KR20080058021A

KR20080058021A - 폐암의 림프절 미세전이 진단용 마커, 상기 마커에 대한프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 폐암의 림프절미세전이 여부를 진단하는 방법

Info

Publication number: KR20080058021A
Application number: KR1020060132041A
Authority: KR
Inventors: 안태진; 김병철; 이규상
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2006-12-21
Filing date: 2006-12-21
Publication date: 2008-06-25
Also published as: KR101343916B1

Abstract

본 발명은 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마커, 상기 마커에 대한 프라이머를 포함하는 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 방법을 제공한다.

Description

폐암의 림프절 미세전이 진단용 마커, 상기 마커에 대한 프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에 대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 방법{Marker for diagnosing lymph node micrometastasis of lung cancer, kit comprising primer for the marker, microarray comprising the marker or antibody against the marker, and method for diagnosing lymph node micrometastasis of lung cancer}

도 1은 본 발명의 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마커 유전자를 선별하는 과정을 도식화한 것이다.

본 발명은 폐암의 림프절 미세전이 진단용 마커, 상기 마커에 대한 프라이머를 포함하는 키트, 상기 마커 또는 상기 마커에 대한 항체를 포함하는 마이크로어레이, 및 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 방법에 관한 것이다.

암 환자의 사망 원인은 초기 종양에 의한 것보다는 주로 암세포의 전이 (metastasis)에 의한다. 이러한 암세포의 전이는 먼저 초기 종양으로부터 전이성 암세포가 떨어져나와 정상 조직의 간질성 기질 (interstitial stroma)과 기저막 (basal membrane, BM)과 같은 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)을 침윤 (invasion)하여 혈관이나 림프관으로 들어간 다음 다른 목표 조직의 모세관 혈관벽에 부착되고 세포의 기질과 기저막을 통하여 모세관으로부터 침출하여 새로운 조직에서 증식하는 과정으로 2차 종양 (전이성 암)을 형성하게 된다.

폐암은 전세계적으로 발병율이 가장 높고 사망률도 매우 높은 암이다. 폐암은 소세포 폐암 (small cell lung cancer)과 비소세포 폐암 (nonsmall cell lung cancer)으로 나누어진다. 그 중에서 비소세포 폐암은 폐암의 약 80%에 해당하는 가장 대표적인 암으로, 선암 (adenocarcinoma), 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma), 대세포 폐암 (large cell carcinoma)으로 나누어진다.

또한, 폐암은 진단 당시 대부분 환자에서 이미 수술이 힘든 전이성을 띄고 생존 기간도 1년 이내로 매우 짧다. 따라서 폐암의 경우에는 전이성 여부를 결정하는 것이 환자의 치료 방법을 결정하고 그 예후를 판단하는데 매우 중요하다.

폐암의 병기를 구분하는 기준인 TNM 시험은 비소세포 폐암을 진행 정도에 따라 초기인 1기에서 말기인 4기까지로 분류한다. 임파선의 국지적 전이 여부에 따라, 1기 폐암은 모두 임파선에 퍼져 있지 않은 것을 말하며, 2기는 폐 내부의 임파선까지만 국지적으로 전이된 것을 말한다. 타 기관으로의 전이 여부에 따라 1기, 2기, 3기는 폐암이 폐에 한정되는 것을 말하며, 4기는 그렇지 않은 경우를 말한다. 병기상 초기인 1, 2기 환자라 하더라도 림프절에 전이가 일어난 2기 암환자는 그렇지 않은 1기 환자에 비해 재발율이 높고 생존율이 낮다.

따라서, 1기라 하더라도 생존율의 향상을 위해서는 현재의 병기 구분법으로 알 수 없는 림프절 미세전이(micrometastasis)를 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하며, 이를 위하여 조직이나 세포 수준보다는 보다 정밀한 분자 수준의 마커 개발 필요한 실정이다.

미국특허공개 제2006/0040302 A1호에는 암을 분류, 진단 및 치료하는 방법이 기재되어 있으나, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 마커에 대한 기재는 없다.

문헌 [Zhifu 등, Molecular Cancer 3: 35(2004)]에는 1기 편평상피세포암에 대한 진단 마커를 기재하고 있으나, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 마커에 대한 기재는 없다.

본 발명의 발명자들은 상기와 같은 종래 기술을 바탕으로 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 방법을 연구하던 중, 폐암 환자의 림프절 미세전이에 따른 발현의 차이를 보이는 201개의 유전자를 발굴하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 마커에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 마이크로어레이에 관한 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 방 법에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마커를 제공한다.

본 발명의 유전자 마커는 폐암, 보다 구체적으로 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma)을 갖는 환자로부터 RNA를 추출하고, 폐암의 림프절 미세전이를 갖지 않는 시료(N0)와 림프절 미세전이를 갖는 시료(N1) 사이의 유전자 발현 패턴을 분석하여, N1/N0의 발현 비율(fold difference)이 높은 유전자를 본 발명의 마커 유전자로 선별하였다. 도 1은 본 발명의 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마커 유전자를 선별하는 과정을 도식화한 것이다.

구체적으로, 20명의 환자의 조직에서 RNA를 분리하고, cDNA를 합성한 후 시험관 내 전사를 통해 cRNA를 제조하는데, 이때 제조된 RNA의 우라실 염기의 일부는 바이오틴으로 변형되어 있다. 이를 마이크로어레이 상의 유전자 프로브와 혼성화시킨후, 프로브와 혼성화하는 강도를 피코에리트린(phycoerythrin)으로 표지된 스트렙트아비딘이 바이오틴에 결합하여 나타내는 형광 값으로 측정하여, N0 시료와 N1 시료 간에 유전자 발현율에 있어서 높은 차이를 보이는 유전자를 선별하였다. 본 발명의 발현 분석에 이용한 플랫폼은 Affymetrix HG-U133PLUS2.0 이다. 상기 방법에 의해 선별된 유전자는 표 3에 기재하였으며, 총 278개의 프로브 세트에 해당하는 총 201개의 유전자를 선별하였다.

폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위해서는 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 이용할 수 있다. 상기 201개의 유전자 모두 폐암의 림프절 미세전이 마커로 유용하나, 신속, 간편, 정확한 마커를 제공하기 위해서는, 의학적 판단을 내리기에 충분한 정도의 과다하지 않는 수의 마커를 이용할 수도 있다. 이는 시간 및 자원의 낭비를 방지할 있다는 점에서도 경제적이다. 바람직하게는, 상기 표 3에 기재된 201개의 폴리뉴클레오티드 세트를 이용하면 더욱 정확하게 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서, 용어 "폐암 (lung cancer)"은 폐에 발생하는 악성 종양을 의미하며, 소세포 폐암과 선암, 편평상피세포암, 대세포 폐암 등의 비소세포 폐암을 모두 포함한다.

본 발명에서, 용어 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 폐암 세포를 림프절 미세전이가 되지 않은 폐암 세포와 림프절 미세전이가 된 폐암 세포로 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 림프절 미세전이가 되지 않은 폐암 세포에 비하여 미세전이를 가진 세포에서 증가를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 폐암의 림프절 미세전이 여부 진단 마커는 표 3에 기재된 201개의 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 폐암의 림프절 미세전이 진단 마커는, 폐암의 림프절 미세전이와 함께 직접적 또는 간접적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

본 발명의 "프라이머"는 유리 3' 히드록실기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형과 염기쌍을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 100개의 뉴클레오타이드 서열을 가 진 센스 및 안티센스 핵산이다. 바람직하게는, 상기 프라이머의 길이는 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 7개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 더 더욱 바람직하게는 7개 내지 20개의 뉴클레오타이드이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡핑, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-라이신 등), 삽입제(예를 들면, 아크리딘 등), 킬레이트화제(예를 들면, 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

바람직하게는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이이다. 그 외에, RT-PCR 키트는 시험관 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프로브를 포함할 수 있다. 상기 키트는 단독으로 상기 프로브를 포함할 수도 있고, 상기 센스 및 안티센스 프라이머 외에 프로브를 추가로 포함할 수도 있다. 프로브의 길이는 7개 내지 100개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 7개 내지 30개의 뉴클레오타이드, 더 더욱 바람직하게는 7개 내지 20개의 뉴클레오타이드이다.

"혼성화 프로브" 또는 "프로브"는 핵산의 부분적으로 또는 완전히 상보적인 가닥에 염기 특이적인 방식으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 펩티드 핵산뿐만 아니라, 모든 기타 유형의 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

혼성화는 스트린전트 조건하에 통상적으로 수행된다. 스트린전트 조건은 서열 의존적이며 환경에 의존하여 변할 수 있다. 일반적으로, 스트린전트 조건은 지정된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm)보다 약 5℃ 낮도록 선택 된다. 상기 Tm은 표적 서열에 상보적인 프로브의 50%가 평형 상태의 표적 서열에 혼성화하는 온도 (지정된 이온 강도, pH, 및 핵산 농도 하의)이다. Tm에서 표적 서열이 일반적으로 과량으로 존재할 때, 프로브의 50%는 평형에서 차지된다. 전형적으로, 스트린전트 조건은 pH 7.0 내지 8.3에서 적어도 약 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 기타 염)의 염 농도를 포함하며, 온도는 짧은 프로브 (예를 들면, 10 내지 50 뉴클레오티드)에 대해 적어도 약 25℃이다. 스트린전트 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 키트는 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함할 수 있다. 또한, 상기 항체를 나노 비드 등에 부착하여, 림프절 전이 여부를 진단하는데 이용할 수 있다. 즉, 나노 비드는 크기가 작아서 혈액 내에서 이동할 수 있으므로, 상기 항체가 부착된 나노 비드는 혈액 등에서 본 발명의 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하여 항원-항체 복합체를 형성할 수 있으며, 상기 복합체를 검출함으로써 폐암의 림프절 전이 여부를 진단할 수 있는 것이다.

상기 키트는 단독으로 상기 항체를 포함할 수도 있고, 상기 센스 및 안티센스 프라이머, 및 상기 프로브 외에 항체를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커에 의해 발현되는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 폐암 진단 마커가 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 폐암 진단 마커에 대한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

하이브리도마 방법은 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌 글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 폐암 진단오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 상기 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

파지 항체 라이브러리 방법은 세포 내에 존재하는, 다양한 폐암 진단 마커에 대한 항체 유전자(Single chain fragment variable, scFv 형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 폐암 단백질과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하는 방법이다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 마커를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, "마이크로어레이"란 기판 상에 폴리뉴클레오티드의 그룹이 높은 밀도로 고정화되어 있는 것으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 그룹은 각각 일정한 영역에 고정화되어 있는 마이크로어레이를 의미한다. 이러한 마이크로어레이는 당업계에 잘 알려져 있다. 마이크로어레이에 관하여는 예를 들면, 미국특허 제5,445,934호 및 제5,744,305호에 개시되어 있으며, 이들 특허의 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어진다.

용어 "기판"은 혼성화 특성을 보유하고, 혼성화의 배경 수준이 낮게 유지되는 조건하에 폴리뉴클레오티드 프로브가 커플링될 수 있는 임의의 기판을 말한다. 통상적으로, 상기 기판은 미세역가(microtiter) 플레이트, 막(예를 들면, 나일론 또는 니트로셀룰로오스) 또는 미세구(비드) 또는 칩일 수 있다. 막에 적용 또는 고정 전에, 핵산 프로브를 변형시켜 고정화를 촉진시키거나 혼성화 효율을 개선시킬 수 있다. 상기 변형은 단독중합체 테일링(homopolymer tailing), 지방족기, NH₂ 기, SH 기 및 카르복실기와 같은 상이한 반응성 작용기와의 커플링, 또는 바이오틴, 합텐 또는 단백질과의 커플링을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마이크로어레이를 제공한다.

마이크로어레이에 고정되는 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체 및 마이크로어레이는 전술한 바와 같다. 본 발명의 마이크로어레이는 항원-항체 복합체 형성에 의해 마커에 의해 코딩되는 단백질을 검출한다.

본 발명에서, 용어 "항원-항체 복합체"란 폐암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미립자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드 시 이에 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우에, 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코스 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코스 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스포에놀피루베이트 데카복실라제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 미립자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다. 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐암 환자로부터 폐암 시료를 수득하는 단계;

상기 시료로부터 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 검출하는 단계; 및

상기 검출 결과에 기초하여 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 단계를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 폐암 환자로부터 폐암 시료를 수득하는 단계를 포함한다. 폐암 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 기관지 세척액 및 뇌척수액 등으로부터 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서는 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma)을 갖는 환자 중에서, 림프절 미세전이를 갖지 않는 환자(N0)와 림프절 미세전이를 갖는 환자(N1)로부터 RNA를 추출하였다.

본 발명의 방법은 상기 시료로부터 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 검출하는 단계를 포함한다. 생물학적 시료 중의 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 mRNA의 검출은 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프로브를 이용할 수 있다.

본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 폐암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블롯팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. mRNA 발현수준 측정은 바람직하게 는, 폐암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR법을 이용하는 것이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 폴리펩티드의 검출은 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 이용할 수 있다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 폐암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 폐암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 폐암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로스 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있다.

본 발명의 방법은 상기 검출 결과에 기초하여 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 단계를 포함한다. 본 발명의 마커 유전자들의 상대적인 발현 프로필을 측정하여 상기 프로필에 따라 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 것이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1: 마커 유전자 선별

본 발명의 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마커 유전자를 선별하기 위해, 문헌 [Zhifu 등, Molecular Cancer 3: 35(2004)]에 기재된 방법을 이용하였으며, 상기 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

폐암 환자 20명으로부터 RNA 시료를 분리하였으며, 환자의 구체적인 프로필은 하기 표 1 및 표 2와 같다.

환자 ID	성별	나이	흡연 유무	N-단계	세포 유형
SML-093	M	50	예	N0	SQC
SML-100	M	50	예	N0	SQC
SML-035	M	50	예	N0	SQC
SML-079	M	56	예	N0	SQC
SML-138	M	65	예	N0	SQC
SML-031	M	67	예	N0	SQC
SML-091	M	69	예	N0	SQC
SML-029	M	69	예	N0	SQC
SML-123	M	70	예	N0	SQC
SML-094	M	70	예	N0	SQC

환자 ID	성별	나이	흡연 유무	N-단계	세포 유형
SML-135	M	48	예	N1	SQC
SML-153	M	48	예	N1	SQC
SML-244	M	50	예	N1	SQC
SML-176	M	55	예	N1	SQC
SML-170	M	65	예	N1	SQC
SML-186	M	67	예	N1	SQC
SML-213	M	69	예	N1	SQC
SML-247	M	69	예	N1	SQC
SML-251	M	70	예	N1	SQC
SML-172	M	70	예	N1	SQC

상기 표 1 및 표 2에서 M은 남성을 나타내고, SQC는 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma)을 나타내며, 모든 환자는 흡연을 하며, 성별은 모두 남성이며, 나이는 약 50세에서 70세 정도이며, 모든 세포 유형은 SQC이다. 표 1과 표 2에서 성별, 나이, 흡연 유무 및 세포 유형은 거의 동일하고, 단지 차이점은 표 1은 N0 단계의 환자 시료인 반면, 표 2는 N1 단계의 환자 시료인 점이다.

폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단할 수 있는 278개 프로프 세트에 해당하는 201개의 유전자 마커 세트를 선정하였다. 상기 프로브 세트 278개에 해당하는 유전자를 하기 표 3에 기재하였다. 프로브 세트 아이디(ID)는 Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 칩의 아이디인데, 이에 상응하는 유전자 아이디는 affymetrix 사에서 제공하는 대표적인 public id로서 affymetrix사에서 프로브 세트을 추출할 당시 사용된 public sequence의 아이디이다. 따라서 프로브 세트 아이디에 상응하는 유전자 아이디는 하기 표 3의 유전자 리스트에 한정되는 것은 아니다.

실시예 2: 유전자 발현을 통한 암전이 진단

폐암 환자의 수술시 시료를 채취하여, 본 발명의 유전자 마커의 발현을 조사하고, 유전자 발현 양상을 예측 모델로 분석하고 전이 여부를 구분하였다.

실시예 3: 골수 및 혈액에서 전이 유전자 진단

폐암 환자에서 혈액을 채취하거나 또는 골수 천자를 수행하여 골수를 채취하였다. 유핵 세포를 분리하고 이들 세포에서 총 RNA를 추출한 후, 마이크로어레이 또는 실시간 PCR을 이용하여 유전자 발현 양상을 조사하였다.

먼저, 마이크로어레이 실험을 위해서, 총 RNA로부터 표적 프로브를 제조하고, 준비된 암전이 마커를 포함하는 마이크로어레이에 혼성화하고, 마이크로어레이 데이타를 분석하여 유전자 발현 양상을 확인하였다.

한편, 실시간 PCR을 위해서, 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하고, 각 마커 유전자에 대한 유전자 발현 수준을 조사하였다.

스파이킹(spiking) 박테리아 유전자 및 β-액틴과 GAPDH 유전자의 발현 정도를 이용하여 전이 특이적 유전자 발현을 확인하였다. 유전자 발현 양상을 예측 모델로 분석하고 전이 여부를 구분하였다.

실시예 4: 골수 및 혈액에서 암세포 진단

폐암 환자에서 혈액 채취 또는 골수 천자를 수행하여 골수를 채취하였다. 유핵 세포 분리 후 암전이 마커에 대한 항체로 표지된 비드와 항-CD45 단클론항체를 분리된 세포에 처리하였다. FACS(유세포분리기)로 분류하여 CD45 음성 세포 중 암전이 마커를 지닌 암세포를 카운팅하여 암전이를 진단하였다.

표지된 암세포는 FACS로 분리하여 총 RNA를 추출한 후, 실시예 2와 같이 마이크로어레이 또는 실시간 PCR을 이용하여 유전자 발현 수준을 조사하였다. 유전자 발현 양상을 예측 모델로 분석하고 전이 여부를 구분하였다.

본 발명에 따르면, 폐암의 림프절 전이 여부를 미량의 생체 시료 (biopsy)로도 초기에 알아낼 수 있으므로, 폐암의 조기 진단에 활용할 수 있다. 또한, 폐뿐만 아니라 혈액 및 골수에서도 미세전이를 검출하는 마커로 활용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 마커를 활용하여 면역세포를 트레이닝시켜 세포 치료에 활용할 수도 있다.

Claims

표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마커.
제1항에 있어서, 표 3에 기재된 201개 폴리뉴클레오티드 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 마커.
표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 키트.
제3항에 있어서, 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제3항에 있어서, 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제5항에 있어서, 상기 항체는 나노 비드에 부착되는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항 또는 제2항에 따른 마커를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마이크로어레이.
제1항 또는 제2항에 따른 마커에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하기 위한 마이크로어레이.
폐암 환자로부터 폐암 시료를 수득하는 단계;

상기 시료로부터 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 검출하는 단계; 및

상기 검출 결과에 기초하여 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 단계를 포함하는, 폐암의 림프절 미세전이 여부를 진단하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 폐암 시료는 혈액, 전혈, 혈장, 혈청, 소변, 조직, 세포, 기관, 골수, 타액, 객담, 기관지 세척액 및 뇌척수액으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서, 상기 검출 단계는 mRNA 또는 폴리펩티드를 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 mRNA는 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 상기 폴리뉴클레오티드에 상보적인 프로브를 이용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 표 3에 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단백질을 인식하는 항체를 이용하여 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.