TW200302091A

TW200302091A - Methods of treating sepsis

Info

Publication number: TW200302091A
Application number: TW092101212A
Authority: TW
Inventors: Che-Ming Teng; Shiow-Lin Pan; Jih-Hwa Guh; Sheng-Chu Kuo; Fang-Yuan Lee
Original assignee: Yung Shin Pharm Ind Co Ltd
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2003-01-21
Publication date: 2003-08-01
Also published as: KR20030095197A; US20030181502A1; EP1331223A1; US6943186B2; DE60319021D1; TWI264304B; JP2003238405A; DE60319021T2; US20050187257A1; ATE386025T1; EP1331223B1

Description

200302091 五、發明說明（1) " " 發明所屬之技術領域本發明有關一種治療敗血症之方法、一種稠合吡唑基化合物、及該化合物對於製造治療敗血症之藥物之用途。先前技術 μ 敗血症之範圍自對於器官功能失常之全身炎症性反應至多發性器官衰竭，及終極死亡。參閱例如St〇ne (1994 年）所著之介第264期，第36 5至367頁；Karima等人 ( 1 999年）所著之财〇/灿第5期，第123至132頁；及 Parrillo寻人（1990年）所著之^(几^ ‘第1 1 3期；第 2 2 7至2 4 2頁。為防止敗血症，在包括抗氧化劑、消炎劑、及脂多醣（LPS)引發之一氧化氮（N0)合成之抑制劑之化合物方面已有研究。參閱例如〇rt〇lani等人（2〇〇〇年）所著之 ^ j r㈡Pir Crit c咖驗第1 6 1期，第1 9 0 7至1 9 1 1頁； Κοχ專人（2000年）所著之Afd 第2 6期，第 S124至128頁，及Boyle等人（2000年）所著之cvm尤以‘第8 7 期，第E18至24頁）。此等研究之結果並不令人滿意 (Glauser (2000年）所著之偷a 第28期第S4至8 頁）。若干資料顯示大量NO促使敗血症中發生血管衰竭（參閱Rees(1995年）所者之^c 7>沒/7义第23期，第1025 至1029頁）。在活體中，大量N〇因下列而產生··（〇在嚴重之病症（例如敗血症）發作後内皮中N 〇過度的合成，參閱例如Ochoa等人（1991年）所著之w几f? Λ/叹第214期，第621至

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626 頁；Nakatsu 及 Diamond( 1 989 年）所著之 cw脚心/处咖咖/第67期，第251至m頁；及㈤等人（1998年）所著之烈沒⑽沒π/第53期，第467至474 頁；及（Η)誘導型Ν0合成酶（lNOS)因細胞對於細菌產物 (例如LPS )或發炎性細胞活素（例如細胞介白素1 z及腫瘤壞死因子w)之反應而上揚，參閱例如curran等人（ι989年）所著之她么第170期，第1 769至1 774頁；及 Nakaya^na等人（1 9 9 2年）所著之第 7期，第471至476頁。N0可與超氧化物反應產生過亞硝酸鹽，，為氧化損害之主因（Szab〇(1996年）所著之灿^^第6 期，第79至88頁）。過亞硝酸鹽亦曾被報告與血管細胞凋亡有關（CuZzocrea等人（ 1 998年）所著之办//¾^似^人第 123期，第525至537頁）。抑制血管細胞〉周亡及因而防止血管及多發性器官衰竭之化合物係治療或防止敗血症或與敗血症有關之症候群之藥物候選者。發明内容於一方面’本發明之特徵在於一種治療敗血症之方法。該方法包括投藥給需要之患者（例如哺乳動物，人或動物）有效量之式（I )之稠合吡唑基化合物：

1057-5446.PF(Nl).plci 第8頁 200302091 五、發明說明（3) (CH2),

A為Η、CrCe烷基、或 (下文稱為，，（CH2)nAr3 (R5 ) ( R6 ) ’ 其中 η 為 0、1、2、或 3 ; Α η、A r2、及 A r3 各獨立為本基、卩(t变基、嚷吩基、卩夫喃基、或卩比σ各基；R 、

R2、R3、R4、h、及h各獨立為XYZ ;或心與匕一起、或與 r4 —起、或r5與匕一起為o(ch2)h〇 ;其中X為鍵或Ci〜c6 基，Y 為鍵、0、S、oc(o)、0(:(0)((^)^6(:(0)0、c( 〇)〇、 C(0)S、C(0)NH、（：（〇)叫〜(：6 烷基、NH、或NCrCe 烷基、及Z 為Η、鹵素、CN、N02、或^〜C6烷基；但是R3及r4之至少一者不為Η。可為支鏈或直鏈。注意上述任何取代基中所示之左邊原子最靠近稠合之吡唑基環。亦注意當有一或多個R基團時’R基團可為相同或不同。 η、/為m祠合吼。坐基化合物之子集為彼等其中Α為 1 土 r2為笨基或D夫喃基、及&與1^2各為Η者。 ^為Ϊ基及S嚷吩基、AG為苯基或咲喃基、 :〇或!者本在若干具體實施例中’ Ri、 cmh、c:、n5〇2、W%'W、CO〇-Ci、“、芳基= —詞，指芳基及雜芳基二者。基。雜芳基為呈有Π :系統。芳基之—實例為苯或S)之芳環之；ί广含…、-雜原子(例如〇、N、基、噻吩基、呋：！統：雜芳基之實例包括但不限於吡啶夫南基、或吡咯基。因此，"Ar "包括苯基、

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第9頁 200302091 五、發明說明（4) 吡啶基、噻吩基、咲喃基、或吡咯基，其各任意包括一、二、三、成更多個取代基。除了彼等在上述中指定給心、 R2、R3、R4、h、及匕者之外，該等取代基亦可為胺基、羥基、巯基、C2〜c6烯基、C2〜C6炔基、G〜C6烷氧基、芳基、雜芳基、環基（cyclyl)、或雜環基（heterocyclyl)，其中烷基、烯基、炔基、烧氧基、芳基、雜芳基、環基、及雜環基任意經匕〜C6烧基、鹵素、胺基、羥基、巯基、氰基、或硝基取代° 如本文中所使用之”烷基”一詞，包括直鏈與支鏈二者，其任意包括一或多個剛剛所述之取代基團。”芳基” 一詞指具有至少一個芳環之烴環系統（單環或雙環）。芳環基團之實例包括但不限於笨基、萘基、及芘基。"雜芳基” 一詞指具有至少一含有至少一雜原子（例如0、N、或S)做為環系統之一部份之芳環之烴環系統（單環或雙環）。雜芳基之實例包括但不限於呋喃基、或吡咯基、噻吩基、噚唑基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、及吲哚基。’’環基π —詞及π雜環基"一詞指具有4至1 4個環原子之部份或完全飽和之單環或雙環系統。雜環基之環含有一或多個雜原子（例如〇、Ν、或s)做為環系統之一部份。舉例之環基與雜環基之環為環己烷、六氫吡啶、六氫吡畊、嗎啉、硫代嗎啉、1，4 -氧氮口半。下列所示為可使用於實施本發明之方法之稠合吡唑基化合物若干特定之實例：

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五、發明說明（6) 化合物5 化合物6 化合物7

1057-5446-PF(Nl).ptd 第12頁 200302091 五、發明說明（7) 化合物8 化合物9

〇

COOH

化合物1 0 化合物1 1 __ 1057-5446-PF(Nl).ptd 第13頁 200302091

五、發明說明（8) 化合物1 2 化合物1 3 化合物1 4 化合物1 5 wwrnu 1057-5446-PF(Nl).ptd 第14頁 200302091 五、發明說明（9) 化合物1 6 /^^οη2οη

化合物1 7

c〇〇ch3

化合物1 8

COOH 化合物1 9

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化合物2 1

π3 c 化合物2 2

n，ch3 Η 於另一方面，本發明之特徵為H、C「CA基、或（叫以叫一，其之中物;其2中、八 3、或4 ; Αη、Arz、及Aq各獨立為笨基、吡啶基、噻吩基、咲喃基、或吼洛基；R,、r2、&、&、& '及&各獨立為XYZ ;其中X為鍵或(^〜06烧基，γ為鍵、〇、s、〇c(0)、 0C(0)(CH2)hC(0)0、C(0)0、C(0)S、C(0)NH、。（0)叫〜(：6

1057-5446-PF(Nl).ptd 第16頁 200302091 五、發明說明αι) 烧基關或Nci〜C6烷基、及Z為H、鹵素、CN、N02、或 CrQ烧，；但是心與^ 一起或心與匕一起任意為wcuo ; 及士必須為R，γ必須祕⑻（叫^以請，及匕及^ 之一者中之Ζ必須為η或匕弋烷基。（叫可為支鏈或直鏈。 HJ、Π]所述之本發明之稠合吡唑基化合物之子集為彼等其:A 為（CH2)nAr3(R5)(R6) ’ Αη 為笨基，Αι^ 為呋喃基，Ah W ^"為° 或1 ’ Ri、R2、&、及& 之-者為Η，及R3 «4 之一者為Η者。本發明之範例化合物為化合物g。 >上述稠δ卩比σ坐基化合物包括化合物本身，以及若可用的活•其鹽及其前驅藥物。例如，可在稠合吡唑基化合物上之帶負電荷取代基（例如羧酸根）與陽離子之間形成此種鹽。適合之陽離子包括但不限於鈉離子、鉀離子、鎂離子、、鈣離子、及銨離子例如四曱銨離子。同樣，帶正電荷取代基（例如胺基）能夠與帶負電荷之相對離子形成鹽。適合之相對離子包括但不限於氣離子、溴離子、碘離子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、或乙酸根。前驅藥物之實例包括酯及其他醫藥上可接受之衍生物，當將其投藥給患者時，能夠提供上述之稠合吡唑基化合物（參閱G〇〇dman及^ lman 所著之迦〇f Therapeutics , 第8版，McGraw-Hi 1 1國際版，1 9 9 2年，，，藥物的生物轉化丨，）。 ’ 此外，本文所描述之若干稠合化合物具有一或多個雙鍵，或一或多個不對稱中心。此種化合物可以生成消旋

1057-5446-PF(Nl).ptd 第17頁 200302091 五、發明說明（12) 、個別之非對映立體異構，及順-或反-或或Z -雙重物、消旋混合物、單一對映體物、非對映立體異構物混合物異構物形式。進一步，前述之稠合吡唑基化合物亦包括其N —氧化物。π N-氧化物，，一詞指當一或多個氮原子存在於稠合吡唑基化合物中時，為N -氧化物形式，即，N 0。本發明展望之取代基及變數之組合僅為彼等導致形成安定之稠合吡唑基化合物者。如本文中所使用之”安定，，一詞指擁有足以允許製造之安定性之化合物，及此維持化合物之整體性足夠長的/段時間以供本文中所詳述之目的 (例如治療敗血症）使用。在進一步之另/方面，本發明特徵為一種抑制血管細胞凋亡之方法。該方法包括投藥給需要之病患（例如哺乳動物’人或動物）有效量之一或多種上述之稠合吡唑基化合物。上述化合物對於製造治療敗血症之藥物之用途亦發明之範疇内。本發明之其他特徵、目的、及優點自敘述及附圖，及自申請專利範圍觀之將更為顯明。實施方式一種如發明内容中描述的稠合吡基化合物，可藉先# 技術的程序製配而得（如美國專利第5, 574, 1 68號）。9其^ 2 Γ列合成路徑：由/氣化芳基碳基與另一芳基化合物偶合製配得一芳基芳基3同，其中芳基化合物可為任意單或多

1057-5446-PF(Nl).ptd 第18頁 200302091 五、發明說明（13) 取代。接著，此酮類再與一芳基烷氨、-聯氨)反應’其中芳基亦為任意nm 形成一包含三或二個芳基的腙，腙藉一 \ 果合I坐基，另-芳基與吼唾基第四和第五個稍個芳基直接與哏。坐基第三個碳連接。若對任何：：2 代基進行修飾可得稠合吡唑基化合物的衍生物。·"的取上述合成路徑所使用的化學品包括··如溶劑、催化劑與保護基和去保護基試劑。上述方法亦可在$其^主要步驟前或後附加其他步驟，以增加或移除適當的保護基得到最終合成的稠合吡唑基化合物。此外，利用替代步二^ 為獲得期待化合物可得到不同的合成步驟。化學合成的轉換與保護基團的方法（保護與去保護），常應用於先前技術中對稠合吡唑基化合物的合成，如R. Larock，

Comprehensive Organic Trancformations^ γqjj

Wu t s, John Wi ley John John Wiley

Pub 1ishers( 1 989 ) ； T. W. Greene and P. G. ^

Protective Groups in Organic Synthesis^ 3rd Ed.， and Sons(1999) ；L. Fieser and M. Fieser,

Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis^

Wiley and Sons(1994) ；L. Paquette,ed.,

Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, and Sons(1995)，及其後來的著作。一合成的稠合吼吐基化合物可進一步藉新鮮管柱層析、高效液相層析或結晶法加以純化。

1057-5446-PF(Nl).ptd 第19頁 200302091 五、發明說明（14) 本發明為一治療敗血症的方法，包括：給予一實驗個體所需如上述一個或多個稠合吡唑基化合物的有效劑量與一劑型上可接受的載體。治療一詞即將一稠合吡唑基化合物給予一實驗個體，使達到治癒、減輕或改善敗血症、敗血症症狀或敗血症傾向的目的。一有效劑量定義為給予一試驗個體所須的一稠合吡唑基化合物的量，並參照其治療效果而定。一稠合吡唑基化合物的有效劑量範圍自0. 1 m g / K g至1 0 0 m g / K g，在先前技術中均有列述，其依照給藥路徑、賦形劑的使用與可結合其他製劑共同治療敗血症的可能性而定。本發明的實施方法，一稠合吡唑基化合物可透過口月艮、非口服、吸入式喷霧器或注入型儲存液方式給藥，其中，非口服方式包括：皮下的、皮内的、靜脈内的、肌肉内的、關節内的、動脈内的、關節滑液内的、胸骨内的、椎管内的、疾病部位的與顱内注射或灌入技術。口服給藥的組成，可以任何口服上可接受的形式包括但不限定於：碇、膠囊、乳劑、水性懸浮液、分散劑與溶液。一般碇的載體包括乳糖與珠澱粉，潤滑劑如硬脂酸鎂，亦加於碇中。口服給藥的膠囊型式，常用的稀釋液包括乳糖與乾珠澱粉。以水性懸浮液或乳劑進行口服給藥時，其主成分可懸浮或溶解於乳化劑或懸浮劑的油相。若有需要，亦可加入特殊甜味、香味或色劑於其中。一無菌注射劑的組成（如水性或油性懸浮液），根據先前技術可製成合適的分散劑或濕潤劑（如T w e e η 8 0 )與懸浮

1057-5446-PF(Nl).ptd 第20頁 200302091 五、發明說明（15) 劑。無菌注與無菌注射醇。可接受液與等張的溶劑或懸浮酸與其甘油劑可接受型式。這些油分散劑或魏一吸入如生理食鹽利用率的吸或分散劑。一藥劑定主成分更劑，例如環可溶性的錯劑，其他載素、硫酸月一適當抑制血管細程序完成，方法射劑可由叙表μ , 液或懸浮液、Γ非口服可接受型稀釋劑或溶劑型賦形劑與、、六卞丨女/合履與1，3-一丁氣化鈉溶液令蜊可為甘露醇、水、Ringer，s溶介質（如合土、。此外，無菌植物油通常使用當作衍生物用°於、、主：甘油或甘油二酯）。月旨肪酸如油油脂如撖欖:由ΐϊ的製配’注射液如天然的藥性溶液或麻油’特別是其聚氧乙基型曱基纖維素：ΐ亦可包含一長鏈醇的稀釋劑或劑型的組ϋ = 土分散劑。水、苯根據先前技術的藥劑劑型製配， -子或其他合適的防腐劑、增力收促進劑、氣碳化物與先前技術配製的穩= ::帶者的二成須與劑型的主成分相容(若能穩仏) 子文试驗個體不會產生毒性，如穩定糊精（其型式特殊為與稠合吡唑基化合物^古合物）’可用於载運稠合❹基化合物的賦ς 體的例子包括二氧化石夕膠體、硬脂酸鎂、桂酸鈉與D&C YeUow #1〇。的體外試驗可事先評估一稠合吡唑基化合物胞凋亡的效果。體内筛選亦可遵照先請參照以下實例。細胞培養，大鼠主動脈平滑肌細胞的培養基是將遠六

1057-5446-PF(Nl).ptd 第21頁 200302091 五、發明說明（16) 君羊大鼠（Sprague-Dawley rats)細胞培養在Dulbecco，s modified Eagle’s medium(DMEM)中並加入10 % FBS、100 units/mL的盤尼西林與100 /zg/mL的鏈黴素（Gibco，

Grand Island, NY)而得，如先前技術（Yang et al. ( 20 0 1 ) Br J Pharmacol. 132: 153 卜 1541)。本試驗取用培養6代以内的細胞，平滑肌細胞可藉對平滑肌α -肌動蛋白特異的單株抗體加以免疫染色以辨認之。細胞毒性檢驗，利用ΜΤΤ檢驗法進行細胞毒性檢驗。 ΜΤΤ(溴化（3-(4, 5 -二曱基噻唑-2 -基）-2, 5-二苯基四唑）， Sigma Chemical，St. Louis, Μ0)溶於磷酸緩衝食鹽水 (PBS)，濃度為5 mg/mL，並過濾（Mill i pore, Bedford, MA)之。自儲液中取出l〇 # L/100 //L培養液加入一平板中之各井，平板緩慢搖晃並保持恆溫3 7 °C持續2小時。以 MTT處理肝細胞會產生一藍紫色的結晶物質，在死細胞中則無染色現象。MTT處理完後，培養液以1 〇〇 // L的二曱基亞石風（DMS0)替代之。MTT在細胞内代謝成結晶物質的範圍以酵素免疫分析法（ELISA )中0D5 5 0測量定量之。凋亡細胞的位置標記，偵測凋亡細胞的位置可利用終端去氧核苷酸轉移酵素（TdT)去氧尿核苷三磷酸（dUTP)缺口終端標記法（TUNEL)，並配合凋亡偵測儀器（Promega，

Madison，WI，USA)，如前所述（Guh et al. ( 1 9 9 8 ) MOL Pharmacol. 53: 46 7-474 ) dTUNEL 法藉 TdT 將生物素 -dUTP轉移至斷裂的去氧核醣核酸（DNA)的3,-氫氧基自由端’之後，生物素標記的斷裂位置再與抗生物素蛋白—螢

1057-5446-PF(Nl).ptd 第22頁 200302091 五、發明說明（17) 光素共輥體（抗生物素蛋白-螢光素異硫氛酸鹽）反應而顯色。顯微照片由一螢光顯微鏡（N i k ο η )得到。環狀鳥糞核苷單磷酸鹽（cGMP)的濃度檢驗，單層細胞以指標試劑恒溫1 0分鐘，之後，細胞以冰冷的p B S洗（條2 次，再以0· 5 mL氫氧化鈉（〇. 1 m〇l/L)使之溶解，最後加入0 · 5 m L鹽酸（0 · 1 m ο 1 / L)中和檢驗溶液。離心（3，〇〇〇 g持續3分鐘）後，以cGMP ELISA偵測懸浮液的cGMP含量。摘測C a s p a s e - 3的活性，C a s p a s e - 3的活性可以 Caspase - 3 色譜檢驗儀器（R&D System, Inc.， Minneapolis，M i η n e s o t a)檢測之。細胞在指標試劑處理 1 0小時後’細胞以冰冷的p B S洗務2次，消化後離心（8 〇〇 g 持續5分鐘），使細胞微粒懸浮在C a s p a s e - 3色譜檢驗儀器的預冷溶解緩衝液上。冰浴1 〇分鐘後，將細胞勻漿離心 (1 0，0 0 0 g持續1分鐘），移出懸浮液，測定C a s p a s e — 3的活性。在一總體積1 0 0 // L的反應緩衝液下完成蛋白分解反應，緩衝液包括5 0从L的細胞萃取物與由儀器得到的5 μ L DEVE-ρΝΑ，反應混合物續恆溫37 °C達1至2小時，最後形成對硝基苯胺，以ELISA 40 5nm測量之。偵測細胞色素c的釋放反應，細胞經消化、離心（8 0 0 g 持續1 0分鐘）後，細胞微粒遂懸浮於5 0 // L的萃取物緩衝液上，爾後將其冰浴3分鐘。緩衝液包含20 mmol/L HEPES、酸驗值7 · 5， 1 〇 mmo 1 / L的氣化鉀、1 · 5 mmo 1 / L的氣化鎂、 1 mmol/L 的EDTA 、1 mmol/L 的EGTA 、1 mmol/L 的

l〇57-5446-PF(Nl).ptd 第23頁 200302091 五、發明說明（18) dithithretol 與1 mmol/L 的PMSF。細胞經30次震盪在4 °C下離心（15, OOOg持續15分鐘），其中20 //g的蛋白質由 1 5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠分離得到且使其附著上PVDF膜，將膜與抗細胞色素c的單株抗體共同恆溫，之後，再將膜與小鼠的I gG共同恆溫，則可偵測細胞色素c的表現。西方點墨分析，細胞暴露在指標試劑4 (Be 1-2)或6 (細胞色素c)小時後，細胞以冰冷的PBS洗滌2次，最後加入冰冷的1 0 0 // L溶解緩衝液（1 〇 m m ο 1 / L T r i s -鹽酸、酸驗值 7· 4， 150 mmol/L 的氣化鈉、1 mm〇l/L 的EGTA、0· 5 mmol/L 的PMSF、10 //g/mL 的aprotinin、10 /zg/mL 的 leupeptin與1 %的Triton X-100)終止反應。若要偵測Akt 的碌酸化，溶解緩衝液須包含1 mm ο 1 / L叙酸鈉、1 mmo 1 / L的氟化鈉、50 mmo 1 / L 的焦填酸四鈉、1 0 nmo 1 / L 的黑海綿酸（okadaic acid)與25 %的去氧膽酸鈉。試驗藉 Bio-Rad蛋白質檢測（Bio-Rad實驗室，CA，USA)偵測蛋白質濃度。西方點墨分析如下，細胞溶出物（2 5 μ g/ 1 ane ) 在1 0-1 5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳，之後，轉移至硝化纖維素膜上，膜上再以抗Be 1-2或抗α -微管蛋白單株抗體或抗Akt磷酸化的多株抗體予以標記，轉移膜伴隨一小氣或兔的"一級抗體繼績生長，如前所述（G u h e t a 1. ( 1 998 ) Eur J Pharmacol. 359: 2 8 卜 284)。最後以一捭曰強型化學螢光偵測儀（ECL; Amersham International， Little Chal font， U.K.)完成信號的偵測。内毒素休克的誘導作用與組織學試驗，此試驗中，於

1057-5446-PF(Nl).ptd 第 24 頁 200302091 五、發明說明（19) 小鼠（ 25-30 g， ICR染色）腹膜内注射6〇 mg/kg的LPS(溶於 PBS )，在注射後的2與6小時以化合物3 (懸浮於羰基曱基纖維素）進行口服給藥，且於注射後每3至6小時監測其存活率。對組織學試驗’將肺組織置於4 %的多聚甲醛並以石蠟包埋，包埋組織進行切片，厚度為6 // m，使用 hematoxy 1 in_eosin染色，以顯微鏡觀察分析。統計分析，各組實驗的指標數據以平均值+ ς E Μ表示，利用AN0VA完成數據的統計分析，之後，進行t_試驗，若p值小於0 · 0 5視為有意義的。結果體外試驗首先，測试在培養的RASMCs中化合物3對硝基氫氰酸鈉（SNP)誘發之細胞凋亡的影響效力。以Mn試驗方法及 TUNEL反應技術確認之結果顯示，SNp(lmm〇：l/L)會誘發全面性細胞凋亡。然而，化合物3(30 //m〇i/L)完全終止SNP 誘發的細胞祠亡。有趣地是，可溶性胍環酶抑制物〇DQ對於SNP誘發的細胞凋亡沒有作用，但明顯地逆轉化合物3媒介之抗細胞调亡反應（請參照表1 )，這結果顯示可溶性脈 % i母之活性與化合物3媒介之抗細胞〉周亡作用有關，而非 SNP誘發之細胞凋亡反應。本研究亦測試胞内cGMP之含量。化合物3亦誘發顯著地cGMP合成增加（4·2± 0.8 fm〇l/孔對照於2.3：t 〇/3fm〇1/ 孔之基準值）。並且，SNP與化合物3之組合可以協同引發超過六倍的環核苷酸形成增加（ 2 5 2· 8 ± 81· 8fm〇i/孔）^

200302091 五、發明說明（20) 然而’ 0DQ顯著地抑制單獨之化合物3(〜基準值）以及SNp與，合物3之組合（〜21 4〇1/孔）的作用。此外，採用MTT測试方法’細胞穿透性cGMP類似物二丁基-cGMP可以顯著地逆轉SMP誘發的細胞凋亡（結果未顯示）。綜合而言，這些數據顯示SNP誘發—獨立於cGMp的細胞凋亡反應，而化合物3經、由一 CGMP依賴性訊息傳遞路徑而防止SNp之反應。為測試是否P I 3 —激酶以及促細胞分裂劑活化之蛋白負激酶（ΜAPK)與化合物3媒介之抗細胞凋亡有關，採用其選擇性抑制物以確認其功能。ρ丨3 —激酶—沃氏藍酵素 (wortmannin)以及促細胞分裂劑活化之蛋白質激酶（ΜΕΚ) 抑制物-PD980 59可顯著地逆轉化合物3作用，此結果顯示 Ρ I 3 -激酶之活性可能對於化合物3引發之抗細胞凋亡扮演者重要角色。一般認為Ρ I 3 -激酶之脂質產物會以高親和性與專一性結合至Akt/PKB ΡΗ部位，因而觸發細胞存活訊息路徑。於本研究中’採用西方墨點分析測試磷酸化Akt之表現。結果顯示不論是化合物3單獨或是其與SNp組合都誘發全面性^破酸化Akt表現增加。這些效果會全面性地被0DQ與沃氏監酵素抑制’因此，推測被化合物3誘發之Ρ I 3-激酶係 cGMP合成之下游反應。 ’、測試SNP與化合物3對於Be 1-2含量與細胞色素c釋放反應之效力。暴露於SNP( lmm〇i/L)可造成細胞質全面性 Be 1 -2表現的向下調節與細胞色素c的釋放。將細胞以化合物3處理可完全地抑制SNp反應。然而，〇DQ及沃氏藍酵素σ

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可完全逆轉化合物3之抑制作用。這些妹止 Be 1 -2向下調節與細胞色素c釋放的抑 ”、、不过之 P I 3激®母相關吼心傳遞路徑對於化合物3之作用。將細胞暴露於SNP(1_1/L)後測試其硫脱氨酸蛋 3(caspase-3)活性。結果顯示SNP顯著地增加在RASMCS的硫胱氨酸蛋白酶3活性；然而’化合物3完全抑制該酵素對於SNP之活性。而且，化合物3媒介之抑制效果也分別部份地，或顯著地，被0DQ與沃氏藍酵素所逆轉。當細胞凋亡百分比與硫胱氨酸蛋白酶3活性再深入分析其相關性時，可獲得一正向線性回歸與〇. 980的相關係數（Η值），推測硫胱氨酸蛋白酶3活性對於S N P誘發效果與化合物3之抗細胞〉周亡反應扮演著決定性的角色。測試化合物1-22對於以SNP誘發培養VSMCs之細胞凋亡的效力。1 6個化合物顯示對於S N P ( 1 m m ο 1 / L)誘發之細胞凋亡有抑制作用。其中某些化合物甚至可以完全終止S N P 誘發之細胞凋亡。體内試驗為研究化合物3對於敗血症之治療潛力，採用LPS誘發敗血症死亡之小鼠模式。對小鼠腹腔施予LPS( 60 mg/kg) 以造成1 0到2 8小時内的累積性死亡。然而，LPS施予後2小時再以化合物3(10 mg/kg) 口服治療（即以化合物3後治療）可顯著地增加小鼠之存活率（第1圖）。此外，這些存活的小鼠在LPS處理後一個月仍然很有活力。觀察體内動物試驗的組織學檢查結果。對照組小鼠顯

1057-5446>PF(N1).ptd 第27頁 200302091 五、發明說明（22) 示仍完整的肺臟組織的組織學外觀。LPS處理後28小時，動物顯現損傷的血管以及由循環大量溢出血液細胞到肺臟組織。然而，以化合物3後治療之健康小鼠族群顯示完整的血管且不會有血液細胞滲溢的現象。血管平滑肌細胞（VSMC)之細胞凋亡現象明顯地具有環境依存性。已有許多研究是關於在動脈粥狀硬化症及創傷後新生血管内膜形成時之VSMC細胞凋亡（Mai 1 at等人之 (1997)Circulation 96: 424-428 ;以及Newby 與 George(1996)之Curr Opin Cardiol. 11: 574-582);然而，很少人關注此現象與敗血症的關係。NO在細胞凋亡之作用係依細胞型態、細胞濃度、自由基環境，以及細胞之氧化還原狀態等而異的（Yabuki等人（ 1 99 7 )Free radical Res· 27:325-335 ;以及Filippov 等人（1997)J Clin Invest. 100:942-948)。化合物3以cGMP依存性方式抑制 SNP誘發之細胞凋亡作用係基於以下觀察：化合物3與SNP 組合會協同性增加c G Μ P合成，二丁基-c G Μ P有效率地模擬化合物3媒介之作用，以及〇DQ顯著地逆轉化合物3之反應。然而，在化合物3媒介之作用中仍然有約2 0%的0DQ不反應作用。 Ν0誘發細胞毒性之機制推測包括粒線體呼吸鏈之不活化，DNA損傷、以及Bel-2向下調節/Bax向上調節（Bolanos 等人（1997)J Neurochem. 68:2227-2240 ;以及Tamatani 等人（ 1 998 )Cell Death Differ· 5:91 卜919)。如上述， SNP誘發一顯著之Be卜2蛋白向下調節而非影響Bax表現（數

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200302091 五、發明說明（24) 3媒介抗細胞凋亡反應具有微小影響（丨〇 7 ·丨± 3丨％對於 1 0 0 · 6 ± 5 · 5 %之細胞存活率於化合物3加上$ n p族群， p = 0.32，n = 7) ’此結果顯示PKC活性對於化合物3之反應無關。此外，結果顯不化合物3具有抑制Lps誘發小鼠敗血症死亡之效果’特別疋貫驗係以化合物3之後治療進行。數據顯示LPS處理小鼠有醫顯著降低死亡率。亦檢視其肺臟組織’顯示肺衰竭係敗血症死亡之一重要原因。基於组學檢查，結果顯示LPS處理後的動物顯現出損傷血管以及大量血球細胞由循環滲露到肺組織。此外，小鼠以化合物 3後治療之族群顯示完整血管且無血球細胞滲露情形，以及如常的活動力。另外也對化合物3對於其他藥理學活性的效果進行檢測。之丽研究指出，化合物3對於環氧酶活性沒有抑制作用（Ko 等人（ 1 994 )Bl〇〇d· 84:4226- 423 3 );本研究亦顯示對於在NR8383巨噬細胞的LPS/干擾素誘發腫瘤壞死因子 α釋放（1 8 · 5 ± 1 · 2 n g / m L相對於對照組的1 5 · 5 土 1.3ng/mL，ρ = 0·13，n = 4)以及對於由黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶系統產生之過氧化物陰離子的細胞色素c還原反應（4〇 + 0.6%相對於對照組之42.0± 2.1%，p = 〇 4，n = 4)具有輕微的抑制作用。此外，又採用穩定自由基丨，卜二笨基_2_苦味酸胼對化合物3之自由基去除活性進行測試。化合物3顯示輕微的自由基去除活性（數據未顯示）。於另一實驗中，對鼠類巨噬細胞RAW264. 7細胞以LPS(1 g/mL)24小時刺激

第30頁 200302091 五、發明說明（25) ' 後，觀察到大量N 0形成。然而，化合物3在本研究中並未干擾LPS引發的反應（53· 4 ± 12· 3 //mol/L亞硝酸鹽對廣於對照組之6 8 · 8 ± 1 3 · 4 // mo 1 / L 亞硝酸鹽，P = 〇 · 4 3，n = 4 )。這些結果顯示化合物3顯示出輕微的抗炎症、抗毒素、以及抗LPS生成N0凡應之活性，而可歸納出這些作用有助於化合物3媒介的動物存活。因此，基於以上討論，化合物3 對於小鼠之敗血症死亡具有抗細胞凋亡之重要角色。表1 S N P，化合物3，以及〇 D Q對於大鼠大動脈平滑肌細胞細胞存活之調控作用處理細胞存活率（％) η 對照组 100 土 0 6 SNP 49·3 士 4.4* 6 化合物3 111.3土 8.8 6 SNP+化合物3 102_9 士 8.1 + 6 ODQ 99.5 士 5.7 5 ODQ+化合物3 96.1 士 4_2 7 ODQ+SNP+化合物3 69·6±4.〇斧 6 數據係以5到7個實驗之平均值± SEM表示，η代表獨立實驗之數目。*Ρ<0· 001相對於對照組；+ Ρ<〇· 〇〇1相對於SNP組； #Ρ<0· 01相對於SNP加上化合物3組。其他實施型態本說明書所揭露的所有特徵可以做任意組合。本說明

第31胃 200302091 丨五、發明說明（26) ^ 書所揭露之每一特徵可以具有相同、〜的替代性特徵所取代。因此，除非=同、或相似露之特徵僅伤从符別說明，不目的 '、作為一般性相同或相似特徵之一則每一揭上述，任何熟於此技藝人士去六例不。主要特徵，並且在不脫離本發明之精I解本發明之本發明進行多種改變與修飾以適於各^ =疇之内，可對如，構造相似於稠合吡嗓基化合物之化1 =或狀況。例行本發明。因此，其他實施型態亦二=可以用於施範圍之内。 s於本發明申請專利

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Claims

200302091 六、申請專利範圍 1. 一種治療敗血症的方法，該方法包括投與一需要之個體一有效劑量之式（I)稠合吡唑基化合物：

A 為 Η、q 〜C6 烷基、或（CH2)n—(S^ ，其中 η 為 0、1、2、 R6 或3 ; Aq、Ar2、及Ar3各獨立為苯基、吼σ定基、噻吩基、咲喃基、或吡咯基；以及 < 心、R2、R3、R4、R5、及R6各獨立為ΧΥΖ ;或心與心、或 R3與匕、或R5與心同時為(KCIUuO ;其中X為一鍵結或烷基，Y 為一鍵結、0、S、0C(0)、0(:(0)((:4)^6(:(0)0、 C(0)0、C(0)S、C(0)NH KCONCrQ 烷基、NH、或NCrQ 烷基、及Z為Η、鹵素、CN、N02、或q〜C6烷基；然而R3及匕之至少一者不為Η。 2. 如申請專利範圍第1項所述之治療敗血症的方法，其中Α為Η。 3. 如申請專利範圍第2項所述之治療敗血症的方法，其中Αη為苯基。 4 ·如申請專利範圍第3項所述之治療敗血症的方法，其中A r2為笨基。

1057-5446-PF(Nl).ptd 第34頁 200302091 六、申請專利範圍 5 ·如申請專利範圍第4項所述之治療敗血症的方法，其中心與匕各為Η。 6. 如申請專利範圍第3項所述之治療敗血症的方法，其中A r 2為咲喃基。 7. 如申請專利範圍第6項所述之治療敗血症的方法，其中心與匕各為Η。 8 ·如申請專利範圍第1項所述之治療敗血症的方法， t A (CH2)n— \r6 。 9 ·如申請專利範圍第8項所述之治療敗血症的方法，其中Aq為苯基。 1 〇.如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法，其中A r2為苯基。 1 1.如申請專利範圍第1 0項所述之治療敗血症的方法，其中A r3為苯基。 1 2.如申請專利範圍第1 1項所述之治療敗血症的方法，其中η為0或1。 1 3.如申請專利範圍第1 2項所述之治療敗血症的方法’其中心、R2、R3、R4、R5、及h之一者為C00H、 COO-Ci 〜C6 烷基、CH20H、CN、N02、或 ii 素。 1 4.如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法，其中A r2為呋喃基。 1 5.如申請專利範圍第1 4項所述之治療敗血症的方法，其中A r3為笨基。

1057-5446-PF(Nl).ptd 第35頁 200302091 六、申請專利範圍 1 6.如申請專利範圍第1 5項所述之治療敗血症的方法，其中η為0或1。 1 7.如申請專利範圍第1 6項所述之治療敗血症的方法，其中心、R2、R3、R4、R5、及R6之一者為C00H、 C00-Ci〜C6 烷基、CH20H、CN、N02、或 ii 素。 1 8 .如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法，其中八]^3為苯基。 1 9.如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法，其中η為0或1 。 2 0.如申請專利範圍第8項所述之治療敗血症的方法，其中Aq為噻σ坐基。一 2 1 .如申請專利範圍第2 0項所述之治療敗血症的方法，其中Ar2為呋喃基。 2 2.如申請專利範圍第2 1項所述之治療敗血症的方法，其中Ar3為苯基。 2 3.如申請專利範圍第2 2項所述之治療敗血症的方法，其中η為0或1 。 2 4.如申請專利範圍第2 3項所述之治療敗血症的方法，其中心、R2、R3、R4、心、及心之一者為C〇〇H、 coo-q 〜C6 烷基、CH20H、CN、N02、或鹵素。 2 5.如申請專利範圍第1項所述之治療敗血症的方法，其中該化合物係

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1057-5446-PF(Nl).ptd 第37頁 200302091 六、申請專利範圍喃基、或吡咯基；以及 &、R2、R3、R4、R5、及R6各獨立為XYZ ;其中X為鍵或烷基，Y 為鍵、0、S、0C(0)、0C(0)(CH2V6C(0)0、 C(0)0、C(0)S、C(0)NH 烷基、NH、或NCrQ 烷基、及Z為H、鹵素、CN、N02、或C!〜C6烷基；但是Ri與匕一起或R5與〜一起任意為0((^)^0 ;及又但是X必須為R，Y必須為0(：(0)((：[12)卜6(：(0)0，及1^及1?4之一者中之2必須為1]或 q〜C6烧基。

2 7.如申請專利範圍第2 6項所述之治療敗血症的方法，其中A為 2 8.如申請專利範圍第2 7項所述之治療敗血症的方法，其中Aq為苯基。 2 9.如申請專利範圍第2 8項所述之治療敗血症的方法，其中A r2為呋喃基。 3 〇.如申請專利範圍第2 9項所述之治療敗血症的方法，其中A r3為笨基。 3 1.如申請專利範圍第3 0項所述之治療敗血症的方法’其中、匕、及h之一者為Η。 3 2.如申請專利範圍第3 1項所述之治療敗血症的方法，其中R3與匕之一者為Η。 3 3.如申請專利範圍第3 2項所述之治療敗血症的方法，其中η為0或1 。 3 4.如申請專利範圍第3 3項所述之治療敗血症的方

1057-5446-PF(Nl).ptd 第38頁 200302091 六、申請專利範圍法，其中R3與R 0，以及Z 為Η。4 另一者係X 為CH2，Υ 必為oc(o)ch2ch2c(o) 3 5· —種抑制 μ 之個體一右μ + 官細胞洞亡之方法，包括投與一需要心卿月丑頁政劑晉a / 里 < 式（I )稠合吡唑基化合物：

其中η為0 Α為Η、（：丨〜(：6烷基、或（ch^—^T^5 2、或 3 ; 、6 Αη、A。、及Aq各獨立為苯基、吡啶基、·噻吩基、呋喃基、或D比洛基；以及心、R2、R3、R4、R5、及R6各獨立為χγζ ;或心與心、或 R3與R4、或R5與匕同時為OCCHJhO ;其中X為一鍵結或(^〜心烷基，Y 為一鍵結、0、S、0C(0)、OCCOKCI^hCKCOO、 C(0)0、C(0)S、C(0)NH 'CXOWCrCe 烷基、NH、或叫〜〇6烷基、及Z為Η、鹵素、CN、N02、或(：厂(：6烷基；然而R3及R4 之至少一者不為Η。

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