KR20030095197A

KR20030095197A - 패혈증의 치료 방법

Info

Publication number: KR20030095197A
Application number: KR10-2003-0004548A
Authority: KR
Inventors: 텡체-밍; 판쉬오우-린; 규지-화; 쿠오쉥-츄; 리팡-얀
Original assignee: 융신 파마슈티칼 인더스트리얼 컴파니 리미티드
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2003-12-18
Also published as: TW200302091A; ATE386025T1; US20030181502A1; DE60319021T2; DE60319021D1; EP1331223A1; US6943186B2; TWI264304B; US20050187257A1; JP2003238405A; EP1331223B1

Abstract

본 발명은 패혈증의 치료 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 하기 일반식(I)의 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다:

상기 일반식(I)에서,

A는 H, C₁~C₆알킬 또는이고; 여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3이고;

Ar₁, Ar₂, 및 Ar₃은 각각 독립적으로 페닐, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 XYZ이거나; 또는 R₁과 R₂가 함께, R₃과 R₄가 함께, 또는 R₅와 R₆이 함께 O(CH₂)_1-6O를 형성하고; 여기서 X는 결합또는 C₁~C₆알킬이고, Y는 결합, O, S, OC(O), OC(O)CH₂)_1-6C(O)O, C(O)O, C(O)S, C(O)NH, C(O)NC₁~C₆알킬, NH, 또는 NC₁~C₆알킬이고, Z는 H, 할로겐, CN, NO₂, 또는 C₁~C₆알킬이고; 단, 상기 조건은 R₃및 R₄중 하나는 H가 아닌 것을 전제로 한다.

Description

패혈증의 치료 방법 {METHODS OF TREATING SEPSIS}

본 출원은 2002년 1월 25일자로 출원된 미국 가출원 번호 제60/351,788호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 본 발명에 참고로 인용된다.

패혈증은 기관의 기능장애에 대한 전신성 염증 반응에서 다수 기관의 기능부전에 이르러, 궁극적으로는 사망에 이르는 질환에 걸쳐 분포한다. 이에 대해서는 예를 들면, Stone(1994)Science264: 365-367; Stone(1994)Science264: 365-367; Karimaet al.(1999)Mol Med Today5: 123-132; 및 Parrilloet al.(1990)Ann Int Med. 113: 227-242를 참조한다. 패혈증을 예방하기 위하여, 항산화제, 소염제, 및 지질다당류(LPS)에 의해 유도되는 질소 산화물(NO) 합성의 저해제를 포함한 화합물들에 대해 많은 연구가 수행되어 왔다. 이에 대해서는 예는 들면 Ortolaniet al.(2000)Am J Respir Crit Care Med. 161: 1907-1911; Koxetal.(2000)Intensive Care Med.26: S124-128; 및 Boyleet al.(2000)Circ Res. 87: E18-24를 참조한다. 이러한 연구의 결과는 만족스럽지 못했다(Glauser (2000)Crit Care Med. 28: S4-8).

몇몇 데이터에 따르면 다량의 NO가 패혈증에서의 혈관 기능부전의 병인에 기여하는 것으로 나타나 있다(Rees(1995)Biochem Soc Trans. 23: 1025-1029). 생체내에서, 다량의 NO는 다음으로부터 기인한다: (i) 패혈증과 같은 중증 발병 후 내피에서의 NO의 과대 합성(예를 들면, Ochoaet al.(1991)Ann Surg. 214: 621-626; Nakatsu & Diamond(1989)Can J Physiol Pharmacol. 67: 251-262; 및 Guhet al.(1998) Mol Pharmacol. 53: 467-474 참조); 및 (ii) 박테리아 산물(예를 들면, LPS) 또는 염증성 사이토카인(예를 들면, 인터루킨-1 및 종양 괴사 인자-I)에 대한 세포 반응으로서 유도성 NO 합성(iNOS)의 상향-조절(up-regulation)(예를 들면, Curranet al.(1989)J Exp Med.170: 1769-1774; 및 Nakayamaet al.(1992)Am J Respir Cell Mol Biol.7: 471-476 참조). 산화성 손상의 원인이 되는 퍼옥시니트라이트를 생성하는 초과산화물과 반응할 수 있는 것은 전혀 없다(Szabo(1996)Shock. 6: 79-88). 퍼옥시니트라이트 또한 혈관 세포의 세포자멸과 관련된 것으로 보고되어 있다(Cuzzocreaet al.(1998)Br J Pharmacol. 123: 525-537).

혈관 세포의 세포자멸을 저해하고, 이를 통해 혈관 및 다수 기관의 기능부전을 예방하는 화합물이 패혈증 또는 패혈증과 관련된 증후의 치료 또는 예방용 약물 후보들이다.

본 발명은 혈관 세포의 세포자멸을 저해하고, 이를 통해 혈관 및 다수 기관의 기능부전을 예방하는 패혈증 또는 패혈증과 관련된 증후의 치료 또는 예방용 약제를 제공하고자 한다.

도 1은 LPS에 의해 유도된 패혈증을 갖고 있는 마우스의 생존에 대한 화합물 3의 투여 효과를 나타낸다(실선: 비히클; 장점선: LPS를 주입하고 2시간 후 투여; 및 단점선: LPS를 주입하고 6시간 후 투여).

한 양태에서, 본 발명은 패혈증의 치료 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 하기 일반식(I)의 융합된 피라졸릴 화합물을 이를 필요로 하는 대상(예를 들면, 포유류, 인간 또는 동물)에세 투여하는 단계를 포함한다:

@청구항 1. (CH₂)_1-6은 분지형 또는 선형일 수 있다. 상기에 기재한 임의의 치환기에 나타낸 왼편의 아암(arm)이 융합된 파라졸릴 고리에 가장 근접하다는 점을 유의한다. 또한, 하나 이상의 R 모이어티가 존재하는 경우, R 모이어티는 서로 동일하거나 상이할 수 있음도 유의한다.

일반식(I)과 관련하여, 융합된 피라졸릴 화합물의 부분 집합은 A가 H이고, Ar₁는 페닐이고, Ar₂는 페닐 또는 푸릴이고, R₁및 R₂은 각각 H인 것들이다.

융합된 피라졸릴 화합물의 다른 부분 집합은 A가 (CH₂)_nAr₃(R₅)(R₆)이고, Ar₁은 페닐 또는 티에닐이고, Ar₂는 페닐 또는 푸릴이고, Ar₃은 페닐이고, n은 0 또는 1인 것들이다. 몇몇 구현예에서, R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆중 하나는 COOH, COO-C₁~C₆알킬, CH₂OH, CN, NO₂, 또는 할로겐이다.

본 명세서에서 사용되는 "Ar"이란 용어는 아릴 및 헤테로아릴기를 의미한다. 아릴은 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템이다. 아릴의 예로는 페닐이 있다. 헤테로아릴은 O, N, 또는 S와 같은 적어도 하나의 이종원자를 함유하는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템을 의미한다. 헤테로아릴 모이어티의 예로는 비제한적으로, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이 포함된다. 따라서, Ar에는 선택적으로 각각 1개, 2개, 3개 또는 그 이상의 치환기를 포함하는 페닐, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이 포함된다. 이상에서 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆에 대해 지정된 것들 외에도, 치환기는 아미노, 하이드록실, 메르캡토, C₂~C₆알케닐, C₂~C₆알키닐, C₁~C₆알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릴, 또는 헤테로사이클릴일 수 있으며, 여기서 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 사이클릴, 및 헤테로사이클릴은 C₁~C₆알킬, 할로겐, 아미노, 하이드록실, 메르캡토, 시아노, 또는 니트로로 선택적으로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "알킬"이라는 용어는 선형 및 분지형 알킬 모두를 포함하며, 이들은 상기에 기재된 치환된 모이어티를 하나 이상 선택적으로 포함한다. 아릴이란 용어는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템 (모노-사이클 또는 바이-사이클)을 의미한다. 아릴 모이어티의 예에는 비제한적으로, 페닐, 나프틸, 및 피레닐이 포함된다. "헤테로아릴"이란 용어는 고리 시스템의 일부로서 O, N, 또는 S와 같은 적어도 하나의 이종원자를 함유하는 적어도 하나의 방향족 고리를 갖는 탄화수소 고리 시스템 (모노-사이클 또는 바이-사이클)을 의미한다. 헤테로아릴 모이어티의 예로는 비제한적으로, 푸릴, 피롤릴, 티에닐, 옥사졸릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 피리디닐, 피리미디닐, 퀴나졸리닐, 및 인돌릴이 포함된다. "사이클릴" 및 "헤테로사이클릴"이란 용어는 4개 내지 14개의 고리원자를 갖는 부분적으로 또는 완전히 포화된 모노-사이클 또는 바이-사이클 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴 고리는 고리 시스템의 일부로서 하나 이상의 이종원자(예를 들면, O, N, 또는 S)를 함유한다. 대표적인 사이클릴 및 헤테로사이클릴 고리로는 사이클로헥산, 피페리딘, 피페라진, 모르폴린, 티오모르폴린, 1,4-옥사제판이 있다.

본 발명의 방법을 실시하는 데 사용될 수 있는 융합된 피라졸릴 화합물의 특정한 예의 일부를 이하에 제시한다:

다른 양태에서, 본 발명은 일반식(I)의 화합물을 특징으로 하며, 상기 일반식(I)에서

상기 일반식(I)에서,

A는 H, C₁~C₆알킬 또는이고; 여기서 n은 0, 1, 2, 또는3이고;

Ar₁, Ar₂, 및 Ar₃은 독립적으로 페닐, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 XYZ이고; 여기서 X는 결합 또는 C₁~C₆알킬이고, Y는 결합, O, S, OC(O), OC(O)(CH₂)_1-6C(O)O, C(O)O, C(O)S, C(O)NH, C(O)NC₁~C₆알킬, NH, 또는 NC₁~C₆알킬이고, Z는 H, 할로겐, CN, NO₂, 또는 C₁~C₆알킬이며; 단, 상기 조건은 선택적으로 R₁과 R₂가 함께, 또는 R₅와 R₆이 함께 O(CH₂)_1-6O를 형성하는 것을 전제로 하며; 또한, R₃및 R₄중 하나에서 X는 C₁~C₆알킬이어야 하고, Y는 OC(O)(CH₂)_1-6C(O)O이어야 하며, Z는 H 또는 C₁~C₆알킬인 것을 전제로 한다. (CH₂)_1-6은 분지형 또는 선형일 수 있다.

이상에서 기재된 본 발명의 융합된 피라졸릴 화합물의 부분 집합으로는 A는 (CH₂)_nAr₃(R₅)(R₆)이고, Ar₁은 페닐이고, Ar₂는 푸릴이고, Ar₃은 페닐이고, n은 0 또는 1이고, R₁, R₂, R₅, 및 R₆각각은 H이고, R₃및 R₄중 하나는 H인 것들이 있다. 본 발명의 대표적인 화합물로는 화합물 9가 있다.

상기에 기재된 융합된 피라졸릴 화합물에는 상기 화합물들 자체뿐 아니라, 적용 가능한 경우 그들의 염 및 그들의 프로드러그도 포함된다. 예를 들면, 이러한 염들은 융합된 피라졸릴 화합물 상의 음전하를 띠는 치환기(예를 들면, 카르복실레이트) 및 양이온 사이에서 형성될 수 있다. 적합한 양이온으로는 비제한적으로, 나트륨 이온, 칼륨 이온, 마그네슘 이온, 칼슘 이온, 및 테트라메틸암모늄 이온과 같은 암모늄 양이온이 포함된다. 마찬가지로, 양전하를 띠는 치환기(예를 들면, 아미노)는 음전하를 띠는 반대이온과 염을 형성할 수 있다. 적합한 반대이온에는 비제한적으로, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 설페이트, 니트라이트, 포스페이트 또는 아세테이트가 포함된다. 프로드러그의 예로는 대상에 투여되는 경우, 상기에 기재된 융합된 피라졸릴 화합물을 제공할 수 있는 에스테르 및 기타 제약학적으로 허용 가능한 유도체가 포함된다(Goodman 및 Gilman's, The Pharmacological basis of Therapeutics, 8th ed., McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs" 참조).

또한, 본 명세서에 제시된 몇몇 융합된 피라졸릴 화합물은 하나 이상의 이중결합을 갖는다. 이러한 화합물들은 라세미체, 라세미 혼합물, 단일 거울상 이성질체, 개별적인 부분 입체 이성질체, 부분 입체 이성질체의 혼합물 및 cis- 또는 trans- 또는E-또는Z-이중 이성질체 형태로서 발생할 수 있다.

나아가, 상술된 융합된 피라졸릴 화합물은 그들의N-산화물도 포함한다.N-산화물이란 용어는 질소 원자를 의미하며, 이는 융합된 피라졸릴 화합물 내에 존재하는 경우,N→산화물의 형태, 즉N→O이다.

본 발명에 의해 구상되는 치환기 및 변이체의 조합은 안정된 융합된 피라졸릴 화합물을 형성하는 것들이다. 본 명세서에서 사용되는 "안정된"이란 용어는 제조가 가능할 정도의 충분한 안정성을 제공하며, 충분한 시간 동안 본 명세서에 상세히 기재된 목적(예를 들면, 패혈증)으로 유용한 화합물의 통합성을 유지하는 화합물을 의미한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 혈관 세포의 세포자멸을 저해하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 이상에서 제시된 융합된 하나 이상의 피라졸릴 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상(예를 들면, 포유류, 인간, 또는 동물)에게 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명의 범위 내에는 상술한 화합물의 패혈증 치료용 약제의 제조를 위한 용도가 포함된다.

본 발명의 그 밖의 특징들, 목적들 및 장점들은 이하의 상세한 설명 및 도면, 그리고 특허청구범위를 통해 명확해질 것이다.

이상에 설명된 융합된 피라졸릴 화합물은 당업자들에게 공지된 방법들에 의해 제조될 수 있다(예를 들면, 미국특허 제5,574,168호 참조). 이러한 방법에는 다음과 같은 경로가 포함된다: 먼저 아릴카르보닐 클로라이드와 다른 아릴 화합물을 커플링시켜 아릴 아릴 케톤을 제조한다. 아릴 화합물 중 하나는 선택적으로 단일-치환되거나 다중-치환된다. 그런 다음, 케톤을 아릴알킬히드라진(또는 알킬히드라진, 히드라진)과 반응시켜 3개(또는 2개)의 아릴기를 함유하는 히드라존을 제조한다. 이때 그의 아릴기도 선택적으로 단일-치환되거나 다중-치환된다. 히드라존기를 알킬렌 결합제를 통해 융합된 피라졸릴 코어로 변형시키고, 다른 아릴기는 피라졸릴 코어의 4-C 및 5-C에 융합시키며, 제3의 아릴기는 피라졸릴 코어의 3-C에 직접 연결한다. 융합된 피라졸릴 화합물의 유도체들은 아릴기 중 하나의 치환기를변형시킴으로써 얻을 수 있다.

상술된 합성 경로에 사용되는 화학물질은 예를 들면, 용매, 반응제, 촉매, 그리고 보호기 및 탈보호기 반응제를 포함할 수 있다. 상술한 방법은 본 명세서에 구체적으로 기재된 단계의 전후에, 궁극적으로 융합된 피라졸릴 화합물을 합성하기 위하여 적합한 보호기를 부가 또는 제거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 다양한 합성 단계들은 원하는 화합물을 얻기 위하여 교체된 차례 또는 순서로 수행될 수 있다. 적합한 융합된 피라졸릴 화합물을 합성하는 데 유용한 합성 화학 변형 및 보호기 방법론(보호 및 탈보호)은 당 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 R. Larock,Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers(1989); T.W. Greene 및 P.G.M. Wuts,Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley 및 그의 제자들(1999); L. Fieser 및 M. Fieser,Fieser and Fiesers Reagents for Organic Synthesis, John Wiley 및 그의 제자들(1994); 및 L. Paquette, ed.,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley 및 그의 제자들(1995) 및 그 개정판들이 있다.

이렇게 합성된 융합된 피라졸릴 화합물은 속성 칼럼 크로마토그래피(flash column chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 또는 결정화를 통해 추가 정제될 수 있다.

본 발명의 한 양태는 패혈증의 치료 방법이다. 상기 방법은 상술한 하나 이상의 융합된 피라졸릴 화합물의 유효량 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함한다. "치료"란 용어는 패혈증, 패혈증의 증후 또는 패혈증에 대한 경향을 치유, 치료, 완화, 경감, 개선, 구제, 개량, 향상 또는 영향을 주기 위한 목적으로 대상에 유합된 피라졸릴 화합물을 이용하는 것을 의미한다. "유효량"이란 이를 필요로 하는 대상에게 투여되는 경우, 대상에 대해 치료 효과를 제공하는 데 요구되는 융합된 피라졸릴 화합물의 함량으로 정의된다. 융합된 피라졸릴 화합물의 유효량은 약 0.1 mg/Kg 내지 약 100 mg/Kg 범위일 수 있다. 유효 용량은 당업자들이 인지하고 있는 바와 같이, 투여 경로, 부형제 사용, 및 패혈증의 치료를 위한 기타 제제들과의 공동 사용 가능성에 따라 가변적일 것이다.

본 발명의 방법을 실시하기 위하여, 융합된 피라졸릴 화합물은 경구, 비경구, 흡입 분사 또는 삽입 저장기를 통해 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "비경구"란 용어는 피하, 경피, 경정맥, 근육내, 관절내, 동맥내, 활액내, 흉골내, 경막내, 병소내, 및 두개골내 또는 주입 기술을 내포한다.

경구 투여용 조성물은 비제한적으로, 정제, 캡슐, 에멀젼 및 수계 현택액을 포함하는 경구용으로 적합한 임의의 투약 형태일 수 있다. 보편적으로 사용되는 정제용 담체에는 락토오스 및 옥수수 전분이 포함된다. 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제도 통상적으로 정제에 점가된다. 캡슐 형태의 경구 투여용으로 유용한 희석제에는 락토오스 및 건조 옥수수 전분이 포함된다. 수계 현탁액 또는 에멀젼이 경구로 투여되는 경우, 활성 성분은 유화제 또는 현탁화제와 조합된 유상에 현탁 또는 용해될 수 있다. 원하는 경우에는, 감미제, 향료, 또는 착색제를 첨가할 수도 있다.

주사용 살균 조성물(예를 들면, 수계 또는 유계 현탁액)은 당 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적합한 분산제 또는 습식제(예를 들면, Tween 80)를 이용해 제형화될 수 있다. 주사용 살균 제제는 무독성으로서 비경구용을 허용 가능한 희석제 또는 용매, 예를 들면 1,3-부탄디올 내의 주사용 살균 용액 또는 현탁액일 수 있다. 활용 가능한 적합한 비히클 및 용매로는 만니톨, 물, 링거 용액 및 염화나트륨 등장액이 있다. 또한, 살균된 고정 오일도 통상적으로 용매 또는 현탁용 매질(예를 들면, 합성된 모노-글리세라이드 또는 디-글리세라이드)로 활용된다. 올레산 및 그의 글리세라이드와 같은 지방산은 올리브유 또는 캐스터 오일과 같이 제약학적으로 허용 가능한 천연 오일이기 때문에, 주사액의 제제에 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁액은 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제, 혹은 카르복시메틸 셀룰로오스 또는 이와 유사한 분산제들을 추가로 함유할 수 있다.

흡입 용액은 제약 분야에 공지된 기술에 따라 제조될 수 있으며, 당 기술 분야에 공지된 벤질 알콜 또는 기타 적합한 보존제를 활용하는 식염수 중의 용액, 생체 이용율을 향상시키는 흡수 촉진제, 플루오로카본 및/또는 기타 가용화제 또는 분산제로 제조될 수 있다.

약제 조성물 내의 담체는 제형의 활성 성분과의 혼화성(및 바람직하게는 이들 활성 성분의 안정화) 측면에서 허용 가능한 것이어야 하고, 처리되는 대상에게 해롭지 않아야 한다. 예를 들면, 사이클로텍스트린과 같은 (융합된 피라졸릴 화합물과 특이적이고 보다 가용성인 복합체를 형성하는) 가용화제가 융합된 피라졸릴 화합물의 전달을 위한 약제 부형제로서 이용될 수 있다. 그 밖의 담체의 예로는콜로이드성 실리콘 이산화물, 마그네슘 스테아레이트, 셀룰로오스, 나트륨 라우릴설페이트, 및 D&C Yellow #10이 포함된다.

혈관 세포의 세포자멸을 저해하는 데 있어서의 융합된 피라졸릴 화합물의 효능을 예비적으로 평가하기 위하여 적합한 생체내 분석을 이용할 수 있다. 당 기술 분야에 공지된 다음과 같은 절차에 따라 생체내 스크리닝을 수행할 수도 있다. 이에 관해서는 이하의 특징적인 실시예를 참조한다.

추가의 상세한 설명 없이도, 이상의 설명으로도 본 발명을 적절히 구현할 수 있을 것으로 여겨진다. 따라서, 하기의 특징적인 구현예는 단지 예시를 위한 것으로서, 어떠한 방식으로든 본 개시의 나머지 부분을 제한하지 않는다. 특허를 포함하여, 본 명세서에 인용된 모든 문헌은 완전히 본 발명에 참고로 인용된다.

방법

세포 배양 래트의 대동맥 평활근 세포(RASMCs)를 Sprague-Dawley 래트로부터 준비하고, 상기에 기재한 바와 같이(Yang et al. (2001) Br J Pharmacol. 132: 1531-1541) 10% FBS, 100 유닛/㎖ 페니실린 및 100 μg/㎖ 스트렙토마이신(Gibco, Grandisland, NY)이 강화된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM) 내에서 배양하였다. 본 연구에는 6세대 이내의 세포들을 사용하였다. 평활근 α-액틴에 대해 특이적인 단일 클론 항체를 이용해 면역염색하여 평활근 세포를 동정하였다.

세포독성 분석 MTT 분석법을 이용해 세포독성을 분석하였다. MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드, Sigma Chemical, St. Louis, MO)를 5 mg/㎖ 농도의 여과된 포스페이트-완충 염수(PBS)(Millipore,Bedford, MA)에 용해시켰다. 이 모액으로부터, 10 ㎕/100 ㎕의 배지를 플레이트의 각각의 웰에 점가하고, 플레이트를 서서히 교반하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. MTT로 살아있는 세포를 처리한 경우에는 짙은 파란색의 포르마잔 산물이 생성된 반면, 죽은 세포에서는 염색이 전혀 관찰되지 않았다. MTT를 로딩한 후, 배지를 100 ㎕의 디메틸설폭사이드(DMSO)로 교체하였다. 세포 내에서 MTT의 포르마잔으로의 환원 정도는 효소-결합 면역흡수 분석(ELISA) 판독기를 이용한 OD₅₅₀의 측정을 통해 정량하였다.

자멸 세포의 원위치 표지 상기에 기재한 바와 같이(Guhet al. (1998)Mol Pharmacol. 53: 467-474) 세포자멸 검출 키트(Promega, Madison, WI, USA)를 이용한 말단 데옥시뉴클레오타이드 트랜스퍼라제(TdT) dUTP 균열-단부 표지(TUNEL)를 이용해 자멸 세포의 원위치 검출을 수행하였다. TUNEL 방법은 바이오틴-dUTP을 절단된 DNA의 3'-OH로 전달하는 TdT를 이용해 원위치에서 자멸 세포를 동정한다. 이어서, 플루오레세인-접합된 아비딘(아비딘-플루오레세인 이소티오시아네이트)과의 반응을 통해 바이오틴-표지된 절단 자리를 가시화하였다. 형광 현미경(Nikon)을 이용해 현미경 사진을 얻었다.

cGMP 함유량 분석 합류 시, 지정된 제제를 이용해 10분 동안 단층 세포를 배양하였다. 이어서, 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 0.5 ㎖의 NaOH(0.1 mol/ℓ)로 용균시켰다. 그런 다음, 0.5 ㎖의 HCl(0.1 mol/ℓ)을 첨가해 분석 용액을 중화하였다. 농축 후(3,000 ± g, 3분), 상청액을 이용해 cGMP ELISA 키트로 cGMP함유량을 검출하였다.

카스패스-3 활성 측정 카스패스-3 열량 분석 키트(R&D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota)를 이용해 카스패스-3 활성을 분석하였다. 세포에 지정된 제제를 10시간 동안 처리한 후, 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 트립신을 처리한 후, 원심분리하고(800 ± g, 5분), 세포 펠릿을 카스패스-3 열량 분석 키트로부터 얻어진 사전-냉각된 용균 완충액에 재현탁하였다. 얼음 상에서 10분 동안 배양한 후, 세포 균질물을 10,000 ± g로 1분 동안 원심분리하고, 카스패스-3 활성을 측정하기 위하여 상청액을 제거하였다. 50 ㎕의 사이토졸 추출물 및 키트로부터 얻어진 5 ㎕의 DEVD-pNA를 함유하는 총 부피 100 ㎕의 반응 완충액 내에서 단백질 분해 반응을 수행하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배약하고, 405 nm에서 ELISA VKS독기를 이용해 p-니트로아닐린의 형성을 측정하였다.

사이토크롬 c 방출 반응 검출 세포에 트립신을 처리하고, 800 ± g로 10분 동안 원심분리하였다. 이어서, 세포 펠릿을 20 mmol/ℓ의 HEPES, pH 7.5, 10 mmol/ℓ의 KCl, 1.5 mmol/ℓ의 MgCl2, 1 mmol/ℓ의 EDTA, 1 mmol/ℓ의 EGTA, 1 mmol/ℓ의 디티트레톨, 1 mmol/ℓ의 PMSF를 함유하는 추출 완충액 50 ㎕에 재현탁하고, 얼음 상에서 3분 동안 배양하였다. 세포를 30회 젖고, 4℃에서 15,000 ± g로 15분 동안 원심분리하였다. 20 mg의 단백질 분액을 15% SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분해한 뒤, PVDF막으로 블롯팅하였다. 막을 항-사이토크롬 C 단일 클론 항체와 함께 배양하였다. 이어서, 막을 항-마우스 IgG와 함께 배양하고, 상기에서와 같이 사이토크롬 CDML 발현을 검출하였다.

웨스턴 블롯 분석 세포를 지정된 제제에 4시간(Bcl-2의 경우) 또는 6시간(사이토크롬 c의 경우) 동안 노출시킨 후, 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고, 100 ㎕의 차가운 용균 완충액(10 mmol/ℓ 트리스-HCl, pH 7.4, 150 mmol/ℓ NaCl, 1 mmol/ℓ EGTA, 0.5 mmol/ℓ 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF), 10 ㎍/㎖ 아프로티닌, 10 ㎍/㎖의 류펩틴, 및 1% 트리톤 X-100)을 첨가해 반응을 종결지었다. 인산화된 Akt를 검출하기 위하여, 1 mmol/ℓ Na₃VO₄, 1 mmol/ℓ NaF, 50 mmol/ℓ 테트라소듐 피로포스페이트, 10 nmol/ℓ 오카다산, 0.25% 소듐 데옥시콜레이트를 용균 완충액 내에서 배양하였다. 바이오-라드 단백질 분석(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)을 통해 단백질 함유량을 측정하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 세포 용균물(25 ㎍/레인)을 10-15% SDS-폴리아크릴아미드겔 상에서 전기영동시키고, 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. 막을 항-Bcl-2 또는 항-α-튜불린 단일 클론 항체, 혹은 항-인산화 Akt 다중 클론 항체로 탐침을 달았다. 옮겨진 막을 상기에 기재한 바와 같이(Guh et al. (1998) Eur J Pharmacol. 359: 281-284) 2차 항-마우스 또는 항-토끼 항체와 함께 전개시켰다. 향상된 화학발광 검출 키트(ECL; Amersham International, Little Chalfont, U.K.)를 이용해 신호 검출을 수행하였다.

내독성 쇼크의 유도 및 조직학적 조사 본 실험에서, 마우스(25-30 g, ICR 균주)에게 60 mg/kg의 LPS(PBS 용해됨)을 복막내 주사하고, LPS를 투여한 후 2시간 및 6시간 동안 화합물 3(카르복시메틸 셀룰로오스에 현탁됨)을 경구를 통해 투여하였다. 생존한 래트를 LPS를 주사한 후 매3시간 내지 6시간마다 감시하였다. 조직학적 조사를 위하여, 폐 조직을 4% 파라포름알데하이드에 넣고, 파라핀 중에 넣어 둔 조직을 6 ㎛ 두께로 절편하고, 페마톡실린-에오신으로 염색한 뒤, 현미경을 이용해 분석하였다.

통계학적 분석 데이터는 지정된 수의 개별적인 실험에 대한 평균±SEM으로 나타내었다. 조건 가변수(variance)의 1차 분석(ANOVA)을 이용해 통계학적 분석을 수행한 결과, t-테스트 및 p값이 유의하게 나타났다.

결과

생체내 분석

먼저, 배양된 RASMC 내에서 소듐 니트로프루사이트(SNP)-유도된 세포자멸에 대한 화합물 3의 효과를 조사하였다. 데이터를 보면 SNP(1 mmol/ℓ)이 MTT 분석법 및 TUNEL-반응 기술로 측정 시, 뚜렷한 세포자멸을 유도하는 것으로 나타나 있다. 그러나, 화합물 3(30 μmol/ℓ)은 SNP-유도된 세포자멸을 완전히 제거하였다. 흥미롭게도, 가용성 구아닐릴 사이클라제의 저해제인 ODQ는 SNP-유도된 세포자멸에 대해서는 영향을 전혀 나타내지 않았으나, 화합물 3-매개의 항-세포자멸 반응(표 1 참조)은 유의하게 역전시켰으며, 이는 가용성 구아닐릴 사이클라제의 활성화가 SNP-유도된 세포자멸 반응 이외의 화합물 3-매개의 항세포자멸에 관여함을 시사한다.

본 연구에서는 세포내 cGMP 수준도 분석하였다. 화합물 3 단독으로도 cGMP 합성을 현저히 증가시켰다(4.2±0.8 fmol/웰, 바탕값 2.3±0.3 fmol/웰). 부가적으로, SNP 및 화합물 3의 조합물은 이러한 환형 뉴클레오타이드의 증가를 상승적으로 6배 이상 이끌어냈다(252.8±81.8 fmol/웰). 그러나, ODQ는 화합물 3 단독의 효과(~바탕값) 및 SNP와 화합물 3의 공동 작용(~21 fmol/웰)을 유의하게 저해하였다. 나아가, MTT 분석법을 이용하여 세포-투과성 cGMP 유사체 디부틸-cGMP는 SNP-유도된 세포자멸을 유의하게 역전시킬 수 있었다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 데이터를 조합해 보면, SNP은 cGMP-비의존성 세포자멸 반응을 유도하는 반면, 화합물 3은 cGMP-의존적 신호전달 경로를 통해 SNP 작용을 방해함을 알 수 있다.

PI 3-키나제 및 마이코겐-활성화 단백질 키나제(MAPK)가 화합물 3-매개의 항-세포자멸과 관련되어 있는지의 여부를 조사하기 위하여, 작용을 측정하기 위하여 그들의 선택적 저해제를 이용하였다. PI 3-키나제 저해제, 워트마닌, 및 마이토겐-활성화 단백질 키나제(MEK) 저해제, PD98059는 화합물 3의 작용을 유의하게 역전시켰으며, 이는 PI 3-키나제의 작용이 화합물 3-유도된 항-세포자멸 효과에 있어 중추적인 역할을 담당할 수 있음을 시사한다.

이는 PI 3-키나제의 지질 산물이 고도의 친화성 및 특이성을 가지고 Akt/PKB PH 도메인에 결합한 뒤, 세포 생존 신호전달 경로를 개시함을 시사한다. 본 연구에서, 인산화 Akt 발현은 웨스턴 블롯팅 분석을 이용해 조사하였다. 그 결과 화합물 3 단독 및 화합물 3과 SNP의 조합물 모두 인산화 Akt 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 이러한 효과는 ODQ 및 워트마닌에 의해 현저히 저해되었으며, 이는 화합물 3에 의해 유도되는 PI 3-키나제의 활성화가 cGMP 합성을 저하시킴을 시사한다.

Bcl-2 수준 및 사이크롬 c 방출 반응에 대한 SNP 및 화합물 3의 효과를 연구하였다. SNP(1 mmol/ℓ) 노출은 Bcl-2 발현 및 사이토크롬c의 사이토졸로의 방출을 유발하였다. SNP의 작용은 세포를 화합물 3으로 처리하는 경우 완전히 예방되었다. 그러나, ODQ 및 워트마닌은 화합물 3에 대한 예방 작용을 완전히 역전시켰다. 이러한 데이터는 화합물 3으로의 cGMP-의존성 PI 3-키나제-관련 신호전달 경로가 SNP에 의해 초래되는 Bcl-2 하향-조절 및 사이토크롬c방출의 방지에 기여함을 시사한다.

SNP(1 mmol/ℓ)에 세포를 노출시킨 추 카스패스-3 활성을 측정하였다. 그 결과 SNP는 RASMC 내에서 카스패스-3의 활성을 유의하게 증가시켰으나; 화합물 3 은 SNP 작용에 대한 이러한 효소 활성을 완전히 저해하였다. 더욱이, 화합물 3-매개의 저해 효과도 ODQ 및 워트마닌 각각에 의해 부분적으로, 그러나 유의하게 역전되었다. 세포자멸 백분율 및 카스패스-3 활성의 상관 관계에 대해 추가 분석한 결과, 0.980의 상관 상수(γ²값)를 갖는 양의 선형 회복이 얻어졌으며, 이는 화합물 3이 항-세포자멸 작용 및 SNP-유도된 효과에 있어서의 카스패스-3 활성을 조절하는 데 있어 결정적인 역할을 담당함을 시사한다.

배양된 VSMC 내에서 소듐 니트로프루사이드(SNP)-유도된 세포자멸에 대한 화합물 1-22의 효과를 조사하였다. 16개의 화합물들이 SNP(1 mmol/ℓ)에 의해 유도되는 세포자멸에 대한 저해 효과를 나타내었다. 이들 중 일부는 SNP-유도된 세포자멸을 완전히 없애주었다.

생체내 분석

패혈증 치료에 있어 화합물 3의 치료 가능성을 조사하기 위하여, 마우스 모델 내의 LPS-유도된 패혈증에 의한 사망을 이용하였다. LPS(60 mg/kg)의 복막내 투여는 10일 내지 28일 이내에 점증적으로 동물의 사망을 초래하였다. 그러나, LPS 적용 후 2시간 뒤(즉, 화합물 3 처리 후) 화합물 3(10 mg/kg)을 경구 처리하면 마우스의 생존율이 유의하게 증가되었다(도 1). 또한, 이들 생존 마우스는 LPS 개시 후 1개월 이상 원기 왕성하였다.

생체내 동물 연구의 조직학적 조사도 수행하였다. 대조군 마우스는 온전한 폐 조직의 조직학적 외관을 나타내었다. 28시간 동안 LPS를 적용한 후, 동물은 손상된 혈관 및 폐 조직 내의 순환계 밖으로 혈구 세포가 광범위하게 누출되는 현상이 나타났다. 그러나, 화합물 3를 처리한 후의 건강한 마우스는 혈구 세포의 침윤 없이 온전한 혈관을 나타내었다.

혈관 평활근 세포(VSMC)의 세포자멸 효과는 명백히 환경-의존적이다. VSMC 세포자멸은 아테롬성 동맥 경화증 및 신생 혈관내막 형성 이후의 손상에 관계된 분야에서 많이 연구되어 왔다(Mallatet al.(1997)Circulation96: 424-428; 및 Newby & George(1996)Curr Opin Cardiol. 11: 574-582.). 그러나, 이들과 패혈증의 연관 관계에 대해서는 거의 주목하지 않았다. 세포자멸에 대한 NO의 작용은 세포 유형, 세포 농도, 라디칼 환경, 및 세포의 산화환원 상태에 따라 좌우된다(Yabukiet al.(1997)Free Radical Res.27: 325-335; 및 Filippovet al.(1997)J Clin Invest. 100: 942-948). 화합물 3은 SNP와 조합된 화합물 3이 cGMP 합성을 상승적으로 증가시키며, 디부틸-cGMP이 화합물 3-매개 효과를 효과적으로 모방하고, ODQ가 화합물 3의 작용을 유의하게 역전시킨다는 연구 결과를 기본으로, cGMP-의존적 방식으로 SNP-유도된 세포자멸 효과를 방해하였다. 그러나, 아직도 화합물 3-매개 효과에 있어 ODQ와는 무관한 작용이 약 20%가 남아있다.

NO-유도된 세포독성에 대해 제안된 메커니즘은 미토콘드리아의 호흡 사슬, DNA 손상, 및 Bcl-2 하향-조절/Bax 상향 조절의 불활성화를 포함한다(Bolanoset al.(1997)J Neurochem. 68: 2227-2240; 및 Tamataniet al.(1998)세포 Death Differ.5: 911-919). 상술한 바와 같이, SNP는 Bax 발현에 대한 영향 이외에도 Bcl-2 단백질의 유의한 하향-조절을 유도하였으며(데이터는 나타내지 않음); 사이토크롬c의 사이토졸로의 방출 반응 및 카스패스-3 활성의 활성화도 촉진한다. 이러한 데이터는 RASMC 내에서의 SNP-매개의 세포자멸 메커니즘에서의 Bcl-2/사이토크롬c/카스패스-3 신호전달 경로의 조절을 입증한다. 그러나, 화합물 3은 SNP 작용에 대한 이러한 세포자멸 현상의 모두를 거의 완벽하게 차단하였다. 나아가, ODQ는 화합물 3-매개 효과를 뚜렷하게 역전시켰으며, 이는 화합물 3이 cGMP-의존적 항-세포자멸 작용을 수행함을 밝혀준다.

환형 뉴클레오타이드 합성의 증가 및 이어서 PI 3-키나제의 활성화가 여러 유형의 세포에서 세포자멸 반응을 예방하는 데 있어 중추적인 역학을 담당하는 것으로 제안되어 왔다(Webster & Anwer(1998)Hepatology. 27: 1324-1331). 또한, 몇몇 세포 유형, 예를 들면 사이토카인에 의해 활성화된 혈관 사이 세포(mesangial cell) 내에서 cGMP는 NO에 의한 p42/44 MAPKy의 활성화를 조절할 수 있다(Callsenet al.(1998)J Immunol. 161: 4852-4858). 이상으로부터, PD98059를 제외한 워트마닌은 화합물 3-매개 효과를 역전시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, Akt 인산화는 화합물 3의 존재 하에서 현저하게 유도되었으나, 이러한 작용은 ODQ에 의해 감소되었다. 이러한 결과는 PI 3-키나제가 화합물 3 적용 후 sGC의 감소 이펙터로서, 항-세포자멸 메커니즘에 관련함으로 시사한다. 반면, p42/44 MAPK 경로는 RASMC 내에서 화합물 3-매개의 생존과는 연관이 없다. 흥미롭게도, 통계학적으로 유의하지는 않으나, 화합물 3 단독은 RASMC 내에서 세포주를 적당히 증가시킨다(11%, Table 1). ODQ 및 PD98059는 화합물 3-유도된 세포 증식을 완전히 저해하며, 이는 sGC 및 p42/44 MAPK 활성의 연관성을 시사한다.

이 연구는 PKC 활성화의 항-세포자멸 역할을 나타낸다. 그러나, 데이터는 선택적인 PKC 저해제인 Ro-318220이 화합물 3-매개의 항-세포자멸 작용에 대해 거의 영향을 주지 않으며(107.1±3.1% vs. 화합물 3 + SNP군의 세포 생존 100.6±5.5%,P= 0.32, n =7), 이는 화합물 3 작용과 PKC가 무관함을 시사한다.

마우스에서 LPP에 의해 유발되는 패혈증에 의한 사망의 예방에 대한 화합물 3의 효과는 다음가 같이 나타났다: 특히, 화합물 3 처리 후에 수행되었다. 이러한 데이터는 LPS-처리된 마우스에서의 사망률의 유의한 감소를 입증한다. 폐 조직에 대해서도 연구한 결과, 폐의 기능부전은 패혈증에 의한 사망을 일으키는 가장 중요한 원인 중 하나인 것으로 나타났다. 조직학적 조사를 기본으로, 동물은 LPS 적용 후 폐 조직 내의 순환계로부터의 혈구 세포의 광범위한 유출 및 손상된 혈관을 나타나었다. 또한, 화합물 3 처리 후의 마우스 군은 혈구 세포의 침윤 없이 온전한 혈관을 나타내었으며, 보편적으로 원기 왕성한 것으로 나타났다.

기타 제약학적 활성에 대한 화합물 3의 효과도 조사하였다. 먼저, 화합물 3은 사이클로옥시게나제 활성에 대해 저해 작용을 전해 나타내지 않았으며(Koet al.(1994) Blood. 84: 4226-4233); NR8383 내에서 LPS/인터페론 γ-유도된 종양 괴사 인자-α의 방출에 대해서도 저해 작용을 거의 나타내지 않았고(18.5±1.2 ng/㎖, 이에 비해 대조군은 15.5±1.3 ng/㎖,P= 0.13, n = 4), 잔틴/잔틴 옥시다제 시스템으로부터 생성된 초과산화물 음이온에 의한 사이토크롬c의 환원에 대해서도 저해 작용을 거의 나타내지 않았다(40±0.6%, 이에 비해 대조군은 42.0±2.1%,P= 0.4, n = 4). 나아가, 안정된 라디칼인 1,1-디페닐-2-파이크릴하이드라질을 이용해 화합물 3의 자유 라디칼-제거 활성도 조사하였다. 화합물 3은 자유 라디칼-제거 활성을 거의 나타내지 않았다. 또 다른 실험에서, 설치류의 마크로파지 RAW 264.7 세포를 LPS(1 ㎕/㎖)로 24시간 동안 자극한 후, NO의 뚜렷한 형성이 관찰되었다(데이터는 나타내지 않음). 그럼에도 불구하고, 화합물 3은 이러한 LPS-자극 효과 이후 본 연구에서 영향을 나타내지 못했다(53.4±12.3 μmol/ℓ 니트라이트, 이에 비해 대조군은 68.8±13.4 μmol/ℓ 니트라이트,P= 0.43, n = 4). 이러한 결과는 화합물 3이 NO 형성에 대해 소염 작용, 항산화 작용 및 항-LPS 작용을 나타내며, 화합물 3-매개의 동물의 생존에 대한 이러한 효과에 기여하는 역할을 담당함을 시사한다. 따라서, 이상의 결론들을 근거로 할 때, 화합물 3은 마우스에서 패혈증에 의한 사망에 대해 항-세포자멸 효과를 나타내는 중요한 역할을 담당한다

[표 1] 래트의 대동맥 평활근 세포에 있어 세포 생존의 조절에 대한 소듐 니트로프루사이드(SNP), 화합물 3, 및 ODQ의 효과

처리	세포 생존율(%)	n
대조군	100±0	6
SNP	49.3±4.4^*	6
화합물 3	111.3±8.8	6
SNP + 화합물 3	102.9±8.1⁺	6
ODQ	99.5±5.7	5
ODQ + 화합물 3	96.1±4.2	7
ODQ + SPN + 화합물 3	69.6±4.0^#	6

데이터는 5회 내지 6회에 걸친 실험의 평균±SEM으로 나타내었고, n은 개별적인 실험의 회수이다. 대조군과 비교해^* P< 0.001; SNP 단독과 비교해⁺ P< 0.001; SNP + 화합물 3과 비교해^# P< 0.01.

기타 구현예

본 명세서에 기재된 모든 특징들은 어떠한 조합으로도 조합될 수 있다. 본 명세서에 기재된 각각의 특징은 동일하거나, 동등 또는 유사한 목적을 제공하는 다른 특징들로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 특별히 지적하지 않는 한, 기재된 각각의 특징들은 포괄적인 일련의 동등 또는 유사한 특징들의 일례일 뿐이다.

이상의 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 용이하게 확인할 수 있으며, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서, 본 발명을 다양한 용도 및 상황에 맞게 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 융합된 피라졸릴 화합물과 구조적으로 유사한 화합물을 본 발명을 실시하는 데 이용할 수 있다. 그러므로, 기타 구현예들도 특허청구범위에 포함된다.

본 발명은 혈관 세포의 세포자멸을 저해하고, 이를 통해 혈관 및 다수 기관의 기능부전을 예방하는 패혈증 또는 패혈증과 관련된 증후의 치료 또는 예방용 약제를 제공한다.

Claims

하기 일반식(I)의 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 패혈증의 치료 방법:

상기 일반식(I)에서,

A는 H, C₁~C₆알킬 또는이고; 여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3이고;

Ar₁, Ar₂, 및 Ar₃은 각각 독립적으로 페닐, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 XYZ이거나; 또는 R₁과 R₂가 함께, R₃과 R₄가 함께, 또는 R₅와 R₆이 함께 O(CH₂)_1-6O를 형성하고; 여기서 X는 결합 또는 C₁~C₆알킬이고, Y는 결합, O, S, OC(O), OC(O)CH₂)_1-6C(O)O, C(O)O, C(O)S,C(O)NH, C(O)NC₁~C₆알킬, NH, 또는 NC₁~C₆알킬이고, Z는 H, 할로겐, CN, NO₂, 또는 C₁~C₆알킬이고; 단, 상기 조건은 R₃및 R₄중 하나는 H가 아닌 것을 전제로 함.
제1항에 있어서,

상기 A가 H인 패혈증의 치료 방법.
제2항에 있어서,

상기 Ar₁이 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제3항에 있어서,

상기 Ar₂가 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제4항에 있어서,

상기 R₁및 R₂가 H인 패혈증의 치료 방법.
제3항에 있어서,

상기 Ar₂가 푸릴인 패혈증의 치료 방법.
제6항에 있어서,

상기 R₁및 R₂가 H인 패혈증의 치료 방법.
제1항에 있어서,

상기 A가인 패혈증의 치료 방법.
제8항에 있어서,

상기 Ar₁이 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제9항에 있어서,

상기 Ar₂가 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제10항에 있어서,

상기 Ar₃이 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제11항에 있어서,

상기 n이 0 또는 1인 패혈증의 치료 방법.
제12항에 있어서,

상기 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆중 하나가 COOH, COO-C₁~C₆알킬, CH₂OH, CN, NO₂, 또는 할로겐인 패혈증의 치료 방법.
제9항에 있어서,

상기 Ar₂가 푸릴인 패혈증의 치료 방법.
제14항에 있어서,

상기 Ar₃이 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제15항에 있어서,

상기 n이 0 또는 1인 패혈증의 치료 방법.
제16항에 있어서,

상기 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆중 하나가 COOH, COO-C₁~C₆알킬, CH₂OH, CN, NO₂, 또는 할로겐인 패혈증의 치료 방법.
제9항에 있어서,

상기 Ar₃이 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제9항에 있어서,

상기 n이 0 또는 1인 패혈증의 치료 방법.
제8항에 있어서,

상기 Ar₁이 티에닐인 패혈증의 치료 방법.
제20항에 있어서,

상기 Ar₂가 푸릴인 패혈증의 치료 방법.
제21항에 있어서,

상기 Ar₃이 페닐인 패혈증의 치료 방법.
제22항에 있어서,

상기 n이 0 또는 1인 패혈증의 치료 방법.
제23항에 있어서,

상기 R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆중 하나가 COOH, COO-C₁~C₆알킬, CH₂OH, CN, NO₂, 또는 할로겐인 패혈증의 치료 방법.
제1항에 있어서,

상기 화합물이 하기 구조식의 화합물 중 하나인 패혈증의 치료 방법:
하기 일반식(I)의 화합물:

상기 일반식(I)에서,

A는 H, C₁~C₆알킬 또는이고; 여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3이고;

Ar₁, Ar₂, 및 Ar₃은 독립적으로 페닐, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 XYZ이고; 여기서 X는 결합 또는 C₁~C₆알킬이고, Y는 결합, O, S, OC(O), OC(O)(CH₂)_1-6C(O)O, C(O)O, C(O)S, C(O)NH, C(O)NC₁~C₆알킬, NH, 또는 NC₁~C₆알킬이고, Z는 H, 할로겐, CN, NO₂, 또는 C₁~C₆알킬이며; 단, 상기 조건은 선택적으로 R₁과 R₂가 함께, 또는 R₅와 R₆이 함께 O(CH₂)_1-6O를 형성하는 것을 전제로 하며; 또한, R₃및 R₄중 하나에서 X는 C₁~C₆알킬이어야하고, Y는 OC(O)(CH₂)_1-6C(O)O이어야 하며, Z는 H 또는 C₁~C₆알킬인 것을 전제로 함.
제26항에 있어서,

상기 A가인 화합물.
제27항에 있어서,

상기 Ar₁이 페닐인 화합물.
제28항에 있어서,

Ar₂가 푸릴인 화합물.
제29항에 있어서,

상기 Ar₃이 페닐인 화합물.
제30항에 있어서,

상기 R₁, R₂, R₅, 및 R₆이 각각 H인 화합물.
제31항에 있어서,

상기 R₃및 R₄중 하나가 H인 화합물.
제32항에 있어서,

상기 n이 0 또는 1인 화합물.
제33항에 있어서,

상기 R₃및 R₄를 제외하고, 상기 X는 CH₂이고, Y는 OC(O)CH₂CH₂C(O)O이어야 하며, Z는 H인 화합물.
하기 일반식(I)의 융합된 피라졸릴 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관 세포의 세포자멸의 저해 방법:

상기 일반식(I)에서,

A는 H, C₁~C₆알킬, 또는이고; 여기서 n은 0, 1, 2, 또는 3이며;

Ar₁, Ar₂, 및 Ar₃은 각각 독립적으로 페닐, 피리디닐, 티에닐, 푸릴, 또는 피롤릴이고;

R₁, R₂, R₃, R₄, R₅, 및 R₆은 각각 독립적으로 XYZ이거나; 또는 R₁과 R₂가 함께, R₃과 R₄가 함께, 또는 R₅와 R₆이 함께 O(CH₂)_1-6O를 형성하고; 여기서 X는 결합 또는 C₁~C₆알킬이고, Y는 결합, O, S, OC(O), OC(O)CH₂)_1-6C(O)O, C(O)O, C(O)S, C(O)NH, C(O)NC₁~C₆알킬, NH, 또는 NC₁~C₆알킬이고, Z는 H, 할로겐, CN, NO₂, 또는 C₁~C₆알킬이고; 단, 상기 조건은 R₃및 R₄중 하나는 H가 아닌 것을 전제로 함.