TW200305433A

TW200305433A - Neospora vaccine

Info

Publication number: TW200305433A
Application number: TW092112372A
Authority: TW
Inventors: David A Brake; Manuel Campos
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-25
Publication date: 2003-11-01
Also published as: CA2245425C; DE69826593T2; US6787146B2; EP1477184A2; ATE277631T1; CA2245425A1; ES2227783T3; US20040223982A1; EP0898969A2; BR9803232A; NZ331529A; CN1211449A; US20020058046A1; AR016396A1; DE69826593D1; EP0898969A3; EP1477184A3; AU8188498A; JP3049016B2; ZA987662B

Description

200305433 ⑴ 玖、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明是關於一可對抗致病性的新孢子虫原蟲的疫苗，此疫苗可用於預防臨床疾病及防止哺乳動物流產。本發明之疫苗是由一新孢子虫細胞製備而成之均質物所構成。【先前技術】哺乳動物的新孢子虫病是由感染致病性菌株的新孢子虫原蟲類寄生蟲所引起，主要可導致流產，新生兒死亡、先天性感染及腦炎等疾病。Dubey and Lindsay，1996, Vet Parasitol,67 l-59，Dubey and Lindsay, 1 993,Parasitol Today 9 452-458犬新孢子虫（Neospora caninum)感染狗及先天性感染小狗，常引起痲痺。從被感染的小狗體內可分離出犬新孢子虫的速殖子（tachyzoites) 。Lindsay and Dubey，1 989，JPai*asitol 7 5 1 6 3 - 1 6 5。感染到新孢子虫也是導致乳牛流產的主要原因。山羊、綿羊和馬也發現有新孢子虫病的病例。雖然犬新孢子虫外表與剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii )相似’但二者仍可由彼此的抗原性和超微構造加以區分。上述Dubey and Lindsay 1993。除此之外，從流產的胎牛腦細胞中分離出的類新孢子虫原蟲類寄生蟲，加以培養後’其抗原性和超微構造大部分與犬新孢子虫相似，並可與岡!]地弓形蟲和哈蒙蟲（Hammondia hammondi )加以區分。Conrad et al 1993,Parasitology 106 239- -6 - (2) (2)200305433 2 4 9。再者’分析從牛和狗所分離出的新孢子虫菌株間的細胞核的小次單位核醣體R N A基因，其核苷酸沒有差異，但與剛地弓形蟲比較則常出現差異。如此確認新孢子虫與剛地弓形蟲爲兩不同之致病原。Marsh et al，1 9 9 5, J Parasitol 81 530-535 ° 從流產胎牛和先天性疾病所分離出的新孢子虫的病原 I生角色已被 g登貫。Barr et al，1994, J Vet Diag Invest 6 2 0 7 - 2 ] 5。將純種B A L B / C老鼠以犬新孢子虫感染的嚙齒類中樞神經系統新孢子虫病之範例已被發展出來。 Lindsay et al 1 99 5, J Parasitol 8 1 3131-315。此夕f ，硏究懷孕的雜種和純種老鼠經胎盤傳送犬新孢子虫的範例已分別描述於 Cole et al，1995, J Parasitol，81 730-732 及 Long et al , 1 996, J Parasitol 8 2 608-611 ° 再者，相當近似於後天性新孢子虫引發之牛流產症的實驗性犬新孢子虫侏儒山羊範例已被發展。Lindsay et al，1995, Am J Vet Res 5 6 1 1 7 6 ·] 1 80 〇 W〇9 5 2 5 5 4 1專利已公佈牛的新孢子虫生物性純培養法，偵測抗新孢子虫抗體的方法，新孢子虫特異性核替酸序列，以及包括牛新孢子虫抗原和攜帶者用以作爲疫苗之組成分。而從新孢子虫細胞所製備的均質物所構成之有效疫苗，用以對抗新孢子虫病，以往並未公佈。【發明內容】 (3) (3)200305433 發明槪述第一點·本發明提供一從新孢子虫製備的均質物，能引起哺乳動物對抗新孢子虫的保護性反應。第二點本發明提供一疫苗保護哺乳動物對抗新孢子虫病，此疫苗由一從新孢子虫製備的均質物及獸醫上可接受的攜帶者所組成，其中的均質物可引起哺乳動物對抗新孢子虫病的保護性反應。此疫苗可進一步包含一或更多附加的免疫調節性成份，例如佐藥或細胞激素。第三點：本發明提供一製備對抗哺乳動物新孢子虫病疫苗的方法，由新孢子虫的均質化細胞做成一均質物，能引起哺乳動物對抗新孢子虫病的保護性反應。免疫有效量的此均質物與獸醫上可接受的攜帶者結合形成一適於哺乳動物投藥的藥劑。第四點·本發明提供一方法用於保護哺乳動物對抗新孢子虫病，亦即給予此哺乳動物一疫苗。而此疫苗由新孢子虫細胞製備而成，具有免疫有效量之均質物可引起哺乳動物對抗新孢子虫病之保護性反應，以及一獸醫上可接受之攜帶者所構成。此疫苗可用於任何易受新孢子虫感染或患新孢子虫疾病的哺乳動物，包括狗、牛、山羊、綿羊和馬等等。第五點·本發明提供一結合型疫苗，可同時保護哺乳動物對抗新孢子虫以及其他疾病或使哺乳動物受苦痛的致病物。此結合型疫苗的第一個組成份爲免疫有效量的均質物，由新孢子虫細胞製備而得，能引起哺乳動物對抗新孢 -8- (4) (4)200305433 子虫病的保護性反應，第二個組成份爲免疫有效量物質可引起哺乳動物對抗疾病的保護反應，以及獸醫上可接受的攜帶者所組成。結合型疫苗的第二個組成份的選取基準爲其具有可引起哺乳動物對抗新孢子虫病或另一疾病或致病性情況之保護反應之物質。此結合型疫苗可進一步包括一或更多附加的免疫調節性成分例如·佐藥或細胞激素等等〇第六點·本發明提供哺乳動物一套對抗新孢子虫病的疫苗。此疫苗的第一內容物爲從新孢子虫細胞製備而得具免疫有效量的均質物，可引起哺乳動物對抗新孢子虫病的保護性反應；第二內容物爲獸醫上可接受的攜帶者或混合第一內容物的稀釋劑。第七點：本發明提供一針對此新孢子虫細胞製備而得之均質物，一或多個抗原性組成份的專一性抗體。本發明之詳細說明申請者發現從新孢子虫細胞所製備的均質物能引起哺乳動物對抗新孢子虫病的保護性反應。本發明即提供一從新孢子虫細胞所製備的均質物，能引起哺乳動物對抗新孢子虫病的保護性反應。本發明進一步提供一疫苗保護哺乳動物對抗新孢子虫病。此疫苗由一免疫有效量的均質物與獸醫學上可接受的攜帶者所組成，其中的均質物是從新孢子虫細胞製備，並能引起哺乳動物對抗新孢子虫病的保護性反應。 -9- (5) (5)200305433 本文中所稱的 '、新孢子虫病〃是指一哺乳動物受到一類或一株新孢子虫感染，或因受一類或一株新孢子虫感染後所引起的臨床症狀，狀況，事件或相關的病理病狀。本文中常用的 ''能引起保護性反應〃是指在哺乳動物內施打疫苗後的反應，包括引發或增強任何以免疫爲基礎的反應’如產生抗體或細胞調節性免疫反應，或包含二者 ’可保護此被免疫的動物對抗新孢子虫病。本文中的 '、保護性反應〃， '、保護之對抗〃，、、保護〃等，是指絕對性防止新孢子虫病或絕對防止因新孢子虫病所致的致病原之感染’包括偵測到減少此致病原感染度及感染率和死亡發生率’或增加受毒性致病株感染後之存活時間，任何感染此致病原後偵測到降低疾病嚴重度或症狀，包括被免疫的動物減少一或多個組織損害程度或降低損害率，或減少流產的發生或減少由母體傳染給後代的發生率。免疫有效量〃一詞是指給一些哺乳類一劑或多劑的疫苗，均質物，抗原或N S A製備物後，能引起保護性反應對抗新孢子虫病的量或藥物劑量。新孢子虫抗原的製備本發明是基於發現從新孢子虫細胞所製備的均質物能使哺乳動物引起保護性反應對抗新孢子虫病。本發明之疫苗內的均質物所用的細胞是指新孢子虫屬的任何一種類或任何一蟲株皆可，不論是否具致病性，其所製備的均質物可使哺乳動物引起保護性反應對抗新孢子虫病。較佳實施 -10- (6) (6)200305433

例的品種是犬新孢子虫。一非限制範例爲從犬新孢子虫株的N C - 1製備均質物，N C 一 1可從受感染的μ a R C 1 4 5猴子腎細胞內取得，μ A R C 1 4 5猴子腎細胞來自美國典型細胞培養收集處〔（American Type Culture Collection)，位於 i 2 3 0 1 ParkIaWnDrive，Rockville，MD 20852，USA(ATCC Accession No CRL-12231)，N C — 1 蟲株也包括從體內或體外培養傳遞的N C - 1衍生株。蟲株 N C — 1 也敘述於 Dubey et al，1 9 8 8，J Am，Vet Med Assoc 1 9 3 1 2 5 9 - 6 3，也倂入本內容之參考資料中。在一非限制範例中，本發明之疫苗可使用從其他種類的新孢子虫所製備的均質物，只要與犬新孢子虫的免疫性相當即可，或與犬新孢子虫N C - 1免疫性相當的其他犬新孢子虫品種。與犬新孢子虫、、免疫性相當〃的新孢子虫，所製備出的均質物能引起哺乳動物製造抗體，可辨認一或更多的犬新孢子虫抗原性成分，藉由西方點墨法分析得之。再者此新孢子虫細胞均質物能引起哺乳動物保護性反應對抗新孢子虫病。同樣的，與犬新孢子虫N C — 1 、'免疫性相當〃的其他犬新孢子虫品種，所製備出的均質物能引起哺乳動物製造抗體，可辨認一或更多的犬新孢子虫 N C - 1抗原性成分（見圖1 )，且此犬新孢子虫細胞均質物能引起哺乳動物保護性反應對抗新孢子虫病。本發明所使用的新孢子虫細胞可直接利用不需進一步修飾。而其它的改變性修飾：譬如經由遺傳操作以加入，增加，刪除或減少一或更多代謝路徑或產物或抗原特性之 -11 - (7) 200305433 表現’譬如特殊的表面抗原，產物或特性。這樣的路徑入，增加或其它方法修飾此爲疫苗接種的哺乳動物，能反應對抗新孢子虫病。譬如的修飾，加入或增加一或更激發或提高保護性反應。在胞以基因修飾加入或增加一以聚丙烯醯胺膠凝體電泳法分析N S A製備物，包括選 28 - 30，33，37, 被識別的抗原，如下所述。選擇其他或附加的方法性成分的表現來修飾此細胞虫細胞結合，從中製備均質新孢子虫細胞做基因上的修性成分的表現，聚丙烯醯胺利用西方點墨法分析N S A 一群分子量約17 - 19, 4 6 ，4 8和5 6仟道耳頓的疫苗就如同附上 ''記號〃自然感染此致病原的動物區對原蟲類細胞，像新孢熟知，包括引用隨機突變法或毒性因子或其它前述的路徑 ’產物或特性表現，可利用加細胞，使用其相對應之均質物提供激發或提高較好的保護性 •對此新孢子虫細胞做基因上多抗原性成分的表現，利用於一非限制範例中，新孢子虫細或更多顯性免疫抗原的表現，分離觀看，以及用西方點墨法自一群分子量約1 7 - 1 9， 46 ，48及56仟道耳頓可如：刪除或減少一或更多抗原，並和未修飾過的正常新孢子物。在一非限制範例中，對此飾，刪除或減少一或更多抗原膠凝體電泳法分離觀看，以及製備物，敘述如下，包括選自 28 - 30，33，37，可被識別的抗原。如此所製造或 '' 標籤〃，能讓那些原先已分疫苗接種的抗原。子虫做基因修飾的技術已普遍，譬如曝露於化學突變原或放 -12 - (8) (8)200305433 射線之下，再挑選出所要的突變表現型。選擇性或附加的方法，新孢子虫細胞可利用已知的定位基因修飾步驟來修飾，如一致性基因重組（h 〇 m ο 1 〇 g 〇 U s recombination )，發表於 Cruz and Beverley，1990, Nature 3 4 8 1 7 1 - 1 7 3,Cruz et al ,19915Proc Natl Acad Sci USA 8 8 7170-7174,Donald and Rοos，1 9 94，Μ o1 Biochem P ar as i it o 1 63 243-253,和 Titus et al 19953Proc Natl Acad Sci USA 92 10267-10271，這些著作亦倂入本內容之參考資料中。此項基因修飾技術爲常用的基因重組技術，可參考以下論文發表，這些著作亦倂入本內容之參考資料中· Maniatis,et al , 1 9 8 9，Μ ο 1 e c u 1 a r C 1 ο n i n g , A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor N Y ? Au sub el, et al , 1 989,Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience，N Y，以及 Sambrook, et al，1 9 8 9，Μ o 1 e cu 1 ar cloning，A Laboratory Manual, 2d ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，N Y o 本發明所用的新孢子虫細胞可於活體外培養’根據已知的技術將新孢子虫的速殖子感染具接受性的細胞株，最好是哺乳類細胞株。能培養新孢子虫速殖子的哺乳類細胞株譬如：人類包皮成纖維細胞（Lindsay et al，1 9 9 3, Am J Vet Res 54 103-106)，牛心肺的主動脈內皮細胞（M ar s h et al 1 9 9 5, Am J Vet Res )，猴腎細胞等其它細胞。舉例 -13- 200305433 Ο) 言之，犬新孢子虫速殖子能培養於H s 6 8人類包皮成纖維細胞株的細胞單層上（ATCC Accession No CRL - 1 6 3 5 ) (Lindsay et al，1993,同上）。緩殖子（brady zoite)可能可用同樣類似的方法培養操作。受新孢子虫感染的哺乳類細胞能用已知的數種培養液維持生長及繼續保有此已受新孢子虫感染之細胞株。例如 :受犬新孢子虫速殖子感染的牛心肺的主動脈內皮細胞之固定細胞單層，可生長於杜比可最少量必需培養中（ Dulbecco5s Minimum Essentia! Medium?DMEM Gibco Laboratories，NY )，並補充1 0% (體積/體積）熱去活化之胎牛血淸（F B S )或成馬血淸（E S ) ，2毫莫耳濃度的L -醯胺麩胺酸，5 0單位/毫升青黴素和5〇微克/毫升鏈黴素（Conrad et al，1 993，同上）。 H S 6 8人類包皮成纖維細胞的細胞單層能維持於 R Ρ Μ I 1 6 4 0培養液，並補充2 % (體積/體積）胎牛血淸，1 · 0毫莫耳濃度的丙酮酸鈉，1 X 1 〇 4單位 /毫升青徽素，1 X 1 0 4微克/毫升鏈黴素，5 X 1 0 2 毫莫耳濃度的2 -氫硫基乙醇和〇 . 3毫克/毫升l -醯胺麩胺酸（維持培養液）；若胎牛血淸改爲1 〇 % (體積 /體積）則可培養維持受到新孢子虫感染的H s 6 8人類包皮成纖維細胞之細胞單層（生長培養液）。感染到新孢子虫的哺乳類細胞單層培養以傳統標準的 3 7 °C和5 %二氧化碳組織培養法維持。當培養中的細胞有7 0〜9 0 %已感染新孢子虫時，其速殖子可由傳統的 -14- 200305433 (ίο) 細胞培養法中傳送到未受感染的細胞單層內，司用標準技術於顯微鏡下得知。受感染的哺乳類細胞培養可用任何標準技術將宿主細胞溶解，再經過濾或離心後收集速殖子。本發明中用來製造細胞均質物的新孢子虫細胞，最好以速殖子爲優先，但也可用緩殖子或卵囊體，或是合倂使用。此外，本發明所用的細胞是可存活的細胞或事前已經過化學去活化劑處理之細胞，譬如用甲醛或戊二醛或放射線或曝露於極端的ρ Η値或溫度等處理。本發明均質物之製造不限制任何特殊的均質物化或破裂的方法。可用任何已熟知的技術來均質化或破裂此新孢子虫細胞，包括冷凍/融化法，滲透性脹破，磨碎，音波振盪法，使用多穩元件，攬拌器或組織均質器等等。本文中的ν均質物〃是指由整個新孢子虫細胞經均質化或破裂後所製備的製備物。本發明之均質物包含由整個新孢子虫細胞經均質化或破裂後成分，因此是一 '、全細胞〃製備物。另一方面，本發明之均質物是由新孢子虫細胞之均質化或破裂之全部內容物的一部分所組成，此部分可由已知的技術一步步操作製備，將整個新孢子虫細胞利用一次或更多次的化學分層法，分離法或純化等步驟處理，包括離心，過瀘，透析，預備凝膠電泳分析，親和性色層分析，離子交換色層分析，大小排除色層分析，硫酸銨沉澱法或合倂使用等。所得的部分全細胞製備物仍保留引起哺乳動物保護性反應的能力，以對抗新孢子虫病。因此此部分可能富含膜成分或可溶性細胞質成分。所以此部分製 -15- (11) (11)200305433 備方便且以常用的製備或篩選步驟即可測試。疫苗之製備與使用本發明提供一抗新孢子虫病的疫苗，由新孢子虫細胞所製備的免疫有效量均質物，其能引起哺乳動物保護性反應對抗新孢子虫病，和獸醫學上可接受的攜帶者所組成。本發明更進一步提供可保護哺乳動物對抗新孢子虫病的疫苗之製備方法，包括新孢子虫的均質化細胞所製備出的均質物能引起哺乳動物的保護性反應對抗新孢子虫病，以及結合免疫有效量的均質物和獸醫學上可接受的攜帶者形成一適於哺乳類投藥的藥劑。疫苗可由直接從新孢子虫細胞培養液中製備的均質物所組成，然後直接給予哺乳動物；或由細胞均質物結合常用的投藥路徑之合適的攜帶者所組成。舉例而言，本發明之疫苗可系統化的按照下列方式組成·將此均質物或其中一部分與標準緩衝液，攜帶者，穩定劑，稀釋劑，防腐劑或助溶劑結合。此疫苗也能系統化的做成持續釋放之型式。稀釋劑包括水，含鹽水，右旋糖，酒精，甘油等等。維持等張性的添加劑包括氯化鈉，右旋糖，甘露醇，山梨糖醇和乳糖等等。穩定劑包括白蛋白。其它適用的疫苗賦形劑和添加劑，已被熟知且常見，可參考Romington’s Pharmacentical Science, ] 8th ed，1990, Mack Publishing, 亦倂入本文之參考資料中。本發明之疫苗可進一步有一個或更多的附加免疫調節 -16- (12) (12)200305433 性成分，如佐藥或細胞激素之組成。非限制性例子的佐藥包括R I B I佐藥系統（R i b i I n c H a m Π t ο η，Μ T )，明礬，礦物凝膠（譬如氫氧化錦），油包水乳劑，譬如 Freund’s完全和不完全佐藥，Bl〇ck共聚合物（ C y t R X , A11 a n t a GA) J Q S — 2 1 ( Cambridge Biotech

Inc Cambridge MA)以及 S A F — M ( Chiron，Emeryville C A ) ，AMPHIGEN®佐藥，巷角替，Qui! a或其它巷角脊部分，單磷酸脂肪A，以及Avri dine脂胺佐藥。本發明之疫苗的特殊非限制例子中所使用的水包油乳劑包括 S EAM6 2和SEAM1/2 ，這些成分陳述於下面內容中。本疫苗的其它免疫調節劑包括一個或更多的介白素，千擾素或其它已知的細胞激素。本疫苗可貯存於水中，或無菌稀釋液重組成冷凍乾燥之型式利於投藥。本發明之疫苗可選擇爲持續釋放抗原之組合。舉例言之，持續釋放之組合物包括·合倂均質物與生物可相容性之聚合物；譬如聚（乳酸），聚（乳酸一羥基乙酸），甲基纖維素，透明質酸，膠原蛋白等等。做爲藥物運送工具的可分解的聚合物之結構，選擇與使用，可參考數篇發表刊物，包括 A，Domb et al，1992，Polymers for Advanced Technologies 3 279-292,此文倂入本文之參考資料中。藥劑組合物中聚合物之選擇與使用之附加指引，可參考 MChasin and R Langer(eds) 1 990, '、 Biodegradable

Polymers as Drug Delivery Systems’’ in Drugs and the

Pharmaceutical Sciences，Vol 45 M Dekker NY 此文倂入本 - 17- (13) (13)200305433 文之參考資料中。另外的方法可將均質物形成微膠囊塡裝之型式，以促進投藥及效力。微膠體塡裝抗原之方法技術已熟知，參考 U · S . P a t · 3 ，1 3 7 ，6 3 1， 1].8.?81:.3，959，457，美國專利 pat.5，008，050及美國專利 5 ，009 ，956等，已倂入本文之參考資料中。微脂粒在本發明中也用來提供均質物持續性釋放之作用’更詳細關於如何製作及使用微脂粒組合物之資料可參 ,TJ.S.Pai.4 0161〇0 :U.S.Pat· 4 4 527 4 7；U.S. Pat. 4921^706； U.S.Pat 4927，637;U.S. Pat. 4’9 4 4，9 4 8;U.S.Pat . 5 0 0 8 0 5 0 ，及 U. S.Pat . 5 ，00 9 ，956 ，這些資料皆倂入本文參考資料中。本發明更進一步提供一保護哺乳動物對抗新孢子虫病的方法，藉由施打疫苗達到，此疫苗由新孢子虫細胞所製備之免疫有效量的均質物可引起哺乳動物保護性反應對抗新孢子虫病，及一獸醫學上可接受之攜帶者所組成。本疫苗最好以非經腸的方式給藥，譬如經由皮下注射或肌肉內注射。然而，亦可由腹膜內注射或靜脈內注射給藥，或經由其它路徑取代，包括：口服，鼻內，直腸，陰道，眼內或結合這些路徑的方式給藥。技術純熟的技術員知道針對所選擇的路徑有系統接種疫苗。有效劑量的決定可經由傳統習用的方法，先給一低劑 -18- (14) (14)200305433 量的均質物，再慢慢增加劑量並伴隨偵測效果反應。決定每一動物的最適宜劑量需考慮很多因素，首先是動物種類，大小，年齡，此動物的一般狀況，目前此動物已服用的藥物，若此動物已接種疫苗則考慮所對抗的新孢子虫蟲株的毒性如何等等。最好是再考慮其他動物硏究的這些結果之後再選擇最確實的劑量。疫苗接種之時間，方法的選擇也要考慮上述的那些因素。本發明之疫苗可根據數個因素，譬如其它動物暴發新孢子虫病的時間等等，而在動物存活的任何時間內接種疫苗。本疫苗可接種斷奶的動物或較年幼的動物或更成熟的動物’或生產前接種疫苗來保護對抗相關於新孢子虫所引起的先天性疾病或流產。只要初次接種疫苗就可獲得有效的保護作用，若要完全的保護可能需要一次或多次的追加接種疫苗。測定疫苗接種後的動物之血淸轉變和抗體力價，可偵測是否已達到足夠的免疫保護作用。決定疫苗接種的時間和次數，最好以獸醫學爲基礎來分析所有的相關因素，包括上述的因素〇疫苗中的均質物含量約1 〇到1 ，〇〇〇微克蛋白質 /毫升較好’若爲1 〇〇到5 0 0微克蛋白質/毫升更好。而適宜的劑量大小約爲〇 · 5毫升到1 〇毫升，若爲 1 · 0毫升到5 · 〇毫升更適宜。通常，以每一劑量爲基準’對動物接種均質物的量以1 〇到1 ，0 〇〇微克之蛋白質較好，若是1 〇〇到5 0 0微克則更好。 -19- (15) (15)200305433 本發明之疫苗使用於保護哺乳動物對抗新孢子虫感染其所^丨起的疾病。本文中所提之 '、哺乳動物〃是指任何使用本發明之疫苗而獲得保護能對抗新孢子虫病的哺乳類動物’包括狗’牛’山羊，綿羊和馬等等。本疫苗可用來保護懷孕及未懷孕之哺乳動物。本發明進一步提供一結合型疫苗保護哺乳動物對抗新孢子虫病及一種或更多種使此動物受痛苦的其他疾病或致病情況。此結合型疫苗由新孢子虫細胞所製備之均質物組成第一個成分，可引起哺乳動物保護性反應對抗新孢子虫病，另一免疫有效量可引起哺乳動物保護性反應對抗使此動物受苦的疾病或致病情況之物質組成第二成分，另外再加上上述一些獸醫學上可接受之佐藥組成此結合型疫苗。結合型疫苗的第二個成分之選擇以其能引起保護性反應對抗新孢子虫病或其它使哺乳動物受痛苦之疾病，致病情況等爲原則。任何已知且使用於特定的哺乳動物之疫苗組成的免疫性成分，皆可用來做爲結合型疫苗的第二個成分。這些免疫性成分包括牛疱疹病毒（牛感染性鼻氣管炎 )’牛呼吸道融合瘤病毒，牛病毒性腹瀉病毒，副流行性感冒病毒I ，I I或I I I型，細螺旋體屬，曲狀桿菌屬，金黃色葡萄球菌，無乳鏈球菌，黴漿菌屬，克雷白氏桿菌屬，沙門氏桿菌屬，輪狀病毒，冠狀病毒，狂犬病病毒，溶血性巴斯德氏桿菌，敗血性出血性巴斯德氏桿菌，梭狀桿菌屬，破傷風類毒素，大腸桿菌，囊蟲種屬，球胞子蟲屬和其它真核生物的寄生蟲。 -20- (16) (16)200305433 本發明之結合型疫苗可進一步包含一種或更多種附加的免疫調節成分，包括佐藥或細胞激素，並可選擇性的組合成持續釋放型或以冷凍乾燥型式保存，如前所述。本發明進一步提供一組疫苗針對哺乳動物對抗新孢子虫病。此疫苗的第一項內容物由免疫有效量的新孢子虫細胞所製備之均質物所組成，此均質物可引起哺乳動物保護性反應對抗新孢子虫病；第二項內容物爲獸醫學上可接受的佐藥或適合與第一項內容物混合的稀釋劑。此疫苗可加入攜帶者或稀釋劑重組成冷凍乾燥之型式貯存。抗新孢子虫的抗體本發明之範圍包括製造可結合一種或多種新孢子虫專一性抗原成分的多株或單株抗體。此抗體可專一性與新孢子虫細胞有關的抗原成分或從中所製備之均質物作用。在一非限制範例中，可從圖1的西方點墨法觀看到抗體對抗一種或更多種抗原性成分之分析，這些抗原包括可被分子量約 17— 19，28 — 3 〇，33，37，46，48 和5 6仟道耳頓的抗體辨認的一群。這些抗體可用於新孢子虫病差異診斷的試劑，譬如偵測動物的組織切片或細胞，組織或檢液中的新孢子虫專一性抗原，用於酵素連接性免疫吸收分析法（E L I S A )或西方點墨法或製備疫苗時之投原定量。被引發的抗體可對抗任何存在於新孢子虫細胞均質物的抗原性成分，譬如以下所描述的N S A製備物。根據已 -21 - (17) (17)200305433 知的免疫學技術，可用來製造牛，馬，兔子，山羊，綿羊和老鼠等不同動物宿主之對抗一種或多種新孢子虫抗原專一性成分的抗體。前述的一些佐藥可用來增加免疫性反應以提高抗體之製造。多株抗體可從被免疫之動物取得，並以標準技術測試其對抗新孢子虫專一性抗原成分之專--性。另一方面，新孢子虫專一性抗原成分的單株抗體之製備，可經由連續的細胞株培養來製造抗體分子的任何技術而完成。包括最初描述於 k 〇 h 1 e r 和 M i 1 s t e i n ( N a t u r e，1 9 7 5，2 5 6 4 9 5 - 4 9 7 )的細胞融合瘤技術，人類B細胞融合瘤技術（k o s b o r e t a 1 1983 ，Immunology Today 4 72,Cote et al，1983，Proc Natl Acad Sci US A 80 2026-2030)，以及 E B V 融合瘤技術（ Cole et a 1，1 9 8 5，Μ ο η o c 1 ο n a 1 Antibodies and Cancer Therapy Alan RLissIncpp77-96)。另一種製造單鏈抗體的技術（U · S · P a t · 4，9 4 6，7 7 8 )也適用於製造新孢子虫抗原專一性單鏈抗體。以上的論文也倂入本文的參考資料中。本發明也包含可與新孢子虫細胞專一性抗原分子結合的抗體片斷，可用已知的技術製造產生。這些片斷包括由胃蛋白酶分解一完整抗體分子所產生之（F a b /) 2片斷，以及由（F a b /) 2片斷經還原連結之雙硫鍵後所產生之F a b片斷。另一方面，構築F a b的表現資料庫 (Huse et al，1989, Science 246 1275-1281)，可快速鑑定出所要的新孢子虫專一性抗原之相對應F a b抗體片斷。 -22- (18) (18)200305433 本發明之丨几體或抗體片斷可進一步以已知的技術，譬如如螢光標籤，放躬線標識或酵素等可偵測之標識所組成，在前述的任何診斷分析法中，可協助偵測專一性結合的抗體。單株抗體和抗體片斷的製造及使用的技術已熟知，附加的描述於其它地方，如Harlow及Lane，1988, Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, J W Goding, 1986,Monoclonal Antibodies Principles and Practice，Academic Press，Lon don。以上論文也倂入本文參考資料中。以下範例提供進一步的例證，不局限本發明的組成分及方法。【實施方式】範例1 ·新孢子虫疫苗的製備（Preparation ofNeospora

Vaccine)新孢子虫培養的保持犬新孢子虫品種N C - 1 的速殖子可維持於猴子腎細胞M A R C - 1 4 5的細胞單層（USDA，ARS，Clay Center，NE )以組織培養瓶在含有1 %胎牛血淸—1 0 0單位/毫升青黴素，1 0 〇微克/毫升鏈黴素和2毫莫耳濃度的醯胺麩胺酸的Opt i-ME乂^培養液（Gib co BRL )於3 7 °C及5 %二氧化碳下培養。以顯微鏡檢視細胞單層的細胞病變效應’若培養的被感染細胞中有6 0〜9 0 %的M A R C — 1 4 5宿主細胞已被分解，則可收取速殖子。使用刮細胞器將其餘被感染含有細 -23- (19)200305433 胞內培養 1 . 之小 Salt 過2 再懸以5 濾器懸浮藍質均質溶液爲2 液加的原 E D 原料 )溶精中 2 9 1毫速殖子的細胞刮下，並倂入含有細胞外游離速殖子的液。被感染細胞加上游離速殖子之製備物以 8 7 6 X g的速度，4 °C離心1 0分鐘，再將所形成九以5毫升的漢克氏平衡鹽水溶液（Hank’s balanced s〇lution，HBSS，Gibco BRL)使之懸浮。此懸浮液通 2號針頭5次，如前述情形離心，以5毫升Η B S S 浮，通過2 8號針頭5次。此物質如前述情形離心，毫升Η B S S再使小九懸浮，之後以無菌的5微尺過移除宿主細胞的殘渣。如前述情形離心，以Η B S S 含有游離速殖子的寄生蟲小九，使用血球計數器及鉗決定存活的速殖子全部數目。物（新孢子虫抗原）的製備上述所製備的存活速殖子以杜比可磷酸鹽緩衝鹽水溶 (Dulbecco’s phosphate buffered sa]ine，DPBS)調整 X 1 0 8 /毫升的細胞密度。每一毫升的速殖子懸浮入5微升的蛋白酶抑制劑原料A和B。蛋白質抑制劑料A包括1毫升E D T A溶液（加1 · 4 6克丁 A到5毫升水中製備）及4毫升水。蛋白酶抑制劑 B包括1毫升N E Μ (氮一乙基一順丁烯二醯抱亞胺液（加3 . 4 3毫克抑胃酶素（s i g m a )到5毫升酒製備），3毫升PMSF (苯甲基磺醯氟）溶液（加 1毫克P M S F ( Sigma )到5毫升酒精中製備）及升TPCK(氮一甲苯磺酸基一l一苯丙胺酸氯甲基 -24- (20) (20)200305433 SH )丨谷液（加1 7 6毫克T P C K ( S i g m a )到5毫升酒精中製備）。將速殖子製備物冷凍（一 2 〇 °C )及融化（室溫）三 A ’ 然後用振^益（Branson Sonifer 250, Branson Inc ) 以固定輸出量（4分鐘/循環）於冰上作用三次。所成之均質物產物命名爲新孢子虫抗原（N S A )製備物。 N S A製備物的蛋白質濃度以商業化產品分析（pierce B C A )，之後分裝並貯存於一 2 0 t：或一 7 0 °C待要進一步製作疫苗及活體外分析時再使用（譬如·西方點墨法，細胞增殖等）。N S A製備物不含任何存活的速殖子，可用M A R C - 1 4 5細胞缺乏新孢子虫生長及無法殺死免疫缺乏性的裸鼠來鑑定。疫苗組合物本文中測試的疫苗由上述製備的N S A製備物和獸醫學上可接受的佐藥組成。常用的佐藥如兩不同的S E A Μ 62或SEAM1/2。SEAM62是一水包油乳劑，包括5 % (體積/體積）鯊烯（Sigma) ，1 % (體積/ 體積）S P A N ® 8 5淸潔劑（ICI Surf act ants表面作用劑）0 · 7 % (體積/體積）TWEEN® 8 0淸潔劑（ 1 C I表面作用劑），2 · 5 % (體積/體積）酒精， 2 0 0微克/毫升QuilA，1 0 〇微克/毫升膽固醇， 0 · 5 % (體積/體積）卵磷脂，和0 · 〇 1 %硫柳汞（ Sigma ) 。S Ε Α Μ 1 / 2是一水包油乳劑，包括5 % ( -25- (21) (21)200305433 體積/體積）鯊烯，1 % (體積/體積）S P A N ® 8 5 淸潔劑，0 · 7 % (體積/體積）Tween 80淸潔劑， 2 . 5 % (體積/體積）酒精，1 0 0微克/毫升Quil A ，5 0微克/毫升膽固醇，和0 . 0 1 %硫柳汞。加入等體積的N S A製備物和佐藥（S E A Μ 6 2或 S Ε Α Μ 1 / 2 )製備成疫苗，之後適度的混合，貯存於 4 °C以便日後使用於初次及追加免疫作用。兩實驗的最後疫苗蛋白質濃度爲2 5 0微克NSA蛋白質/毫升。對照組疫苗只含有佐藥（範例2爲S E A Μ 6 2，範例3爲 SEAM1/2，如下所述）。範例2 ·免疫作用和激發免疫活性的老鼠這兩部分的硏究目的是要證明·新孢子虫細胞均質物，此處爲犬新孢子虫品種N C - 1的速殖子均質物有能力引起免疫活性的老鼠保護性免疫反應。第一部分硏究中，在第0天及第2 1天以只含 5 E A Μ 6 2佐藥（對照組）或N S Α製備物加上 SEAM62佐藥（疫苗組），免疫化8週大的母 BALB/c老鼠（n = 10/組）。最後一次免疫作用後第1 5天，每組隨機挑選3隻老鼠收集各別血淸樣本，貯存於- 2 0 °C用於西方點墨法分析寄生蟲專一性抗體（圖1 )。免疫作用後之西方點墨法分析如下述處理。使用標準非還原性準備的凝膠體電泳法（S D S - P A G E ) ，1 2 %十二烷基硫酸鈉—聚丙烯醯胺凝膠體（No vex ) -26- (22) (22)200305433 ，分層N S A製備物與倂排的分子量記號物（No vex，San 3 Diego,CA )。電泳作用完後，將被分開的蛋白質轉印到 P V D F 膜（Millipore3Bedford，MA )上，以淸洗液（磷酸鹽緩衝液（酸驗値p Η 7 · 5 / 0 · 5 % T w e e η 2 0淸潔劑漂洗，自然風乾，切成一條條個別長條（約8微克 N S Α蛋白質/條）。將長條與阻檔用緩衝液（含5 %脫脂奶的淸洗液）室溫下作用過一夜。之後短暫漂洗2次，將長條與最後一次免疫作用後第1 5天的初次抗血淸樣本 (用淸洗液1 * 2 0 0比例稀釋）在室溫作用1小時；佐藥對照組老鼠取3個抗血淸樣本（圖1第1至3行）或疫苗組老鼠取3個抗血淸樣本（圖1第4至6行）作用。之後以淸洗液漂洗2次後，將長條與已結合驗性磷酸酶的山羊抗老鼠免疫球蛋白I g G (kirkegaard & perry)(用淸洗液1 · 1 0 ，0 0 0比例稀釋）室溫下作用1小時，再以淸洗液漂洗2次，使用能產生色澤的B C I P / N B T 受質（5 —溴一 4 一氯一 3 -吲哚基一磷酸/硝基藍四唑物）（kirkegaard & Perry )偵測具免疫反應性的蛋白質〇圖1西方點墨法顯示，從3隻被N S A製備物加上佐藥（第4 - 6行）免疫化的老鼠所收集的血淸抗體，能與分子量約 17— 19，28 — 30，33，37，46， 4 8和5 6仟道耳頓的N S A製備物蛋白質作用。而只給予佐藥的控制組老鼠偵測不到N S A專一性抗體（第1 -3行），因此3隻被N S A製備物加上佐藥免疫化的老鼠 -27- (23) (23)200305433 之血淸樣本免疫反應性彼此一致，是由於給予N S A製備物所引起的。第二部分的研究中，在第0天及第1 4天以只含 S Ε Α Μ 1 / 2佐藥（對組組）或N S A製備物加上 S Ε Α Μ 1 / 2佐藥（疫苗組），免疫化4週大的母 BALB/c老鼠（η=16/組）。最後一次免疫作用後第7天，每組隨機挑選4隻提供者老鼠，收集每隻老鼠的血淸，合倂在一起貯存於- 2 0 °C待免疫螢光分析法時測試。使用標準程序製備提供組胰臟細胞。簡而言之，合倂每一組的腎臟並使之破裂，使用組織孔篩篩濾以取得單細胞懸浮液，並用T r i s緩衝液0 . 8 3 %氯化銨溶解紅血球細胞。存活細胞計數完後，將疫苗組和對照組各自合倂的胰臟細胞製備物分裝，一些使用於以下所述的激發前抗原專一性淋巴細胞增殖及細胞激素分析。剩餘的合倂胰臟細胞使用於轉移到T -細胞缺乏的無胸腺老鼠（見以下範例3 )。剩餘的老鼠分成4組（η二6 /組）做隨後的激發分析。接種NSA製備物加上S ΕΑΜ1/2佐藥或只有 SEAM1/2 佐藥的各組（η = 6/組）BALB/c 老鼠，免疫作用後第2 2天皮下注射lx 1 06或lx 1 0 7的N C - 1速殖子激發。激發後三星期，收集全部老鼠的個別血淸樣本，老鼠被犧牲後，收集個別組織（胰臟，肺和腦）做隨後如下所述的處理及分析。激發前後的免疫螢光抗體（I F A )力價分析如下處 -28- (24) (24)200305433 理。將存活的N C - 1速殖子（5 χ 1 0 4 )加入9 6孔的凹孔盤每個凹孔底部，凹孔自然風乾後’將平盤貯存於一 2 0 °C待用。收集免疫作用後（激發第0天）第2 1天及激發後第2 1天的血淸測試樣本，做1 F A力價測試。以最初1 · 5 0稀釋血淸，之後2倍連續稀釋後加入各凹孔中，室溫作用3 0分鐘。經2次碳酸鹽淸洗液漂洗後’ 凹孔中加入已結合異硫氰酸酯（F a b ) 2螢光物的抗老鼠免疫球蛋白 I g G + I gM (Southern Biotechology, Birmingham，AL )平盤經淸洗後加入5 0微升的5 0 %甘油稀釋淸洗液到每個凹孔中。平盤置4 °C中直到在裝有可發射5 1 0微微尺（5 1 0 n m )濾鏡的螢光顯微鏡下觀察。抗體力價是以能產生可被偵測到螢光發生的最高稀釋倍數之免疫血淸。根據I F A力價分析結果，本發明之疫苗能引起體液性免疫反應，製造抗體對抗整個速殖子（圖2 )。比較之下，疫苗免疫化老鼠4個隨機合倂的血淸樣本平均I F A 力價> 2 5 ，0 0 0 ，而對照組老鼠的血淸樣本平均 I F A力價< 5 0。疫苗組動物的激發後幾何平均力價顯著高於對照組（P < 0 . 0 0 1 )，也高於激發前力價，表示疫苗可作用於已接種疫苗的動物引發記憶性免疫反應 ’所以當再次以寄生蟲激發時可增進免疫反應，N S A製備物可引起細胞性（T -細胞）免疫反應之能力如下處理。只注射佐藥的對照組老鼠和注射N S A製備物加佐藥的疫苗組老鼠，在最後免疫作用後第7天犧牲掉並移除他們 (25) 200305433 的胰臟。將合倂的胰臟（每組4組）破裂後’使用篩篩濾以取得單細胞懸浮液，並用T r i s緩衝液 0 · 8 3 %氯化銨溶解紅血球細胞。計數存活的細將細胞懸浮於含有1 0 %熱去活化胎牛血淸，1 〇 /毫升青黴素，100微克/毫升鏈黴素，5x 莫耳濃度/3 -氫硫基乙醇，2毫莫耳濃度L -醯胺，5微克/毫升胰島素，1〇微克/毫升運鐵蛋白 1 0微克/毫升硒的完全R Ρ Μ I培養液中。於9 孔盤中每孔放5 X 1 0 5細胞做細胞增殖分析，將： NSA製備物或含有NSA製備物初濃度爲1〇微 N S Α蛋白質/毫升的完全培養液，以5倍連續稀後加入上述凹孔內到最終體積爲2 0 0微升’平盤 °C，7 %二氧化碳環境下7 2小時。T淋巴細胞的析，藉由加入0 3 3微居里的〔3 Η〕胸腺嘧啶細胞，再培養1 8到2 4小時。將細胞經濾紙過濾 M A C Η ΙΠ 細胞收受器收集（Tom Tech，Orange, C 以閃爍計數器決定倂入的放射線、活 Wallac,Turku，Finland)。實驗結果以△ C p m ( 含有N S A的平均c p m値減只含培養液的平均c )表示如圖3 。取自疫苗組老鼠的胰臟細胞，可於活體外受N 備物刺激而增殖，對照組老鼠則否。這些活體外細分析結果證明本發明之疫苗能引起細胞性（T 一細疫反應。組織孔胞後， 0單位 1〇一 5 麩胺酸，和 6孔凹不含克釋4次置3 7 增殖分到胰臟，後由 :τ )，性（培養液 p m値 S A製胞增殖胞）免 -30- (26) (26)200305433 於9 6孔凹孔盤中每孔放5 x 1 〇 5細胞做細胞徼素分析，將不含N S A製備物或含有n S A製備的完全培養液（最後濃度爲10微克NSA蛋白質/毫升），準備 4 4個加入上述凹孔內到最終體積爲2 〇〇微升。平盤置 3 7 °C，7 %二氧化碳下作用培養，每2 4小時收集無細胞懸浮液4天’並貯存於- 2 0 °C待日後測試。收集樣本中出現專一性細胞激素，可利用商品化的結合性和未結合性細胞激素專一性抗體’基因重組細胞激素來進行兩位置酵素連接性免疫吸收分析法鑑定，實驗步驟依照廠商建議進行（Phai*mingen，San Diego，CA )。實驗結果已減去沒加 N S A製備物的凹孔背景値，以微微克/毫升表示。提供者激發前製造胰臟抗原專一性細胞激素如圖4所示，證明本發明之疫苗可於免疫作用後引起型1 (干擾素 —r ，介白素一 2)及型2 (介白素一6 ，介白素一 10 )細胞性免疫反應。最近發現干擾素- r在鼠類扮演保護的角色對抗新孢子虫病（khan etal，1997, Experimental P a r a s i t ο 1 o g y，8 5 2 4 - 3 4 )特別値得注意。再者，干擾素— r是宿主對抗相關之寄生蟲，剛地弓形蟲所必需（Suzuki et al，1988, Science 240 516-518)。本發明之疫苗能引發干擾素- 7的產生，包括此疫苗能保護具免疫活性的老鼠，以及將此種老鼠細胞轉移到免疫不全缺乏胸腺的老鼠體內後，能引發記憶性τ細胞分泌干擾素- r的能力，如下範例3所述。此已殺死的疫苗能引發介白素- 6和介白素 - 1 0的製造以保護來對抗新孢子虫病，十分重要，因爲 - 31 - (27) (27)200305433 此二細胞激素在宿主對抗剛地弓型蟲上扮演重要角色（ Suzuki et al，1997, In feet I m m u n ? 6 5 2339-2345，Neyer et al，1997 ln fect 65 1675-1682)。本發明之疫苗能引發細胞性（T細胞）免疫反應，可進一步由測試激發後第2 1天的抗原專一性胰臟細胞增殖而確定。如圖5所示以1 X 1 0 6或1 X 1〇7的N C — 1速殖子激發後，可使T -淋巴細胞對N S A製備物的反應，疫苗組明顯高於對照組（p < 0 · 〇 1 ，p < 0.05) ° 測試本發明之疫苗具保護能力，使動物對抗新孢子虫病所引起的腦炎，可藉由比較疫苗組和對照組老鼠以兩個不同激發劑量感染後，測量肺和腦組織切片的損害數目。激發後第2 1天，收集個別的肺和腦組織（6 /組），以 1 0 %中和性福馬林緩衝液固定，切片，並以慣用的組織學技術處理，用蘇木素和伊紅染色。將染色後的肺和腦部切片編號並覆蓋打分數，使操作者不知道事前之處理情形。肺和腦損害評分準則如下· （ 0 )在正常範圍內，（1 )輕微損害，（2 )輕度損害，（3 )中度，（4 )嚴重及（5 )顯著損害。 B A L B / c老鼠激發後的腦和肺部損害分數顯示於圍6 C a - d )，結果證明使用本發明之疫苗免疫後的老鼠，以1 X 1 0 7 N C - 1寄生蟲速殖子激發後，比對照組有顯著較低的平均肺C P < 0 . 0 1 )和腦（P < 0 · 0 5 )損害分數。此外，以1 X 1 0 6 N C - 1寄生 -32- (28) (28)200305433 蟲速殖子激發後，對照組老鼠比疫苗組老鼠顯示更高的腦和肺損害分數。以1 x 1 〇 6激發劑量的損害分數’疫苗組與對照組間缺乏統計上的差異’是基於疫苗組中的一隻老鼠異於他者，呈現肺和腦分數爲2。範例3 :接受性轉移胰臟細胞後激發免疫缺乏性老鼠本硏究的目的是要測試’疫苗接種後的免疫活性老鼠的胰臟淋巴細胞，能使用於接受性轉移保護作用到T細胞免疫缺乏的無胸腺老鼠（n u / n u或裸鼠，Charles River* Labs )使其受毒性N C — 1激發後能延長存活天數的能力。每隻裸鼠（η = 7 /組）接受1 X 1 0 7胰臟細胞（存於0 · 1毫升D P B S )的靜脈內注射；胰臟細胞來自疫苗組或對照組B A L B / c老鼠最後一次免疫作用後第 7天的老鼠。對照組n u / n u老鼠只接受D P B S ( 0 . 1毫升）。在第2 2天（轉移後2 4小時），將全部裸鼠皮下注射5 X 1 0 6 N C — 1速殖子激發，然後監視這些裸鼠的新孢子虫病臨床病徵，以及在激發後第1 4天開始死亡。無胸腺裸鼠激發後的存活曲線呈現於圖7。只接受 D P B S的裸鼠（無胰臟細胞= 無細胞組〃）對N C — 1速殖子的激發具高度感受性，經激發後2 1天，這組老鼠沒有一隻存活。而接受曾經注射N S Α製備物加佐藥或只有佐藥的B A L B / c老鼠胰臟細胞的裸鼠存活較久。 -33 - (29) (29)200305433 接受只注躬佐藥的B A L B / c老鼠胰臟細胞的裸鼠， 8 0 %最後都死於新孢子虫感染’只有1隻在此實驗最終仍存活（激發後4 8天）。相較之下，接受注射N S A製備物加佐藥的B A L B / c老鼠胰臟細胞的裸鼠，在寄生蟲激發後，整個實驗期間有1 〇〇 %的裸鼠存活。這些實驗結果證明接種疫苗的提供者胰臟細胞能賦與接受性的保護性免疫力對抗新孢子虫病，並更進一步證明本發明之疫苗的功效。以上所引用的全部專利，專利申請書和發表皆完整的倂入本文的參考資料中。本發明並不局限於文中所舉的特別範例，這些只是本發明的某一方面的單一個別例證。功能相當的組成和方法都在本發明的範圍內。的確，除了那些本文中所述說明的內容之外，本發明的各種修正將明顯見於前文所述的那些純熟技術中。像這些修正都包含於附加申請範圍內容中。【圖式簡單說明】圖1 · B A L B / c老鼠激發前的血淸西方點墨法（

Western blot )分析。N C - 1速殖子的全細胞均質物（即> N S A製備物〃）以聚丙烯醯胺膠凝體電泳法分層，然後轉印到P V D F膜，再與一級抗血淸樣品接觸作用後 ’加入已結合鹼性磷酸酶之抗老鼠的山羊免疫球蛋白 I gG，再以能產生色澤的BC I P/NBT受質與之作用。第1至3行是只施行佐藥而得的老鼠血淸（對照組） -34- (30) (30)200305433 ’第4至6行施打N S A製備物及佐藥而得的老鼠血淸（投苗組），分子量如圖所示。被免疫化的老鼠血淸含有可與N S A製備物作用反應的抗體，其分子量約爲1 7 一 19 ，28 — 30，33，37，46 ，48 及 56 仟道耳頓（k D )。圖2 :激發前（A )及激發後（b )的免疫螢光抗體 (i F A )力價。於含有N C - 1速殖子細胞的凹孔盤，分別加入第2 1天免疫化後之實驗動物血淸（即激發前的第0天）和第2 1天激發後的實驗動物血淸。然後於凹孔盤中再加入已結合異硫氰酸酯（F a b ) 2螢光物的抗老風免疫球蛋白 I g G 與 I gM。（kirkegarred&Perry， Gaithersburg，MD )。淸洗後，以上位螢光顯微鏡檢視。抗體力價是以能產生可被偵測到螢光發生的最高稀釋倍數之免疫血淸濃度爲基準。疫苗組實驗動物的激發前與對照組比較後顯示較高的平均免疫螢光抗體力價之結果如圖 2 A，至於激發後與對照組比較後顯示特別高的平均免疫螢光抗體力價之結果如圖2B (P<〇 · 〇〇1)，圖 2 B以1 〇 6激發時的對照組幾何平均力價（g Μ T )= 2 ，691 ;疫苗組 GMT = 25 ，600，以 1〇7 激發時的對照組G Μ 丁 = 5 ，3 8 2 ;疫苗組G Μ T = 7 2，4 0 8 ° 圖3 :激發前胰臟的專一性抗原增殖分析法。製備免疫化後第2 1天的對照組（只施打佐藥）老鼠胰臟細胞，或疫苗組（施打N S Α製備物與佐藥）老鼠胰臟細胞。τ -35- (31) 200305433 細胞增殖分析法是藉由將前述所製備的孢子虫於含有〔3 Η〕標識的胸腺核苷下之範例2所述。結果以△ c p m表示 N S A的平均c p m値減只含培養液的並證明新孢子虫的細胞均質物能引發體外以N S A製備物刺激後能增殖。圖4 捐贈者激發前胰臟抗原專一。製備免疫化後第2 1天的對照組（只臟細胞，或疫苗組（施打N S A製備物細胞；與N S A製備物一起培養以製造含細胞的上淸液，以購買來的細胞激素商品上之指示方法分析（P h a r M i n g e η，實驗結果證明新孢子虫的細胞均質物能群於體外以N S Α製備物剌激能製造型 INF — r)，介白激素—2(IL — 白素一6 ( I L - 6 )，介白素一10 細胞激素。圖5 .激發後抗原專一性胰臟細胞第2 1天的激發後之對照組（只施打佐老鼠胰臟細胞或疫苗組（施打N S A製 B A L B / C老鼠胰臟細胞。T細胞增下所述的將胰臟細胞以〔3 Η〕標識的以 lxl〇6(A)或lxl07(B) 激發之後，可比較出疫苗組比對照組老老鼠胰臟細胞與新培養液中培養，如 (培養液含有平均c p m値），內T細胞族群於體性細胞激素之製造施打佐藥）老鼠胰與佐藥）老鼠胰臟細胞激素。收集不專一性抗體，按照 San Dieg〇，C A )，引發體內T細胞族 1 (伽侷干擾素（ 2 ))和型2 (介 (1 L 一 1 0 )的增殖分析法。製備藥）B A L B / c 備物與佐藥）殖分析法是藉由如胸腺核苷培養法。之NC—1速殖子鼠（η = 4 /組） -36- (32) (32)200305433 的胰臟細胞有明顯較高的抗原專一性反應（* = P < 0.05，**二？<0.〇1)。圖6 激發後肺與腦部損害評估。製備以1 X 1 〇 6 (A，B)或 1x107(C，D) ，NC— 1 速殖子激發之激發後第2 1天的對照組（η = 6 )和疫苗組（n二 6 ) B A L B / c老鼠之肺與腦部組織切片，損害評估如下所述。圖中呈現各實驗動物的損害評估値，打點線代表每一組的平均損害値。實驗結果證明以新孢蟲的細胞均質物免疫之動物，用1 X 1 0 7 N C - 1速殖子激發後，比對照組有明顯較低的肺（P < 0 · 0 1 )及腦部（P < 0 · 0 5 )損害値。A，對照組平均=〇 . 5 ，疫苗組平均二0 · 3 3 ，B對照組平均二1 · 〇，疫苗組平均二〇· 3 3 C ，對照組平均=1 · 8 3 ，疫苗組平均= 〇· 6 7 ( P <〇· 0 1 ) ，D對照組平均=1 · 8 3 ，疫苗組平均=1.0 (P<〇 .05)。圖7 :無胸腺裸鼠激發後之存活曲線圖。裸鼠只接受 D P B S (無胰臟細胞二 ''無細胞組〃）；裸鼠接受只注射佐藥C ''佐藥組〃）的B A L B / c老鼠胰臟細胞；裸鼠接受注射N S A製備物及佐藥疫苗組〃）的 B A L B / c老鼠胰臟細胞。實驗結果證明將免疫過的 B A L B / c老鼠胰臟細胞轉移到裸鼠可導致獲得保護性免疫力，對抗毒性N C - 1的激發，而延長存活期，具明顯的保護作用。 -37-

Claims

(1) (1)200305433 拾、申請專利範圍 1 · 一種組合型疫苗，其係用於保護哺乳動物對抗新孢子虫病及隨意之一種或多種使哺乳動物受苦的其它疾病或致病情況，此組合型疫苗包括免疫有效量之第一組成物，其包括由犬新孢子虫細胞所製備之均質物，此均質物可引起哺乳動物保護性反應以對抗新孢子虫病；免疫有效量之第二組成物，此組成物可引起哺乳動物保護性反應以對抗使該動物受苦的疾病或致病情況，及獸醫學上可接受的載劑。 2 ·如申請專利範圍第1項之組合型疫苗，其中該均質物是犬新孢子虫細胞之全細胞均質物。 3 ·如申請專利範圍第1項之組合型疫苗，其中用以製備第一組成分均質物的犬新孢子虫是N C - 1株。 4 ·如申請專利範圍第1項之組合型疫苗，其中第一組成分之均質物是由速殖子製備而成。 5 .如申請專利範圍第1項之組合型疫苗，其中第二組成分可引起晡乳動物保護性反應以對抗選自下列之致病原，包括牛泡疹病毒、牛呼吸道融合病毒、牛病毒性腹瀉病毒、副流行性感冒病毒，I ，I I或I I I型、細螺旋體屬（Lep tospiia spp)、曲狀桿菌屬（Campylobacter spp·)、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、黴漿菌屬、克雷白氏桿菌屬（Klebsiel 1 a s p p )、沙門氏桿菌屬、輪狀病毒、冠狀病毒、狂犬病病毒、溶血性巴斯德氏桿菌、敗血性出血性巴斯德氏桿菌、梭狀桿菌屬、破傷風類毒素、大腸桿菌、囊蟲種屬（Cryptospor idium spp )、球胞子種屬（Elmeria spp )和新孢子虫屬。