeptidase - Google Patents

Description

200531978 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於去除蛋白質N端甲硫胺酸的方法及級戍_ 尤指使用改造過的N端胺基酸水解酶之方法及其組成。 【先前技術】 除去重組蛋白的轉譯起始N-甲醯基-甲硫胺酸或甲硬 對於該重組蛋白之功能與穩定具有決定性的影響。例如， < 指出甲硫胺酸的去除對於人類的血紅蛋白（hemoglobin)、介 素2 (interlukin-2)、生長荷爾蒙或娃類的核醣核酸水解轉布 &重

^-(Adachi et al, 2000; Endo et al, 2001; Busby et al Liao a/·，2003; Boix a/·，1996; Varshavsky，1996)。 出具有天然N端的蛋白質，已有各種去除N端甲硫胺峻^ $ 式。有一種方法是利用溴化氰（CNBr)營造極酸的環境來切除w 端的甲硫胺酸，但該方法僅限用於中間沒有其他甲硫胺峻％$ 白質（Boix d α/·，1996);另外一種方法是在目標蛋白的前方接 一段募胜肽，再利用一專一的蛋白酶，例如：第十因子a(paetc)i> Xa)、腸激酶（enterokinase)或組織蛋白酶C(cathepsinC)，活體 外切除該段寡胜肽(Belagaje ei α/·，1997);再者，利用產氣單 胞菌蛋白質水解酶⑽as 中的胺基酸水解酶 活體外切除蛋白質的N端甲硫胺酸(Notomista ei a/.，1999. Shapiro W α/·，1988);最後一種是在目標蛋白的前方接一段訊 號胜肽，然後再利用活體内的分泌加工切除N端曱硫胺酸，不 過該法的產量很低(每公升的培養量僅得到1〜5毫克）（Huang ei α/·，1998)。 最近，Ν端甲硫胺酸水解酶(MetAPs)可用來切除大腸桿菌 與酵母菌的N端曱硫胺酸。真核生物的MetAP有兩種類型， MetAP I 及 MetAP II。MetAP I 僅存於真細菌（eubacteria)， 200531978

MetAP II 存在於古細菌（archaea) (Li 以 α/·，1995; Tahirov d α/·， 1998)。MetAPs的基因已經證實為原核及真核生物的生長所必 須。然而，對於去除N端甲硫胺酸的效率係受限於其第二個殘 基側鏈的大小（殘基小於3.68埃），也就是N端甲硫胺酸隔壁 的殘基（Ben-Bass at βία/.，1987; Hire 1 da/.，1989; Hwang d α/.， 1999; Chen以α/.，2002)。因此，要移除一含有較大或巨大第二 殘基的蛋白質的Ν端甲硫胺酸是很麻煩的。另外當該第二殘基 攜帶電荷’不論是酸性（穀胺酸（Glu )或天門冬胺酸（Asp )) 或鹼性（離胺酸（Lys)，精胺酸（Arg)或組胺酸（His))，也 同樣很難去除N端甲硫胺酸。 從大腸桿囷的MetAP與以胺版酶抑制劑（bestatin)構成的 抑制物複合物的構造發現有四個殘基：酪胺酸168 (Tyr 168)、 穀胺醯胺233 (Gln233 )、甲硫胺酸206 (Met206)與穀胺酸 204 ( Glu204 )係位於受質結合區（Lowther α/.，1999; Lowther d α/·，2000)。當對應至大腸桿菌MetAP的甲硫胺酸206與穀 胺驢胺233位置，酵母菌MetAP的甲硫胺酸329與穀胺醯胺 356被丙胺酸（Ala)取代，若於活體外測試其活性時，純化 的MetAP I變異物（M329A，Q356A)其催化寡肽的能力顯著 增加，且其受質為第二殘基較小的天門冬醯胺（Asn)、組胺酸 (His)及曱硫胺酸（Met)，而非巨大或帶有酸性電荷的殘基 (Roderick α/·，1993; Walker α/·，1999)。因此，目前仍急需 發展一種方法可用來去除各種Ν端甲硫胺酸，尤其是去除那些 第二殘基為龐大或酸性殘基之Ν端甲硫胺酸。 【發明内容】 本發明係提供一種可與多種受質結合之Ν端甲硫胺酸水解 酶（methionine aminopeptidase，MetAPs)，尤指一種可以去除第 二殘基為龐大或酸性殘基之蛋白質的N端甲硫胺酸。具體而言， 200531978 該MetAPs之序列係為SEQ ID 1^0:1(索引號：〇1146727)上之 233、206及/或168位置發生突變。較佳情況為前述突變位置上 之胺基酸殘基係由甘胺酸(Gly)或蘇胺酸(Thr)取代。其中SEQID ΝΟ:1之序列如下所示：

MAISIKTPED

NEQHAVSACL

IKDGFHGDTS

AAIQKFVEAE

工EKMRVAGRL GYHGYPKSVC KMFIVGKPT工 GFSVVREYCG

AAEVLEMIEP 工SINEVVCHG MGERLCRITQ HGIGRGFHEE

YVKPGVSTGE

IPDDAKLLKD

ESLYLALRMV

PQVLHYDSRE

LDRICNDYIV

GDIVNIDVTV

KPGINLREIG

TNVVLKPGMT

FTIEPMVNAG KKEIRTMKDG WTVKTKDRSL SAQYEHTIVV TDNGCEILTL RKDDTIPAII SHDE 因此，本發明之一目的係在於提供一多肽，係含有改造過 的SEQIDNO:l，其中SEQIDN0.1之殘基206或233係以其 他胺基酸取代，前述之胺基酸係選自下列群組，包含··甘胺酸 (Gly)、蘇胺酸（Thr)、天門冬胺酸（Asp )、纈胺酸（Val)與天 門冬醯胺（Asn)。殘基233較佳係以甘胺酸或蘇胺酸取代，而 殘基206較佳係以甘胺酸、蘇胺酸或纈胺酸取代。更佳地，殘 基233與206均被取代。較佳的取代例係為： (a) 殘基206被甘胺酸取代，而殘基233被甘胺酸取代； (b) 殘基206被蘇胺酸取代，而殘基233被甘胺酸取代； (c) 殘基206被蘇胺酸取代，而殘基233被蘇胺酸取代；或 (d ) 殘基206被綠胺酸取代，而殘基233被蘇胺酸取代。 殘基168亦可選擇性地被取代，較佳之取代胺基酸係 選自下列群組：甘胺酸（Gly)、絲胺酸（Set·)、蘇胺酸（Thr)、 纈胺酸（Val)、天門冬胺酸（Asp)與穀胺酸（Glu);更佳係 為甘胺酸或蘇胺酸。 本發明之另一目的係在於提供一多肽，係包含改造過的 SEQ ID NO]，其中 SEQ ID ΝΟ:1 之殘基 168、206 及/或 233 200531978 係以其他胺基酸取代，前述多肽係可去除一受質多肽之N端甲 硫胺酸，其中位於前述受質多肽之N端甲硫胺酸旁邊之胺基酸 係選自下列群組：組胺酸（His)、天門冬醯胺（Asn)、穀胺醯 胺（Gin)、白胺酸（Leu)、異白胺酸（lie)、苯丙胺酸（Phe)、 甲硫胺酸（Met)、穀胺酸（Glu)與天門冬胺酸（Asp)。 本發明亦提供一種細胞，係含有本發明所述之改造過的多 肽，該細胞係可為真核或原核生物，較佳係為哺乳動物細胞、 昆蟲細胞（例如High Five細胞）或細菌；更佳係為大腸桿菌。 本發明進一步提供可編碼前述改造多肽之基因，特別是表 現載體。 本發明之另一目的係提供一移除目標蛋白之N端甲硫胺酸 之方法，係包含：將目標蛋白與本發明之改造多肽（MetAPs) 在適於切除N端甲硫胺酸的環境下接觸。例如，本發明係可將 一編碼改造多肽之DNA送入細胞，且該細胞係表現目標蛋 白。本發明亦可將一編碼改造多肽之DNA與一編碼目標蛋白 之DNA送入一細胞中。 本發明所使用之目標蛋白，其N端甲硫胺酸旁邊之胺基 酸較佳係可選自下列群組：穀胺醯胺（Gin )、天門冬醯胺 (Asn)、天門冬胺酸（Asp)、穀胺酸（Glu)、白胺酸（Leu)、 異白胺酸（lie)以及組胺酸（His)。前述殘基（第二個殘基） 更佳係為榖胺酸（Glu)或天門冬胺酸（Asp)。 本發明之又一目的係提供一包含至少一種本發明之改 造多肽(MetAPs)之組合物、一編碼MetAP之DNA或一含有 MetAP之細胞。 本發明亦提供一種可用於移除目標蛋白的N端甲硫胺酸 之套組，該套組係包含至少兩種組成係選自下列群組：

(1)至少一種本發明所述之改造MetAP或一編碼MetAP 200531978 之核酸； (2 ) —種含有本發明所述之改造MetAP或含有編碼 MetAP之核酸的細胞； (3 ) —種可表現目標蛋白的質體； (4) 一可被MetAP作用之正控制組蛋白，或一段編碼正 控制組蛋白的核酸； (5 ) —使用說明；以及 (6) —用於放置前述套組組成之容器； 其中前述套組之内容物較佳係至少包含（1)、（2)或（3) 其中一種。 本發明之一個或多個實施態樣係詳述如下，本發明之特 色、目的及優點皆描述於實施方式及申請專利範圍中。 【實施方式】 本發明係提供一種可與多種受質結合之N端甲硫胺酸水 解酶（methionine aminopeptidase，MetAPs)，尤指一種可以從第 二殘基為龐大或酸性殘基之蛋白質去除N端甲硫胺酸之胺基酸 水解酶。於本發明之一較佳實施態樣中，該MetAPs之序列係為 SEQ ID NO]上之233、206及/或168位置發生突變。較佳情況 為前述突變位置上之胺基酸殘基係由甘胺酸（Gly)或蘇胺酸（Thr) 取代。 在進一步敘述本發明之前，本發明所使用之名詞解釋，除 非另外說明，否則係如以下之定義。 區域（domain):文中所述之多肽“區域”係指具有特殊結構 或功能之部份，例如：受質結合區域、催化部位、α-螺旋結構、 β-平面結構、β-轉折結構、環狀結構以及兩種結構之間的非結構 性多肽區域。 200531978 改造的MetAP :係指一經過人工調整之MetAP。改造的 MetAP與其相對應之野生型MetAP係至少有一個胺基酸不相同 或缺失。 於細胞中表現多肽：使一個細胞内之聚核苷酸經由蛋白質 轉譯過程，編碼出含有所欲序列之多肽。 表現載體：一載體係可編碼一條或多條所欲序列之多肽， 並含有合適之轉錄或轉譯調節序列以便於在細胞内表現該段多 肽。表現載體的例子包括：質體（plasmid)、噬菌體（phage) 與病毒。表現載體係可包含可誘導的或細胞種類專一的啟動子 (promoter)、強化子（enhancer)或抑制子（repressor)、内含子 (intron)、聚腺苦酸訊號（polyadenylation signal)、選擇性標記 (selectable marker )、多接頭位點（polylinker )、特定點之重組 序列（site-specific recombination sequence)以及其他習知可促進 功能、易於使用及控制mRNA及/或蛋白質表現量之特定構造。 可誘導之啟動子：一啟動子係可依據細胞内在或外在環境而 調控特定聚核苷酸轉錄RNA的程度。可誘導之啟動子係可被多 種環境因子所誘導或抑制，前述環境因子例如··荷爾蒙、營養物、 代謝物、毒物、壓力、滲透壓、細胞内特定生化之活化或去活化 路徑或他種調節基因表現之手段。 Ν ί而甲石爪月女酸水解酶(methi〇nine aminopeptidase，MetAPs) ·· 一種可以移除蛋白質N端甲硫胺酸之酵素。 夕狀·一由任意數目的胺基酸殘基藉著胜肽鍵（peptide bond) 連續接合所組成的分子。於本發明中，多肽與蛋白質為可互換的 名詞。 10 200531978 序列之實質相似性：以多肽而言，當利用習知序列比對程 式，例如·· Clustal W，比對兩條多肽之基本序列具有至少約50 % 、至少約60% 、至少約70% 、至少約80% 、至少約90%或至 少約95%之相似度時，可謂其具有序列之實質相似性。 實質上更有效率：當第一 MetAP移除N端之甲硫胺酸之效 率高於第二MetAP之移除效率至少約50%時，可謂其實質上更 有效率。舉例而言，當第一 MetAP可移除約25%的受質上之N 端甲硫胺酸，而第二MetAP可移除約15%之同樣受質上之N端 甲硫胺酸，則第一 MetAP較第二MetAP實質上更有效率。若第 二MetAP沒有辦法移除受質上的N端甲硫胺酸，也就是說N端 甲硫胺酸的移除無法被偵測到，則只要第一 MetAP可移除至少 1%之同樣受質，便可謂其實質上更有效率。於較佳的情況下， 第一 MetAP移除N端之甲硫胺酸之效率係高於第二MetAP之移 除效率至少約100% ，更佳為150% 、200% 、甚至最佳達到250 % 〇 實驗方法 本發明中係利用點突變法將大腸桿菌MetAP之下列三種 胺基酸殘基：Tyrl68、Met206與Gln233中之至少一種進行突 變，但是負責催化作用的Glu204則進行保留。利用一共同表 現系統藉由同一載體或不同載體產生一目標蛋白以及一改造 過的MetAP，如此在不需進一步藉由化學或酵素處理（BoixW α/.，1996; Walker以α/.，1999)的情況下，便可去除大腸桿菌中 第二殘基為龐大殘基或酸性殘基之目標蛋白的Ν端甲硫胺 酸。前述殘基例如：甲硫胺酸（Met)、組胺酸（His)、天門冬 胺酸（Asp)、天門冬醯胺（Asn)、穀胺酸（Glu)、穀胺醯胺（Gin)、 白胺酸（Leu)、異白胺酸（lie)、苯丙胺酸(Phe)及色胺酸（Τηρ)。 200531978 於疋便可製備一目標蛋白其N端無多餘的甲硫胺酸。

Onconase是一個很好的例子，其係為美國草蛙（及⑽α 化似）身上的抗癌核聽核酸水解酵素（ribonuclease) (Boix d α/·，1996)。〇nconaseN 端的焦穀胺酸（Pyroglutamate)對於其結 構完整性、催化活性以及細胞毒性均非常重要（Lia〇 W β/·， 2003)。然而’因為轉譯起始碼為甲硫胺酸，初生的〇nc〇nase 轉譯產物之起頭為MQD而無法擁有正確的結構或功能。因 此，為產生一正常功能的Onconase，其N端的甲硫胺酸必須 在轉譯後被移除。然而，由於Onconase因為其第二個殘基穀 胺醯胺（Gin)過於龐大，所以其N端的甲硫胺酸無法被大腸 桿菌的N端甲硫胺酸水解酶移除。 於本發明中，多種經過改造的MetAP係與Onconase(開 放讀碼區（open reading frame)從MQD開始）在大腸桿菌中共同 表現。野生型MetAP完全無法移除Onconase N端之甲硫胺 酸，而殘基233由甘胺酸(Gly)或蘇胺酸(Thr)取代之突變MetAP 則可有效率的移除Onconase N端之甲硫胺酸（實施例2 );同 樣地，殘基206由甘胺酸(Gly)、蘇胺酸(Thr)或纈胺酸（Val) 取代之突變MetAP亦可移除Onconase之N端甲硫胺酸（實施 例2)。另外，殘基233及206之突變可加強N端甲硫胺酸之 移除效率（實施例2 )。 為決定改造的MetAP移除Onconase N端甲硫胺酸之效 率，係建立出多種含有不同第二殘基之0nconase序列作為目 標序列。這些目標序列係與各種改造過的MetAP共同表現’ 然後分析Onconase的N端序列。如表一所示’在殘基206以 蘇胺酸(Th〇取代及殘基233以甘胺酸(Gly)取代之雙突變，簡 稱MetAP*TG，其對於多種受質均表現出顯著的活性。甚至在 鄰近酸性殘基之N端甲硫胺酸，如穀胺酸（Glu)及天門冬胺 200531978 酸（Asp)，也可以被有效率的移除（參見表一之MDD-Onc及 MED-Onc)。再者，當第二殘基為鹼性的組胺酸（His)時，也 有92 % N端甲硫胺酸可以高效率的被移除（參見表一 MHD-Onc)。不過當第二殘基為精胺酸(Ar*g)或離胺酸(Lys)時， 該MetAP酵素的效率不佳。 本發明係發現當殘基168也以較小的胺基酸取代時，可更 增進其移除N端甲硫胺酸之效率。例如，野生型MetAP與 MetAP*TG突變型對於MYD_Onc或MWD-Onc活性均不 佳，然而MetAP-GTG突變型（殘基168為甘胺酸（Gly)、殘基 206為蘇胺酸(Thr)、殘基233為甘胺酸(Gly))則有較高的移除 活性（表一）。 除了第二殘基外，第三殘基也會影響N端甲硫胺酸之移除 效率。因此，本發明係構築了含有不同第三殘基之受質，以評 估改造MetAP之效率（實施例5)。如表二所示，該MetAP可移 除多數不同情況的N端甲硫胺酸。 因此，本發明之多種改造MetAP係可廣泛地移除多種蛋白 質之N端甲硫胺酸，前述蛋白質包括第二或第三殘基為巨大或 酸性殘基之蛋白質。為了解本發明之改造MetAP之一般實用 性，本實驗檢視蛋白質資料庫中所有蛋白質的N端序列。使用 蛋白質序列分析之SignalP程式於NCBI之人工校對（curated) 真核生物蛋白質參考序列資料庫（2003年1月7曰）中搜尋，發現 5298個分泌型蛋白中37.4%之N端為小型殘基，而17978個非 分泌型蛋白中有58.5%係擁有小型的第二殘基。前述蛋白質的N 端甲硫胺酸或許可以被野生型的MetAP移除。然而相反地，根 據利用本發明之改造MetAP之結果，有84.5%之分泌型蛋白以 及90.2%之非分泌型蛋白可利用本發明之方法順利移除其N端 甲硫胺酸，便可得到與天然蛋白質相同的N端序列。 200531978 树㈣提供改造之N端胺錢切酶係將位於推定受質 結Β區之蘇胺酸、尹硫胺酸及毅胺驢胺進行取 A ,、、 該改造之MetAP之序列係包含SEQ m二丄之=切2=: 或233殘基位置發生取代。較佳情況為^ ^ _ 凡為別述取代位置係由小型之 月女基鲅殘基，例如：甘胺酸、纈胺酸、 門冬醯胺;更佳係為甘胺酸、纈胺酸或蘇胺:。天門冬M夂與天 需注意的是，本發明之改造_?除了在168、裏或加 殘綠置之外，亦可於其他位置發生突變（包括：胺基酸刪除、 增加或取代）。其付述增加在料MetAp#能較不 重要之區域或殘基位置’例如：位在推定受質結合區之突變 ⑽、瓣、Y65F或F177L係不會減低催化活性。另一方面， 已知對於MetAP活性具影變：h从& # ▲ 成③/、〜誓力的殘基位置也不應對其進行突 變时例如·位在推定文負結合區之突變之C7〇s及W221L係 會嚴重減低其催化活性（活性分別降至野生型之Μ%及27%)。 至於位於鈷結合區之突變，例如：D97a di〇8a hi7il、e2〇4v 與E235V貝|!幾乎癱瘓其活性（活性為野生型之2〜6%;⑶㈣虹 1999 )。另外，於大腸桿菌中之MetAp中則是Giu2〇4與Ghi235 殘基對於始金屬之結合及催化活性有影響（L〇wther以“/·， 1999)〇 當利用習知序列比對程式比對本發明之改造MetAp與野生 型MetAP之基本胺基酸序列，除了在168、2〇6及233殘基位置 之外，係至少有約50% 、至少約6〇% 、至少約7〇% 、至少約8〇 /0 、至少約90%或至少約95%之相似度。本發明之改造MetAp 較佳係僅於受質結合區或催化區以外之區域含有限制數目的點 突變（例如1至5個）。 ^了甲硫胺酸的移除之外，N端殘基的修飾通常對於蛋白 14 200531978 質的功能也很重要。例如：肌動蛋白（actin) N端殘基的乙醯化 (acetylation)可加強其與肌凝蛋白（myosin)之交互作用（Abe以 α/·，2000 )。SOS3蛋白質之N端甘胺酸之1蔻醯化 (myristoylation )作用對於植物的耐鹽性有決定性的影響 (Ishitani eia/·，2000)。另外，在所有已知具毒性的娃類的核醣核 酸酵素、某些哺乳動物之核醣核酸酵素、免疫球蛋白以及荷爾蒙 (促甲狀腺激素釋放激素（thyrotropin-releasing hormone )、促黃 體生成素釋放激素（luteinzing-hormone releasing hormone)、促 性腺素釋放激素（Gonadotropin-releasing hormone )、促腎上腺皮 質激素釋放激素（corticotropin-releasing hormone)以及胃泌素 (Gastrin)中均發現N端榖胺醯胺轉變為焦縠胺酸之現象（Busby et aL, 1987; Liao et aL, 2003; Boix et aL, 1996; Fischer aL, 1987)。而N端焦穀胺酸之三組氫鍵對於蛙類核醣核酸酶之結構 完整性、催化活性以及毒性相當重要（Lia〇以a/，2〇〇3; Huang以 α/·，1998; Leu 2003)。本發明之改造MetAP係可於活體内 產生大量去甲硫胺酸之蛋白質（1升培養基中約有10〜50毫克）， 且其末端榖胺酿胺係在活體外之溫和環境下轉換成為焦穀胺 酸’而不需經過化學或酵素處理（Liao et al，2003; Notomista et al， 1999; Shapiro ei “/·，1988)。為避免第二殘基續被切除，第三殘 基係可在不影響蛋白質特性的情況下以龐大或酸性殘基取代。因 而本文中所述之改造MetAP及其表現系統係可大量產製可溶性 或不可溶性之蛋白質並維持其原本蛋白質的性質。 本發明亦提供一改造過的N端甲硫胺酸水解酶，前述N端 甲硫胺酸水解酶係衍生自非SEQ ID N〇:l之野生型MetAP。於 這樣的情況下，該野生型酵素之序列係與SEQ ID ΝΟ:1比對， 且其序列對應至SEQ ID NO]之168、206及/或233殘基處係以 同於SEQ ID N〇:l之型式進行突變。該改造過之MetAP得以移 15 200531978 除至少一個受質之N端甲硫胺酸，且該移除係為其對應之野生 型MetAP所無法達成。亦或是該改造過之MetAP係可較野生型 實質上更有效率地移除受質之N端甲硫胺酸。 本發明亦提供一種產生或表現不具有N端甲硫胺酸之蛋白 質，係將一含有N端甲硫胺酸之蛋白質在活體内或活體外與本 發明之MetAP接觸。較佳地，該蛋白質與改造的MetAP係表現 於同一細胞。前述蛋白質與改造的MetAP係可由同一段DNA編 碼，例如同時可編碼前述兩種蛋白質之質體。或者是編碼MetAP 的基因係插入細胞内的基因組，而前述蛋白質係由質體編碼。前 述MetAP與蛋白質也可由不同質體編碼。 將多肽導入細胞係可採用多種習知的方法，包括但不限於： 轉染（transfection)、顯微注射(microinjection)、scrape loading 以 及細胞的受體輔助攝入(receptor mediated uptake)等。轉染係可為 暫時或永久轉染。目前轉染的方式包括磷酸鈣沉澱法、電穿孔 法、微脂粒感染以及胜肽輔助轉染等。DNA彈（ballistic DNA)運 送及轉導，即藉由病毒或病毒載體感染將外來DNA導入細胞， 也是可使用的方法之一。 例如，本發明之多肽可藉由一表現載體送入細胞，合適的表 現載體係包含一可在欲導入的細胞内具有活性之啟動子 (promoter)，亦可包括一選擇性標記、細胞種類專一或細胞循環 階段專一的強化子（enhancer)或抑制子（repressor)、多接頭位點 (polylinker)、啟動密碼子（start codon)、核醣體結合位點（ribosome binding site)、内部核醣體結合位點（internal ribosome entry site)、内含子（intron)、停頓密碼子（stop codon)、多聚腺苦酸訊 號（polyadenylation signals)以及其他可幫助複製及載體穩定、 m RN A穩定性及細胞内部位置、轉譯效率或結合前述各種考量之 序列特徵。 200531978 組合物 本發明亦提供一種組合物，係包含至少一前述改造過之 MetAP或一編碼MetAP之核酸。該核酸係可進一步包括一“卡匡 (cassette)’’，係於其内插入一段編碼受質蛋白質之序列用以表現 受質蛋白質。該卡匣較佳係包含一段適合在宿主細胞内表現 MetAP及受質蛋白質之啟動子，該卡匣係可選擇性地包含合適 宿主細胞之強化子或其他調節序列。該卡匣較佳係包含一多限制 酶切點（multiple cloning site)以幫助插入多種不同的受質蛋白 質。 本發明亦提供包含至少一前述改造過之MetAP或一編碼 MetAP核酸之細胞。該細胞可為原核或真核細胞，較佳為原核 細胞，更佳為細菌細胞，最佳為大腸桿菌。該細胞可以任何形式 之培養物存在，例如冷柬、懸浮於液態培養基、塗佈於固態培養 基或附著於固態支撐物。前述核酸係可插入細胞内的基因組，或 存在於染色體之外。該細胞係可進一步包含一受質蛋白質或一編 碼受質蛋白質之核酸。 套組 本發明係提供一種可用於去除目標蛋白之N端甲硫胺酸的 套組，該套組係包含至少兩種選自下列群組之組成： (1) 至少一前述改造MetAP或一編碼MetAP之核酸； (2) —細胞包含至少一前述改造MetAP或一編碼MetAP之核 酸； (3) —質體用以表現目標蛋白； (4) 一可被MetAP作用之正控制蛋白質或一編碼正控制蛋白 質之核酸； (5) —使用說明書；及 (6) —用於承裝套組組成之容器。 200531978 前述質體較佳係包括一 “卡匣（cassette)”係於其内插入一段 編碼目標蛋白之序列用以表現目標蛋白。該卡匣較佳係包含一段 適合在宿主細胞内表現MetAP及目標蛋白之啟動子，該卡匣係 可選擇性地包含合適宿主細胞之強化子或其他調節序列。該卡匣 較佳係包含一多限制酶切點（multiple cloning site)以幫助插入多 種不同的目標蛋白。該質體係可選擇性地包含編碼MetAP之序 列，也就是含有組成（1)及（3)。 較佳地，該套組係至少含有組成（1)、（2)或（3)，一較佳實施 態樣係含有組成（2)與（3)，以及選擇性含有一將（3)導入（2)之工 具。例如，該套組係可包含用於磷酸鈣轉染、電穿孔、微脂粒轉 染或顯微注射用之試劑。 以下之實施例係用以描述本發明，而非用於縮限本發明之範 〇 以下實施例中所使用之縮寫其解釋如下，未於本發明中定義 之縮寫係保有其一般大眾接受的解釋。 °c = _攝氏溫度 hr = 小時 min =分鐘 sec = =秒 μΜ = =微莫耳濃度(micromolar) mM =毫莫耳濃度（millimolar) Μ = 莫耳濃度 ml = 毫升 μ1 = 微升 mg = :毫克 Kg = 微克 MetAP = N端甲硫胺酸水解酶 18 200531978 DMEM = Dulbecco’s modified Eagle’s medium FBS =胎牛血清 PBS =磷酸鹽緩衝溶液 PAGE =聚丙稀酿胺凝膠電泳（(polyacrylamide gel electrophoresis)

Pyr=焦穀胺酸 材料與方法 構築表現質體

將源自美國草虫圭（⑼^ )，可編碼目標蛋白onconase 的基因rpr(AF332139)之5’端及3’端分別以Ndel及BamHI限制 酶切除後，插入表現質體pET22b (Novagen)之T7啟動子下游 (Liao W α/·，2003; Huang ei α/·，1998; Liao α/·，2000)，其他的 目標蛋白，包括源自牛虫圭（i?⑽a ⑽a)之RC-RNase LI (AF288642.2)、RC-RNase 2 (AF242553)、RC-RNase 3 (AF242554)、RC-RNase4(AF242555)、RC-RNase6(AF242556) 以及CA150 (—轉錄延長調節因子；NM_006706)與一谷胱甘肽 轉移酶（Glutathione S-Transferase) (M14654)亦用同樣的方法製 備。

大腸桿菌N端甲硫胺酸水解酶（索引號M15106)或其突變種 係藉由三步驟PCR與T7啟動子融合，並依照前述方式利用SacI 及Hindlll切點插入含有目標蛋白之pET22b載體，第一步驟PCR 係利用寡核苷酸 1 (5’CGCGG AGCTC GATCC CGCGA AATTA ATACG 3’； SEQ ID NO:2)與寡核苷酸 2 (5，CTTGA TTGAG ATAGC CATTA TCTCC TTCTT AAAGT TAAAC AAAAT TATTT CTAGA GG 3，； SEQ ID NO:3)分另J 作為 5,與 3,引子，pET22b 作為模板。第二步驟PCR係利用步驟一之PCR產物作為5’大引 子（megaprimer)，募核苷酸 3(5，CCGGA AGCTT TTATT CGTCG 200531978 TGCGAGATTATCG3，； SEQIDNO:4)作為 3’引子，以及大腸桿 菌 MetAP 基因（M15101 )作為模板（Huang w α/.，1998; Ben-Bassat α/·，1987)。編碼目標蛋白及大腸桿菌MetAP基因各有其Τ7 RNA聚合酶啟動子，然而因MetAP基因下游僅有一個轉錄終 點，故其可轉錄至同一 RNA分子以進行共同轉譯 (cotranslation)，或者是，MetAP基因可直接單獨藉由SacI及 Hindlll切點插入至pET29b載體。 根據晶體結構以及胺基酸序列比對，將位於推定的大腸桿菌 MetAP之受質結合區的殘基Tyr 168、Met206以及Gln233進行點 突變（（Ben-Bassat ei α/·，1987; Lowther ei α/.，1999; Walker d α/·， 1999))。為了表現分泌型的核醣核酸水解酵素，其基因係利用前 述方式複製並表現(Huang W α/·，1998)。 表現及純化MetAP及目標蛋白

MetAP係單獨或與目標蛋白，即〇nconaSe與RC-RNaseL 1， 在0·5 mM IPTG及37 °C環境下共同表現於大腸桿菌 BL21(DE3)。超音波震破後’位於水溶層的MetAP係以緩衝液A 透析（20 mM Hepes，pH 8.0，50 mM 氣化鉀（KC1))，並用磷酸 纖維素（phosphocellulose) (Whatman P-11)與 DEAE-cellulose (Whatman DE52)管柱層析純化至均質狀態，其每升培養基之產 量為50mg。 大部分共同表現之目標蛋白，例如〇nc〇nase或 RC-RNaseL 1 ’係存在於非水溶層的細胞裂解物，其係利用已知 之方法改質（denature)再還原本質（renature)及純化（Lia〇以α/， 2003)。鈾述純化的核醣核酸水解酵素係儲存於2〇 mM之^粦酸鈉 溶液，pH 7.0,以利N端焦縠胺酸之形成。或者是該核醣核酸水 20 200531978 解酵素係經由pelB系統分泌至培養基，經過濃縮及純化至電泳 均質，其產量約為每升培養基可產出1至5mg。 分析重組蛋白質之N端

位於細胞沉澱物或水溶性層的蛋白質係利用13.3% SDS-PAGE 分离隹並在轉印緩衝液（transfer buffer)( 10 mM Tris_HCl， pH 7·5, 50 mM NaCl，2 mM EDTA，0.5 mM 2-mercaptoethanol )接 觸轉印（contact transfer)— 整夜至 ProBlottTM membrane (Applied Bioystems)。利用Edman降解法偵測蛋白質N端的前五個殘基。 甲硫胺酸的移除效率之計算係將第一個降解循環中起首為第二 殘基的蛋白質數除以總蛋白質數（包括起首為第二殘基的蛋白質 及起首為甲硫胺酸的未處理蛋白質）。理論上，每個降解循環後 的百分比應該相同，因此為避免實驗的變異，於五個連續的降解 循環重複同樣的計算方式，以onconase來說就是M，Q，D，W及 L。並依照習知方法進行質谱圖（mass spectrum)分析（Liao以α/.， 2003)〇 活體外MetAP活性分析 本實驗所使用的募胜肤受質係由432A Synergy胜肤合成儀

(Applied Biosystems，Foster，CA，USA)所合成，純化的 MetAP 酵素之活性分析係描述於Ben-Bassat d α/·，1987。簡言之，取稀 釋的10μ1的MetAP酵素加到90μ1的受質溶液中，前述受質溶液 含有4 mM寡胜肽、pH值7·5的0.1 Μ磷酸鉀緩衝液以及0.2 mM氣化鈷（CoCh)。將其培養於37。(：，10分鐘後至於滚水兩分 鐘以停止反應。加入0.9 ml之顯色混合物，該顯色混合物係含 有 〇·2 mg L-型胺基酸氧化酶（L-amino acid oxidase)、0.03 mg 之辣根過氧化酶（horseradish peroxidase)及0.2 mg之o-二甲氧 基聯苯胺（〇_dianisidine)溶於 pH 值 7·4、〇·1 Μ Tris-HCl。將 前述混合的試劑培養於37°C，10分鐘後於波長440nm紀錄其光 21 200531978 學密度（optical density)。一單位活性係定義為在分析環境中使用 純甲硫胺酸作為標準物的情況下，每分鐘產生Ιμπιοί的胺基酸。

Met處理過的寡胜肽之ν端殘基進一步用Edman降解法分析再 確認。 核醣核酸水解酵素活性分析 核醣核酸水解酵素活性係於RNA-casting SDS-PAGE上作酶 譜分析（zymogram assay) (Liao and Wang，1994)。另外，每個純 化的核餹核酸水解酵素其活性係可藉由測量核醣核酸水解酵素 分解酵母菌的總RNA後，所釋出的酸可溶性核苷酸來得知。一修 個單位的酵素活性係定義為於37〇C下15分鐘酵素所產生的 A260酸可溶性物質含量（Huang以，1998)。 實施例一 、 生產MetAP及目標蛋白 編碼改造MetAP的基因係單獨或與目標蛋白共同表現於大 · 腸才干菌BL21(DE3)。MetAP為水溶性（第一 a圖，第5及7欄） 並經過電泳純化至均質（第2欄）。MetAP的產量係隨著共同表現 的目標蛋白種類而改變，例如在缺少目標蛋白的情況下，一升培 春 養基可產生50mg的純化蛋白。目標蛋白的可溶性以及產量係隨 著其性質以及培養狀況而改變，以蛙類的核醣核酸酵素（如 onconase或RC-RNaseU)為例，其於37ΐ培養基為不可溶（第 一 Α圖，第4、6及8欄），然而CA150之蛋白質（一轉錄延長因 子）全為可溶，谷胱甘肽轉移酶則為部份可溶。 實施例二 殘基233及206係與受質專一性有關 大腸柊菌MetAP的殘基Gln233係位於受質結合區域與兩個 始離子與兩個催化殘基Glu2G4&⑴咖相鄰。為了解殘基⑶ 22 200531978

對於MetAP受質結合專一的重要性，將其以一小型胺基酸，例 如，甘胺酸、蘇胺酸、天門冬胺酸或天門冬醯胺取代，所產生的 MetAP 係分別命名為 MetAP-Q233G、MetAP-Q233T、 MetAP-Q233D以及MetAP-Q233N。每個MetAP突變種係和目標 蛋白，起首為MQD的onconase (MQD-Onc)，共同表現。其後， 利用前面材料與方法中所述之方式決定共同表現的onconase之 N端殘基。結果顯示MetAP-Q233G之甲硫胺酸移除率達74°/〇， MetAP-Q233T之甲硫胺酸移除率達88%。相反地，野生型酵素 則沒有活性。 接近催化殘基His79 (2.97 A)之殘基Met206係以一小型胺基 酸取代，例如，甘胺酸、蘇胺酸或纈胺酸，所產生的MetAP係 分別命名為 MetAP-M206G、MetAP_M206T 以及 MetAP-M206V。 當共同表現MQD-Onc與MetAP突變種，MQD-Onc之N端甲硫 胺酸移除率係分別 MetAP-M206G (85%)、MetAP_M206T (86%) 以及 MetAP-M206V (61%)。

製備Met206與Gln233之雙突變並測試其活性，其結果係 如表一所示，受質為MQD-Onc，雙突變MetAP-M206G-Q233G 之甲硫胺酸移除率可達96%;MetAP-M206T-Q233G為91%; MetAP-M206T-Q233T 為 93% 以及 MetAP-M206V-Q233T 為 90%，均呈現高催化活性。於表一中，這些突變種係分別命名為 MetAP-*GG，MetAP-*TG，MetAP-*TT 以及 MetAP-*VT。 表一、受質的第二殘基對於改造MetAP活體内催化活性的影響 受質 催化活性（°/0)a 最大側鏈長度

MetAP- MetAP_ h *TG YMQb MetAP- MetAP-GTG TTG (A)c M^GD-Oncd 100c 95 0.00 M^AD-Onc 100 99 1.51 Μ 丄 PD-Onc 80-90 93 2.40 M^D-Onc 80-90 99 2.41 23 200531978 M4TD-Onc 80-90 MVD-Onc M^ND-Onc 80-90 〜20 M^DD-Onc 〜20 M^LD-Onc 〜20 M^ID-Onc 〜20 M；HD-Onc 0 M^QD-Onc M^ED-Onc 0 0 M^FD-Onc 0 M^M^D-Onc 0 M^KD-Onc 0 M^YD-Onc 0 M^WD-Onc 0 M 丄 RD-Onc 0 85 2.54 80 2.55 85 3.68 68 27 80 3.74 86 90 3.90 22 94 68 3.91 92 4.64 91 97 4.93 33 35 58 4.97 5 23 5.10 100(73)e 5.46 3 7 6.37 1 20 6.43 2 78 6.64 2 4 7.40

3活性的計算係從含有不同第二殘基的甲硫胺酸標記之〇沉〇1^记其末端殘基的移除百分 比來表示。 :MetAP-YMQ表示野生型之大腸桿菌N端甲硫胺酸水解酶。 c胺基酸殘基的最大側鏈長度以及野生型MetAP之移除效率係採用Hirei以乂，丨989之 研究結果。 d箭頭丄係表示MetAP的切點。 e括號内的數值係代表第二殘基被MetAP移除的百分比。 實施例三 殘基168亦與受質專一性有關 第三殘基Tyrl68係位於MetAP之受質結合區域與催化殘基 His79形成一氫鍵，將MetAP-*TG進一步以小型殘基：甘胺酸、 絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、天門冬胺酸或穀胺酸取代，所產生的 MetAP 係分別命名為 MetAP-GTG、MetAP-STG、MetAP-TTG、 MetAP-VTG、MetAP_DTG 以及 MetAP-ETG。對受質 MID-Onc 之 甲硫胺酸移除率在Y168G突變種顯著增加達94%，Y168T突變 種之甲硫胺酸移除率達68% (分別為表一之MetAP-GTG與 MetAP-TTG)。 有趣的是，在第二殘基為酸性之情況下，例如MDD-Onc或 24 200531978 MED-Onc，Y168T突變種的活性較Y16犯突變種來的高（參表 一），顯示大腸桿菌MetAP殘基168的氫氧基團若為較短的側鏈可 能對於酸性第二殘基的辨識扮演重要的角色。 實施例四 受質之第二殘基對於受質專一性的影響 為評估第二殘基，也就是位於N端p硫胺酸隔壁的殘基，對 於移除N端甲硫胺酸之影響力，本實驗利用含有不同第二殘基之 MXD-Onc(表一）。結果顯示，MetAP-*TG對於不同的受質均能表 現高度的催化活性，例如MLD-Onc (達到86%之甲硫胺酸移除 率）、MND (85%)、MDD (68%)、MHD (92%)、MQD (91%)以及 MMD-Onc (對於第一個甲硫胺酸有1〇〇〇/0移除率，第二個甲碗胺 酸有73%移除率）（表一）。奇特的是儘管MetAP-*GG有很大的 受質結合區域，但它只對於MQD-Onc有很高的活性（96%),對於 MLD-Onc (18°/。）與MID-Onc (5%)活性卻很低。相反地，野生型 酵素對於前述受質僅有些微的活性。 因此，MetAP-*TG對於中等大小第二殘基之活性，即天門 冬醯胺（85%)，白胺酸（86%)、組胺酸（92%)、穀胺醯胺（90%)以及 甲硫胺酸（100%)，與小型不帶電的殘基，即甘胺酸（95%)、内胺 酸（99%)、脯胺酸（93%)、絲胺酸（99%)、蘇胺酸（85%)以及纈月安 酸（80%)等有相當好的活性；對於帶有巨大第二殘基，如異白 胺酸(lie)與色胺酸(Trp)，之蛋白質，多數的N端甲硫胺酸均可被 MetAP-GTG移除，效率分別為94%與78%。值得注意的是， MetAP-*TG甚至對於含有酸性第二殘基的蛋白質也能有效地移 除其N端甲硫胺酸（對於MDD-Onc可達68°/。，而MED-Onc可達 33% )。當第二殘基為鹼性的組胺酸時，MetAP-*TG具有相當高 的N端甲硫胺酸移除率（92%)，對於其他的鹼性第二殘基，如離 胺酸(Lys)及精胺酸(Arg)，則幾乎不具活性。 25 200531978 綜合前述結果顯示，當重組蛋白的第二殘基為巨大殘基、酸 性或疏水性殘基時，其N端甲硫胺酸可以被移除。然而對於鹼性 巨大殘基，其活性仍低，例如第二殘基為離胺酸則僅有9%的移 除率，精胺酸只有8%的移除率，參見表二。前述起始為MK-或 MR-類的蛋白質可能是因為受質和MetAP的結合區域，如：殘基 His63、Metll2、Asn95及Trp221等之電荷互斥或立體結構障礙 才使得移除率偏低。因此，以小型或親水性殘基取代這些巨大的 帶電殘基或許可以增加受質的辨識以及MetAP的催化活性。 實施例五 第三殘基對於受質專一性的影響 除了第二殘基之外，第三殘基也可能影響MetAP活性。人類 或酵母菌的MetAP在第二殘基為纈胺酸/蘇胺酸而第三殘基為脯 胺酸（Pro )的狀況下，例如：MVP啟動之人類血紅球蛋白 (MVP_initiated human p_globin) (Prchal d α/·，1986)及 MVP 或 MTP 啟動之酵母菌類細胞色素C (MVP- or MTP- initiated yeast iso-1-cytochrome c) (Moerschell W α/·，1990)，活性會降低。相反 地，大腸桿菌的MetAP則在第三殘基為脯胺酸的情況下，可以同 時移除N端甲硫胺酸及第二殘基丙胺酸，例如：MVP啟動之人類 介白素-2 (MAP_initiated human interleukin-2) (Ben-Bassat α/·， 1987)。Ben-Bassat a/.亦推測可能有其他的N端胺基酸水解酶 負責活體内移除第二殘基丙胺酸(Ben-Bassat ei α/1987)。 於本實施例中，第三殘基的影響係利用起始為MAX、MLX、 MQX或MXA的onconase來實驗。 以MAX-Onc作為受質，改變第三殘基並未明顯影響N端甲 硫胺酸的移除。如表二所示，當第三殘基為小型、中型、酸性或 200531978 鹼性時，N端甲硫胺酸均可被移除；然而，只有當第三殘基為小 型殘基時，即甘胺酸或丙胺酸時，第二殘基的丙胺酸才會被移除 (參表二）。此結果和野生型MetAP能夠移除MAA-或MAG-起首 的onconase以及RC-RNase 4受質之N端甲硫胺酸與第二殘基的 丙胺酸的結果是一致的（參見表二與表三）。 以MLX-Onc或MQX-Onc作為受質，當第三殘基為小型或中 型時（例如：甘胺酸、丙胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、天門冬 驗胺），N端甲硫胺酸與第二殘基白胺酸/穀胺醯胺均可被移除， 當第三殘基為巨大或帶電時（例如：天門冬胺酸、穀胺酸、丙苯 · 賤峻、色胺酸、離胺酸或精胺酸），僅有N端甲硫胺酸被移除。 奮受質MFX-Onc或MWX-Onc之第三殘基為丙胺酸時，甲硫胺 岐與丙苯胺酸/色胺酸殘基均可被MetAP-GTG移除，但若第三殘 基為天門冬胺酸時，亦僅有N端甲硫胺酸被移除（參見表二）。 ， 當第三殘基為脯胺酸時，MetAP-*TG自丙胺酸/白胺酸/縠胺 · 職賤第二胺基上移除N端甲硫胺酸的效率會降低。相反地，即使 僅有一半的N端甲硫胺酸移除率，MetAP-GTG仍可以移除多數 噼鞍酸之前的白胺酸/縠胺醯胺（參見表二）。該結果顯示位於第三 立薏的脯胺酸殘基可能造成一立體結構障礙而影響MetAP酵素 性。 綜合前述結果顯示，當第三殘基為小型殘基時，改造過的 =etAp仍可於活體内移除N端甲硫胺酸與第二殘基的丙胺酸/白 耸峻/穀胺醯胺/苯丙胺酸/色胺酸，野生型大腸桿菌MetAp同樣可 父矛夕除MAA-為首的onconase或RC-RNase 4之N端甲硫胺酸以 ^第二殘基的丙胺酸（參表二及表三），一旦N端甲硫胺酸被 etAP變異體移除後，小型的第三殘基就會變成第二殘基並且使 巳鉍除去甲硫胺酸的蛋白質可以繼續被MetAP移除新的N端胺 27 200531978 基酸’因此’大腸桿菌MetAP被認為可能具有其他N端胺基酸 的移除活性’例如：丙胺酸、白胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸以及 色月女酸荨’如果此推論為真實，那麼將不再需要如Ben-Bassat α/· 所述其他蛋白酶的參與（Ben-Bassat以α/，1987)。 移除巨大Ν端殘基，例如：白胺酸、穀胺醯胺、苯丙胺酸以 及色胺酸以及露出小型殘基，例如··丙胺酸、絲胺酸以及蘇胺酸 等’或許可以保護蛋白質不被降解，因為根據蛋白質穩定性的Ν 端法則（Varshavsky，1996; Tobias 以 α/·，1991)預測··含有巨大 Ν 端 殘基的蛋白質，一般被認為是不穩定的殘基，其半衰期很短；而 鲁 含有小型Ν端殘基的蛋白質，一般被認為是穩定的殘基，其半衰 期較長。 表二、受質的第三殘基對於改造MetAPs之活體内催化活性的影響 催化活性（％)5

MetAP- YMQb 質 受 M^G-Oncc ^10(63)^ MW-Onc 85(77) MW〇nc -e M^AV-Onc . M^AN-Onc . M^AD-Onc - M 丄 AL-Onc . M^AQ-Onc - M^E-Onc . M^AF-Onc - M^AM-Onc - M^AK-Onc - M^AR-Onc . M^^G-Onc - MW-Onc . M^L^P-Onc - M；L；S-Onc - M^L^T-Onc .

MetAP- *TG

MetAP- GTG 80(57) 100(25) 72(38) 100 100 100 100 97 96 100 96 100 94 86(16) 100(30) N.D.f -or-I-OI-on Μ Μ Μ Μ 催化活性（％) MetAP- MetAP- *TG GTG 88(24) 93(55) 75(36) 100(51) 100 100 100 96 100(100) 87(46) 100(100) 100(80) 5 55(95) 82(59) 87(69) 91 72(54) 9-or 4 Ε Ε F-^·· KWR- QQQQQQQQQQQ ~^ ^ ^ —V —V —V —^ f _V —> —> ΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜΜ nlncncn(Λο-οη-ο-ο i giv ΐ.ώ ·° 100(100) 25 76(26) 100(65) 91 71 80 100(59) 78 95 83 f ο )) f ♦ ο 9 ο 117 9 L /|\ /IV /ν' 4 6 3 7 Ν 5 8 8 9 100,100(73) M^IA-Onc 36 96 M^^A-Onc 2 36(100) M^KA-Onc 2 9 28 200531978

MxV-Onc Mt^N-Onc M 丄 LD-Onc 76(27) 97(69)硏A-0nc 92(58) 100(68) MV^A-Onc 义_98 M^-Onc 22 100(89) 8 殘基的甲硫胺酸標記之onconase其末端殘基 活性的計算係從含有不同第二殘基與第三 的移除百分比來表示。

MetAP-YMQ表示野生型之大腸桿菌N端甲硫胺酸水解酶。 箭頭i係表示MetAP的切點。 括號内的數值係代表第二殘基被MetAP移除的百分比。 -表示無實驗結果。 f N.D·表示在同樣的培養環境下沒有偵測到任何蛋白質。 表三、大腸桿菌内MetAP-*TG之受質專一性

受質a 可溶性 催化活性（％) M^QDWL-Onc - 91 M^QDWL-Onc15 M^QDWE-RCS - 80 - 96 M 丄 QDWD-RC6 Μ^ΟΨΑ-Κ04 - 82 - 93 MVAWA-RC4 - 100(100)° MVAWA-RC4 - 100(18) MiAiPWA-RC4 - 79(63) MiQ；NWE-RC2 M^^NWA-RCLl - 80(56) - 96(62) M^DWA-RCLl • 99 MVAGA-CA150 + 100(71) m4qdil-gst M；QDIL-GSTb + + 87 71 M 丄 QDIL-GST M^DIL-GST5 - 85 - 70

aOnc, onconase (AF332139); RC2, RC-RNase2 (AF242553); RC3, RC-RNase3 (AF242554); RC4, RC-RNase4 (AF242555); RC6, RC-RNase6 (AF242556); RCL1，RC-RNaseU (AF288642); CA150,轉錄延長調節子 1 (NM—006706); GST, glutathione S-transferase (Μ 14654)。 b目標蛋白的基因係被轉殖入pET22b且與位於pET29b之MetAP-*TG共同 轉型.兩種基因之表現係同時由T7RNA聚合酶驅動。 e括號内的數值係代表第二殘基被MetAP移除的百分比。 29 200531978 實施例六 其他重組蛋白之應用 為探討改造的MetAPs對於其他重組蛋白質的N端甲硫胺酸 移除效果，本實施例利用數種可溶性及不可溶性之蛋白質作為受 質。非可溶性之MQD-起首的娃卵核醣核酸酶（RC-RNase 3、 RC-RNase 4、RC-RNase 6 以及 RC-RNase L1 -N2D)的 N 端曱硫 胺酸係可被MetAP-*TG移除，然而同樣MetAP-*TG酵素亦可移 除非可溶性之MQN-起首的娃卵核醣核酸酶（RC-RNase 2與 RC-RNase L1)之甲硫胺酸及穀胺醯胺（參表三）。可溶性或不可溶 之MQD-起首的曰本血吸蟲之谷胱甘肽轉 移酶（GST) N端甲硫胺酸亦可被MetAP-*TG移除。可溶性之MLA-起首的CA150蛋白質，一轉錄延長調節子，之N端甲硫胺酸以 及白胺酸亦可同樣被移除。（參表三）。

MetAP與目標蛋白可由個別的載體表現，將MetAP-*TG基 因轉殖到pET29b載體，該載體係含有抗卡納黴素標記 (kanamycin-resistance marker );而目標蛋白基因，例如 oriconase 或GST，則轉殖到另一 pET22b載體，其含有抗安比西林標記 (ampicilin resistance marker )。將兩種載體於大腸桿菌 Bl2 1 (DE3) 中共同表現。這兩種MQD起首的蛋白質之曱硫胺酸均可被移除， 然其移除效率略低（降低10-15% )(參表三）。此現象可能導因於編 碼改造MetAP的質體（及RNA)的數量較低的緣故。 實施例七 本發明生產的重組核醣核酸酵素之特性 N端··

根據Edman降解法分析，MQD起首的onconase經過MetAP 200531978 作用後，其N端為穀胺醯胺，不過根據質譜分析，由包含體 (inclusion body)重新摺疊（refolding)不久之後就變成穀胺醯胺/ 焦穀胺酸的混合物。因此，質譜分析圖的一個峰尖（11，818道耳 呑）與焦穀胺酸起首的原生型onconase —致，另一個峰尖（11，835 道耳呑）則與榖胺驢胺起首的onconase —致，前述計算係利用 ExPASY系統計算DNA序列而得（Wilkins d α/.，1998)。減少的 17個道耳呑顯示焦穀胺酸為穀胺醯胺經過減胺作用 (deamination)的結果。在重組RC-RNaseLl蛋白質實驗中亦可 觀察到同樣的結果。 催化活性：

Onconase催化活性會因為N端添加甲硫胺酸而妨礙焦穀胺 酸的形成，導致催化活性大幅降低（降低100倍）。為了解本發明 對於onconase之催化活性影響，在有及無MetAP-*TG的環境下 表現重組onconase，將兩組分別命名為rmOnc(有MetAP-*TG處 理者）或rMOnc(無MetAP-*TG處理者，並用酶譜或酸性不溶物方 法來分析。酶譜（第一 B圖左側）或酸性不溶物方法（未顯示） 之結果分析顯示rmOnc組的催化活性係與從青蛙卵母細胞分離出 的原生型onconase或從培養基分離出來的重組onconase， sOnc(Liao, et al，2003)，的活性相似；然而，沒有 MetAP-*TG 處 理的rMOnc組則沒有活性。此結果證實了改造MetAP移除N端 甲硫胺酸對於onconase的活性具有舉足輕重的影響。 同樣地，rmRCLl-N2D的催化活性也和從牛蛙肝臟分離出 來的核醣核酸酵素（RCL1)或從培養基純化出來的核醣核酸酵素 (sRCLl)相似。然而，rmRCLl 的活性不如 rmRCLl-N2D、RCL1 或sRCL來的高（第一 B圖右側）。因為RCL1的起始胺基酸序列 為MQN，而RCL1-N2D的起始胺基酸序列為MQD，rmRCLl的 200531978 活性減低可能是因為末端的穀胺醯胺部分刪除的緣故，此現象在 第二殘基為小型或中型胺基酸的時候會發生（參見實施例五），因 此，對於那類起首為MQ且之後為小型或_型胺基酸的受質蛋白 質，最好可以將第三殘基變成巨大或帶電的胺基酸（參見實施例 五），尤其是天門冬胺酸(Asp)。 實施例八

MetAP突變種之活體外催化活性 為測量改造MetAP之活體外催化活性，係純化前述突變種並 與各種胜肽受質共同培養。以第二殘基為丙胺酸的四至十二胜肽 (dodecapeptides)的寡胜肽來說，野生型 MetAP 與 MetAP-*TG 呈現高度催化活性，然而 MetAP-*GG，MetAP-*TT 與 MetAP-GTG則無（參表四）。 以第二殘基為穀胺醯胺的募胜肽來說，野生型與多數改造的 MetAPs均未呈現明顯的催化活性。在所有測試的MetAPs中， MetAP-GTG表現的活性最高，其對於十二胜肽MQDWLTFQKKHI 的專一活性達到其對於MADWLTFQKKHI活性的43%， MADWLTFQKKHI序列也就是rM-Onc的a螺旋N端序列。純化 的MetAP對於MQD起首的寡胜肽之活體外催化活性很低，表示 可能活體外環境尚需要一些因子來幫助曱硫胺酸自巨大的第二 殘基上移除。 表四、改造的MetAP對於合成寡胜肽之活體外催化活性 受質 _專一活性（單位/毫克）a_

MetAP- MetAP^ MetAP- MetAP- MetAP-

_YMQ(wt) *GG *TT *TG_GTG MADY 13 8土 8 0.51±0Ό1 ~0.38±0.03 72±10 1.68±0.51 MADYLT 138±6 0.29±0.01 0.12±0.01 116±4 2.50±0.42 MQDYLT 0.43±0.01 0.29±0.02 0.13±0.01 0.42+0.02 0.23+0.01 MADWLTFQKKHI 85±13 3.28±0.04 1.00±0.08 73±15 9.80±0.26 32 200531978 MQDWLTFQKKHI 0.62±0.08 0.50土0.02 0.25±0.01 0.59±0.07 4.24土 0.14 a —單位活性係定義為在文中所述利用純曱硫胺酸作為標準的分析環境下，每分鐘所產生的微 莫耳(μπιοί)胺基酸 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本 發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍内，當 可作各種之更動與潤飾，因此，本發明之保護範圍，當視後附之 申請專利範圍所界定者為準。

33 200531978 參考資料 [0001] U.S. Patent No. 5,013,662. 【0002] Abe, A” et al (2000) Acetylation at the N-terminus of actin strengthens weak interaction between actin and myosin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 268:14-19.

[0⑽3】Adachi，K·，以 a/. (2000) Expression of functional soluble human alpha-globin chains of hemoglobin in bacteria. Protein Expr. Purif., 20:37-44.

[0004] Belagaje, R.M., et al (1997) Increased production of low molecular weight recombinant proteins in Escherichia coli. Protein Sci.? 6:1953-1962.

[0005] Ben-Bassat，A·，以 a/. (1987) Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase and its gene structure. J. Bacteriol., 169:751-757.

[0006] Boix, E., et al (1996) Role of the N terminus in RNase A homologues: differences in catalytic activity, ribonuclease inhibitor interaction and cytotoxicity. J. Mol. Biol., 257:992-1007.

[0007] Busby, W.H., Jr.? et al (1987) An enzyme(s) that converts glutaminyl-peptides into pyroglutamyl-peptides. Presence in pituitary, brain, adrenal medulla, and lymphocytes. J. Biol. Chem·，262:8532-8536· [0008] Chang, S.Y., et al (1989) Methionine aminopeptidase gene of Escherichia coli is essential for cell growth. J. Bacteriol., 171:4071-4072.

[0009] Chen, S., et al (2002) The specificity in vivo of two distinct methionine aminopeptidases in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys., 398:87-93.

[0010] Chiu, C.H., et al (1999) Amino acid residues involved in the functional integrity of Escherichia coli methionine aminopeptidase. J Bacteriol 181:4686-4689.

[0011] Endo, S·，以 a/· (2001) The additional methionine residue at the N-terminus of bacterially expressed human interleukin-2 affects the interaction between the N- and C-termini. Biochemistry, 40:914-919.

[0012] Fischer, W.H., and Spiess, J. (1987) Identification of a mammalian glutaminyl cyclase converting glutaminyl into pyroglutamyl peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84:3628-3632.

[0013] Hirel, P.H., et al (1989) Extent of N-terminal methionine excision from Escherichia coli proteins is governed by the side-chain length of the penultimate amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.，86:8247-8251.

[0014] Huang, H.C., et al (1998) The Rana catesbeiana rcr gene encoding a cytotoxic 34 200531978 ribonuclease. Tissue distribution, cloning, purification, cytotoxicity, and active residues for RNase activity. J. Biol. Chem., 273:6395-6401.

[0015] Hwang, D.D, et al. (1999) Co-expression of glutathione S-transferase with methionine aminopeptidase: a system of producing enriched N-terminal processed proteins in Escherichia coli. Biochem. J.? 338(Pt 2):335-342.

[0016] Ishitani, M., et al (2000) SOS3 function in plant salt tolerance requires N-myristoylation and calcium binding. Plant Cell, 12:1667-1678.

[0017] Leu, Y.J.? et al (2003) Residues involved in the catalysis, base specificity, and cytotoxicity of ribonuclease from Rana catesbeiana based upon mutagenesis and X-ray crystallography. J. Biol. Chem., 278:7300-7309.

[0018] Li, X., and Chang, Y.H. (1995) Amino-terminal protein processing in Saccharomyces c⑽vz_此e is an essential function that requires two distinct methionine aminopeptidas Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92:12357-12361.

[0019] Liao, Y. D.? and Wang, J.J. (1994). Yolk granules are the major compartment for bullfrog (Rana catesbeiana) oocyte-specific ribonuclease. Eur J Biochem., 222:215-220.

[0020] Liao, Y.D., et al (2000) Purification and cloning of cytotoxic ribonucleases from Rana catesbeiana (bullfrog). Nucleic Acids Res., 28:4097-4104.

[0021] Liao, Y.D., et al (2003) The structural integrity exerted by N-terminal pyroglutamate is crucial for the cytotoxicity of frog ribonuclease from Rana pipiens. Nucleic Acids Res., 31:5247-5255.

[0022] Lowther, W.T., et al (1999) Escherichia coli methionine aminopeptidase: implications of crystallographic analyses of the native, mutant, and inhibited enzymes for the mechanism of catalysis. Biochemistry, 38:7678-7688.

[0023] Lowther, W.T., and Matthews, B.W. (2000) Structure and function of the methionine aminopeptidases. Biochim. Biophys. Acta·, 1477:157-167.

[0024] Moerschell, R.P., et al (1990) The specificities of yeast methionine aminopeptidase and acetylation of amino-terminal methionine in vivo. Processing of altered iso-1-cytochromes c created by oligonucleotide transformation. J. Biol. Chem., 265:19638-19643.

[0025】 Notomista，E.,以 a/. (1999) Effective expression and purification of recombinant onconase, an antitumor protein. FEBS Lett., 463:211-215.

[0026] Prchal, J.T., et al (1986) Hemoglobin Long Island is caused by a single mutation (adenine to cytosine) resulting in a faHure to cleave amino-terminal methionine· Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,83:24-27. 35 200531978 [0027] Roderick, S.L., and Matthews, B.W. (1993) Structure of the cobalt-dependent methionine aminopeptidase from 及c<9//: a new type of proteolytic enzyme. Biochemistry, 32:3907-3912.

[0028] Shapiro, R., et al (1988) Expression of Met-(-l) angiogenin in Escherichia coir. conversion to the authentic less than Glu-1 protein. Anal. Biochem., 175:450-461.

[0029] Tahirov, T.H., et al (1998) Crystal structure of methionine aminopeptidase from hyperthermophile, Pyrococcus furiosus. J. Mol. Biol., 284:101-124.

[0030] Tobias, J.W., et al (1991) The N-end rule in bacteria. Science, 254:1374-1377.

[0031] Varshavsky, A. (1996) The N-end rule: functions, mysteries, uses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93:12142-12149.

[0032] Vetro, J.A., and Chang, Y.H. (2002) Yeast methionine aminopeptidase type 1 is ribosome-associated and requires its N-terminal zinc finger domain for normal ftinction in vivo. J. Cell. Biochem., 85:678-688.

[0033] Walker, K.W., and Bradshaw, R.A. (1999) Yeast methionine aminopeptidase I. Alteration of substrate specificity by site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem., 274:13403-13409.

[0034] Wilkins, M.R., et al (1998) Protein identification and analysis tools in the ExPASy Server. Humana Press, New Jersey. 上述及本文中所引用之公開文件、專利以及專利申請案係全文 引入作為本申請案之參考文件。

36 200531978 【圖式簡單說明】 第一 A圖為共同表現MetAP及目標核醣核酸酶 將30微升（μΐ)轉殖的大腸桿菌BL21(DE3)菌液分成含有蛋白 質的上清液（S)及不可溶的沉澱物（P)，並將其用13.3%的 SDS-PAGE電泳分析以及Coomassie blue染色。第一攔為2微克 (pg)的RNA水解酵素Onconase;第二欄為3微克（pg)的 Met AP ;第三、四欄分別為僅表現Onconase的大腸桿菌的上清液 及沉殿物；第五、六欄分別為共同表現Onconase與MetAP的大 腸桿菌的上清液及沉澱物；第七、八欄分別為共同表現MetAP與 RC-RNaseLl的大腸桿菌的上清液及沉澱物。 第一 B圖分析重組核醣核酸酶 上一列為2微克之純化核醣核酸酶經過13.3%的SDS-PAGE電 泳分析以及Coomassie blue染色。下一列係為10奈克（ng) onconase 與 1 奈克 RC-RNaseLl 以 RNA-casting SDS-PAGE 電泳 分離以及用Toluidine blue染色的結果。其中sOnc與sRCL 1係分 別表示從培養基純化、細胞分泌的onconase以及RC_RNase L1 ;而rmOnc、rmRCL 1與rmRCL 1-N2D係分別表示於活體内以 MetAP-*TG處理過之原帶有甲硫胺酸（Met-tagged)的onconase、 RC-RNase L1 與 RC-RNase L1-N2D ;另外 rMOnc 與 rMRCLl 係 分別表示未經MetAP處理過之原帶有甲硫胺酸的onconase與 RC-RNase LI; RCL1則表示從牛蛙肝臟純化出的原始RC-RNase L1。 【主要元件符號說明】 序列表 200531978 序列表 <110>中央硏究院 <120> WN端胺基酸水解酶去除蛋白質N端之甲硫胺酸 <130> 04p0161 <160> 1 <170> Patentln version 3.2

<210〉 1 <211> 264 <212> PRT <213〉大腸桿菌(Escherichia coli) <400> 1

Met Ala lie Ser lie Lys Thi* Pro Glu Asp lie Glu Lys Met Arg Val 15 10 15

Ala Gly Arg Leu Ala Ala Glu Val Leu Glu Met lie Glu Pro Tyr Val 20 25 30

Lys Pro Gly Val Ser Thr Gly Glu Leu Asp Arg lie Cys Asn Asp Tyr 35 40 45 lie Val Asn Glu Gin His Ala Val Ser Ala Cys Leu Gly Tyr His Gly 50 55 60

Tyr Pro Lys Ser Val Cys lie Ser lie Asn Glu Val Val Cys His Gly 65 70 75 l 序列表 200531978 80 lie Pro Asp Asp Ala Lys Leu Leu Lys Asp Gly Asp lie Val Asn lie 85 90 95

Asp Val Tk Val lie Lys Asp Gly Phe His Gly Asp Thi* Ser Lys Met 100 105 110

Phe lie Val Gly Lys Pro Thr lie Met Gly Glu Arg Leu Cys Arg lie 115 120 125

Thi* Gin Glu Ser Leu Tyr Leu Ala Leu Arg Met Val Lys Pro Gly lie 130 135 140

Asn Leu Arg Glu lie Gly Ala Ala lie Gin Lys Phe Val Glu Ala Glu 145 150 155 160

Gly Phe Ser Val Val Arg Glu Tyr Cys Gly His Gly lie Gly Ai-g Gly 165 170 175

Phe His Glu Glu Pro Gin Val Leu His Tyr Asp Ser Arg Glu Thr Asn 180 185 190

Val Val Leu Lys Pro Gly Met Thr Phe Thi* lie Glu Pro Met Val 200531978 序酿

Asn 195 200 205

Ala Gly Lys Lys Glu lie Arg Thr Met Lys Asp Gly Trp Thr Val Lys 210 215 220

Thr Lys Asp Arg Ser Leu Ser Ala Gin Tyr Glu His Thr lie Val Val 225 230 235 240

Thr Asp Asn Gly Cys Glu lie Leu Thr Leu Arg Lys Asp Asp Thr lie 245 250 255

Pro Ala lie lie Ser His Asp Glu 260

Claims (1)

1. 200531978 十、申請專利範圍： 1 · 一種多肽，係包含改造過的SEQ ID NO: 1，其中前述SEQ ID ΝΟ:1之殘基206或233係以選自下列群組之胺基酸取代： 甘胺酸（Gly)、蘇胺酸（Thr*)、天門冬胺酸（Asp)、纈胺酸（Val) 與天門冬醯胺（Asn)。 2. 如申請專利範圍第1項所述之多肽，其中前述殘基233係以 甘胺酸或蘇胺酸取代。 3. 如申請專利範圍第1項所述之多肽，其中前述殘基206係以 甘胺酸、蘇胺酸或纈胺酸取代。 4. 如申請專利範圍第1項所述之多肽，其中前述殘基233與 206均被取代。 5. 如申請專利範圍第4項所述之多肽，其中前述殘基233與 206的取代係包含·· (a) 殘基206被甘胺酸取代，而殘基233被甘胺酸取代； (b) 殘基206被蘇胺酸取代，而殘基233被甘胺酸取代； (c) 殘基206被蘇胺酸取代，而殘基233被蘇胺酸取代；或 (d) 殘基206被纈胺酸取代，而殘基233被蘇胺酸取代。 6. 如申請專利範圍第1項所述之多肽，係可進一步包括於SEQ ID ΝΟ:1之殘基168發生取代。 7. 如申請專利範圍第6項所述之多肽，其中前述取代殘基168 之胺基酸係選自下列群組：甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、纈胺 酸、天門冬胺酸與榖胺酸。 8. 如申請專利範圍第6項所述之多肽，其中前述取代殘基168 之胺基酸為甘胺酸或蘇胺酸。 9. 一種包含申請專利範圍第1項所述多肽之細胞。 10. 如申請專利範圍第9項所述之細胞，其係為細菌。 11. 如申請專利範圍第9項所述之細胞，其係為大腸桿菌。 12. 如申請專利範圍第9項所述之細胞，其係為大腸桿菌 200531978 BL21(DE3) ο 13·如申請專利範圍第9項所述之細胞，其係為真核細胞。 14·一種DNA分子，係包含可編碼申請專利範圍第i項所述多 肽之序列。 15·如申請專利範圍第14項所述之DNA分子，其係為一表現 載體。 16· —種細胞，係包含申請專利範圍第14項所述之dna分子。 17·—種移除目標蛋白之N端甲硫胺酸之方法，係包含：將目 標蛋白與申請專利範圍第1項所述之多肽在適於移除N端甲 硫胺酸的環境下接觸。 18·如申請專利範圍第17項所述之方法，係包含將一編碼前述 多肽之DNA送入細胞，且前述細胞係包含編碼目標蛋白之 DNA。 19·如申請專利範圍第17項所述之方法，係包含將一編碼前述 多狀之DNA以及一編碼前述目標蛋白之dna送入細胞。 20.如申請專利範圍第17項所述之方法，係包含將一編碼目標 蛋白與前述多肽之DNA送入細胞。 21·如申請專利範圍第17項所述之方法，其中前述位於目標蛋 白N端甲硫胺酸旁邊之胺基酸係可選自下列群組：穀胺醯胺 (Gin )、天門冬醯胺（Asn )、白胺酸（Leu )、異白胺酸（ue )、 甲硫胺酸（Met)與組胺酸（His)。 22·如申請專利範圍第17項所述之方法，其中前述位於前述目 標蛋白N端曱硫胺酸旁邊之胺基酸係可選自下列群組：苯丙 胺酸（Phe )、酪胺酸（Tyr )與色胺酸（Trp )。 23.如申請專利範圍第17項所述之方法，其中前述位於目標蛋 白N端甲硫胺酸旁邊之胺基酸係可選自下列群組：天門冬胺 酸（Asp)與穀胺酸（Glu)。