TW200302091A - Methods of treating sepsis - Google Patents
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Description
200302091 五、發明說明(1) " " 發明所屬之技術領域 本發明有關一種治療敗血症之方法、一種稠合吡唑基 化合物、及該化合物對於製造治療敗血症之藥物之用途。 先前技術 μ 敗血症之範圍自對於器官功能失常之全身炎症性反應 至多發性器官衰竭,及終極死亡。參閱例如St〇ne (1994 年)所著之介第264期,第36 5至367頁;Karima等人 ( 1 999年)所著之财〇/灿第5期,第123至132頁;及 Parrillo寻人(1990年)所著之^(几^ ‘第1 1 3期;第 2 2 7至2 4 2頁。為防止敗血症,在包括抗氧化劑、消炎劑、 及脂多醣(LPS)引發之一氧化氮(N0)合成之抑制劑之化合 物方面已有研究。參閱例如〇rt〇lani等人(2〇〇〇年)所著之 ^ j r㈡Pir Crit c咖驗 第1 6 1期,第1 9 0 7至1 9 1 1頁; Κοχ專人(2000年)所著之Afd 第2 6期,第 S124至128頁,及Boyle等人(2000年)所著之cvm尤以‘第8 7 期,第E18至24頁)。此等研究之結果並不令人滿意 (Glauser (2000年)所著之偷a 第28期第S4至8 頁)。 若干資料顯示大量NO促使敗血症中發生血管衰竭(參 閱Rees(1995年)所者之^c 7>沒/7义 第23期,第1025 至1029頁)。在活體中,大量N〇因下列而產生··(〇在嚴重 之病症(例如敗血症)發作後内皮中N 〇過度的合成,參閱例 如Ochoa等人(1991年)所著之w几f? Λ/叹第214期,第621至
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626 頁;Nakatsu 及 Diamond( 1 989 年)所著之 cw脚心/处咖咖/第67期,第251至m頁;及㈤等 人(1998年)所著之烈沒⑽沒π/第53期,第467至474 頁;及(Η)誘導型Ν0合成酶(lNOS)因細胞對於細菌產物 (例如LPS )或發炎性細胞活素(例如細胞介白素1 z及腫瘤壞 死因子w)之反應而上揚,參閱例如curran等人(ι989年) 所著之她么第170期,第1 769至1 774頁;及 Nakaya^na等人(1 9 9 2年)所著之第 7期,第471至476頁。N0可與超氧化物反應產生過亞硝酸 鹽,,為氧化損害之主因(Szab〇(1996年)所著之灿^^第6 期,第79至88頁)。過亞硝酸鹽亦曾被報告與血管細胞凋 亡有關(CuZzocrea等人( 1 998年)所著之办//¾^似^人第 123期,第525至537頁)。 抑制血管細胞〉周亡及因而防止血管及多發性器官衰竭 之化合物係治療或防止敗血症或與敗血症有關之症候群之 藥物候選者。 發明内容 於一方面’本發明之特徵在於一種治療敗血症之方 法。該方法包括投藥給需要之患者(例如哺乳動物,人或 動物)有效量之式(I )之稠合吡唑基化合物:
1057-5446.PF(Nl).plci 第8頁 200302091 五 、發明說明(3) (CH2),
A為Η、CrCe烷基、或 (下文稱為,,(CH2)nAr3 (R5 ) ( R6 ) ’ 其中 η 為 0、1、2、或 3 ; Α η、A r2、及 A r3 各獨 立為本基、卩(t变基、嚷吩基、卩夫喃基、或卩比σ各基;R 、
R2、R3、R4、h、及h各獨立為XYZ ;或心與匕一起、或與 r4 —起、或r5與匕一起為o(ch2)h〇 ;其中X為鍵或Ci〜c6 基,Y 為鍵、0、S、oc(o)、0(:(0)((^)^6(:(0)0、c( 〇)〇、 C(0)S、C(0)NH、(:(〇)叫〜(:6 烷基、NH、或NCrCe 烷基、及Z 為Η、鹵素、CN、N02、或^〜C6烷基;但是R3及r4之至少一 者不為Η。可為支鏈或直鏈。注意上述任何取代基 中所示之左邊原子最靠近稠合之吡唑基環。亦注意當有一 或多個R基團時’R基團可為相同或不同。 η、/為m祠合吼。坐基化合物之子集為彼等其中Α為 1 土 r2為笨基或D夫喃基、及&與1^2各為Η者。 ^為Ϊ基及S嚷吩基、AG為苯基或咲喃基、 :〇或!者本在若干具體實施例中’ Ri、 cmh、c:、n5〇2、W%'W、CO〇-Ci、“、 芳基= —詞,指芳基及雜芳基二者。 基。雜芳基為呈有Π :系統。芳基之—實例為苯 或S)之芳環之;ί广含…、-雜原子(例如〇、N、 基、噻吩基、呋:!統:雜芳基之實例包括但不限於吡啶 夫南基、或吡咯基。因此,"Ar "包括苯基、
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第9頁 200302091 五、發明說明(4) 吡啶基、噻吩基、咲喃基、或吡咯基,其各任意包括一、 二、三、成更多個取代基。除了彼等在上述中指定給心、 R2、R3、R4、h、及匕者之外,該等取代基亦可為胺基、羥 基、巯基、C2〜c6烯基、C2〜C6炔基、G〜C6烷氧基、芳基、雜 芳基、環基(cyclyl)、或雜環基(heterocyclyl),其中烷 基、烯基、炔基、烧氧基、芳基、雜芳基、環基、及雜環 基任意經匕〜C6烧基、鹵素、胺基、羥基、巯基、氰基、或 硝基取代° 如本文中所使用之”烷基”一詞,包括直鏈與支鏈二 者,其任意包括一或多個剛剛所述之取代基團。”芳基” 一 詞指具有至少一個芳環之烴環系統(單環或雙環)。芳環基 團之實例包括但不限於笨基、萘基、及芘基。"雜芳基” 一 詞指具有至少一含有至少一雜原子(例如0、N、或S)做為 環系統之一部份之芳環之烴環系統(單環或雙環)。雜芳基 之實例包括但不限於呋喃基、或吡咯基、噻吩基、噚唑 基、咪唑基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、喹唑啉基、及吲 哚基。’’環基π —詞及π雜環基"一詞指具有4至1 4個環原子 之部份或完全飽和之單環或雙環系統。雜環基之環含有一 或多個雜原子(例如〇、Ν、或s)做為環系統之一部份。舉 例之環基與雜環基之環為環己烷、六氫吡啶、六氫吡畊、 嗎啉、硫代嗎啉、1,4 -氧氮口半。 下列所示為可使用於實施本發明之方法之稠合吡唑基 化合物若干特定之實例:
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五、發明說明(6) 化合物5 化合物6 化合物7
1057-5446-PF(Nl).ptd 第12頁 200302091 五、發明說明(7) 化合物8 化合物9
〇
COOH
化合物1 0 化合物1 1 __ 1057-5446-PF(Nl).ptd 第13頁 200302091
五、發明說明(8) 化合物1 2 化合物1 3 化合物1 4 化合物1 5 wwrnu 1057-5446-PF(Nl).ptd 第14頁 200302091 五、發明說明(9) 化合物1 6 /^^οη2οη
化合物1 7
c〇〇ch3
化合物1 8
COOH 化合物1 9
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化合物2 1
π3 c 化合物2 2
n,ch3 Η 於另一方面,本發明之特徵 為H、C「CA基、或(叫以叫一,其之中物;其2中、八 3、或4 ; Αη、Arz、及Aq各獨立為笨基、吡啶基、噻吩 基、咲喃基、或吼洛基;R,、r2、&、&、& '及&各獨立 為XYZ ;其中X為鍵或(^〜06烧基,γ為鍵、〇、s、〇c(0)、 0C(0)(CH2)hC(0)0、C(0)0、C(0)S、C(0)NH、。(0)叫〜(:6
1057-5446-PF(Nl).ptd 第16頁 200302091 五、發明說明αι) 烧基關或Nci〜C6烷基、及Z為H、鹵素、CN、N02、或 CrQ烧,;但是心與^ 一起或心與匕一起任意為wcuo ; 及士 必須為R,γ必須祕⑻(叫^以請,及匕及^ 之一者中之Ζ必須為η或匕弋烷基。(叫可為支鏈或直 鏈。 HJ、Π]所述之本發明之稠合吡唑基化合物之子集為彼等 其:A 為(CH2)nAr3(R5)(R6) ’ Αη 為笨基,Αι^ 為呋喃基,Ah W ^"為° 或1 ’ Ri、R2、&、及& 之-者為Η,及R3 «4 之一者為Η者。本發明之範例化合物為化合物g。 >上述稠δ卩比σ坐基化合物包括化合物本身,以及若可用 的活•其鹽及其前驅藥物。例如,可在稠合吡唑基化合物 上之帶負電荷取代基(例如羧酸根)與陽離子之間形成此種 鹽。適合之陽離子包括但不限於鈉離子、鉀離子、鎂離 子、、鈣離子、及銨離子例如四曱銨離子。同樣,帶正電荷 取代基(例如胺基)能夠與帶負電荷之相對離子形成鹽。適 合之相對離子包括但不限於氣離子、溴離子、碘離子、硫 酸根、硝酸根、磷酸根、或乙酸根。前驅藥物之實例包括 酯及其他醫藥上可接受之衍生物,當將其投藥給患者時, 能夠提供上述之稠合吡唑基化合物(參閱G〇〇dman及^ lman 所著之迦 〇f Therapeutics , 第8版,McGraw-Hi 1 1國際版,1 9 9 2年,,,藥物的生物轉化 丨,)。 ’ 此外,本文所描述之若干稠合化合物具有一或多個雙 鍵,或一或多個不對稱中心。此種化合物可以生成消旋
1057-5446-PF(Nl).ptd 第17頁 200302091 五、發明說明(12) 、個別之非對映立體異構 ,及順-或反-或或Z -雙重 物、消旋混合物、單一對映體 物、非對映立體異構物混合物 異構物形式。 進一步,前述之稠合吡唑基化合物亦包括其N —氧化 物。π N-氧化物,,一詞指當一或多個氮原子存在於稠合吡唑 基化合物中時,為N -氧化物形式,即,N 0。 本發明展望之取代基及變數之組合僅為彼等導致形成 安定之稠合吡唑基化合物者。如本文中所使用之”安定,,一 詞指擁有足以允許製造之安定性之化合物,及此維持化合 物之整體性足夠長的/段時間以供本文中所詳述之目的 (例如治療敗血症)使用。 在進一步之另/方面,本發明特徵為一種抑制血管細 胞凋亡之方法。該方法包括投藥給需要之病患(例如哺乳 動物’人或動物)有效量之一或多種上述之稠合吡唑基化 合物。 上述化合物對於製造治療敗血症之藥物之用途亦 發明之範疇内。 本發明之其他特徵、目的、及優點自敘述及附圖,及 自申請專利範圍觀之將更為顯明。 實施方式 一種如發明内容中描述的稠合吡基化合物,可藉先# 技術的程序製配而得(如美國專利第5, 574, 1 68號)。9其^ 2 Γ列合成路徑:由/氣化芳基碳基與另一芳基化合物偶 合製配得一芳基芳基3同,其中芳基化合物可為任意單或多
1057-5446-PF(Nl).ptd 第18頁 200302091 五、發明說明(13) 取代。接著,此酮類再與一芳基烷 氨、-聯氨)反應’其中芳基亦為任意nm 形成一包含三或二個芳基的腙,腙藉一 \ 果 合I坐基,另-芳基與吼唾基第四和第五個稍 個芳基直接與哏。坐基第三個碳連接。若對任何::2 代基進行修飾可得稠合吡唑基化合物的衍生物。·"的取 上述合成路徑所使用的化學品包括··如溶劑、 催化劑與保護基和去保護基試劑。上述方法亦可在$其^主要 步驟前或後附加其他步驟,以增加或移除適當的保護基得 到最終合成的稠合吡唑基化合物。此外,利用替代步二^ 為獲得期待化合物可得到不同的合成步驟。化學合成的轉 換與保護基團的方法(保護與去保護),常應用於先前技術 中對稠合吡唑基化合物的合成,如R. Larock,
Comprehensive Organic Trancformations^ γqjj
Wu t s, John Wi ley John John Wiley
Pub 1ishers( 1 989 ) ; T. W. Greene and P. G. ^
Protective Groups in Organic Synthesis^ 3rd Ed., and Sons(1999) ;L. Fieser and M. Fieser,
Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis^
Wiley and Sons(1994) ;L. Paquette,ed.,
Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, and Sons(1995),及其後來的著作。 一合成的稠合吼吐基化合物可進一步藉新鮮管柱層 析、高效液相層析或結晶法加以純化。
1057-5446-PF(Nl).ptd 第19頁 200302091 五、發明說明(14) 本發明為一治療敗血症的方法,包括:給予一實驗個 體所需如上述一個或多個稠合吡唑基化合物的有效劑量與 一劑型上可接受的載體。治療一詞即將一稠合吡唑基化合 物給予一實驗個體,使達到治癒、減輕或改善敗血症、敗 血症症狀或敗血症傾向的目的。一有效劑量定義為給予一 試驗個體所須的一稠合吡唑基化合物的量,並參照其治療 效果而定。一稠合吡唑基化合物的有效劑量範圍自0. 1 m g / K g至1 0 0 m g / K g,在先前技術中均有列述,其依照給藥 路徑、賦形劑的使用與可結合其他製劑共同治療敗血症的 可能性而定。 本發明的實施方法,一稠合吡唑基化合物可透過口 月艮、非口服、吸入式喷霧器或注入型儲存液方式給藥,其 中,非口服方式包括:皮下的、皮内的、靜脈内的、肌肉 内的、關節内的、動脈内的、關節滑液内的、胸骨内的、 椎管内的、疾病部位的與顱内注射或灌入技術。 口服給藥的組成,可以任何口服上可接受的形式包括 但不限定於:碇、膠囊、乳劑、水性懸浮液、分散劑與溶 液。一般碇的載體包括乳糖與珠澱粉,潤滑劑如硬脂酸 鎂,亦加於碇中。口服給藥的膠囊型式,常用的稀釋液包 括乳糖與乾珠澱粉。以水性懸浮液或乳劑進行口服給藥 時,其主成分可懸浮或溶解於乳化劑或懸浮劑的油相。若 有需要,亦可加入特殊甜味、香味或色劑於其中。 一無菌注射劑的組成(如水性或油性懸浮液),根據先 前技術可製成合適的分散劑或濕潤劑(如T w e e η 8 0 )與懸浮
1057-5446-PF(Nl).ptd 第20頁 200302091 五、發明說明(15) 劑。無菌注 與無菌注射 醇。可接受 液與等張的 溶劑或懸浮 酸與其甘油 劑可接受型 式。這些油 分散劑或魏 一吸入 如生理食鹽 利用率的吸 或分散劑。 一藥劑 定主成分更 劑,例如環 可溶性的錯 劑,其他載 素、硫酸月 一適當 抑制血管細 程序完成, 方法 射劑可由叙表μ , 液或懸浮液、Γ非口服可接受型稀釋劑或溶劑 型賦形劑與、、六卞丨 女/合履與1,3-一丁 氣化鈉溶液令蜊可為甘露醇、水、Ringer,s溶 介質(如合土、。此外,無菌植物油通常使用當作 衍生物用°於、、主:甘油或甘油二酯)。月旨肪酸如油 油脂如撖欖:由ΐϊ的製配’注射液如天然的藥 性溶液或麻油’特別是其聚氧乙基型 曱基纖維素:ΐ亦可包含一長鏈醇的稀釋劑或 劑型的組ϋ = 土分散劑。 水、苯根據先前技術的藥劑劑型製配, -子或其他合適的防腐劑、增力 收促進劑、氣碳化物與先前技術配製的穩= ::帶者的二成須與劑型的主成分相容(若能穩 仏) 子文试驗個體不會產生毒性,如穩定 糊精(其型式特殊為與稠合吡唑基化合物^古 合物)’可用於载運稠合❹基化合物的賦ς 體的例子包括二氧化石夕膠體、硬脂酸鎂、 桂酸鈉與D&C YeUow #1〇。 的體外試驗可事先評估一稠合吡唑基化合物 胞凋亡的效果。體内筛選亦可遵照先 請參照以下實例。 細胞培養,大鼠主動脈平滑肌細胞的培養基是將遠六
1057-5446-PF(Nl).ptd 第21頁 200302091 五、發明說明(16) 君羊大鼠(Sprague-Dawley rats)細胞培養在Dulbecco,s modified Eagle’s medium(DMEM)中並加入10 % FBS、100 units/mL的盤尼西林與100 /zg/mL的鏈黴素(Gibco,
Grand Island, NY)而得,如先前技術(Yang et al. ( 20 0 1 ) Br J Pharmacol. 132: 153 卜 1541)。本試驗取用 培養6代以内的細胞,平滑肌細胞可藉對平滑肌α -肌動蛋 白特異的單株抗體加以免疫染色以辨認之。 細胞毒性檢驗,利用ΜΤΤ檢驗法進行細胞毒性檢驗。 ΜΤΤ(溴化(3-(4, 5 -二曱基噻唑-2 -基)-2, 5-二苯基四唑), Sigma Chemical,St. Louis, Μ0)溶於磷酸緩衝食鹽水 (PBS),濃度為5 mg/mL,並過濾(Mill i pore, Bedford, MA)之。自儲液中取出l〇 # L/100 //L培養液加入一平板 中之各井,平板緩慢搖晃並保持恆溫3 7 °C持續2小時。以 MTT處理肝細胞會產生一藍紫色的結晶物質,在死細胞中 則無染色現象。MTT處理完後,培養液以1 〇 〇 // L的二曱基 亞石風(DMS0)替代之。MTT在細胞内代謝成結晶物質的範 圍以酵素免疫分析法(ELISA )中0D5 5 0測量定量之。 凋亡細胞的位置標記,偵測凋亡細胞的位置可利用終 端去氧核苷酸轉移酵素(TdT)去氧尿核苷三磷酸(dUTP)缺 口終端標記法(TUNEL),並配合凋亡偵測儀器(Promega,
Madison,WI,USA),如前所述(Guh et al. ( 1 9 9 8 ) MOL Pharmacol. 53: 46 7-474 ) dTUNEL 法藉 TdT 將生物素 -dUTP轉移至斷裂的去氧核醣核酸(DNA)的3,-氫氧基自由 端’之後,生物素標記的斷裂位置再與抗生物素蛋白—螢
1057-5446-PF(Nl).ptd 第22頁 200302091 五、發明說明(17) 光素共輥體(抗生物素蛋白-螢光素異硫氛酸鹽)反應而顯 色。顯微照片由一螢光顯微鏡(N i k ο η )得到。 環狀鳥糞核苷單磷酸鹽(cGMP)的濃度檢驗,單層細胞 以指標試劑恒溫1 0分鐘,之後,細胞以冰冷的p B S洗(條2 次,再以0· 5 mL氫氧化鈉(〇. 1 m〇l/L)使之溶解,最後加 入0 · 5 m L鹽酸(0 · 1 m ο 1 / L)中和檢驗溶液。離心(3,〇 〇 〇 g持 續3分鐘)後,以cGMP ELISA偵測懸浮液的cGMP含量。 摘測C a s p a s e - 3的活性,C a s p a s e - 3的活性可以 Caspase - 3 色譜檢驗儀器(R&D System, Inc., Minneapolis,M i η n e s o t a)檢測之。細胞在指標試劑處理 1 0小時後’細胞以冰冷的p B S洗務2次,消化後離心(8 〇 〇 g 持續5分鐘),使細胞微粒懸浮在C a s p a s e - 3色譜檢驗儀器 的預冷溶解緩衝液上。冰浴1 〇分鐘後,將細胞勻漿離心 (1 0,0 0 0 g持續1分鐘),移出懸浮液,測定C a s p a s e — 3的活 性。 在一總體積1 0 0 // L的反應緩衝液下完成蛋白分解反 應,緩衝液包括5 0从L的細胞萃取物與由儀器得到的5 μ L DEVE-ρΝΑ,反應混合物續恆溫37 °C達1至2小時,最後形成 對硝基苯胺,以ELISA 40 5nm測量之。 偵測細胞色素c的釋放反應,細胞經消化、離心(8 0 0 g 持續1 0分鐘)後,細胞微粒遂懸浮於5 0 // L的萃取物緩衝液 上,爾後將其冰浴3分鐘。緩衝液包含20 mmol/L HEPES、 酸驗值7 · 5, 1 〇 mmo 1 / L的氣化鉀、1 · 5 mmo 1 / L的氣化鎂、 1 mmol/L 的EDTA 、1 mmol/L 的EGTA 、1 mmol/L 的
l〇57-5446-PF(Nl).ptd 第23頁 200302091 五、發明說明(18) dithithretol 與1 mmol/L 的PMSF。細胞經30次震盪在4 °C下離心(15, OOOg持續15分鐘),其中20 //g的蛋白質由 1 5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠分離得到且使其附著上PVDF膜, 將膜與抗細胞色素c的單株抗體共同恆溫,之後,再將膜 與小鼠的I gG共同恆溫,則可偵測細胞色素c的表現。 西方點墨分析,細胞暴露在指標試劑4 (Be 1-2)或6 (細 胞色素c)小時後,細胞以冰冷的PBS洗滌2次,最後加入冰 冷的1 0 0 // L溶解緩衝液(1 〇 m m ο 1 / L T r i s -鹽酸、酸驗值 7· 4, 150 mmol/L 的氣化鈉、1 mm〇l/L 的EGTA、0· 5 mmol/L 的PMSF、10 //g/mL 的aprotinin、10 /zg/mL 的 leupeptin與1 %的Triton X-100)終止反應。若要偵測Akt 的碌酸化,溶解緩衝液須包含1 mm ο 1 / L叙酸鈉、1 mmo 1 / L的氟化鈉、50 mmo 1 / L 的焦填酸四鈉、1 0 nmo 1 / L 的黑海綿酸(okadaic acid)與25 %的去氧膽酸鈉。試驗藉 Bio-Rad蛋白質檢測(Bio-Rad實驗室,CA,USA)偵測蛋白 質濃度。西方點墨分析如下,細胞溶出物(2 5 μ g/ 1 ane ) 在1 0-1 5% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上進行電泳,之後,轉移 至硝化纖維素膜上,膜上再以抗Be 1-2或抗α -微管蛋白單 株抗體或抗Akt磷酸化的多株抗體予以標記,轉移膜伴隨 一小氣或兔的"一級抗體繼績生長,如前所述(G u h e t a 1. ( 1 998 ) Eur J Pharmacol. 359: 2 8 卜 284)。最後以一捭 曰 強型化學螢光偵測儀(ECL; Amersham International, Little Chal font, U.K.)完成信號的偵測。 内毒素休克的誘導作用與組織學試驗,此試驗中,於
1057-5446-PF(Nl).ptd 第 24 頁 200302091 五、發明說明(19) 小鼠( 25-30 g, ICR染色)腹膜内注射6〇 mg/kg的LPS(溶於 PBS ),在注射後的2與6小時以化合物3 (懸浮於羰基曱基纖 維素)進行口服給藥,且於注射後每3至6小時監測其存活 率。對組織學試驗’將肺組織置於4 %的多聚甲醛並以石蠟 包埋,包埋組織進行切片,厚度為6 // m,使用 hematoxy 1 in_eosin染色,以顯微鏡觀察分析。 統計分析,各組實驗的指標數據以平均值+ ς E Μ表 示,利用AN0VA完成數據的統計分析,之後,進行t_試 驗,若p值小於0 · 0 5視為有意義的。 結果 體外試驗 首先,測试在培養的RASMCs中化合物3對硝基氫氰酸 鈉(SNP)誘發之細胞凋亡的影響效力。以Mn試驗方法及 TUNEL反應技術確認之結果顯示,SNp(lmm〇:l/L)會誘發全 面性細胞凋亡。然而,化合物3(30 //m〇i/L)完全終止SNP 誘發的細胞祠亡。有趣地是,可溶性胍環酶抑制物〇DQ對 於SNP誘發的細胞凋亡沒有作用,但明顯地逆轉化合物3媒 介之抗細胞调亡反應(請參照表1 ),這結果顯示可溶性脈 % i母之活性與化合物3媒介之抗細胞〉周亡作用有關,而非 SNP誘發之細胞凋亡反應。 本研究亦測試胞内cGMP之含量。化合物3亦誘發顯著 地cGMP合成增加(4·2± 0.8 fm〇l/孔對照於2.3:t 〇/3fm〇1/ 孔之基準值)。並且,SNP與化合物3之組合可以協同引發 超過六倍的環核苷酸形成增加( 2 5 2· 8 ± 81· 8fm〇i/孔)^
200302091 五、發明說明(20) 然而’ 0DQ顯著地抑制單獨之化合物3(〜基準值)以及SNp與 ,合物3之組合(〜21 4〇1/孔)的作用。此外,採用MTT測 试方法’細胞穿透性cGMP類似物二丁基-cGMP可以顯著地 逆轉SMP誘發的細胞凋亡(結果未顯示)。綜合而言,這些 數據顯示SNP誘發—獨立於cGMp的細胞凋亡反應,而化合 物3經、由一 CGMP依賴性訊息傳遞路徑而防止SNp之反應。 為測試是否P I 3 —激酶以及促細胞分裂劑活化之蛋白 負激酶(ΜAPK)與化合物3媒介之抗細胞凋亡有關,採用其 選擇性抑制物以確認其功能。ρ丨3 —激酶—沃氏藍酵素 (wortmannin)以及促細胞分裂劑活化之蛋白質激酶(ΜΕΚ) 抑制物-PD980 59可顯著地逆轉化合物3作用,此結果顯示 Ρ I 3 -激酶之活性可能對於化合物3引發之抗細胞凋亡扮演 者重要角色。 一般認為Ρ I 3 -激酶之脂質產物會以高親和性與專一 性結合至Akt/PKB ΡΗ部位,因而觸發細胞存活訊息路徑。 於本研究中’採用西方墨點分析測試磷酸化Akt之表現。 結果顯示不論是化合物3單獨或是其與SNp組合都誘發全面 性^破酸化Akt表現增加。這些效果會全面性地被0DQ與沃 氏監酵素抑制’因此,推測被化合物3誘發之Ρ I 3-激酶係 cGMP合成之下游反應。 ’、 測試SNP與化合物3對於Be 1-2含量與細胞色素c釋放反 應之效力。暴露於SNP( lmm〇i/L)可造成細胞質全面性 Be 1 -2表現的向下調節與細胞色素c的釋放。將細胞以化合 物3處理可完全地抑制SNp反應。然而,〇DQ及沃氏藍酵素σ
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可完全逆轉化合物3之抑制作用。這些妹止 Be 1 -2向下調節與細胞色素c釋放的抑 ”、、不 过之 P I 3激®母相關吼心傳遞路徑對於化合物3之作用。 將細胞暴露於SNP(1_1/L)後測試其硫脱氨酸蛋 3(caspase-3)活性。結果顯示SNP顯著地增加在RASMCS的 硫胱氨酸蛋白酶3活性;然而’化合物3完全抑制該酵素對 於SNP之活性。而且,化合物3媒介之抑制效果也分別部份 地,或顯著地,被0DQ與沃氏藍酵素所逆轉。當細胞凋亡 百分比與硫胱氨酸蛋白酶3活性再深入分析其相關性時, 可獲得一正向線性回歸與〇. 980的相關係數(Η值),推測硫 胱氨酸蛋白酶3活性對於S N P誘發效果與化合物3之抗細胞 〉周亡反應扮演著決定性的角色。 測試化合物1-22對於以SNP誘發培養VSMCs之細胞凋亡 的效力。1 6個化合物顯示對於S N P ( 1 m m ο 1 / L)誘發之細胞 凋亡有抑制作用。其中某些化合物甚至可以完全終止S N P 誘發之細胞凋亡。 體内試驗 為研究化合物3對於敗血症之治療潛力,採用LPS誘發 敗血症死亡之小鼠模式。對小鼠腹腔施予LPS( 60 mg/kg) 以造成1 0到2 8小時内的累積性死亡。然而,LPS施予後2小 時再以化合物3(10 mg/kg) 口服治療(即以化合物3後治療) 可顯著地增加小鼠之存活率(第1圖)。此外,這些存活的 小鼠在LPS處理後一個月仍然很有活力。 觀察體内動物試驗的組織學檢查結果。對照組小鼠顯
1057-5446>PF(N1).ptd 第27頁 200302091 五、發明說明(22) 示仍完整的肺臟組織的組織學外觀。LPS處理後28小時, 動物顯現損傷的血管以及由循環大量溢出血液細胞到肺臟 組織。然而,以化合物3後治療之健康小鼠族群顯示完整 的血管且不會有血液細胞滲溢的現象。 血管平滑肌細胞(VSMC)之細胞凋亡現象明顯地具有環 境依存性。已有許多研究是關於在動脈粥狀硬化症及創傷 後新生血管内膜形成時之VSMC細胞凋亡(Mai 1 at等人之 (1997)Circulation 96: 424-428 ;以及Newby 與 George(1996)之Curr Opin Cardiol. 11: 574-582);然 而,很少人關注此現象與敗血症的關係。NO在細胞凋亡之 作用係依細胞型態、細胞濃度、自由基環境,以及細胞之 氧化還原狀態等而異的(Yabuki等人( 1 99 7 )Free radical Res· 27:325-335 ;以及Filippov 等人(1997)J Clin Invest. 100:942-948)。化合物3以cGMP依存性方式抑制 SNP誘發之細胞凋亡作用係基於以下觀察:化合物3與SNP 組合會協同性增加c G Μ P合成,二丁基-c G Μ P有效率地模擬 化合物3媒介之作用,以及〇DQ顯著地逆轉化合物3之反 應。然而,在化合物3媒介之作用中仍然有約2 0%的0DQ不 反應作用。 Ν0誘發細胞毒性之機制推測包括粒線體呼吸鏈之不活 化,DNA損傷、以及Bel-2向下調節/Bax向上調節(Bolanos 等人(1997)J Neurochem. 68:2227-2240 ;以及Tamatani 等人( 1 998 )Cell Death Differ· 5:91 卜919)。如上述, SNP誘發一顯著之Be卜2蛋白向下調節而非影響Bax表現(數
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200302091 五、發明說明(24) 3媒介抗細胞凋亡反應具有微小影響(丨〇 7 ·丨± 3丨%對於 1 0 0 · 6 ± 5 · 5 %之細胞存活率於化合物3加上$ n p族群, p = 0.32,n = 7) ’此結果顯示PKC活性對於化合物3之反應無 關。 此外,結果顯不化合物3具有抑制Lps誘發小鼠敗血症 死亡之效果’特別疋貫驗係以化合物3之後治療進行。數 據顯示LPS處理小鼠有醫顯著降低死亡率。亦檢視其肺臟 組織’顯示肺衰竭係敗血症死亡之一重要原因。基於组 學檢查,結果顯示LPS處理後的動物顯現出損傷血管以及 大量血球細胞由循環滲露到肺組織。此外,小鼠以化合物 3後治療之族群顯示完整血管且無血球細胞滲露情形,以 及如常的活動力。 另外也對化合物3對於其他藥理學活性的效果進行檢 測。之丽研究指出,化合物3對於環氧酶活性沒有抑制作 用(Ko 等人( 1 994 )Bl〇〇d· 84:4226- 423 3 );本研究亦顯示 對於在NR8383巨噬細胞的LPS/干擾素誘發腫瘤壞死因子 α釋放(1 8 · 5 ± 1 · 2 n g / m L相對於對照組的1 5 · 5 土 1.3ng/mL,ρ = 0·13,n = 4)以及對於由黃嘌呤/黃嘌呤氧化 酶系統產生之過氧化物陰離子的細胞色素c還原反應(4〇 + 0.6%相對於對照組之42.0± 2.1%,p = 〇 4,n = 4)具有輕微 的抑制作用。此外,又採用穩定自由基丨,卜二笨基_2_苦 味酸胼對化合物3之自由基去除活性進行測試。化合物3顯 示輕微的自由基去除活性(數據未顯示)。於另一實驗中, 對鼠類巨噬細胞RAW264. 7細胞以LPS(1 g/mL)24小時刺激
第30頁 200302091 五、發明說明(25) ' 後,觀察到大量N 0形成。然而,化合物3在本研究中並未 干擾LPS引發的反應(53· 4 ± 12· 3 //mol/L亞硝酸鹽對廣於 對照組之6 8 · 8 ± 1 3 · 4 // mo 1 / L 亞硝酸鹽,P = 〇 · 4 3,n = 4 )。 這些結果顯示化合物3顯示出輕微的抗炎症、抗毒素、以 及抗LPS生成N0凡應之活性,而可歸納出這些作用有助於 化合物3媒介的動物存活。因此,基於以上討論,化合物3 對於小鼠之敗血症死亡具有抗細胞凋亡之重要角色。 表1 S N P,化合物3,以及〇 D Q對於大鼠大動脈平滑肌細胞 細胞存活之調控作用 處理 細胞存活率(%) η 對照组 100 土 0 6 SNP 49·3 士 4.4* 6 化合物3 111.3土 8.8 6 SNP+化合物3 102_9 士 8.1 + 6 ODQ 99.5 士 5.7 5 ODQ+化合物3 96.1 士 4_2 7 ODQ+SNP+化合物3 69·6±4.〇 斧 6 數據係以5到7個實驗之平均值± SEM表示,η代表獨立實驗 之數目。*Ρ<0· 001相對於對照組;+ Ρ<〇· 〇〇1相對於SNP組; #Ρ<0· 01相對於SNP加上化合物3組。 其他實施型態 本說明書所揭露的所有特徵可以做任意組合。本說明
第31胃 200302091 丨 五、發明說明(26) ^ 書所揭露之每一特徵可以具有相同、 〜 的替代性特徵所取代。因此,除非=同、或相似 露之特徵僅伤从 符別說明,不 目的 '、作為一般性相同或相似特徵之一則每一揭 上述,任何熟於此技藝人士去六 例不。 主要特徵,並且在不脫離本發明之精I解本發明之 本發明進行多種改變與修飾以適於各^ =疇之内,可對 如,構造相似於稠合吡嗓基化合物之化1 =或狀況。例 行本發明。因此,其他實施型態亦二=可以用於施 範圍之内。 s於本發明申請專利
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Claims (1)
- 200302091 六、申請專利範圍 1. 一種治療敗血症的方法,該方法包括投與一需要之 個體一有效劑量之式(I)稠合吡唑基化合物:A 為 Η、q 〜C6 烷基、或(CH2)n—(S^ ,其中 η 為 0、1、2、 R6 或3 ; Aq、Ar2、及Ar3各獨立為苯基、吼σ定基、噻吩基、咲 喃基、或吡咯基;以及 < 心、R2、R3、R4、R5、及R6各獨立為ΧΥΖ ;或心與心、或 R3與匕、或R5與心同時為(KCIUuO ;其中X為一鍵結或 烷基,Y 為一鍵結、0、S、0C(0)、0(:(0)((:4)^6(:(0)0、 C(0)0、C(0)S、C(0)NH KCONCrQ 烷基、NH、或NCrQ 烷 基、及Z為Η、鹵素、CN、N02、或q〜C6烷基;然而R3及匕 之至少一者不為Η。 2. 如申請專利範圍第1項所述之治療敗血症的方法, 其中Α為Η。 3. 如申請專利範圍第2項所述之治療敗血症的方法, 其中Αη為苯基。 4 ·如申請專利範圍第3項所述之治療敗血症的方法, 其中A r2為笨基。1057-5446-PF(Nl).ptd 第34頁 200302091 六、申請專利範圍 5 ·如申請專利範圍第4項所述之治療敗血症的方法, 其中心與匕各為Η。 6. 如申請專利範圍第3項所述之治療敗血症的方法, 其中A r 2為咲喃基。 7. 如申請專利範圍第6項所述之治療敗血症的方法, 其中心與匕各為Η。 8 ·如申請專利範圍第1項所述之治療敗血症的方法, t A (CH2)n— \r6 。 9 ·如申請專利範圍第8項所述之治療敗血症的方法, 其中Aq為苯基。 1 〇.如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法, 其中A r2為苯基。 1 1.如申請專利範圍第1 0項所述之治療敗血症的方 法,其中A r3為苯基。 1 2.如申請專利範圍第1 1項所述之治療敗血症的方 法,其中η為0或1。 1 3.如申請專利範圍第1 2項所述之治療敗血症的方 法’其中心、R2、R3、R4、R5、及h之一者為C00H、 COO-Ci 〜C6 烷基、CH20H、CN、N02、或 ii 素。 1 4.如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法, 其中A r2為呋喃基。 1 5.如申請專利範圍第1 4項所述之治療敗血症的方 法,其中A r3為笨基。1057-5446-PF(Nl).ptd 第35頁 200302091 六、申請專利範圍 1 6.如申請專利範圍第1 5項所述之治療敗血症的方 法,其中η為0或1。 1 7.如申請專利範圍第1 6項所述之治療敗血症的方 法,其中心、R2、R3、R4、R5、及R6之一者為C00H、 C00-Ci〜C6 烷基、CH20H、CN、N02、或 ii 素。 1 8 .如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法, 其中八]^3為苯基。 1 9.如申請專利範圍第9項所述之治療敗血症的方法, 其中η為0或1 。 2 0.如申請專利範圍第8項所述之治療敗血症的方法, 其中Aq為噻σ坐基。 一 2 1 .如申請專利範圍第2 0項所述之治療敗血症的方 法,其中Ar2為呋喃基。 2 2.如申請專利範圍第2 1項所述之治療敗血症的方 法,其中Ar3為苯基。 2 3.如申請專利範圍第2 2項所述之治療敗血症的方 法,其中η為0或1 。 2 4.如申請專利範圍第2 3項所述之治療敗血症的方 法,其中心、R2、R3、R4、心、及心之一者為C〇〇H、 coo-q 〜C6 烷基、CH20H、CN、N02、或鹵素。 2 5.如申請專利範圍第1項所述之治療敗血症的方法, 其中該化合物係1057-5446-PF(Nl).ptd 第36頁 2003020911057-5446-PF(Nl).ptd 第37頁 200302091 六、申請專利範圍 喃基、或吡咯基;以及 &、R2、R3、R4、R5、及R6各獨立為XYZ ;其中X為鍵或 烷基,Y 為鍵、0、S、0C(0)、0C(0)(CH2V6C(0)0、 C(0)0、C(0)S、C(0)NH 烷基、NH、或NCrQ 烷 基、及Z為H、鹵素、CN、N02、或C!〜C6烷基;但是Ri與匕一 起或R5與〜一起任意為0((^)^0 ;及又但是X必須為R,Y必 須為0(:(0)((:[12)卜6(:(0)0,及1^及1?4之一者中之2必須為1]或 q〜C6烧基。2 7.如申請專利範圍第2 6項所述之治療敗血症的方 法,其中A為 2 8.如申請專利範圍第2 7項所述之治療敗血症的方 法,其中Aq為苯基。 2 9.如申請專利範圍第2 8項所述之治療敗血症的方 法,其中A r2為呋喃基。 3 〇.如申請專利範圍第2 9項所述之治療敗血症的方 法,其中A r3為笨基。 3 1.如申請專利範圍第3 0項所述之治療敗血症的方 法’其中、匕、及h之一者為Η。 3 2.如申請專利範圍第3 1項所述之治療敗血症的方 法,其中R3與匕之一者為Η。 3 3.如申請專利範圍第3 2項所述之治療敗血症的方 法,其中η為0或1 。 3 4.如申請專利範圍第3 3項所述之治療敗血症的方1057-5446-PF(Nl).ptd 第38頁 200302091 六、申請專利範圍 法,其中R3與R 0,以及Z 為Η。4 另一者係X 為CH2,Υ 必為oc(o)ch2ch2c(o) 3 5· —種抑制 μ 之個體一右μ + 官細胞洞亡之方法,包括投與一需要 心卿月丑 頁政劑晉a / 里 < 式(I )稠合吡唑基化合物:其中η為0 Α為Η、(:丨〜(:6烷基、或(ch^—^T^5 2、或 3 ; 、6 Αη、A。、及Aq各獨立為苯基、吡啶基、·噻吩基、呋 喃基、或D比洛基;以及 心、R2、R3、R4、R5、及R6各獨立為χγζ ;或心與心、或 R3與R4、或R5與匕同時為OCCHJhO ;其中X為一鍵結或(^〜心 烷基,Y 為一鍵結、0、S、0C(0)、OCCOKCI^hCKCOO、 C(0)0、C(0)S、C(0)NH 'CXOWCrCe 烷基、NH、或叫〜〇6烷 基、及Z為Η、鹵素、CN、N02、或(:厂(:6烷基;然而R3及R4 之至少一者不為Η。1057-5446-PF(Nl).ptd 第39頁
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