TW200521139A - Biomakers for liver diseases and method for using same - Google Patents

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200521139 玖、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於肝臟疾病之生物標記分子及其檢測方法，係利 用自體抗原篩選方法篩選出可用於檢測肝臟疾病之生物標記分 子，並利用這些生物標記分子發展為檢測套組，藉篩選檢體申自 體抗體或自體抗原的存在判斷是否罹患肝臟疾病。 【先前技術】 免疫系統若功能不健全，便會產生免疫性疾病，我們身體許 多疾病的根本原因常可追究於免疫系統的功能不健全。一般可分 為二種情況。第一種是抵抗力降低，身體的免疫細胞活力下降， 或生產的數量不足以抵抗入侵的細菌、病毒或黴菌，因此易被感 染流行病。傷風、感冒、肺炎、腸炎甚至於肝炎，愛滋病等，都 屬於這一類。第二種的免疫不全是免疫系統反應過度。這種情況 導因於入侵的物質並不是細菌而只是小花粉或是食物中大分子 蛋白質’免疫系統就釋出大量的抗體加以對抗，而攻勢就發生在 我們的細胞中，如此引起一連串的反應，也被稱為過敏症。而這 時候若果真有細菌、病毒或黴菌這類真的病原來侵犯時，免疫系 統已無餘力抵抗了。第三種情況是免疫細胞攻擊自體的正常細 胞，也就是自體免疫疾病，例如··類風濕性關節炎、紅斑性狼瘡 或皰疹等等，這種免疫系統疾病起因於病患本身免疫辨識系統發 生問題，病患的免疫系統對於本身的某些物質會產生自體抗體 (autoantibody)，進而破壞身體組織造成病痛。 目前已知並非是只有自體免疫疾病才有自體抗體的存在，越 來越多的相關研究指出人類對癌症所發生的免疫反應，部分存在 著腫瘤自體抗原（autoantigen)與人類自體抗體的情形，因此對 於發現這些可以引起人體反應的腫瘤自體抗原在癌症檢測、診斷 或建立預後上有一定的方向和應用性，進而應用於疾病的免疫治 200521139 療上。 在美國專利 6631330、5137807、5830667、6264949、5985542 等五篇中，揭露使用生物標記分子診斷肝硬化（cirrhosis )、纖 維化（fibrosis )或自體免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH ); 而在美國專利4994374、5175084等兩篇中則使用生物標記分子 診斷肝癌（hepatcellular carcinoma):另外在美國專利6410724 則使用和肝癌相關的DNA引子（DNA primer)組成一檢測套組，但 這些生物標記分子多少都存在準確性不高或易被干擾的缺點。 在美國專利5891436及公開專利20030138860中，揭露了使 -用生物標記分子檢測人體血清中其自體抗體的存在，以做為硬化 (primary biliary cirrhosis )、癌症的判斷，這說明在癌症病人中 會有自體抗體（autoantibody )的產生，確立應用於篩選癌症相關 之生物標記分子（biomarker )的合理性。 * 自民國七十一年以來，癌症即躍居臺灣地區十大死亡原因首 位。其中肝癌不分男性或女性都名列前茅，這對國人的健康造成 極大威脅，為有效篩檢罹患肝臟疾病的病患，期許早期治療降低 死亡率，發現高準確性及不被干擾的生物標記分子，以作為檢測 肝硬化及肝癌之檢測套組，便成為重要的課題。 【發明内容】 有鑑於習知技術之缺失，本發明係揭露肝臟疾病之生物標記 分子，由於確知其自體抗體的存在，故可設計成檢測套組，藉此 作為肝硬化或肝癌之診斷使用。 本發明之目的係關於一種用於檢測肝臟疾病之生物標記分 子，其係選自SEQ ID N0:1至SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸 序列或其衍生物或其片段或其變異體或其組合物或其對應之自 體抗體。 前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 200521139 前述變異體係將生物標記分子之胺基酸序列中之胺基酸以 一個或多個胺基酸取代、刪除、插入及/或添加；變異體之胺基酸 序列與生物標記分子之胺基酸序列具有大於80%之序列同一性。 本發明之另一目的係關於一種肝臟疾病之檢測套組，包含一 組生物標記分子，其係選自SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:24所示 之任一胺基酸序列或其衍生物或其片段或其變異體或其組合物。 前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 前述檢測套組係可進一步包含可辨識SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸序列或其衍生物或其片段或其變異 體之抗體之二級抗體。 本發明之再一目的係關於一種肝臟疾病之筛檢方法，係包含 下列步驟··提供一檢體；利用SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:24所 示之任一胺基酸序列或其衍生物或其片段或其變異體或其組合 物之生物標記分子辨識捕捉檢體中之自體抗體；及偵測自體抗 體。 前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 前述檢體係為全血或血清，其中以血清較佳。 前述生物標記分子係可為各種型式，包括，但不限於，檢測 套組、或先行固定於基材上，前述基材係為免疫分析盤或生物晶 片。 前述檢體係可進一步先行利用螢光標記進行標示。 前述篩檢方法係可增加一利用二級抗體辨識吸附自體抗體 之步驟。 前述二級抗體係經修飾具有特殊官能基可進行顯色反應、放 射性偵測或螢光偵測。 前述偵測自體抗體係利用酵素連結免疫吸附分析 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELIS A )、放射免疫分析 200521139 (Radioimmunoassa，RIA )或免疫螢光分析（Immunofluorescence ) 偵測二級抗體，或直接利用螢光掃描偵測被螢光標記標示之自體 抗體。 本發明之再一目的係關於一種肝臟疾病之檢測套組，包含一 組可辨識具有SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID N〇:24所示之任一胺基酸 序列對應之抗體。 前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 本發明之再一目的係關於一稂利用前述檢測套組篩檢肝臟 疾病之方法，係包含下列步驟··提供一檢體；利用SEQ ID NO] 至SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸序列對應之抗體辨識捕捉檢 體t之抗原；及偵測抗體與抗原之複合物。 前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 前述檢體係為全血或血清，其中以血·清較佳。 本發明之基礎係利用自體抗原篩選方法，先純化出正常人和 肝硬化、肝癌病人的抗體並分別固定於不同管柱中，再將人肝疾 病相關之細胞株（HepG2 C3A&SNU-387 )的細胞萃取物依序通入 正常人及病人之管柱，以得到和肝硬化、肝癌等肝臟疾病相僩之 自體抗原，再以這些自體抗原做為檢測肝硬化及肝癌之生物標記 套組，搭配酵素連結免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay ，ELISA ) 、放射免疫分析法 (Radioimmunoassay 5 RIA ) 或免疫螢光分析法 (Immunofluorescence )等，藉檢測人體血清中是否有該自體抗 原（autoantigen)所相對應的自體抗體（autoantibody)的存在判 斷是否罹患肝癌或肝硬化等肝臟疾病。由於這些生物標記分子皆 是以已存在之自體抗體篩選出來，所以在診斷上即可設計為檢測 套組，藉生物標記分子相對應之自體抗體存在與否，作為是否罹 患該疾病之判斷，這比直接篩檢抗原的困難度要降低許多，可有 200521139 效提南準確度與靈敏度。 【實施方式】 本發明係關於利用自體抗原篩選方法，篩選出可用於檢測肝 硬化或肝癌等肝臟疾病之生物標記分子，自體抗原篩選方法如第 一圖所示，包含以下步驟··首先取得正常人及病患之血清樣品， 分別利用可捕捉抗體之親和力管柱純化出血清樣品十所含之抗 體；接著將正常人之抗體與病患之抗體分別填充入管柱之中，以 製得含正常人抗體之管柱及含病患抗體之管柱，抗體填充固定於 官柱之中之方法，係將由血清樣品純化出來的抗體與管柱中之化 學官能基形成化學鍵結固定於管柱中。然後取一樣品，此樣品可 為（癌）細胞株或者病理組織之萃取物；前述病患之血清樣品係 可為單一病患之血清樣品或複數病患之血清混合樣品。 將來自（癌）細胞株或病理組織萃取物的樣品通入正常人抗 體官柱時，可藉由正常人抗體的專一親和力將非專一性之抗原捕 捉而滯留於管柱之中，通過管柱的樣品將不含非專一性抗原，這 個序其實可視為利用病患抗體管柱篩選檢體中自體抗原之樣 扣月〕處理。經移除樣品中非專一性之抗原，樣品組成便剩下特有 之抗原，此時再將樣品通入含病患抗體之管柱中，藉由病患所具 有之自體k體來進一步篩選疾病相關之自體抗原。由於已先藉由 人的血清抗體去除非專一性之抗原，所以利用病患之自體抗 體篩選所得到的自體抗原會具有較高的專一性。 由病患抗體管柱中置換而出的自體抗原，係利用質譜技術進 行氦疋，前述之鑑定係將質譜訊號透過資料庫比對，以取得自體 抗原之資訊。 將人類肝臟疾病相關之細胞株利用上述方法進行自體抗原 之純化與鑑定，由於這些自體抗原係利用病患血清中之抗體篩選 出來’所以可利用這些自體抗原作為生物標記分子發展為檢測套 200521139, 組，該檢測套組賴自前述自體抗原篩選枝_出之自體抗原 或其衍生物或其片段或其變異體或其組合物1筛選檢體中自體 抗體的存在，判斷是否羅患肝硬化或肝癌疾病。檢測套組令除生 物標,己分子外’還可係可進一步包含可辨識該生物標記分子之自 體抗體之二級抗體，以利應用於相關檢測方法。 運用前述檢測套組筛檢之方法如第二圖所示·包含下列步 驟：㈣提供-檢體；接著湘生物標記分子辨識捕捉檢體中之 自體抗體’氣後偵測自體抗體。前述生物標記分子僚選自自體抗 原筛選方法篩選出之自體抗原或其衍生物或其片段Μ變里體 或其組合物。 前述檢體係為全血或血清，其中以血清較佳的選擇。 為有利於檢測的進行，前述生物標記分子可先行蚊於基材 上，常見-之固定基材係為免疫分析盤或生物晶片。當生物標記分 子捕捉檢體中之自體抗體後，可利用二級抗體辨識錢自體抗 體，這些二級抗體係經修飾具有特殊官能基，以進行顯色反應、 放射性偵測或螢光偵測。 利用二級抗體辨識吸附自體抗體後，即可加入特殊試劑進行 顯色反應，然後利用酵素連結免疫吸附分析（Enzyme-Unked Immunosorbent Assay，ELISA)進行二級抗體存在之判斷，進而 得知自體抗體是否存在，或透過放射免疫分析 (Radioimmunoassay ， RIA )或免疫螢光分析 (Immunofluorescence)，同樣可以得知藉由二級抗體的反應判 斷自體抗體是否存在，以作為是否罹患肝癌或肝硬化之依據。 若不使用二級抗體，也可將檢體在與生物標記分子反應前， 先利用螢光標記（例如Cy3或Cy5)標示，然後透過生物標記分 子篩選自體抗體’由於自體抗體已先被螢光標記標示，所以在無 須使用二級抗體情況下即可進行螢光掃瞄分析。 10 200521139 除了偵測自體抗體的存在作為判斷，偵測抗原的存在亦可作 為是否罹患肝硬化或肝癌之依據，為達此目的，設計一種包含可 辨識具有自體抗原篩選方法篩選出之自體抗原之抗體的檢測套 組，亦可作為肝臟疾病檢測之用。 利用前述檢測套組篩檢肝癌及肝硬化之方法包含下列步 驟··提供一血清檢體；利用前述抗體辨識捕捉血清中之抗原；及 偵測抗體與抗原之複合物。 以下實施例係用於進一步了解本發明之優點，並非用於限制 本發明之申請專利範圍。 實施例1.利用肝臟疾病病患血清中之自體抗體篩選自體抗原 由血清純化自體抗體·· 首先取肝硬化或肝癌病患之血清，將血清用鍵結緩衝液 (binding buffer : 20 mM PBS，pH 7.0 )以 1 : 10 的 t匕{歹J 稀釋後， 以0.45# m孔徑的濾膜過濾，避免後續層析步驟造成管柱堵塞； 接著以10倍管柱體積的鍵結緩衝液，在1 ml/min的流速下清洗 Protein G親和力管柱，之後將前述經濾膜過渡之血清樣本以0.2 ml/min的流速通入Protein G親和力管柱中，使抗體得以藉由與 管柱之親和力滯留於管柱中；再取5-10倍管柱體積的鍵結緩衝液 以1 ml/miri的流速清洗Protein G親和力管柱，移除企清樣品中 不與管柱發生親和力鍵結之物質，然後取2-5倍管柱體積之沖提 緩衝液（elution buffer : 0.1 M Glycine-HCl，pH 2.7 )以 1 ml/min 的流速將抗體自管柱中沖提出並收集，收集抗體之試管中需預先 加入60-200" 1之Tris-HCl溶液（1 Μ，pH 9.0)，最後將樣品置 換於耦合緩衝液（coupling buffer : 0.2 M NaHC〇3，〇·5 M NaCl， ρΗ8·3)中，即完成血清中自體抗體（IgG)之純化。 由於本發明需要填充有正常人IgG及病患IgG之管柱各一， 故需取正常人及病患血清分別進行前述純化步驟。 200521139 Ί 製備含有自體抗體之管柱： 取NHS-activated管柱一只，移除上端蓋子後滴一滴酸化溶 液（acidification solution : 1 mM HC1 (需冰浴））以避免氣泡生 成。接著將此管柱上端與注射器（syringe )或泵浦（pUmp )連接 後移除下端扭轉處，再以2倍管柱體積之酸化溶液將管柱中之異 丙醇清洗出來，重複此清洗步驟3次後，將含有自體抗體之樣品 注入管柱中。前述之含有自體抗體之樣品係由Protein-G親和力 管柱純化血清得到的含有自體抗體之耦合緩衝液，經配製後成為 總體積為1倍管柱體積，濃度為0.5-10 mg/ml。將前述含有自體 抗體之樣品通入管柱後則將管柱密封，在25°C中反應15-30分 鐘，或者在4°C _反應4小時，使抗體得以與管柱產生化學鍵結 固定於管柱之中。 自體抗體與管柱完成鍵結反應後，先利用2倍管柱體積之封 阻緩衝液（blocking buffer : 0·5 M ethanolamine，0.5 M NaCl，pH 8·3)沖提管柱，重複此步驟3次，再利用2倍管柱體積之清洗緩 衝液（washing buffer : 0· 1 M acetate，0·5 M NaCl，pH 4 )清洗管 柱，同樣重複3次，接著再換回封阻緩衝液以2倍管柱體積沖提 管柱3次後，讓管柱反應15-30分鐘，使管柱中未鍵結自體抗體 之官能基被封阻而失去活性，待封阻反應完成後以2倍管枉體積 之清洗緩衝液清洗管柱，重複3次，接著以2倍管柱體積之封阻 緩衝液沖提管柱，重複3次，確保所有未鍵結自體抗體之官能基 都能被封阻，再以2倍管柱體積之清洗緩衝液清洗管柱，重複3 次後’最後以2-5倍管柱體積之一般中性PH緩衝液沖提管柱後， 完成含有自體抗體之管柱的製備。 由肝臟疾病相關之細胞株萃取物中純化鑑定自體抗原： 首先將移除培養基之HepG2 C3A cells 2.68 mg以冰浴之Tris saline 溶液（50 mM Tris pH 7·5，150 mM NaCl，1.5 mM PMSF， 12 200521139

Phosphatase inhibitors)清洗兩次後，加入 Triton Extraction 溶液 lml ( 15 Mm Tris pH 7·5，120 mM NaCl，25 mM Κα，2 mM EGTA，0.1 mM DTT，0.5% Triton X-100，10// g/ml leupeptin， 0.5 Mm PMSF，Phosphatase inhibitors)，置於 4°C、30 分鐘，此 時細胞開始分解釋出蛋白質，然後利用桌上型離心機於4°C以 14,000 rpm的轉速離心15分鐘，移除固態不溶之細胞結構，收集 上層液進行後續之免疫親和層析。 經收集得到的細胞萃取液與鍵結緩衝液（binding buffer*)以 1:10的比例稀釋後，利用0.45//m孔徑的濾膜過濾，以避免後續 通入管柱後造成管柱的阻塞，而在將樣品注入具有抗體（IgG) 的管柱前，需先以1 〇倍管柱體積的鍵結緩衝液，在1 ml/min的 流速下清洗正常人及病患之抗體管柱，之後將前述經濾膜過濾之 細胞萃取液以0.2 ml/min的流速通入正常人抗體管枉中，再取 5-10倍管柱體積的鍵結緩衝液以1 ml/min的流速沖提正常人抗體 管柱，此時細胞萃取液中所含有之正常人抗體具辨識捕捉的抗原 會滯留其中，此步驟之目的在捕捉移除細胞株中非專一性之抗 原，所以經管柱層析後之細胞萃取液中將不含非專一性之抗原； 將此細胞萃取液收集導入病患抗體管柱，取5-10倍管枉體積的鍵 結緩衝液以1 ml/min的流速沖提病患抗體管柱，此時細胞萃取液 中所具有之自體抗原將被管柱中病患之自體抗體所捕捉而滯留 於管柱之中，當細胞萃取液通過正常人抗體管柱時，一般正常人 抗體可辨識捕捉之抗原將被滯留於管柱中，而將不含前述正常人 抗體可辨識捕捉之抗原之細胞萃取液導入病患抗體管枉時，只有 病患抗體管柱可辨識捕捉之抗原被滯留於管柱之中，這些滞留於 病患抗體管柱中之抗原，係藉由2-5倍管柱體積之沖提緩衝液 (elution buffer )以1 ml/min的流速將自體抗原由病患抗體管柱 中沖提出並收集，接者使用騰蛋白酵素（Trypsin )進行蛋白質水 13 200521139 解反應，將被水解之自體抗原之胜肽以質譜技術進行分析，所得 之圖譜可藉甴資料庫比對獲知蛋白質之資訊。 利用肝硬化或肝癌病患血清中之自體抗體篩選肝臟疾病相 關細胞株，可得下列之自體抗原： I. Nucleoside diphosphate kinase ( gi|1421609 » SEQ ID NO.l ) 2· NM23 protein ( gi|35068，SEQ ID N0.2 ) 3. ATP synthase beta chain » mitochondrial [precursor] (gi|28940，SEQIDNO.3) 4· 14-3-3 zeia protein(tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein) ( gi|4507953，SEQ ID NO.4) 5. 14-3-3 epsilon protein(tyrosine 3/tryptophan 5 -monooxygenase activation protein)( gi|4507953 » SEQ ID NO.5) 6. Protein disulfide isomerase-related protein 5 ( gi| 1710248， SEQ ID NO.6) 7. unnamed protein product ( gi|21750187 ^ SEQ ID NO.7 ) 8. Tropomyosin alpha 3 ( gi|37403 ? SEQ ID NO.8 ) 9. Trypomyosin alpha 4 ( gi|10435300，SEQ ID NO.9) 10. Calreticulin precursor (gi|4757900，SEQ ID NO.IO) II. Human pre-mRNA splicing factor SF2p32 ( gi|338043 » SEQ ID NO.l 1 ) 12. Tumor necrosis factor type 1 receptor associated protein TRAP-1 (gi|1082886, SEQ ID N0.12) 13. Tumor rejection antigen( gp96 ) 1 ； glucose regulated protein (gi|4507677，SEQIDNO.13) 14. Heat shock protein 90-beta ( gi|72222 5 SEQ ID NO.14) 20Q521139 15. Heat shock 90-alpha ( gi|123678 * SEQ ID NO.15) 16. Heat shock 60kDa protein 1 ( gi|3 1542947 » SEQ ID NO.16) 17. HMG-1 (gi|968888, SEQIDNO.17) 18. KIAA0144 gene product ( NICE-4 protein) ( gi|131 1 1995， SEQ ID NO.18) 19. Valosin-containing protein(p97) ； transitional endoplasmic reciculum ATPase ( gi|6005942，SEQ ID N0.19) 20：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase 5 liver (gi|30157565，SEQ ID NO.20) 21.Cytokeratin ( gi|1419564，SEQ ID ΝΟ·21 ) .. 22.IGF-II mRNA-binding protein 1 ( gi|4191608，SEQ ID NO.22) 23. NADPH : quinone reductase ( gi| 13236495，SEQ ID ΝΟ·23 ) 24. Crystal Structure Of The Human Co-Chaperone P23( hsp-90 co-chaperone) (gi|9257073，SEQ ID N0.24) 上列由肝臟疾病相關之細胞株篩選之自體抗原如表一所 示，其中左側為蛋白質之GI編號（gi number)及名稱，右側為 利用肝硬化或肝癌病患之血清在肝臟疾病相關細胞株47可被篩 選出來的自體抗原，由表中顯示，這些自體抗原並不侷限於單一 之肝臟疾病中才會被篩選出來，利用不同來源血清中之自體抗體 針對不同細胞株也會重複篩選出來，顯示這些抗原與肝臟疾病之 相關性極為密切。表一中部分蛋白質具有兩個GI編號，其係肇 因於蛋白質及其變異體在質譜鑑定時具有近似之判別結果。 200521139 噼运製·)锄锶鸯餐！ WS1要膝，#^^-®, M< 肝癌血清 VS. SNU-387 ❿ • • 肝硬化血清 VS. SNU-387 • • • • 肝癌血清 VS. HepG2 C3A • 參 • • • • • • • • •Φγ <J ϊ . G Jj cn (N T. > o • • • 蛋白質名稱 Nucleoside Diphosphate Kinase( = NM23 protein) ATP synthase beta chain, mitochondrial [Precursor] 14-3-3 protein Protein disulfide isomerase-related protein 5 Gi|21750187 Unname protein product (RNA rec mot.) Tropomyosin Calreticulin precursor Human pre-mRNA splicing factor SF2p32, complete sequence Tumor necrosis factor type 1 receptor associated protein TRAP-1 Tumor rejection antigen (gp96) 1; glucose regulated protein Heat shock protein 90 Heat shock 60kDa protein 1 (chaperonin); mitochondrial matrix protein PI HMG-1 (high-mobility group-1) KIAA0144 gene product (NICE-4 protein ) Valosin-containing protein(p97); transitional endoplasmic reticulum ATPase Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, liver Cytokeratin IGF-I1 mRNA-binding protein 1 NADPH:quinone reductase Crystal Structure Of The Human Co-Chaperone P23 (hsp-90 co-chaperone) GI number 1421609 28940 (N CN s 00 rn ON «〇 1710248 21750187 37403, 10435300 4757900 338043 1082886 4507677 OO 5 2 CN CN (N 31542947 968888 13111995 6005942 30157565 1419564 4191608 13236495 9257073 200521139 實施例2·鑑定利用自體抗原篩選方法篩選出來之自體抗原 之可利用性 為進一步證實實施例1.筛選出之24個自體抗原之.可利 用性，需進一步使用免疫分析方法（ELISA、RIA、免疫螢 光法等）搭配上述24個生物標記分子，分別對正常人、肝 硬化病患及肝癌病患之血清樣品做進一步檢測，其檢測方法 依循第二圖，首先提供一檢體，然後利用SEQ ID ΝΟ:1至 SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸序列或其衍生物或其片段 或其組合物之生物標記分子辨識捕捉檢體中之自體抗體，最 後偵測自體抗體。 以酵素連結免疫吸附分析 （Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELIS A )為例，其詳細檢測步驟如下： 首先將生物標記分子以彼覆緩衝液（coating buffer，可有三 楂選擇為 a· 50mM Na2HC03，ρΗ=9·6 或 b· 20mM Tris-HCl， pH=8.5 或.c· lOmM PBS，ρΗ=7·4)稀釋成濃度 0.5〜10/z g/ml，彼覆緩衝液係依據生物標記分子之pi值選擇，以大 於pi值1〜2 pH值之緩衝液為較佳。在ELISA plate中加入 100/zl/well之生物標記分子溶液，置於4°C中反應隔夜進行 固定化。 ；

接著移除未固定化之生物標記分子，以PBST buffer*清 洗兩次（PBST buffer : PBS buffer+0.05% Tween-20)，然 後加入200 # 1/well的封阻緩衝液（blocking buffer ··可有三 種選擇 a_ Gelatin-NET : 0.5% Gelatin，0.15M NaCl，5mM EDTA · 2Na，0.05% Tween-20，50mM Tris base 或 b. 1% BSA-PBS，ρΗ=7·4 或 5% Non-fat milk-PBS，ρΗ=7·4)在室 溫下反應最少2小時進行封阻反應；反應完成後利用PBST 17 200521139 緩衝液清洗3次，然後加入100# l/well待反應之血清溶液 (血清溶液係使用封阻緩衝液稀釋1000倍），此時血清中 之自體抗體將與被固定化之生物標記分子進行辨識吸附’此 反應於室溫下至少進行2小時後，利用PBST緩衝液清洗4 次，再加入100/zl/well之二級抗體（二級抗體係利用封阻 緩衝液稀釋5000倍），此時二級抗體將會與自體抗體進行 辨識吸附，此反應於室溫下至少進行1小時候，以？88丁緩 衝液清洗5次，接著加入100# Ι/well之TMB進行30分鐘 顯色反應，然後加入l〇〇//l/well之0,5M H2S04後，偵測 450nm之吸收度。 為確認自體抗體的表現量確實可作為肝硬化及/或肝癌 之檢測，可分別利用ELISA分析各自體抗原筛選正常人、 肝硬化病患及肝癌病患血清中之自體抗體之吸光值數據 後，以生物統計學進行分析以GADPH、NADPH、HMG_1、 NM23 及 Cytokeratin 等五個蛋白質為例，利用 Wilcoxon-Mann-Whitney進行檢定，在95%之信賴水準下所 得結果如下表： GADPH NADPH HMG-1 NM23 Cytokeratin 正常人 VS. 肝硬化病患 Ρ=0.001 p=0.001 p=0.00006 p=0.0001 p=0.001 正常人 VS. 肝癌病患 Ρ=0.017 P=0.016 p=0.015 p=0.002 p=0.0 16 肝硬化病患 VS. 肝癌病患 ρ>0.05 p>0.05 p>0.05 p>0.05 p>0.05 正常人:N=10、肝硬化病患：N=15、肝癌病患：Ν=21 ( ρ<〇·〇5假設成立） 18 200521139 假設各生物標記分子之自體抗體於正常人、肝硬化病患 及肝癌病患中表現量具差異性，則由表中顯示這樣的假設在 正常人與肝硬化病患的比較，以及正常人與肝癌病患之比較 之假設成立，意即各生物標記分子之自體抗體之表現量在正 常人與肝硬化病患及肝癌病患中之差異，具有生物統計上的 意義存在。 經由生物統計可知蛋白質GADPH之自體抗體在正常人 與肝硬化病患中之表現量差異達8.375倍，在正常人與肝癌 病患中之表現量差異達4.86倍；蛋白質HMG-1之自體抗體 在正常人與肝硬化病患中之表現量差異達74倍；蛋白質 NM23之自體抗體在正常人與肝硬化病患中之表現量達24 倍，在正常人與肝癌病患中之表現量達8.545倍。這些結果 證實在肝硬化及肝癌病人的血清中，此24個自體抗原之相 關自體抗體（autoantibodies)的表現量高於正常人，因此將上 述24個自體抗原搭配免疫分析方法組合成一套檢測套組， 藉此篩選檢體中自體抗體表現量，確實可以作為肝硬化及肝 癌之檢測用。 雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限 定本發明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發明之精神和範 圍内，當可作各種之更動與潤飾，因此，本發明之保護範圍， 當視後附之申請專利範圍所界定者為準。 200521139 【圖式簡單說明】 第一圖係為利用自體抗原篩選方法之流程圖 第二圖係為利用生物標記分子篩選自體抗體之流程圖。

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Claims (1)

1. 200521139 拾、申請專利範圍： 1. 一種用於檢測肝臟疾病之生物標記分子，其係選自：SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸序列或其衍 生物或其片段或其變異體或其組合物及其對應之自體抗 體。 2. 如申請專利範圍第1項所述之檢測肝臟疾病之生物標記 分子，其中前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 3. 如申請專利範圍第1項所述之檢測肝臟疾病之生物標記 分子，其中前述變異體係與前述SEQIDNO:l至SEQID φ ΝΟ:24所示之任一胺基酸序列具有大於80°/。之序列同一 性。 4. 一種肝臟疾病之檢測套組，包含：生物標記分子，其係 選自SEQ ID NChl至SEQ ID ΝΟ:24所示之任一胺基酸 序列或其衍生物或其片段或其變異體或其組合物。 5. 如申請專利範圍第4項所述之肝臟疾病之檢測套組，其 中前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 6. 如申請專利範圍第4項所述之肝臟疾病之檢測套組，其 中前述檢測套組係可進一步包含可辨識SEQ ID NO: 1至 籲 SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸序列或其衍生物或其 片段或其組合物之自體抗體之二級抗體。 7. —種肝臟疾病之篩檢方法，係包含下列步驟： 提供一檢體； 利用SEQIDN0:1至SEQIDNO:24所示之任一 胺基酸序列或其衍生物或其片段或其變異體或其組合物 之生物標記分子辨識捕捉檢體中之自體抗體；及 4貞測自體抗體。 21 200521139,* ϊι . 8·如申請專利範圍第7項所述之篩檢方法，其中前述檢體 k包含全血或血清。 如申吻專利範圍第8項所述之篩檢方法，其令前述檢體 係為血*清。 10·如申請專利範圍第7項所述之篩檢方法，其中前述生物 標記分子係可製成檢測套組。 11·如申請專利範圍第7項所述之篩檢方法，其中前述生物 標記分子係可進一步先行固定於基材上。 12·如申請專利範圍第u項所述之筛檢方法，其中前述基材 係為免疫分析盤或生物晶片。 •如申μ專利範圍第7項所述之篩檢方法，其中前述檢體 係可進一步先行以螢光標記進行標示。 14·如申請專利範圍第7項所述之_檢方法，其中前述筛檢 A T g加利用一級抗體辨識吸附自體抗體之步 驟。 15.如申請專利範圍第14項所述之篩檢方法，其中前述二級 抗體係經修飾具有特殊官能基可進行顯色反應、放射性 偵測或螢光偵測。 W如申請專利範圍第7項所述之筛檢方法，其中前述_ 自體抗體係利用螢光掃瞒分析偵測具有發光標記之自體 抗體。 P·如中請專利範圍第7項所述之筛檢方法，其中前述偵測 自體抗體係利用酵素連結免疫吸附分析（ Im_osorbent Assay ’ EUSA )、放射免疫分析 (Radioi_unoassay，RIA )或免疫螢光分析 (Immunoflu〇rescence)镇測二級抗體。 22 200521139 18.—種肝臟疾病之檢測套組，包含一組可辨識具有SEQ ID .ΝΟ··1至SEQ ID NO:24所示之任一胺基酸序列之抗體。 .19.如申請專利範圍第18項所述之肝臟疾病之檢測套組，其 中前述肝臟疾病係為肝硬化或肝癌。 20. —種肝臟疾病之篩檢方法，係包含下列步驟： 提供一檢體； 利用SEQ ID ΝΟ:1至SEQ ID NO:24所示之任一 胺基酸序列對應之抗體辨識捕捉檢體中之抗原；及 偵測抗體與抗原之複合物。 21. 如申請專利範圍第20項所述之篩檢方法，其中前述檢體 係為全血或血清。 22. 如申請專利範圍第21項所述之篩檢方法，其中前述檢體 係為血清。 1

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