DE69826593T2

DE69826593T2 - Neospora Impfstoff

Info

Publication number: DE69826593T2
Application number: DE69826593T
Authority: DE
Inventors: David Alan East Lyme Brake; Manuel Stonington Campos
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1997-08-26
Filing date: 1998-08-12
Publication date: 2005-02-10
Anticipated expiration: 2018-08-13
Also published as: CA2245425C; US6787146B2; EP1477184A2; ATE277631T1; CA2245425A1; ES2227783T3; US20040223982A1; TW200305433A; EP0898969A2; BR9803232A; NZ331529A; CN1211449A; US20020058046A1; AR016396A1; DE69826593D1; EP0898969A3; EP1477184A3; AU8188498A; JP3049016B2; ZA987662B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff gegen pathogene Protozoen Neospora, wobei der Impfstoff geeignet ist zur Verhütung von klinischen Krankheiten und Abgängen bei Säugern. Der Impfstoff der Erfindung enthält ein Homogenisat, das aus Zellen einer Art von Neospora hergestellt wurde.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Neosporosis bei Säugern wird durch eine Infektion mit einem pathogenem Stamm des Protozoen-Parasiten Neospora verursacht und wurde als Hauptursache von Fehlgeburt, Neugeborenentod, kongenitaler Infektion und Encephalitis erkannt. Dubey und Lindsay, 1996, Vet. Parasitol. 67: 1–59; Dubey und Lindsay, 1993, Parasitol. Today 9: 452–458. Neospora caninum infiziert Hunde und infiziert Welpen kongenital, was oft zu einer Lähmung führt. Tachyzoiten von N. caninum wurden aus natürlich infizierten Welpen isoliert. Lindsay und Dubey, 1989, J. Parasitol. 75: 163–165. Die Infektion mit Neospora ist auch eine Hauptursache von Fehlgeburten bei Milchvieh. Fälle von Neosporosis wurden auch bei Ziegen, Schafen und Pferden berichtet.
Obwohl N. caninum dem pathogen Toxoplasma gondii erstaunlich ähnlich ist, sind N. caninum und T. gondii voneinander unterscheidbar sowohl antigenisch als auch ultrastrukturell. Dubey und Lindsay, 1993, oben. Zusätzlich wurde gezeigt, das Neospora-artige Protozoen-Parasiten, die aus den Gehirnen von abgestoßenen Rinderföten isoliert wurden und in vitro kontinuierlich kultiviert wurden, antigenisch und ultrastrukturell von T. gondii und Hammondia hammondi verschieden sind und N. caninum am ähnlichsten sind. Conrad et al., 1993, Parasitology 106: 239–249. Weiterhin ergab eine Analyse der kleinen Untereinheit von ribosomalen Kern-RNA-Genen keine Nukleotid-Unterschiede zwischen Neospora Stämmen, die aus Vieh und Hunden isoliert wurden, zeigten aber übereinstimmende Unterschiede im Vergleich zu T. gondii, was somit den Unterschied zwischen den Pathogenen bestätigt. Marsh et al., 1995, J. Parasitol. 81: 530–535.
Die etiologische Rolle eines Rinderisolats aus Neospora bei Rinderfehlgeburten und kongenitaler Krankheit wurde bestätigt. Barr et al., 1994, J. Vet. Diag. Invest. 6: 207–215. Ein Nagetiermodell von Neosporosis im zentralen Nervensystem wurde entwickelt unter Verwendung von Inzucht-BALB/c-Mäusen, die mit N. caninum infiziert wurden. Lindsay et al., 1995, J. Parasitol. 81: 313–315. Zusätzlich wurden Modelle zur Untersuchung von der Übertragung von N. caninum über die Plazenta bei trächtigen heterogen gekreuzten Tieren und Inzuchtmäusen von Cole et al., 1995, J. Parasitol. 81: 730–732 bzw. von Long et al., 1996, J. Parasitol. 82: 608–611 beschrieben. Weiterhin wurde ein experimentelles N. caninum Zwergziegenmodell entwickelt, das sehr ähnlich ist der natürlich erworbenen durch Neospora induzierten Fehlgeburt bei Vieh. Lindsay et al., 1995, Am. J. Vet. Res. 56: 1176–1180.
WO 9525541 offenbart eine biologisch reine Kultur von Rinder Neospora, Methoden zum Nachweis von anti-Neospora-Antikörpern und Neospora-spezifischen Nukleinsäuren und eine Zusammensetzung, die ein Neospora-Antigen vom Rind und einen Träger enthält zur Verwendung als Impfstoff.
Parasitology Research 1992, 78: 689–694 offenbart die Charakterisierung von Antigenen, die in hyperimmunem Kaninchenserum entdeckt wurden, das gegen Tachyzoites von NC-1-Isolaten von Neospora caninum erzeugt wurde.
Ein wirksamer Impfstoff gegen Neosporosis mit einem Homogenisat, das aus Zellen von Neospora erzeugt wurde, wurde bisher nicht offenbart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Homogenisat, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann.
In einem zweiten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen Impfstoff, um einen Säuger gegen Neosporosis zu schützen, der eine immunologisch wirksame Menge eines Homogenisats, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei einem Säugetier induzieren kann, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger enthält. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine oder mehrere zusätzliche immunmodulierende Komponenten enthalten, was z. B. ein Adjuvans oder Cytokin einschließt.
In einem dritten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der einen Säuger gegen Neosporosis schützt, das beinhaltet, dass Zellen von Neospora homogenisiert werden unter Bildung eines Homogenisats, das eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei einem Säuger induzieren kann, und eine immunologisch wirksame Menge des Homogenisats mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger in einer Form kombiniert wird, die zur Verabreichung an den Säuger geeignet ist.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann an irgendeine Säugetierart, die für eine Infektion und Krankheit, die durch Neospora verursacht wird, empfänglich ist, verabreicht werden, was Hunde, Kühe, Ziegen, Schafe und Pferde einschließt, ohne darauf beschränkt zu sein.
In einem fünften Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen Kombinationsimpfstoff zum Schutz eines Säugers gegen Neosporosis und ggf. eine oder mehrere andere Krankheiten oder pathologische Zustände, die den Säuger befallen können, wobei der Kombinationsimpfstoff eine immunologisch wirksame Menge einer ersten Zusammensetzung, die ein Homogenisat hergestellt aus Zellen von Neospora enthält, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei einem Säuger induzieren kann; eine immunologisch wirksame Menge einer zweiten Zusammensetzung, die eine schützende Antwort gegen eine Krank heit oder einen pathologischen Zustand, die/der den Säuger befällt, induzieren kann und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger enthält.
Die zweite Zusammensetzung des Kombinationsimpfstoffs wird ausgewählt, basierend auf der Fähigkeit, die schützende Antwort entweder gegen Neosporosis oder eine andere Krankheit oder einen anderen pathologischen Zustand, die/der Mitglieder der Säugetierart befällt, zu induzieren, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Der Kombinationsimpfstoff der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine oder mehrere zusätzlich immunmodulierende Komponenten enthalten, was z. B. ein Adjuvans oder Cytokin u. a. einschließt.
In einem sechsten Aspekt liefert die vorliegende Erfindung einen Kit zum Impfen eines Säugers gegen Neosporosis, der einen ersten Behälter mit einer immunologisch wirksamen Menge eines Homogenisats, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei einem Säugetier induzieren kann, und einen zweiten Behälter mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel, das dazu geeignet ist, mit dem Inhalt des ersten Behälters vermischt zu werden, enthält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Western-Blot-Analyse eines Serums von BALB/c Mäusen vor einem immunologischen Provokationstest. Ein Vollzellhomogenisat von NC-1 Tachyzoiten (das „NSA-Präparat") wurde mit SDS-PAGE fraktioniert und auf eine PVDF-Membran überführt, die dann mit primären Antiserumproben und anschließend mit mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Antimaus-IgG inkubiert wurde und entwickelt wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats BCIP/NBT. Bahnen 1–3 = Serum von Mäusen, denen Adjuvans alleine verabreicht worden war (Kontrolle); Bahnen 4–6 = Serum von Mäusen, denen das NSA-Präparat plus Adjuvans (Impfstoff) verabreicht worden war; Molekulargewichtsstandards angegeben. Serum von immunisierten Mäusen enthält Antikörper, die mit NSA-Präparatproteinen mit Molekulargewichten von etwa 17–19, 28–30, 33, 37, 46, 48 und 56 kD reaktiv sind.
2. Immunfluoreszenz-Antikörper-(IFA)-Titer vor dem Provokationstest (A) und nach dem Provokationstest (B). Serum von Tieren am Tag 21 nach Immunisierung (Tag 0 vor Provokationstest) und Tag 21 nach dem Provokationstest wurde in Näpfe gegeben, die NC-1 Tachyzoiten enthielten. Die Näpfe wurde dann mit (Fab)₂-Fluoreszeinisothiocyanat-konjugiertem Antimaus-IgG + IgM (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD.) inkubiert, gewaschen und mit einem Epifluoreszenzmikroskop untersucht. Der Antikörper-Titer basiert auf der höchsten Verdünnung des Immunserums, das eine nachweisbare Fluoreszenz erzeugt. Die Ergebnisse zeigen höhere mittlere IFA-Antikörper-Titer bei geimpften Tieren vor dem Provokationstest (2A) und signifikant höhere IFA-Antikörper-Titer nach dem Provokationstest (2B) (P < 0,001) im Vergleich zu Kontrollen. Bei 2B mit 10⁶ Beaufschlagung: Kontrolle geometrischer mittlerer Titer (GMT) = 2.691; Impfstoff GMT = 25.600. Bei Beaufschlagung mit 10⁷: Kontrolle GMT = 5.382; Impfstoff GMT = 72.408.
3. Antigen-spezifischer Proliferationstest in der Milz vor Provokation. Am Tag 21 nach Immunisierung wurden Splenozyten von Mäusen, denen Adjuvans alleine (Kontrolle) oder NSA-Präparate plus Adjuvans (Impfstoff) verabreicht worden war, vorbereitet und T-Zell-Proliferationsassays durchgeführt, bei denen Splenozyten in Gegenwart des NSA-Präparats inkubiert wurden und Splenozytenkulten mit [³H]Thymidin pulsweise behandelt wurden, wie unten beschrieben (Beispiel 2). Die Ergebnisse sind ausgedrückt als Δ cpm (mittlere cpm mit NSA minus mittlere cpm mit Medium allein) und zeigen, dass ein Zellhomogenisat von Neospora eine T-Zellpopulation in vivo induzieren kann, die in vitro proliferieren kann nach Stimulierung mit dem NSA-Präparat.
4. Antigenspezifische Cytokinproduktion in Milz im Donor. Am Tag 21 nach Immunisierung wurden Splenozyten von Mäusen, denen Adjuvans alleine (Kontrolle) oder das NSA-Präparat plus Adjuvans (Impfstoff) verabreicht worden war, vorbereitet und der Anteil an Cytokinproduktion bestimt, indem die Splenozyten in Gegenwart des NSA-Präparats inkubiert wurden, die zellfreien Überstände gesammelt wurden und auf spezifische Cytokine untersucht wurde unter Verwendung kommerzieller cytokinspezifischer Antikörper nach den Anleitungen des Herstellers (PharMingen, San Diego, CA.). Die Ergebnisse zeigen, dass ein Zellhomogenisat von Neospora eine T-Zellpopulation in vivo induzieren kann, die sowohl Cytokine Typ 1 (IFN-γ, IL-2) als auch Typ 2 (IL-6, IL-10) in vitro erzeugen kann nach Stimulierung mit NSA-Präparat.
5. Antigenspezifischer Proliferationsassay in Milz nach Provokation. Am Tag 21 nach Provokation wurden Splenozyten von BALB/c-Mäusen, denen Adjuvans alleine (Kontrolle) oder das NSA-Präparat plus Adjuvans (Impfstoff) verabreicht worden war, vorbereitet und T-Zellproliferationsassays durchgeführt, indem Spenozytenkulturen mit [³H]Thymidin pulsartig behandelt wurden, wie unten beschrieben. Nach der Provokation mit 1 × 10⁶ (A) oder 1 × 10⁷ (B) NC-1-Tachyzoiten wurden bei Verwendung von Splenozyten aus geimpften Mäusen signifikant höhere antigenspezifische Antworten (* = P < 0,05; ** = p < 0,01) nachgewiesen als bei Kontrollmäusen (n = 4/Gruppe).
6. Lungen- und Hirnläsionswerte nach Provokation. Schnitte von Lungen- und Hirngewebe am Tag 21 nach der Provokation mit Kontroll- (n = 6) und Impfstoff- (n = 6) BALB/c-Mäusen, die entweder mit 1 × 10⁶ (A, B) oder 1 × 10⁷ (C, D) NC-1-Tachyzoiten beaufschlagt worden waren, wurden vorbereitet und wie unten beschrieben bewertet. Läsionswerte für einzelne Tiere sind angegeben. Die gepunktete Linie zeigt die mittlere Läsionsbewertung für jede Gruppe. Die Ergebnisse zeigen, dass Tiere, die mit einem Zellhomogenisat von Neospora immunisiert wurden, und mit 1 × 10⁷ NC-1 Tachyzoiten beaufschlagt wurden, signifikant niedrigere mittlere Läsionswerte in der Lunge (p < 0,01) und im Gehirn (P < 0,05) haben im Vergleich zu Kontrollen. A. Kontrollmittelwert = 0,5, Impfstoffmittelwert = 0,33. B. Kontrollmittelwert = 1,0, Impfstoffmittelwert = 0,33 C. Kontrollmittelwert = 1,83, Impfstoffmittelwert = 0,67 (P < 0,01). D. Kontrollmittelwert = 1,83, Impfstoffmittelwert = 1,0 (P < 0,05).
7. Überlebenskurven von athymischen Nacktmäusen nach Provokation. Nacktmäuse, die DPBS alleine (keine Splenozyten = „keine Zellen") erhielten; Nacktmäuse, die Splenozyten von BALB/c-Mäusen erhielten, denen Adjuvans alleine („Adjuvans") injiziert worden war; Nacktmäuse, die Splenozyten von BALB/c-Mäusen erhielten, denen das NSA-Präparat plus Adjuvans („Impfstoff") injiziert worden war (n = 6–7 Mäuse/Gruppe). Die Ergebnisse zeigen, dass der Transfer von Zellen von geimpften BALB/c-Mäusen zu Nacktmäusen zu einer adoptiven schützenden Immunität führt, wie durch das verlängerte Überleben und den signifikanten Schutz gegen eine NC-1 virulente Provokation gezeigt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Anmelder haben gefunden, dass ein Homogenisat, das aus Zellen von Neospora hergestellt wird, eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann. Die vorliegende Erfindung liefert somit ein Homogenisat, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Impfstoff, um Säuger gegen Neosporosis zu schützen, der eine immunologisch wirksame Menge eines Homogenisats, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger enthält.
Der Ausdruck „Neosporosis", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Infektion eines Säugers durch Zellen einer Art oder eines Stamms von Neospora oder irgendein klinisches Symptom, einen Zustand, ein Ereignis oder eine Pathologie, die mit einer Infektion des Säugers durch Zellen einer Art oder eines Stamms von Neospora assoziiert ist oder daraus entsteht.
Der Ausdruck „fähig eine schützende Antwort zu induzieren" wird hier breit verwendet, um die Induktion oder Verstärkung irgendeiner immunbasierten Antwort bei dem Tier als Antwort auf die Impfung zu induzieren, einschließlich entweder einer Antikörper- oder Zell-vermittelten Immunantwort oder beides, die dazu dient, das geimpfte Tier gegen Neosporosis zu schützen. Die Ausdrücke „schützende Antwort", „Schutz gegen", „schützen" etc., wie sie hier verwendet werden, beziehen sich nicht nur auf die absolute Verhütung von Neosporosis oder absolute Verhütung einer Infektion durch ein Neosporosis verursachendes Pathogen, sondern auch auf jede nachweisbare Reduktion des Grads oder der Rate an Infektion durch ein solches Pathogen, irgendeine nachweisbare Reduktion des Auftretens von Tod oder irgendeinen nachweisbaren Anstieg der Überlebenszeit nach einer Infektion mit einem virulenten Stamm des Pathogens, jede nachweisbare Reduktion der Schwere der Krankheit oder irgendeines Symptoms oder Zustands, der durch Infektion mit dem Pathogen entsteht, einschließlich z. B. jegliche nachweisbare Reduktion in der Bildungsrate oder der absoluten Anzahl von Läsionen in einem oder mehreren Geweben des geimpften Tiers oder irgendeine nachweisbare Reduktion beim Auftreten von Abgängen oder Fehlgeburten oder der Übertragung von Infektionen von einem Elterntier auf die Nachkommen.
Die Phrase „immunologisch wirksame Menge" bezieht sich auf die Menge oder Dosis des Impfstoffs. Homogenisats, Antigens oder NSA-Präparats, die eine schützende Antwort gegen Neosporosis induzieren kann, wenn sie an ein Mitglied einer Säugetierart verabreicht wird entweder nach einer einzelnen Verabreichung oder nach mehreren Verabreichungen.
Herstellung von Neospora-Antigen
Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, das ein Homogenisat, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann. Die Zellen, die verwendet werden, um das Homogenisat des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung zu erzeugen, können von irgendeinem Stamm oder irgendeiner Art der Gattung Neospora stammen, wobei die Zellen pathogen sein können oder nicht und wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Art von Neospora N. caninum. Ein nicht beschränkendes Beispiel eines Stamms von N. caninum, aus dem ein Homogenisat in geeigneter Weise hergestellt werden kann, ist der Stamm NC-1, der erhältlich ist aus infizierten MARC145 Affennierenzellen von der American Type Culture Collection, in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA (ATCC Hinterlegungs-Nr. CRL-12231), und Stämme beinhaltet, die von NC-1 abgeleitet sind durch eine oder mehrere in vitro und/oder in vivo Passagen. Der Stamm NC-1 wird auch von Dubey et al., 1988, J. Am. Vet. Med. Assoc. 193: 1259–63 beschrieben. Stämme von Neospora zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können alternativ aus Organen, Geweben oder Körperflüssigkeiten von infizierten Tieren isoliert werden unter Verwendung von Standardisolierungstechniken, wie solchen, die in den oben durchgesehen Publikationen beschrieben werden.
In einer nicht beschränkenden Ausführungsform kann der Impfstoff der vorliegenden Erfindung hergestellt werden unter Verwendung eines Homogenisats von Zellen anderer Arten von Neospora, die immunologisch äquivalent zu N. caninum sind, oder unter Verwendung von Homogenisaten von Zellen anderer Stämmen von N. caninum, die immunologisch äquivalent sind zu N. caninum Stamm NC-1. Eine Art von Neospora ist „immunologisch äquivalent" zu N. caninum, wenn ein Homogenisat, das aus den Zellen der immunologisch äquivalenten Art hergestellt wurde, bei einem Säuger die Erzeugung von Antikörpern induzieren kann, die eine oder mehrere antigene Komponenten erkennen können, die in einem Homogenisat von Zellen von N. caninum vorhanden sind, was z. B. mit Western-Blot-Analyse bestimmt wird, und wobei das Homogenisat von Zellen der immunologisch äquivalenten Art eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugern induzieren kann. In gleicher Weise ist ein Stamm von N. caninum „immunologisch äquivalent" zu N. caninum-Stamm NC-1, wenn ein Homogenisat, das aus den Zellen des immunologisch äquivalenten Stamms hergestellt wurde, in einem Säuger die Erzeugung von Antikörpern induzieren kann, die eine oder mehrere antigene Komponenten erkennen, die in einem Homogenisat von Zellen von N. caninum Stamm NC-1 vorhanden sind (siehe 1) und wenn das Homogenisat, das aus den Zellen des immunologisch äquivalenten Stamms hergestellt wurde, eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei Säugetieren induzieren kann.
Zellen von Neospora zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung können direkt und ohne weitere Modifikation verwendet werden. Alternativ können solche Zellen modifiziert werden, z. B. durch genetische Manipulation, um die Expression eines oder mehrerer metabolischer Stoffwechselwege oder Produkte oder von antigenischen Eigenschaften wie z. B. einem speziellen Oberflächenantigen oder Virulenzfaktor zuzufügen, zu erhöhen, zu deletieren oder zu reduzieren oder um in sonstiger Weise die Stoffwechselwege, Produkte oder Eigenschaften zu modifizieren. Solche Stoffwechselwege, Produkte oder Eigenschaften, deren Expression geeigneterweise zugefügt, erhöht oder in sonstiger Weise in den Zellen modifiziert werden kann, sind bevorzugt solche, die dazu dienen, die Induktion einer schützenden Antwort gegen Neosporosis bei einem Säuger, der mit dem entsprechenden Homogenisat geimpft wurde, anzuschalten oder zu verstärken. Zellen von Neospora können z. B. genetisch modifiziert werden, um die Expression einer oder mehrerer antigener Komponenten, die geeignet sind, um die Induktion einer schützenden Antwort anzuschalten oder zu verstärken, zuzufügen oder nachweisbar zu erhöhen. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform werden Zellen von Neospora genetisch modifiziert, um die Expression eines oder mehrere immundominanter Antigene zuzufügen oder nachweisbar zu erhöhen, z. B. solche, die durch SDS-PAGE-Abtrennung und Western-Blot-Analyse des NSA-Präparats sichtbar gemacht werden können, wie unten beschrieben, einschließlich solcher Antigene, die identifiziert wurden als solche mit einem Molekulargewicht ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 17–19, 28–30, 33, 37, 46, 48 und 56 kD.
Alternativ und zusätzlich können Zellen modifiziert werden, um die Expression einer oder mehrerer antigener Komponenten, die normalerweise mit unmodifizierten Zellen von Neospora oder einem daraus hergestellten Homogenisat assoziiert sind, zu deletieren oder nachweisbar zu reduzieren. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform werden Zellen von Neospora genetisch modifiziert, um die Expression einer oder mehrerer antigener Komponenten zu deletieren oder nachweisbar zu reduzieren, wie solchen, die mit SDS-PAGE-Trennung und Western-Blot-Analyse des NSA-Präparats, wie unten beschrieben, sichtbar gemacht werden können und schließen solche antigenischen Komponenten ein, die identifiziert wurden als solche mit einem Molekulargewicht ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 17–19, 28–30, 33, 37, 46, 48 und 56 kD. Auf diese Weise können Impfstoffe hergestellt werden, die „markiert" oder „etikettiert" sind, wodurch es möglich ist, dass Tiere, die geimpft wurde, von solchen unterschieden werden können, die natürlich mit dem Pathogen infiziert wurden.
Methoden, mit denen Protozoenzellen, wie solche von Neospora, genetisch modifiziert werden können, sind allgemein im Stand der Technik bekannt und schließen die Einführung von statistischen Mutationen, z. B. durch Kontakt mit chemischen Mutagenen oder Bestrahlung, gefolgt von einer Selektion eines gewünschten mutanten Phänotyps ein. Alternativ oder zusätzlich können Neospora-Zellen durch gezielte genetische Modifikation modifiziert werden, wie sie mit bekannten Verfahren durchgeführt wird, z. B. durch homologe Rekombination, wie z. B. von Cruz und Beverley, 1990, Nature 348: 171–173; Cruz et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7170–7174; Donald und Roos, 1994, Mol. Biochem. Parasitol. 63: 243–253; und Titus et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 10267–10271 beschrieben. Eine solche genetische Mo difikation liegt im Bereich des Standes der Technik und kann durchgeführt werden unter Verwendung allgemein bekannter rekombinanter Techniken, wie solchen, die z. B. in Maniatis, et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel, et al., 1989, Current Protocols In Molecular Biology, Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y.; und Sambrook, et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. beschrieben wurden.
Zellen von Neospora zur Verwendung für die vorliegende Erfindung können, sobald sie erhalten wurden, in vitro gezüchtet werden, indem irgendeine rezeptive Zelllinie, bevorzugt eine Säuger-Zelllinie, mit Tachyzoites der Art oder des Stamms von Neospora mit bekannten Techniken, die im Stand der Technik beschrieben sind, infiziert wird. Säugerzelllinien, in denen Tachyzoites von Neospora gezüchtet werden können, schließen z. B. humane Vorhautfibroblasten (Lindsay et al., 1993, Am. J. Vet. Res. 54: 103–106), Endothelzellen aus der Herzlungenaorta von Rindern (Marsh et al., 1995, oben), Rindermonozyten (Lindsay und Dubey, 1989, oben), Affennierenzellen u.a. ein. Z. B. können Tachyzoites von N. caninum in Monolayers von Hs68 Human-Vorhautfibroblastenzellen (ATCC Hinterlegungs-Nr. CRL-1635) gezüchtet werden (Lindsay et al., 1993, oben). Bradyzoiten können in gleicher Weise kultiviert und manipuliert werden.
Säugerzellkulturen können gezogen werden und Zellkulturen, die mit Neospora infiziert wurden, können aufrechterhalten werden auf verschiedenen Arten von Kulturmedien, die im Stand der Technik beschrieben werden. Z. B. können stationäre Monolayer-Kulturen von Endothelzellen aus der Herzlungenaorta von Rindern, die mit Tachyzoites von N. caninum infiziert sind, in Dulbecco's Minimal-Essential-Medium gezüchtet werden (DMEM: Gibco Laboratories, N.Y.), das mit 10% (V/V) hitze-inaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) oder Serum von ausgewachsenen Pferden (ES), 2 mM L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin ergänzt ist (Conrad et al., 1993, oben). Monolayers von Hs68 Human-Vorhautfirbroblastenzellen können in RPMI 1640 Medium erhalten werden, das 2% (V/V) FBS, 1,0 mM Natriumpyruvat, 1 × 10⁴ U/ml Penicillin, 1 × 10⁴ μg/ml Streptomycin, 5 × 10^–2 mM 2-Mercaptoethanol und 0,3 mg/ml L-Glutamin (Aufrechterhaltungsmedium) enthält. Monolayer-Kulturen von Hs68 Human-Vorhautfibroblastenzellen, die mit Neospora infiziert sind, können in identischen Medien aufrechterhalten werden, in denen aber das FBS auf 10% (V/V) erhöht wurde (Wachstumsmedium).
Mit Neospora infizierte Monolayer-Kulturen von Säugerzellen werden typischerweise unter Standardgewebekulturbedingungen aufrechterhalten, z. B. bei 37°C und 5% CO₂. Tachyzoites werden typischerweise auf nicht-infizierte Monolayer-Kulturen übertragen, wenn 70–90% der Säugerzellen in der Kultur infiziert worden sind, was mikroskopisch unter Verwendung von Standardtechniken bestimmt werden kann. Tachyzoites können aus infizierten Säugerzellkulturen gesammelt werden, indem die Wirtszellen unter Verwendung von Standardtechnik lysiert und die Tachyzoites gesammelt werden z. B. durch Filtration oder Zentrifugation.
Zellen, die verwendet werden können, um das Zellhomogenisat der Erfindung zu erzeugen, sind bevorzugt Tachyzoites, können aber alternativ Bradyzoites oder Oocysten sein oder irgendeine Kombination davon. Zusätzlich können Zellen zur Verwendung für die vorliegende Erfindung entweder lebensfähige Zellen sein oder Zellen, die vorher inaktiviert wurden, z. B. durch Behandlung mit chemischen inaktivierenden Mitteln, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd u.a. oder durch Behandlung mit Bestrahlung oder durch Kontakt mit extremen pH-Werten oder Temperaturen oder irgendeiner Kombination davon.
Die Produktion des Homogenisats der Erfindung ist nicht auf irgendeine spezielle Methode der Homogenisierung oder der Zerteilung beschränkt. Zellen von Neospora können stattdessen homogenisiert oder aufgerissen werden unter Verwendung irgendeiner Technik, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich Einfrieren/Auftauen, osmotisches Aufbrechen, Vermahlen, Beschallen, Verwendung eines Polytrons, Mischers oder Gewebehomogenisators oder irgendeiner Kombination davon, ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Ausdruck „Homogenisat", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Präparat, das durch Homogenisieren oder Aufbrechen ganzer Zellen von Neospora hergestellt wurde.
Herstellung und Verwendung von Impfstoffen
Die vorliegende Erfindung liefert einen Impfstoff gegen Neosporosis, der eine immunologisch wirksame Menge eines Homogenisat, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis in einem Säuger induzieren kann, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger enthält.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, der einen Säuger gegen Neosporosis schützt, das beinhaltet, dass Zellen von Neospora homogenisiert werden, um ein Homogenisat zu erzeugen, das eine schützende Antwort gegen Neosporosis in einem Säuger induzieren kann, und dass eine immunologisch wirksame Menge des Homogenisats mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger in einer Form, die zur Verabreichung an den Säuger geeignet ist, vereinigt wird.
Der Impfstoff kann einfach ein Zellhomogenisat enthalten, das in der Kultur-Flüssigkeit, die direkt aus einer Neospora-Zellkultur entnommen wurde, hergestellt wurde, das dann direkt an den Säuger verabreicht wird, oder anstatt dessen ein Zellhomogenisat aufweisen, das mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger vereinigt wurde, ausgewählt aus solchen, die im Stand der Technik als geeignet für den Verabreichungsweg bekannt sind. Z. B. kann der Impfstoff der vorliegenden Erfindung formuliert werden nach üblichen Konventionen, indem das Homogenisat oder eine Fraktion davon mit Standardpuffern, Trägern, Stabilisatoren, Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln und/oder Löslichkeitsvermittlern vereinigt wird. Der Impfstoff kann auch formuliert werden, um eine Langzeitwirkung zu erleichtern. Verdünnungsmittel können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Ethanol, Glyzerin und dgl. einschließen. Additive für die Isotonizität können Natriumchlorid, Dextrose, Mannit, Sorbit, Lactose u.a. einschließen. Stabilisatoren können u.a. Albumin einschließen. Geeignete andere Impfstoffträger und Additive sind bekannt oder ergeben sich für den Fachmann auf diesem Gebiet. Siehe z. B. Remington Pharmaceutical Science, 18. Auflage, 1990, Mack Publishing.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine oder mehrere zusätzliche immunmodulierende Komponenten enthalten, wie z. B. ein Adjuvans oder Cytokin. Nicht beschränkende Beispiele für Adjuvantien schließen das RIBI Adjuvans-System (Ribi Inc. Hamilton, MT.) Alaun, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxydgel, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie z. B. Freund's komplettes und inkomplettes Adjuvans, Blockcopolymere (CytRx, Atlanta GA), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA) und SAF-M (Chrion, Emeryville, CA), AMPHIGEN^® Adjuvans, Saponin, Quil A oder andere Saponinfraktionen, Monophosphoryllipid A und Avridin-lipidamin Adjuvans ein. Spezifische nicht beschränkende Beispiele für Öl-in-Wasser-Emulsionen, die für den Impfstoff der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen SEAM62 und SEAM ½ ein, deren Komponenten unten angegeben sind. Andere immunmodulierende Mittel, die in dem Impfstoff enthalten sein können, schließen z. B. ein oder mehrere Interleukine, Interferone oder andere bekannte Cytokine ein. Der Impfstoff kann in Lösung oder alternativ in lyophilisierter Form, die vor der Anwendung mit einer sterilen verdünnten Lösung rekonstituiert wird, aufbewahrt werden.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann ggf. für eine Langzeitwirkung des Antigens formuliert werden. Beispiele für solche Depotpräparate schließen ein Homogenisat in Kombination mit Verbundstoffen von biokompatiblen Polymeren, wie z. B. Poly(Milchsäure), Poly(Milch-co-Glycolsäure), Methylzellulose, Hyaluronsäure, Collagen und dgl. ein. Die Struktur, Auswahl und Verwendung von abbaubaren Polymeren in Wirkstoffabgabeträgern wurde in vielen Publikationen im Überblick dargestellt, einschließlich A. Domb et. al., 1992, Polymers for Advanced Technologies 3: 279–292. Weitere Richtlinien bei der Auswahl und Verwendung von Polymeren in pharmazeutischen Präparaten findet sich in dem Text von M. Chasin und R. Langer (Herausgeber), 1990, „Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems" in Drugs and the Pharmaceutical Sciences, Band 45, M. Dekker. N.Y. Alternativ oder zusätzlich kann das Homogenisat mikroverkapselt werden, um die Verabreichung und Wirksamkeit zu verbessern. Methoden zur Mikroverkapselung von Antigenen sind im Stand der Technik wohl bekannt und schließen Techniken ein, die z. B. in US Patent 3,137,631; US Patent 3,959,457, US Patent 4,205,060; US Patent 4,606,940; US Patent 4,744,933; US Patent 5,123,117 und der internationalen Veröffentlichung WO 95/28227 beschrieben werden.
Liposomen können auch verwendet werden, um für eine Langzeitwirkung des Homogenisats der vorliegenden Erfindung zu sorgen. Details dazu, wie liposomale Präparate herzustellen und zu verwenden sind, finden sich u.a. in US Patent 4,016,100; US Patent 4,452,747; US Patent 4,921,706; US Patent 4,927,637; US Patent 4,944,948; US Patent 5,008,050 und US Patent 5,009,956.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren, um einen Säuger gegen Neosporosis zu schützen, das beinhaltet, dass dem Säuger ein Impfstoff verabreicht wird, der eine immunologisch wirksame Menge eines Homogenisats, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis in einem Säuger induzieren kann, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger enthält.
Der Impfstoff wird bevorzugt parenteral verabreicht, z. B. entweder durch subkutane oder intramuskuläre Injektion. Der Impfstoff kann jedoch statt dessen auch durch intraperitoneale oder intravenöse Injektion oder auf anderen Wegen, einschließlich dem oralen, intranasalen, rektalen, vaginalen, intraokularen Weg oder auch einer Kombination dieser Wege verabreicht werden. Der Fachmann auf diesem Gebiet weiß, wie die Impfstoffzusammensetzung je nach dem ausgewählten Weg zu formulieren ist.
Eine wirksame Dosierung kann mit üblichen Mitteln bestimmt werden, ausgehend von einer geringen Dosis des Homogenisats und dann durch Erhöhung der Dosierung, während die Wirkungen beobachtet werden. Zahlreiche Faktoren können in Betracht gezogen werden, wenn eine optimale Dosis pro Tier bestimmt wird. Zu den primären gehören die Art, die Größe des Tieres, das Alter des Tieres, der allgemeine Zustand des Tieres, die Gegenwart anderer Wirkstoffe in dem Tier, die Virulenz der jeweiligen Art oder des Stammes von Neospora, gegen die das Tier geimpft werden soll und dgl. Die tatsächliche Dosis wird bevorzugt ausgewählt nach Inbetrachtziehung der Ergebnisse von anderen Tierstudien.
Impfprotokolle können ausgewählt werden basierend auf den oben beschriebenen Faktoren. Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann zu jeder Zeit im Leben des jeweiligen Tieres verabreicht werden abhängig von verschiedenen Faktoren einschließlich dem zeitlichen Ablauf beim Ausbrechen von Neosporosis unter anderen Tieren etc. Der Impfstoff kann an Tiere im Stillalter oder jünger oder an reifere Tiere verabreicht werden, z. B. als Vorbrutimpfstoff um gegen eine mit Neosporosis in Beziehung stehende kongenitale Krankheit oder gegen Abgang zu schützen.
Ein wirksamer Schutz kann nur eine primäre Impfung erfordern oder eine oder mehrere Boosterimpfungen können zum vollen Schutz notwendig sein. Eine Methode, um nachzuweisen, ob ein adäquater Immunschutz erreicht worden ist, besteht darin, die Serokonversion und Antikörpertiter bei dem Tier nach der Impfung zu bestimmen. Der zeitliche Ablauf der Impfung und ggf. die Anzahl der Boosterimpfungen werden bevorzugt von einem Tierarzt bestimmt auf Basis der Analyse aller relevanten Faktoren, von denen einige oben beschrieben wurden.
Die Menge an Homogenisat in dem Impfstoff liegt bevorzugt in einem Bereich von etwa 10 bis etwa 1000 μg Protein/ml und bevorzugter etwa 100 bis etwa 500 μg Protein/ml. Eine geeignete Dosierung liegt in einem Bereich von etwa 0,5 ml bis 10,0 ml und bevorzugter etwa 1,0 ml bis etwas 5,0 ml. Allgemein wird auf Basis einer Dosis die Menge an Zellhomogenisat, die an ein Tier verabreicht wird, bevorzugt etwa 10 bis etwa 1000 μg Protein und bevorzugter etwa 100 bis etwa 500 μg Protein sein.
Der Impfstoff der vorliegenden Erfindung ist nützlich, um Säugetiere gegen Infektion und/oder Erkrankung, die von Neospora verursacht wird, zu schützen. Der Ausdruck „Säuger", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf irgendeine Säugetierart, die gegen Neosporosis geschützt werden kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Impfstoffs, was u.a. Hunde, Kühe, Ziegen, Schafen und Pferde einschließt. Der Impfstoff ist geeignet, um sowohl trächtige als auch nicht trächtige Säuger zu schützen.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Kombinationsimpfstoff, um einen Säuger gegen Neosporosis und ggf. eine oder mehrere weitere Krankheiten oder pathologische Zustände, die den Säuger befallen können, zu schützen wobei der Kombinationsimpfstoff eine immunologisch wirksame Menge einer ersten Zusammensetzung mit einem Homogenisat, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis in einem Säuger induzieren kann; eine immunologisch wirksame Menge einer zweiten Zusammensetzung, die eine schützende Antwort gegen eine Krankheit oder einen pathologischen Zustand, der den Säuger befallen kann, induzieren kann, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger enthält, wie oben beschrieben.
Die zweite Zusammensetzung des Kombinationsimpfstoffs wird ausgewählt auf Basis der Fähigkeit, eine schützende Antwort entweder gegen Neosporosis oder eine andere Krankheit oder einen anderen pathologischen Zustand, der Mitglieder der Säugetierart befällt, zu induzieren, wie es im Stand der Technik bekannt ist. Jede immunogene Zusammensetzung, von der bekannt ist, dass sie in einer Impfstoffzusammensetzung für eine spezielle Säugetierart geeignet ist, kann in der zweiten Zusammensetzung des Kombinationsimpfstoffs verwendet werden. Solche immunogenen Zusammensetzungen schließen solche ein, die Schutz gegen Pathogene liefern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rinderherpesvirus (infektiöse Rinderrhinotracheitis), Respiratory syncytial Virus bei Rind, Rindervirusdiarrhövirus, Parainfluerizavirus Typen I, II oder III, Leptospira spp., Camylobacter spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Rotavirus, Coronavirus, Rabies, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Clostridia spp., Tetanus toxoid, E. coli, Cryptosporidium spp., Eimeria spp. und andere eukaryotische Parasiten, ohne darauf beschränkt zu sein.
Der Kombinationsimpfstoff der vorliegenden Erfindung kann weiterhin eine oder mehrere zusätzliche immunmodulierende Komponenten enthalten, was ein Adjuvans oder Cytokin einschließt, und kann ggf. für Langzeitwirkung formuliert werden oder in lyophilisierter Form aufbewahrt werden oder beides, wie oben beschrieben.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin einen Kit, um einen Säuger gegen Neosporosis zu impfen, der einen ersten Behälter mit einem Impfstoff aufweist, der eine immunologisch wirksame Menge eines Homogenisats enthält, das aus Zellen von Neospora hergestellt wurde, wobei das Homogenisat eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei einem Säuger induzieren kann, und einen zweiten Behälter mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel, der/das geeignet ist, um mit dem Inhalt des ersten Behälters vermischt zu werden. Der Impfstoff kann in lyophilisierter Form aufbewahrt werden, um durch Zugabe des Trägers oder Verdünnungsmittels rekonstituiert zu werden.
Anti-Neospora-Antikörper
Die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die an eine oder mehrere Neospora-spezifische antigene Komponenten binden, fällt in den Schutzbereich der Erfindung. Solche Antikörper können für irgendeine der antigenen Komponenten, die mit Neospora-Zellen oder einem daraus hergestellten Homogenisat assoziiert sind, spezifisch sein. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform können Antikörper gegen eine oder mehrere antigene Komponenten gezüchtet werden, die in dem Western-Blot von
1 sichtbar gemacht wurden, einschließlich solcher antigener Komponenten, die als solche identifiziert wurden, die ein Molekulargewicht haben ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus etwa 17–19, 28–30, 33, 37, 46, 48 und 56 kD. Solche Antikörper können als Reagenzien für die Differentialdiagnose von Neosporosis nützlich sein z. B. zum Nachweis von Neospora-spezifischen Antigenen in histologischen Schnitten oder in Zell-, Gewebe- oder Flüssigkeitsproben eines Tiers, wie z. B. in ELISA- oder Western-Blot-Assays, oder um die Menge an Antigen in dem Impfstoffpräparat quantitativ zu bestimmen.
Antikörper können jede der antigenen Komponenten, die in einem Homogenisat von Neospora-Zellen vorhanden sind, gezüchtet werden, wie solchen, in dem unten beschriebenen NSA-Präparat. Verschiedene Wirtstiere einschließlich Kühe, Pferde, Kaninchen, Ziegen, Schafe und Mäuse, ohne darauf beschränkt zu sein, können gemäß bekannten immunologischen Techniken verwendet werden, um Antikörper gegen eine oder mehrere Neospora-spezifische antigene Komponenten zu erzeugen. Verschiedene Adjuvantien, wie solche, die oben beschrieben wurden, können verwendet werden, um die immunologische Antwort zu erhöhen, um die Antikörperproduktion zu verstärken.
Polyklonale Antikörper können aus immunisierten Tieren erhalten werden und auf ihre Spezifität gegen Neospora-spezifische antigene Komponenten getestet werden unter Verwendung von Standardtechniken. Alternativ können monoklonale Antikörper gegen Neospora-spezifische antigene Komponenten hergestellt werden unter Verwendung jeder Technik, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur ermöglicht. Dies schließt die Hybrdomatechnik ein, die ursprünglich von Köhler und Milstein beschrieben wurde (Nature, 1975, 256: 495–497); die Human B-Zell-Hybridomatechnik (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026–2030) und die EBV-Hybridomatechnik (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapo, Alan R. Liss, Inc., Seiten 75–96), ohne darauf beschränkt zu sein. Alternativ können Techniken, die zur Herstellung von Einzelkettenantikörpern beschrieben wurden (siehe z. B. US Patent 4,946,778) angepasst werden, um Neospora antigenspezifische Einzelkettenantikörper herzustellen.
Antikörperfragmente, die spezifische Bindungsstellen für eine Neospora-spezifische antigene Komponente aufweisen, sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst und können mit bekannten Techniken erzeugt werden. Solche Fragmente schließen F(ab')₂-Fragmente, die durch Pepsinverdau eines intakten Antikörpermoleküls erzeugt werden können, und Fab-Fragmente, die durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')₂-Fragmente erzeugt werden können, ein. Alternativ können Fab-Expressionsbibliotheken konstruiert werden (Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281), die eine schnelle Identifizierung von Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein Neospora-spezifisches Antigen zulassen.
Die Antikörper und Antikörperfragmente der vorliegenden Erfindung können weiterhin eine nachweisbar Markierung aufweisen, z. B. eine fluoreszierende Markierung, eine radioaktive Markierung oder ein Enzym, wie es im Stand der Technik bekannt ist, um den Nachweis spezifisch gebundener Antikörper in irgendeinem der vorher erwähnten diagnostischen Assays zu fördern.
Techniken zur Herstellung und Verwendung von monoklonalen Antikörpern und Antikörperfragmenten sind im Stand der Technik wohl bekannt und werden außerdem u.a. in Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory und in J. W. Goding, 1986, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, London, beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden angegeben, um die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung weiter zu erläutern, nicht aber um sie zu beschränken.
Beispiel 1: Herstellung von Neospora Impfstoff
Erhaltung von Neospora Kulturen
Tachyzoites des NC-1 Stammes von N. caninum wurden in MARC-145 Affennierenzellenmonolayers (USDA, ARS, Clay Center, NE) in Gewebekulturkolben bei 37°C und 5% CO₂ in Opti-MEM^TM-Medium (Gibco BRL), das 1% (V/V) FBS, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 2 mM Glutamin enthielt, aufrechterhalten. Tachyzoites wurden aus infizierten Zellkulturen geerntet, wenn etwa 60–90% der MARC-145 Wirtszellen lysiert waren, was durch mikroskopische Untersuchungen der Monolayers auf zytopathische Effekte bestimmt wurde. Verbleibende infizierte Zellen, die intrazelluläre Tachyzoites enthielten, wurden abgekratzt unter Verwendung eines Zellkratzers und mit dem Kulturmedium vermischt, das freie, extrazelluläre Tachyzoites enthielt. Das Präparat (infizierte Zellen plus freie Tachyzoites) wurde zentrifugiert (1.876 × g, 10 Minuten, 4°C) und das Pellet wurde wieder in 5 ml Hanks ausgeglichener Salzlösung (HBSS) (Gibco BRL) suspendiert. Die Suspension wurde fünfmal durch eine Nadel Größe 22 geleitet, wie vorher zentrifugiert, wieder in 5 ml HBSS suspendiert und fünfmal durch eine Nadel Größe 28 geleitet. Das Material wurde wie vorher zentrifugiert und das Pellet in 5 ml HBSS resuspendiert und gefolgt von einer Passage durch ein steriles 5 μm Filter, um Wirtszellbruchstücke zu entfernen. Das Material wurde wie vorher zentrifugiert, das Parasitenpellet, das freie Tachyzoiten enthielt, wurde in HBSS resuspendiert, die Gesamtanzahl lebensfähiger Tachyzoiten wurde bestimmt unter Verwendung eines Hämacytometers und von Trypanblau.
Herstellung von Homogenisat (Neospora Antigen)
Lebensfähige Tachyzoiten, die wie oben beschrieben hergestellt worden waren, wurden auf eine Zelldichte von 2 × 10⁸/ml in Dulbecco's phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) eingestellt. Pro 1 ml Tachyzoitensuspension wurden jeweils 5 μl Protease-Inhibitor-Vorratslösungen A und B zugegeben. Protease-Inhibitor-Vorratslösung A enthält 1 ml EDTA Lösung (hergestellt indem 1,46 gm EDTA zu 5 ml H₂O zugegeben werden) und 4 ml H₂O. Die Protease-Inhibitor-Vorratslösung B enthält 1 ml NEM (N-Ethylmaleimid)-Lösung (hergestellt, indem 312 mg NEM (Sigma Chemical Co.) zu 2,5 ml Ethanol zugegeben werden), 1 ml Pepstatinlösung (hergestellt, indem 3,43 mg Pepstatin (Sigma) zu 5 ml Ethanol zugegeben werden), 3 ml PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)-Lösung (hergestellt, indem 291 mg PMSF (Sigma) zu 5 ml Ethanol zugegeben werden) und 1 ml TPCK (N-Tosyl-L-Phenylalaninchloromethylketon)-Lösung (hergestellt, indem 176 mg TPCK (Sigma) zu 5 ml Ethanol zugegeben werden).
Das Tachyzoitenpräparat wurde dreimal eingefroren (–20°C) und aufgetaut (Raumtemperatur) und dann mit 3 Zyklen auf Eis beschallt (Branson Sonifer 250, Branson Inc.) mit einer konstanten Ausgangsleistung (4 Minuten/Zyklus). Das entstehende Homogenisat wurde als Neospora-Antigen (NSA)-Präparat bezeichnet. Die Proteinkonzentration des NSA-Präparats wurde bestimmt unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Tests (Pierce BCA). Aliquots des NSA-Präparats wurden erstellt und bei –20° C oder –70°C aufbewahrt bis zur weiteren Verwendung in einem Impfstoff oder für in vitro Assays (z. B. Western Blot, Zellproliferation). Das NSA-Präparat enthielt keine lebensfähigen Tachyzoiten, wie durch einen Mangel an in vitro Wachstum im MARC-145 Zellen bestimmt wurde, und die Unfähigkeit, immundefiziente Nacktmäuse zu töten.
Impfstoffformulierung
Der hier getestete Impfstoff enthielt das oben hergestellte NSA-Präparat und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Hilfsstoff. Ein bis zwei unterschiedliche Adjuvantien, entweder SEAM62 oder SEAM 1/2 wurden als Adjuvans verwendet. SEAM62 ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die 5% (V/V) Squalen (Sigma), 1% (V/V) SPAN^®85 Detergens (ICI Surfactants), 0,7% (V/V) TWEEN^®80 Detergens (ICI Surfactants), 2,5% (V/V) Ethanol, 200 μg/ml Quil A, 100 μg/ml Cholesterin, 0,5% (V/V) Lecithin und 0,01% Thimerosal (Sigma) enthält. SEAM ½ ist eine Öl-in-Wasser-Emulsion, die 5% (V/V) Squalen, 1% (V/V) SPAN^®85 Detergens, 0,7% (V/V) Tween 80 Detergens, 2,5% (V/V) Ethanol, 100 μg/ml Quil A, 50 μg/ml Cholesterin und 0,01% Thimerosal enthält.
Impfstoffe wurden hergestellt, indem gleiche Volumina NSA-Präparat und Adjuvans zugegeben wurden (SEAM62 oder SEAM1/2) gefolgt von vorsichtigem Vermischen und wurden für primäre und Boostimpfungen bei 4°C aufbewahrt. Die fertige Impfstoffproteinkonzentration in beiden Versuchen war 250 μg NSA-Protein/ml. Kontrollimpfstoffe enthielten nur Adjuvans (SEAM62 in Beispiel 2 unten; SEAM1/2 in Beispiel 3 unten).
Beispiel 2: Immunisierung und
Provokationstest bei immunkompetenten Mäusen
Der Zweck dieser zweiteiligen Studie war es, die Fähigkeit eines Homogenisats von Neospora-Zellen, in diesem Fall Tachyzoites vom N. caninum-Stamm NC-1, zu zeigen, um eine schützende Immunantwort in immunkompetenten Mäusen zu induzieren.
Im ersten Teil der Studie wurden 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (n = 10/Gruppe) am Tag 0 und wieder am Tag 21 immunisiert entweder mit SEAM62 Adjuvans alleine (Kontrolle) oder dem NSA-Präparat plus SEAM62 Adjuvans (Impfstoff). 15 Tage nach der letzten Immunisierung wurden einzelne Serumproben statistisch von 3 Mäusen pro Gruppe gesammelt und bei –20° C zur Analyse auf parasitenspezifische Antikörper mit Western-Blot aufbewahrt (1). Die Western-Blot-Analyse nach Immunisierung wurde wie folgt durchgeführt. Das NSA-Präparat wurde neben Molekulargewichtsmarkern (Novex, San Diego, CA.) unter nichtreduzierenden Standardbedingungen mit präparativer Gelelektrophorese (SDS-PAGE) fraktioniert unter Verwendung von vorgegossenen 12% Natriumdodecysulfatpolyacrylamidgelen (Novex). Nach Elektrophorese wurden abgetrennte Proteine auf PVDF-Membran (Minipore, Bedford, MA) überführt, die Membran dann mit Waschpuffer (phophatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5)/0,5% Tween 20 Detergens) gespült, luftgetrocknet und einzelne Membranstreifen herausgeschnitten (ungefähr 8 μg NSA-Protein/Streifen). Die Streifen wurden über Nacht bei Raumtemperatur im Blockierungspuffer inkubiert (Waschpuffer, der 5% Magermilch enthält). Nach 2 kurzen Waschungen wurden die Streifen eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wobei primäre Antiserumproben (Verdünnung 1 : 200 in Waschpuffer), die 15 Tage nach der letzten Immunisierung entweder aus 3 einzelnen Adjuvanskontrollmäusen (1, Bahnen 1–3) oder drei geimpften Mäusen (1, Bahnen 4–6) erhalten wurden. Nach zweimaligem Spülen mit Waschpuffer wurden die Streifen mit mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-IgG (Kirkegaard & Perry) (Verdünnung 1 : 10.000 in Waschpuffer) eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, zweimal mit Waschpuffer gespült und immunoreaktive Proteine nachgewiesen unter Verwendung des chromogenen Substrats BCIP/NBT (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat/Nitroblautetrazolium) (Kirkegaard & Perry).
Wie in dem Western-Blot in 1 gezeigt, waren Serumantikörper aus 3 Mäusen, die mit dem NSA-Präparat plus Adjuvans immunisiert worden waren (Bahnen 4–6), reaktiv mit NSA-Präparat-Proteinen mit Molekulargewichten von etwa 17–19, 28–30, 33, 37, 46, 48 und 56 kD. Die Imunreaktivitätsprofile der Serumproben aus den drei Mäusen, die mit NSA-Präparat plus Adjuvans immunisiert worden waren, waren im wesentlich identisch zueinander und aufgrund der Verabreichung von NSA-Präparat, da keine NSAspezifischen Antikörper in Kontrollmäusen, denen Adjuvans alleine verabreicht worden war, nachgewiesen wurden (Bahnen 1–3).
In dem zweiten Teil der Studie wurden vier Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (n = 16/Gruppe) an den Tagen 0 und 14 entweder mit NSA-Präparat plus SEAM1/2 Adjuvans (Impfstoff) oder mit SEAM1/2 Adjuvans allein (Kontrolle) immunisiert. 7 Tage nach der letzten Immunisierung wurden vier Donormäuse statistisch aus jeder Gruppe ausgewählt. Serum wurde von jeder Maus gesammelt, gepoolt und bei –20° C bis zum Testen durch Immunfluoreszenz aufbewahrt. Splenozyten aus den Donorgruppen wurden dann unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Kurz gesagt wurden gepoolte Milzorgane aus jeder Gruppe zerstört unter Verwendung von Gewebemaschensieben, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten und Erythrozyten wurden mit Tris-gepuffertem 0,83% NH₄Cl lysiert. Nach Zählung der lebenden Zellen wurden Aliquots aus jeden der zwei gepoolten Splenozytenpräparate (Impfstoff, Kontrolle) verwendet für eine antigen-spezifische Lymphozytenpoliferation und Cytokinassays vor dem Provokationstest, wie unten beschrieben. Verbleibende gepoolte Splenozyten wurden für adoptiven Transfer in T-Zell-defiziente athymische Mäuse verwendet (siehe Beispiel 3, unten). Verbleibende Mäuse wurden in vier Gruppen (n = 6/Gruppe) für den nachfolgenden Provokationstest aufgeteilt.
Am Tag 22 nach Immunisierung wurden den Gruppen (n = 6/Gruppe) von BALB/c-Mäusen das NSA-Präparat plus SEAM1/2 Adjuvans oder das SEAM1/2 Adjuvans alleine verabreicht und sie wurden entweder mit 1 × 10⁶ oder 1 × 10⁷ NC-1 Tachyzoiten subkutant beaufschlagt. 3 Wochen nach dem Provokationstest wurden einzelne Serumproben von Mäusen gesammelt, die Mäuse wurden getötet und Gewebe (Milz, Lunge und Gehirn) für nachfolgende Aufarbeitung und die unten beschriebenen Tests gesammelt.
Immunfluoreszenzantikörper-(IFA)-Titerassays vor und nach dem Provokationstest wurden wie folgt durchgeführt. Lebensfähige NC-1 Tachyzoiten (5 × 10⁴) wurden in jeden Napf einer 96 Napfflachbodenplatte gegeben. Die Näpfe wurden luftgetrocknet und die Platten wurden bis zur Verwendung bei –20° C aufbewahrt. Serumtestproben, die am Tag 21 nach der Immunisierung (Tag 0 Provokationstest) und am Tag 21 nach Provokationstest gesammelt wurden, wurden auf IFA-Titer getestet. Beginnend mit einer Anfangsserumverdünnung von 1 : 50 wurden zweifache Serienverdünnungen in die Näpfe gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach zweimal Waschen in Carbonatspülpuffer wurden die Näpfe mit (Fab)₂-Fluorescein-isothiocyanat-konjugiertem Anti-Maus-IgG + IgM (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und 50 μl 50% Glyzerin, das mit Spülpuffer verdünnt war, wurden in jeden Napf gegeben. Die Platten wurden bei 4° C aufbewahrt, bis sie unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet wurden, das mit einem Emissionsfilter mit 510 nm ausgestattet war. Die Antikörpertiter basierten auf der höchsten Verdünnung des Immunserums mit nachweisbarer Fluoreszenz.
Basierend auf den Ergebnissen der IFA-Titerassays kann der Impfstoff der Erfindung eine humorale Immunantwort induzieren, was zur Erzeugung von Antikörpern führt, die gegen Gesamttachyzoiten reaktiv sind (2). Der mittlere IFA-Titer von vier statistisch gepoolten Serumproben von Mäusen, die mit Impfstoff immunisiert wurden, war > 25.000 verglichen mit einem mittleren Titer von < 50 unter Verwendung von gepoolten Seren von Kontrollmäusen. Das geometrische Mittel der Titer nach Provokationstest war signifikant höher bei geimpften Tieren als in Kontrollen (P < 0,001) und höher als die Titer vor Provokationstest, was zeigt, das der Impfstoff eine Memoryimmunantwort bei geimpften Tieren induzierte, die bei nachfolgendem Kontakt mit Parasiten geboostert wurde.
Die Fähigkeit des NSA-Präparats, eine zelluläre (T-Zell) Immunantwort zu induzieren, wurde wie folgt bestimmt. 7 Tage nach der letzten Immunisierung wurden Mäuse, denen nur Adjuvans (Kontrolle) und Mäuse, denen NSA-Präparat plus Adjuvans (Impfstoff) injiziert worden war, getötet und ihre Milzorgane entfernt. Gepoolte Milzorgane (4 pro Gruppe) wurden aufgerissen unter Verwendung von Gewebemaschensieben, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten gefolgt von einer Lyse der Erythrozyten in Tris-gepuffertem 0,83% NH₄Cl. Nach Zählen der lebensfähigen Zellen wurden die Zellen in komplettem RPMI 1640 Medium, das 10% hitzeinaktiviertes FBS, Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml), 5 × 10^–5M β-Mercaptoethanol, 2 mM L-Glutamin, 5 μg/ml Insulin, 10 μg/ml Transferin und 10 μg/ml Selen enthielt, suspendiert. Für Proliferationsassays wurden Zellen auf 96 Napfflachbodenplatten mit 5 × 10⁵ Zellen pro Napf plattiert. Die Zellen wurden mit komplettem Medium mit oder ohne fünffache Reihenverdünnung des NSA-Präparats inkubiert ausgehend von 10 μg NSA-Protein/ml in Vierfachansätzen in einem Endvolumen von 200 μl. Die Platten wurden bei 37°C in 7% CO₂ 72 Stunden lang inkubiert. Die Proliferation der T-Lymphozyten wurde beurteilt durch Pulsen der Splenozytenkulturen mit 0,33 μCi [³H]Thymidin für weitere. 18–24 Stunden. Die Zellen wurden auf Filtern geerntet unter Verwendung einer MACHIII Zellerntevorrichtung (TomTech, Orange, CT.) und der Einbau von Radioaktivität wurde bestimmt mit einem Scintillationszähler (Wallac, Turku, Finnland). Die Ergebnisse sind ausgedrückt in 3 als Δcpm (mittlere cpm mit NSA minus mittlere cpm mit Medium allein).
Splenozyten aus geimpften Mäusen, nicht aber aus Kontrollmäusen proliferierten in vitro nach Stimulation mit dem NSA-Präparat. Diese in vitro Zellproliferationstestergebnisse zeigen, dass der Impfstoff der vorliegenden Erfindung eine zelluläre (T-Zell) Immunantwort induzieren kann.
Für Cytokinassays wurden Zellen in 96 Napfflachbodenplatten mit 5 × 10⁵ Zellen pro Napf plattiert. Die Zellen wurden mit komplettem Medium mit oder ohne das NSA-Präparat (10 μg NSA-Protein/ml Endkonzentration) in vierfachen Ansätzen in einem Endvolumen von 200 μl inkubiert. Die Platten wurden bei 37°C in 7% CO, inkubiert und zellfreie Überständen in Intervallen von 24 Stunden vier Tage lang gesammelt und bei –20°C bis zum Test aufbewahrt. Die Gegenwart von spezifischen Cytokinen in gesammelten Proben wurde mit einem zweibindigen Immunosorbentassay (ELISA) unter Verwendung einer Gruppe von im Handel erhältlichen cytokin-spezifischen unkonjugierten und konjugierten Antikörpern, rekombinanten Cytokinstandards und Protokollen, die vom Hersteller vorgeschlagen wurden (PharMingen, San Diego, CA.), bestimmt. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als pg/ml, wobei der Hintergrund an Cytokinaktivität in den Näpfen mit Zellen, die ohne NSA inkubiert worden waren, abgezogen wurde.
Die antigenspezifische Cytokinproduktion in der Milz durch Donoren vor dem Provokationstest ist in 4 gezeigt, was zeigt, dass der Impfstoff der vorliegenden Erfindung nach Immunisierung sowohl eine zelluläre Immunantwort vom Typ 1 (IFN-γ, IL-2) als auch vom Typ 2 (IL-6, IL-10) induzieren kann. Die Induktion von IFN-γ ist besonders bemerkenswert, da kürzlich gezeigt wurde, dass dieses Cytokin eine schützende Rolle gegen Maus-Neosporosis spielt (Khan et al., 1997, Experimental Parasitology, 85: 24–34). Außerdem scheint IFN-γ erforderlich zu sein für einen Schutz des Wirts gegen den verwandten Apicomplexa Parasiten T. gondii (Suzuki et al., 1988, Science 240: 516–518). Die Induktion von INF-γ durch den Impfstoff der vorliegenden Erfindung kann auch an der Fähigkeit des Impfstoffs, immunkompetente Mäuse zu schützen, beteiligt sein, ebenso wie an der Fähigkeit, Memory-T-Zellen zu induzieren, die IFN-γ nach adoptivem Transfer solcher Zellen in immundefiziente athymische Mäuse ausscheiden können, wie in Beispiel 3 unten beschrieben. Die Fähigkeit des abgetöteten Impfstoffs, IL-6 und IL-10 zu induzieren, kann auch wichtig sein für die Fähigkeit des Impfstoffs gegen Neosporosis zu schützen, da gezeigt wurde, dass beide Cytokine eine wichtige Rolle bei dem Schutz des Wirts gegen T. gondii spielen (Suzuki et al., 1997, Infect. Immun. 65: 2339–2345; Neyer et al., 1997, Infect. Immun., 65: 1675–1682).
Die Fähigkeit des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung, eine zelluläre (T-Zell) Immunantwort zu induzieren, wurde weiter untersucht, indem die antigenspezifische Proliferation in der Milz 21 Tage nach Provokationstest untersucht wurde, wie oben für Mäuse 21 Tage nach der Immunisierung beschrieben. Wie in 5 gezeigt, waren die T-Lymphozytenantworten auf das NSA-Präparat nach Provokationstest entweder mit 1 × 10⁶ oder 1 × 10⁷ NC-1 Tachyzoiten bei geimpften Tieren wesentlich höher (P < 0,01, P < 0,05) als bei Kontrollen.
Die Fähigkeit des Impfstoffs der vorliegenden Erfindung, Tiere gegen Neospora-induzierte Encphalitis zu schützen, wurde untersucht, indem die Anzahl der Läsionen in Lungen- und Hirngewebeschnitten nach Infektion von geimpften und Kontrollmäusen mit zwei verschiedenen Provokationsdosen gemessen wurde. 21 Tage nach der Herausforderungsimpfung wurden Lungen- und Gehirngewebe einzeln gesammelt (6/Gruppe) und in 10% neutralem gepufferten Formalin fixiert, geschnitten und mit Hematoxylin und Eosin gefärbt unter Verwendung von histologischen Routinetechniken. Gefärbte Lungen- und Gehirnschnitte wurden kodiert und in einem Blindversuch bewertet ohne vorherige Kenntnis von der Behandlung. Lungen- und Hirnläsionen wurden mit dem folgenden System bewertet: (0) innerhalb der normalen Grenzwerte, (1) leicht, (2) mild, (3) mäßig, (4) schwer und (5) markant.
Die Bewertungen für Hirn- und Lungenläsionen nach dem Herausforderungstest von BALB/c-Mäusen sind in 6(a–d), präsentiert, was zeigt, dass Tiere, die mit dem Impfstoff der vorliegenden Erfindung immunisiert wurden, im Mittel erheblich weniger Lungen-(p < 0,01) und Hirn-(P < 0,05)-Läsionen haben als Kontrollen nach einem Herausforderungstest mit Parasiten mit 1 × 10⁷ NC-1 Tachyzoiten. Zusätzlich sind die Bewertungen für mittlere Hirn- und Lungenläsionen numerisch höher bei Kontrollmäusen im Vergleich zu geimpften Mäusen nach Beaufschlagung mit Parasiten mit 1 × 10⁶ NC-1 Tachyzoiten. Der Mangel an statistisch signifikantem Unterschied bei den Läsionsbewertungen zwischen geimpften und Kontrollmäusen bei einer Herausforderungsdosis von 1 × 10⁶ kann einer Ausreißermaus in der Impfgruppe zugeschrieben werden, die sowohl eine Lungen- und als Hirnbewertung von 2 hatte.
Beispiel 3: Herausforderungstest an Immundefizienten Mäusen nach adoptiven Transfer von Splenozyten
Der Zweck dieser Untersuchung war zu bestimmen, ob Milzlymphozyten aus geimpften immunkompetenten Mäusen verwendet werden könnten, um adoptiv auf T-Zell immundefiziente athymische Mäuse (nu/nu oder „Nackt"-Mäuse, Charles River Labs) Schutz zu übertragen, was durch eine Verlängerung des Überlebens nach einem virulenten NC-1-Herausforderungstest gezeigt wird.
Jede Nacktmaus (n = 7/Gruppe) erhielt eine intravenöse Injektion von 1 × 10⁷ Splenozyten (in 0,1 ml DPBS), die entweder von geimpften oder mit Adjuvans behandelten BALB/c-Mäusen als Kontrolle 7 Tage nach der letzten Immunisierung erhalten wurden. Kontroll-nu/nu-Mäuse erhielten nur DPBS (0,1 ml). Am Tag 22 (24 Stunden nach Transfer) wurden alle Nacktmäuse subkutan mit 5 × 10⁶ NC-1 Tachyzoiten beaufschlagt. Die provozierten Nacktmäuse wurden auf klinische Zeichen von Neosporosis und Tod überwacht beginnend am Tag 14 nach dem Provokationstest.
Die Überlebenskurven der athymischen Nacktmäusen nach dem Provokationstest sind in 7 dargestellt. Nacktmäuse, die DPBS allein erhielten (keine Splenozyten = „keine Zellen") waren höchst empfänglich für eine Beaufschlagung mit NC-1 Tachyzoiten. Am Tag 21 nach Provokationstest überlebte keine der Mäuse in dieser Gruppe. Nacktmäuse, die Splenozyten von BALB/c-Mäusen erhielten, denen entweder NSA-Präparat plus Adjuvans oder Adjuvans allein injiziert worden war, lebten länger. 80% der Nacktmäuse, die Splenozyten aus BALB/c-Mäusen erhielten, denen Adjuvans alleine injiziert worden war, überlebten schließlich ihre Infektion und nur eine Maus in dieser Gruppe lebte am Ende des Versuchs (Tag 48 nach Provokationstest). Im Gegensatz dazu überlebten 100% der Nacktmäuse, die Splenozyten von BALB/c-Mäusen erhalten hatten, denen das NSA-Präparat plus Adjuvans injiziert worden war, die Parasitenbeaufschlagung über den gesamten Versuchszeitraum. Diese Ergebnisse zeigen, dass Splenozyten aus geimpften Donatoren adoptive schützende Immunität gegen Neosporosis beitragen können und liefern einen weiteren Hinweis für die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Impfstoffs.

Claims

Homogenisat, hergestellt durch Homogenisieren oder Aufreißen ganzer Zellen von Neospora, das eine schützende Antwort gegen Neosporosis in einem Säugetier hervorrufen kann.
Homogenisat nach Anspruch 1, wobei die Art von Neospora, aus der das Homogenisat hergestellt wird, N. caninum ist.
Homogenisat nach Anspruch 1, das die Erzeugung von Antikörpern induzieren kann, die eine oder mehrere antigene Komponenten erkennen, die in einem Homogenisat von Zellen von N. caninum Stamm NC-1 vorhanden sind.
Homogenisat nach Anspruch 3, wobei die Neospora-Art, aus der das Homogenisat hergestellt wird, N. caninum ist.
Homogenisat nach Anspruch 4, wobei der Stamm von N. caninum, aus dem das Homogenisat hergestellt wird, NC-1 ist.
Homogenisat nach Anspruch 1, das aus Tachyzoites hergestellt wird.
Impfstoff, um ein Säugetier gegen Neosporosis zu schützen, enthaltend eine immunologisch wirksame Menge eines Homogenisats, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger.
Impfstoff nach Anspruch 7, der weiterhin eine oder mehrere zusätzliche immunmodulierende Komponenten enthält.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die zusätzliche immunmodulierende Komponente ein Adjuvans ist.
Impfstoff nach Anspruch 9, wobei das Adjuvans ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem RIBI-Adjuvanssystem (RIBI Inc.), Alaun, Aluminiumhydroxidgel, einer Öl-in-Wasser-Emulsion, einer Wasser-in-Öl-Emulsion, einem Blockcopolymer, QS-21, SAF-M, Amphigen^®-Adjuvans, Saponin, Quil A, Monophosphoryllipid A und Avridin-Lipidaminadjuvans.
Impfstoff nach Anspruch 10, wobei das Adjuvans eine Öl-in-Wasser-Emulsion ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEAM 62 und SEAM 1/2.
Impfstoff nach Anspruch 8, wobei die zusätzliche immunmodulierende Komponente ein Zytokin ist.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, wie in Anspruch 7 definiert, das beinhaltet, dass Zellen von Neospora homogenisiert werden, um ein Homogenisat zu erzeugen, das eine schützende Antwort gegen Neosporosis bei einem Säugetier induzieren kann, und eine immunologisch wirksame Menge des Homogenisats mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger kombiniert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen, die homogenisiert werden, Tachyzoites sind.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Tachyzoites durch Einfrieren/Auftauen und Beschallung homogenisiert werden.
Verfahren nach Anspruch 13, das weiter beinhaltet, dass eine oder mehrere zusätzliche immunmodulierende Komponenten dem Impfstoff zugegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zusätzliche immunmodulierende Komponente ein Adjuvans ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die zusätzliche immunmodulierende Komponente ein Zytokin ist.
Kombinationsimpfstoff um ein Säugetier gegen Neosporosis und gegebenenfalls eine oder mehrere weitere Krankheiten oder pathologische Zustände, die das Säugetier befallen können, zu schützen, wobei der Kombinationsimpfstoff eine immunologisch wirksame Menge einer ersten Zusammensetzung mit einem Homogenisat, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert; eine immunologisch wirksame Menge einer zweiten Zusammensetzung, die eine schützende Antwort gegen eine Krankheit oder einen pathologischen Zustand induzieren kann, die/der das Säugetier befallen kann, und einen veterinärmedizinisch annehmbaren Träger aufweist.
Kombinationsimpfstoff nach Anspruch 19, der weiterhin eine oder mehrere zusätzliche immunmodulierende Komponenten enthält.
Kombinationsimpfstoff nach Anspruch 20, wobei die zusätzliche immunmodulierende Komponente ein Adjuvans ist.
Kombinationsimpfstoff nach Anspruch 20, wobei die zusätzliche immunmodulierende Komponente ein Zytokin ist.
Kombinationsimpfstoff nach Anspruch 19, wobei die, zweite Zusammensetzung in dem Säugetier eine schützende Antwort gegen ein Pathogen induzieren kann, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rinderherpesvirus, Rinder-Respiratory-Syncitial-Virus, Rindervirusdiarrhoe-Virus, Parainfluenzavirus Typ I, II oder III, Leptospira spp., Campylobacter spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma spp., Klebsiella spp., Salmonella spp., Rotavirus, Coronavirus, Rabies, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Clostridia spp., Tetanus-Toxoid, E. coli, Cryptosporidium spp., Eimeria spp. und Neurospora spp.
Kit zum Impfen eines Säugetiers gegen Neosporosis enthaltend einen ersten Behälter mit einer immunologisch wirksamen Menge eines Homogenisats, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, und einen zweiten Behälter mit einem veterinärmedizinisch annehmbaren Träger oder Verdünnungsmittel.
Kit nach Anspruch 24, wobei das Homogenisat in lyophilisierter Form ist.