TARIFNAME Te' êîîâîtîâéîgîî;fâââîltf 5** BIS (PIRIDIN- GERMANYUM IÇEREN FAR- MASÖTIK BILESIM VE ÜRETIM YÖNTEMI Teknik Alan Mevcut bulus, bis (piridin - 2,6-dikarboksilat) germanyum içeren farmasötik bir bilesim ve bunun üretimi için bir yöntemle ilgilidir. Belirtilen bilesim, veterinerlik tibbi da dahil olmak üzere bir immünomodülatör ajan ve bir interferon indükleyici olarak kullanilir. Önceki teknigin açiklamasi Bis; (pindin - asagidaki yapiya sahip bir bilesiktir: ` Bu bilesik, belirgin birimmünernodülatör've interferon indükleyici aktiviteye sa- hiptir, hümoral ve hücresel bagisiklik üzerinde uyarici bir etkiye sahiptir. BPDG içeren preparatlar (ilaçlar), Vücuda enjekte edildiginde interferon üretimini arttirir, viral preteinlerin translasyonunu engellemeye yardimci olur, makrofajlarm, T ve B-lenfositlerin, bagisiklik sisteminin efektör hücrelerinin aktivitesini arttirir. Bilesigin kendisi, hazirlanma yöntemleri RU 2171259 patentinde anlatilmistir. Bu nedenle bu bilesik, örnegin 2,6-piridindikarboksilik asit gibi bir asidi tetraalkoksi- germanyum, tercihen tetrametoksigermanyum veya tetraetoksigermanyum ile re- aksiyona sokarak hazirlanabilir. Tetraalkoksigerrnanyum, örnegin germanyum tetrahalid ve biralkali metal alkolattan, örnegin germanyum tetraklorür ve sod- yum metanolattan (etanolat) (sodyum metalinin metanol (etanol) içinde çözünme- farrnasötik bilesimleri açiklar. Vidal'in el kitabina göre, bis (piridin - 2,6-dikarboksilat) germanyum ve Maksidin 0,15 ve 0,4 göz ve burun içi damlalari ile ve ayrica yardimci maddeler dahil olmak üzere: monoetanolamin, sodyum klorür, enjeksiyonluk su ile de bilinmektedir. Bu preparatlarin raf ömrü 2 yildir, bu süreden sonra kullamlamazlar ve imha edilme- BPDG'nin karmasik bir bilesik oldugu akilda tutulmalidir, bu karmasik bilesigin stabilitesi ve biyolojik aktivitesi, pH, çözeltinin bilesimi de (tasiyici, çözücü) da- hil olmak üzere depolama kosullarina baglidir. Bu nedenle, BPDG içeren, daha uzun bir raf ömründe stabil olan ve bu kadar uzun süreli depolamada etkinligi ve biyolojik aktivitesini kaybetmeyen bir preparatin olusturulmasina ihtiyaç vardir. Bulusun açiklamasi Mevcut bulus, asagidaki bilesime sahip farmasötik bir bilesim saglar: - Bis (piridin - 2,6 - dikarboksilat) germanyum - 1-5 mg - sodyum klorür - 2,0-3,0 mg - enjeksiyonluk su - l ml'ye kadar, bu durumda bilesimin pH degeri 5,0-6,0'd1r. Özel versiyonda, bulusa göre farmasötik bilesim asagidaki bilesime sahiptir: - Bis (piridin - 2,6 - dikarboksilat) germanyum - 4 mg - sodyum klorür - 3,0 mg - monoetanolamin - 0,002 m1 - enjeksiyonluk su - l ml'ye kadar, Bilesimin pH degeri 5,0 ila 6,0'd1r. Ek olarak, farmasötik bir bilesim hazirlamak için asagidaki adimlari içeren bir yöntem önerilmistir: - gerekli miktarlarda bis (piridin - 2,6-dikarboksilat) germanyum elde edilmesi veya saglanmasi; i - sodyum klorürün su içinde çözünmesiyle sulu bir sodyum klorür çözeltisinin elde edilmesi, su miktari, nihai farmasötik bilesimdeki toplam su miktarinin %10 ila %20'si kadardir; ' - elde edilen iki sulu çözeltinin karistirihnasi; - kalan su miktarinin eklenmesi; - pH 5 ,0-6,0'a monoetanolamin eklenmesi. Daha spesifik olarak, sulu bir BPDG çözeltisi hazirlamak için su miktari, nihai farmasötik bilesimdeki toplam su miktarinin %50 ila %70'i arasindadir. Elde edilen farmasötik bilesim, en az 28 aylik bir depolama stabilitesine ve ayrica stabil bir biyolojik aktiviteye sahiptir. Bu gerçek, mevcut bulusun yazarlari tara- findan tespit edilmistir. pH 5 ,0-6,0'da, BPDG içeren bilesimin fizikokimyasal ve biyolojik aktivitesini en az 28 ay boyunca kaybetmedigi belirlenmistir. Böylece, BPDG'nin sulu bir çözeltideki biyolojik aktivitesinin pH'a bagli oldugu ve pH 5,0-6,0'da kesin olarak azalmadigi bulunmustur. Bu durumda, örnegin, ,0'dan daha düsük bir pH degerinde, BPDG içeriginde bir azalma ve bilesimin biyolojik aktivitesinde bir azalma gözlenir. 6,0'in üzerindeki pH degerinde, bile- sirriin BPDG ile depolanmasi sirasinda biyolojik aktivitede bir azalma da gözlenir. Farmasötik bir bilesim elde etme yöntemi, aktif bir bilesik BPDG elde etme, sulu bir BPDG çözeltisi elde etme, sulu bir sodyum klorür çözeltisi elde etme, daha önce elde edilmis iki sulu çözeltiyi karistirma, kalan su miktarini ekleme, pH 5 ,0- 6,0'a monoetanolamin ekleme adimlarini içerir. Farmasötik bir bilesim elde edilirken, üretim yönteminin, bilesenlerin sulu çözel- tilerini ayri ayri elde etme adimlarini içerdigi ve ara sulu çözeltilerin her birine eklenen` su miktarinin önemli oldugu da unutulmamalidir. Böylece, BPDG'nin suda çözünmesiyle sulu bir BPDG çözeltisi elde edilir ve gerekli su miktari, nihai farmasötik bilesimdeki toplam su miktarinin %20 ila %70'i arasindadir. Sodyum klorürün suda çözünmesiyle sulu bir sodyum klorür çözeltisi hazirlanir, gerekli su gereken tam su miktarlarini ve sulu BPDG çözeltisi ve sulu sodyum klorür çözel- tisinin karistirilrnasiyla hazirlanan çözeltiye eklenecek kalan su miktarini anlaya- caktir. Bu sulu çözeltilerin hazirlanma sirasinin önemli olmadigi da uzman kisi için asikar olacaktir, çünkü daha sonra tek bir sulu çözelti halinde karistirilirlar. Farmasötik bilesimi ve bilesimin hazirlama yöntemine göre kullanilan çözücü su, elde edilen fannasötik bilesime, bitmis dozaj formuna ve amacina bagli olarak degisen saflik derecelerinde su olabilir. Enjekte edilebilir bir dozaj formu elde edilmesi amaçlaniyorsa, enjeksiyonluk su kullanilabilir. Ek olarak, bu bulusun pH 5 ,0-6,0 ile nihai farrnasötik bilesimin hazirlanmasmda monoetanolamin kullanmasina ragmen, bu alanda geleneksel olarak kullamlan di- ger pH düzenleyicilerin kullanilmasinin da mümkün oldugu akilda tutulmalidir, Örnegin, siVi dozaj formlarinin pH'mi ayarlamak için sodyum hidroksit veya hid- roklorik asit, organik ve inorganik asitler (sitrik, asetik, fosforik Vb.) ve bunlarin yani sira, pH'i belirtilen aralikta tutabilen trietanolamin ve su bazli tamponlar kul- lanilabilir. Ayrica ek olarak, farmasötik bir bilesimin hazirlanmasina yönelik bir yöntem, ör- negin filtrasyon, sterilizasyon filtrasyonu, doldurma ve paketleme gibi bitmis bir dozaj formu elde etmek için islem sonrasi adimlari içerebilir. Bu adimlar, bitmis bir dozaj formunun hazirlanmasi için standarttir ve bu adimlarin gerçeklestiril- mesi için malzeme ve ekipman, teknikte uzman bir kisi tarafindan anlasilacaktir. Mevcut bulus, asagidaki örneklerle açiklanacaktir. Bu örnekler, önerilen bulusun kapsammi smirlamak veya daraltmak için tasarlanmamistir. Bis (piridin - 2,6- dikarboksilat) germanyum elde etme edildigi gibi elde edildi. Elde edilen bilesigin analizi ve yapinin teyidi, patent RU 2171259, Örnek 2'de tarif edildigi gibi gerçeklestirildi. Ortaya çikan yapi, bis (pi- ridin - 2,6-dikarboksilat) germanyum'a uygundur. Farmasötik bir bilesimin hazirlanmasi ren farmasötik bir bilesim asagidaki gibi elde edildi. Gerekli miktarda BPDG ve sodyum klorür, önceden bir terazi üzerinde kuru halde tartildi. BPDG, suda çözünür, renksiz bir kristaldir. Enjeksiyon için su içeren bir kaba, gerekli miktarda BPDG eklenerek sulu bir BPDG çözeltisi elde edildi. BPDG'yi çözmek için kaptaki su miktari %20 ila %70 arasindaydi. Islem oda sicakliginda karistirilarak gerçeklestirildi ve çözünme sü- resi kaptaki su miktarina bagliydi. Çözünme islemi görsel olarak izlendi: berrak, renksiz bir çözeltiye ulasildiginda karistirma sonlandirildi. Çözelti kapta birakildi. Önceden tartilan sodyum klorür miktari, %10 ila %20 su miktarini içeren baska bir yardimci kaba yerlestirildi ve oda sicakliginda karistirilarak eritildi. Çözünme ve karistirma islemi, berrak, renksiz bir çözelti elde edilene kadar gerçeklestirildi. Daha sonra, BPDG çözeltisine bir sodyum klorür çözeltisi ilave edildi ve birkaç dakika karistirildi. Agirlik veya hesaplama ile kalan su miktari, nihai farmasötik bilesimin su içerigine ilave edildi. Daha sonra, pH 5,0-5,6'ya kadar bir hesaplama ile monoetanolamin miktari ilave edildi. pH, suya daldirilabilir bir pH metre veya dogrudan kaba monte edilmis bir oto- matik sensör ile kontrol edildi. Daha sonra elde edilen çözelti sterilize edici filtrasyona tabi tutuldu, 5 ml'lik Ila- konlara dolduruldu, kapatildi ve blisterler veya paketler içinde paketlendi. Depolama stabilitesi analizi Depolama stabilitesi analizi için 2 farkli konsantrasyon içeren Ilakon seçildi: ml basina 0,15 ve 0,4 mg. Bu bulusa göre bilesimi içeren 5 ml'lik flakonlar, 0,15 ve 0,4 mg BPDG içerigi, mg ve 0,4 mg içeren Ilakonlar ve enjeksiyon için su içeren flakonlar, stabilite analizi için 5 adet gruba ayrildi. Böylece deneye 4 grup bilesim katildi. Bu Ila- konlar, 25 °C±2°C'de, %60±%5 oraninda bagil nemde, stabilite odalarinda, sicak- lik Ve nem kontrolü ile 28 ay boyunca, birincil ve ikincil ambalajlarda (paket için- deki Ilakonlar ve blisterler) depolandi. ' Bu bilesimler, depolama sirasinda degisimi mümkün olan göstergelere göre analiz - BPDG'nin kütle fraksiyonu; - biyolojik aktivite; - sterilite. Dis görünüm görsel olarak analiz edildi. Devlet Farmakopesi'nde belirtilen yön- temlere göre pH ve sterilitenin belirlenmesi (örnegin, OFS.1.2.4.0003.15, BPDG'nin kütle fraksiyonunun belirlenmesi, spektrofotometrik yöntemle gerçek- lestirildi. 10 mm emici tabaka kalmligma sahip optik hücrelerde 200-300 nm dalga boyu araliginda çözeltinin optik yogunlugunu ölçmeyi mümkün kilan bir fotometrik analiz cihazi kullanildi. Preparatin 0,5 ml'lik bir numunesi, saf su ile 100 ml'ye seyreltildi. Elde edilen çözeltinin optik yogunlugu, saflastirilmis suyun kontrolüne karsi = 271±2 nm dalga boyunda ölçüldü. 3 farkli numuneden optik yogunlugun ortalama degeri belirlendi. BPDG içerigi, 260'a esit BPDG yok olma larak hesaplandi. Sonuçlar asagidaki tabloda gösterilmistir. Biyolojik aktivitenin degerlendirilmesi, bulusa göre BPDG bilesiminin etkisi al- tinda in vitro interferon (IFN) indüksiyonunun belirlenmesiyle gerçeklestirildi. Vero hücreleri veya digerleri (insan embriyo fibroblast hücre hatti), insan embri- yonik akciger fibroblast hücre hatti), nakledilebilir insan hücre hatti L41) ve bir referans ensefalomiyokardit virüsü (EMC), gentamisin ve glutarnin ile desteklen- mis DMEM kültür ortarrii. Hücre kültürü, bir C02 inkübatöründe (37±2) °C sicaklikta, (5,0±0,5) karbondi- oksit içerigi Ve %(70±5) oraninda nem ile yetistirildi. Hücre büyümesi, bir mik- roskop kullanilarak günlük olarak izlendi. Yogun bir tek tabaka olusumundan sonra, yeniden tohumlama yapildi (2-4 günde bir). Daha sonra hücreler, 96 oyuklu bir plakaya aktarildi ve bir tek hücre katmani elde edildi. Süspansiyondaki hücrelerin konsantrasyonu, kültür ortami DIVIEM eklene- rek oyuklar doldurulmadan önce inokuluma (200-300 bin hücre/ml) getirildi. 96 oyuklu kültür plakalarinda 0,l ml'lik oyuklara dagitildi. Plakalar, C02 inkübatöre bir sicaklikta, bu kosullar altinda tam bir tek tabaka olusana kadar 24-48 saat bo- yunca inkübe edilerek yerlestirildi. Uluslararasi standart Interferon -alfa-Zb numunesinin ( bir çözeltisi standart olarak kullanildi. Bu standart 10 kez daha seyreltildi, 10 ml standart nu- mune çözeltisi ve 90 ml DMEM kültür ortami yerlestirildi ve karistirildi. Ortaya çikan çözelti, l ml'de 700 IU interferon alfa-2b içerir. Tek tabakadaki hücreler 96 oyuklu bir plakaya döküldü ve daha sonra siralara bagli olarak farkli konsantrasyonlarda BPDG, Virüs hücreleri (ensefalomiyokardit virüsünün (EMC) referans susu), interferon alfa-2b çözeltisi eklendi. Plakalar, Inkübasyondan sonra virüs titresi belirlendi. Virüsün sitopatojenik etkisinin (hücre tek tabakasinin tam dejeneras'yonu) bulundugu maksimum seyreltmenin tersi, hücre kültürü plakasmin oyuklarinm %50'sinde Virüs titresi olarak alindi. 100 TCID50/ml içeren Virüsün çalisma dozu hazirlandi. Ortam, oyuklardan otomatik olarak bir pipet ile çikarildi ve kullanilan tüm oyuk- lara test numunesi, standart numune ve ayrica Virüs dozunu kontrol etmeye yöne- lik oyuklar ile Virüsün çalisma dozu eklendi. Hücre tek tabakasim izlemek için oyuklara destekleyici besin ortami eklendi. Plakalar, Virüs dozunun kontrolü altinda 24 saat boyunca (37±l) °C'de %(5 ±0,5) C02 ve %(70 ± 5) nem oraninda inkübe edildi. A` aktivitesinin birimi, hücre kültürünün oyuklarinin %5 O'sinde CPE Virüsünden ta- mamen korundugu preparatin (ilacm) maksimum seyreltmesinin karsiligi olan 205 IU/ml cinsinden ifade edilen bir deger alarak alindi. Test numunesinin ve standart numunenin titresi, Spearman-Karber yöntemi kullanilarak hesaplandi ve ardindan standart interferon numunesine göre BPDG bilesiminin spesifik aktivitesi hesap- Sonuçlar asagidaki tablolarda sunulmaktadir. Degerler, grup için elde edilenlerin 210 ortalamasini temsil eder. Tablo 1. 0,15 mg BPDG içeren bulusa göre bir bilesirnin test sonuçlari .. Test süresi (ay) Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ nüm renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kütle fraksi- yonu, en az Biyolojik Interferon ' aktivite titresi 4 Sterilite S teril 01_ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Tablo 2. 0,4 mg BPDG içeren bulusa göre bir bilesimin test sonuçlari Test süresi (ay) Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun] Uygun/ Uygun] Uygun/ Uygun/ Uygun/ nüm renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kutle fraksi- %Ü,4 yonu, en az Biyolojik Interferon aktivite titresi 4 Sten'lite S teril 01- Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] .. Test süresi (ay) Dis görü- Berrak Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] nürn renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kutle fraksi- %0,15 yonu, en az Biyolojik Interferon aktivite titresi 4 , Sterilite Steril 01- Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Uygun] Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ nüm renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kutle fraksi- %0,4 yonu, en az Biyolojik Interferon aktivite titresi 4 Sterilite S teril 01_ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ 220 Sunulan verilerden görülebilecegi gibi, bulusa göre bilesim, fizikokimyasal stabi- liteye sahiptir ve biyolojik aktivite, tüm depolama süresi boyunca (24 ay ve daha pH'in bilesimin stabilitesi üzerindeki etkisinin analizi. 225 PH'in bulusa göre bilesimleiin stabilitesi üzerindeki etkisini analiz etmek için ve 6,2-7. Böylece, farkli pH araliklarina sahip 5 adet Ilakon, 25°C±2°C'de, %60±%5 ora- ninda bagil nemde, stabilite odalarinda, sicaklik ve nem kontrolü ile 28 ay bo- 230 yunca, birincil ve ikincil ambalajlarda (paket içindeki flakonlar ve blisterler) de- polandi. Analiz, örnek 3'te belirtilenler ile ayni göstergelere göre gerçeklestirildi: Bu bilesimler, depolama sirasinda degisimi mümkün olan göstergelere göre analiz 235 ' dis görünüm; ° BPDG'nin kütle fraksiyonu; biyolojik aktivite; sterilite. 240 Sonuçlar asagidaki tablolarda sunulmaktadir. Degerler, grup için elde edilenlerin ortalamasini temsil eder. Tablo 5. pH 5,0-6,0'da 0,15 mg BPDG içeren bulusa göre bir bilesimin test so- nuçlari .. Test süresi (ay) Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ nüm renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kütle fraksi- yonu, en az aktivite titresi 4 Sterilite S teril 01_ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ .. Test süresi (ay) Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ nüm renksiz Karsilik Karsi- Karsi- Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kutle fraksi- %074 yonu, en az Biyolojik Interferon Sterilite Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Steril ol- Karsilik Karsi- Karsi- Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Tablo 7. pH 4,8-4,4'te 0,4 mg BPDG içeren bulusa göre bir bilesimin test sonuç- .. Test süresi (ay) Dis görünüm Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kütle fraksi-(yO 4 yonu, en az Biyolojik ak- Interferon Sterilite S teril 01_ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ .. Test süresi (ay) Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ nürn renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kütle fraksi- (70 15 yonu, en az Biyolojik Interferon Sterilite S teril 01_ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Tablo 9. pH 6,2-7'de 0,4 mg BPDG içeren bulusa göre bir bilesimin test sonuçlari Göstergeler Normlar 0 3 6 S est sursgi (ay) 18 24 28 Dis görü- Berrak Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ nüm renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kutle fraksi- %034 yonu, en az Biyolojik Interferon aktivite titresi 4 Sterilite S teril 01_ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Tablo 10. pH 6,2-7'de 0,15 mg BPDG içeren bulusa göre bir bilesimin test sonuç- 255 lari ' .. Test süresi (ay) nüm renksiz Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik Karsilik kutle fraksi- %0315 yonu, en az Biyolojik Interfe- aktivite ron titresi n 4 TU /ml 16 8 c 8 8 8 4 4 Sterilite Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Uygun/ Böylece, yukaridaki verilere dayanarak sunlar açikça görülebilir: Steril ol- l) pH degeri 5,0-6,0 araliginda oldugunda, izlenen göstergeler, tüm çalisma süresi boyunca degismez veya çok az (etki etmeyecek seviyede) degisir; 2) 4,8-4,4'lük bir pH degerinde, 28 ay içinde BPDG içeriginde, preparatin biyolo- 260 jik aktivitesinde bir azalmanin yani sira, baslangiç degerine kiyasla %8-10 ora- ninda azalma olur. 3) 6,2-7'lik bir pH degerinde, 28 ay içinde BPDG içeriginde, preparatin biyolojik aktivitesinde bir azalmanin yani sira, baslangiç degerine kiyasla %7-14 oraninda azalma olur. 265 Yukaridaki verilere dayanarak, bulusa göre farmasötik bilesimin en az 28 ay bo- yunca stabil oldugu ve BPDG'nin stabilitesinin ve bilesimdeki biyolojik aktivite- sinin ph'dan etkilendigi, özellikle de 5 ,O-6,0 araliginda olmasi gerektigi sonucuna varilabilir. TR TR TR