TR201806959T4 - Yabanıl tip ve/veya mutasyona uğramış bir hedef dna dizisini tespit etmeye yönelik yöntem ve kit. - Google Patents

Yabanıl tip ve/veya mutasyona uğramış bir hedef dna dizisini tespit etmeye yönelik yöntem ve kit. Download PDF

Info

Publication number
TR201806959T4
TR201806959T4 TR2018/06959T TR201806959T TR201806959T4 TR 201806959 T4 TR201806959 T4 TR 201806959T4 TR 2018/06959 T TR2018/06959 T TR 2018/06959T TR 201806959 T TR201806959 T TR 201806959T TR 201806959 T4 TR201806959 T4 TR 201806959T4
Authority
TR
Turkey
Prior art keywords
sequence
target
segment
dna
chain
Prior art date
Application number
TR2018/06959T
Other languages
English (en)
Inventor
Fontana Francesca
Manaresi Nicolo
Original Assignee
Menarini Silicon Biosystems Spa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Menarini Silicon Biosystems Spa filed Critical Menarini Silicon Biosystems Spa
Publication of TR201806959T4 publication Critical patent/TR201806959T4/tr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C12Q1/6855—Ligating adaptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Mevcut buluş; (a) DNA dizilerinin her birinin, bir birinci dizi segmenti, restriksiyon endonükleaz ile kesildiği üzere genomik DNA'nın bir ikinci dizi segmenti, söz konusu birinci dizi ile, eğer mevcut ise restriksiyon endonükleazın 5' çıkıntısı birleşimini ters tamamlayıcı bir üçüncü dizi segmenti içerdiği DNA kütüphanesini sağlama; (b) birinci veya ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir birinci geri primer; birinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir ikinci ileri primer; ikinci hedef dizi antipozitif zincirin üçüncü dizi segmentinin 5' ucu bölgesine hibridize olan bir birinci kısmı ve ikinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir ikinci kısmı içeren, birinci kısmının uzunluğu, üçüncü ileri primerin toplam uzunluğuna göre %20 ila %80 olan bir üçüncü ileri primer kullanarak PCR ile DNA dizisi kütüphanesini amplifiye etme; (c) (b) adımında amplifiye edilen DNA dizilerini tespit etme adımlarını içeren, bir mutasyonun bir restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi meydana getirmesi/ortadan kaldırması noktasında ayrılan, bir DNA kütüphanesinden bir birinci ve/veya bir ikinci hedef DNA dizisini tespit etmeye yönelik bir yöntem ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME YABANIL TIP VENEYA MUTASYONA UGRAMIS BIR HEDEF DNA DIZISINI TESPIT ETMEYE YÖNELIK YÖNTEM VE KIT Mevcut bulus, yabanil tip bir hedef DNA dizisini ve/veya mutasyona ugramis bir hedef DNA dizisini tespit etmeye yönelik; tek bir veya çok sayida nükleotid subst'ütisyonu veya delesyonu veya insersiyonunun bir restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi olusturmasi/ortadan kaldirmasi bakimindan farkli olan bir yöntem ve bir kit ile ilgilidir.
Teknigin Bilinen Durumu Dizileme ve SNP tespiti dahil olmak üzere farkli türden genetik analizlerin yapilmasina imkan vermek amaciyla, DNA'yi amplifiye etmek için tek veya birkaç hücre üzerinde T'L'im Genom Amplifikasyonu kullanilmaktadir.
Deterministik bir restriksiyon bölgesi (bundan sonra DRS-WGA olarak adlandirilacaktir) temelinde bölge Iigasyon aracili bir PCR (LM-PCR) yoluyla Tüm Genom Amplifikasyonu EP1109938 dokümanindan bilinmektedir.
Tek hücrelerin amplifikasyonunda DRS-WGA'nin daha iyi oldugu (örn: Lee YS, et al: Comparison of whole genome amplification methods for further quantitative analysis with microarray-based comparative genomic hybridization. Taiwan J Obstet Gynecol. 2008, 47(1):32-41) bakiniz) ve ayrica fiksatif tedavi nedeniyle DNA degradasyonuna karsi daha toleransli oldugu (örn: Stoecklein N.H. et al: SCOMP is Superior to Degenerated Oligonucleotide Primed-PCR for Global Amplification of Minute Amounts of DNA from Microdissected Archival Samples. American Journal of Pathology 2002, Vol. 161, No. 1; Arneson N. et al.: Comparison of Whole Genome Amplification methods for analysis of DNA extracted from microdissected early breast Iesions in formalin-fixed paraffin- DRS-WGA DNA kütüphaneleri, Sekil 1A”da gösterildigi gibi genel yapisi olan DNA fragmentlerini içermektedir. Sekil 18, restriksiyon endonükleaz Msel kullanilarak DRS- WGA ile elde edilen DNA kütüphanesi fragmentlerinin yapisina ait spesifik bir örnegi göstermektedir.
Akis asagi DRS-WGA mutasyon tespiti deneyleri normalde, primerleri restriksiyon endon'ükleaz (RE) amplikonunda tasarlayarak gerçeklestirilmektedir. DNA-WGA uniform ve dengeli amplifikasyon bakimindan en iyi sonuçlari verse de, söz konusu mutasyonun RE amplikonu içerisinde DRS-WGA restriksiyon endon'ükleaz için bir restriksiyon bölgesi olusturdugu veya ortadan kaldirdigi durumlarda mutasyon varligini belirlemek için deneyleri tasarlamak zorlu olabilmektedir; bunun nedeni ise primerleri RE amplikonu içerisinde tasarlamaya yönelik bilinen yolun yabanil tip ve mutasyona ugramis DNA'yi ayirt etmeye imkan vermemesidir.
Açiklama yoluyla, yukarida bahsedilen probleme neden olan mutasyon örnekleri bundan sonra Msel restriksiyon endon'ukleaz restriksiyon bölgesi TTTA için gösterilmektedir, bununla birlikte ayni problemler herhangi baska bir restriksiyon bölgesinde de meydana gelmektedir. Asagida belirtilen örneklerin mevcut bulusu sinirlandirmadigi, kör uçlu DNA fragmentlerini toplayan bir restriksiyon endonükleaz kullanan yöntemler dahil olmak 'üzere, DRS-WGA için diger yöntemleri de kapsadigi anlasilmalidir.
Vaka A. Bir mutasyon yeni bir restriksiyon bölgesi (RS) olusturmaktadir Subst'utisyon Substütisyon, bir (veya daha fazla) nükleotid(ler)in farkli bir nükleotidle yanlis bir sekilde degistirildigi bir DNA mutasyonudur. Bu durum belirli DNA bölgesindeki nükleotid dizisinde bir degisime yol açmaktadir.
Substütisyon dolayisiyla, yabanil tip (WT) DNA dizisinde RS”nin mevcut olmadigi mutasyona ugramis (M) DNA dizisinde bir RS olusturmaktadir.
Tek bir baz-substütisyon örnegi olarak: WT Dizisi burada V; A veya C veya G (T degil), B ise C veya G veya Tldir (A degil).
Delesyon Bir DNA mutasyonu, yabanil tip (WT) DNA dizisinde RS'nin mevcut olmadigi mutasyona ugramis (M) kaldirabilmektedir.
Tek veya çok sayida (n) baz delesyonuna örnek olarak: lnsersiyon DNA dizisinde bir RS 'üreten bir (veya daha fazla) nükleotid(ler)i Bir DNA mutasyonu, yabanil tip (WT) DNA dizisinde RS`nin mevcut olmadigi mutasyona ugramis (M) DNA dizisinde bir RS üreten bir ekleyebilmektedir.
Tek bir baz insersiyonuna örnek olarak: TT[insA]AB (veya daha fazla) nükleotid(ler)i ve ilgili ayirt edilemez vakalar: VTAA T[insT]AA (9') TTAB TTA[insA]B (1 O') Yukaridaki mutasyonlarin tümü bir RS olusturarak; yalnizca yabanil tip alel (eger mevcut ise) dogru bir sekilde amplifiye edilecegi ve dizilenecegi için, mutasyon bölgesini içeren bir bölgeyi amplifiye eden primer çiftleri kullanildiginda, örnegin PCR ve Dizileme ile, mutasyonun DNA kütüphanesi fragmentinde tespit edilememesine yol açmaktadir. Bu durum Sekil 2'de, soldaki ekli resimde Vaka A olarak özetlenmistir.
Vaka B. Mutasyon yabanil tip (WT) diziden restriksiyon bölgesini kaldirmaktadir Substütisyon Subst'utisyon, WT DNA dizisinde mevcut olan RS'yi kaldirabilmektedir.
WT Dizi M Dizi Vaka Yukarida belirtilen, M DNA dizisinin ve WT DNA dizisinin yer degistirdigi vakalara (1)-(4) karsilik gelmektedir.
Delesyon Bir DNA mutasyonu, bir RS”nin yabanil tip (WT) DNA dizisinde mevcut oldugu bir RS`yi kaldiran bir (veya daha fazla) nükleotid(ler)i kaldirabilmektedir.
Tek baz delesyonlarina örnek olarak: WT Dizi M Dizi Vaka VTTAA V[deIT]TAA (15) TTAAB TT[deIA]AB (16) ve ilgili ayirt edilemez vakalar: VTTAA VT[delT]AA (15,) TTAAB TTA[deIA]B (16,) Bir DNA mutasyonu, bir RS'nin yabanil tip (WT) DNA dizisinde mevcut oldugu bir RS'yi kaldiran bir (veya daha fazla) nükleotid(ler)i ekleyebilmektedir.
WT Dizi M Dizi Vaka TTAA T[insV]nTAA (17) TTAA TT[insV]nAA (18) TTAA TT[insB]nAA (19) TTAA TTA[insB]nA (20) Yukaridaki örnekte oldugu gibi bir veya daha fazla bazin delesyonunu içeren herhangi bir (veya baska birçok) vaka bir WT dizide bulunan RS'yi kaldirarak, parçalanmamis bir diziye yol açmaktadir.
Mutasyona ugramis dizinin, mutasyon bölgesini içeren DNA dizisini amplifiye eden primer çiftlerini tasarladigi kolaylikla tanimlanabilirken, yabanil tip alel (eger mevcut ise) amplifiye edilme konusunda basarisizliga ugrayarak genotip hakkinda yanlis bir degerlendirme vermektedir. Bu durum Sekil 2'de, sagdaki ekli resimde Vaka B olarak özetlenmistir.
Dahasi, mutasyon olmadiginda PCR'dan hiçbir sinyal olmayacaktir ve DRS-WGA esnasinda bir yabanil tip alel çikisi olup olmadigi veya genotipin basitçe yabanil tip olup olmadigini belirlemek imkansiz hale gelecektir.
EP1350853 dokümaninda restriksiyon bölgelerindeki polimorfizmleri ortaya çikaran çogaltilmis parça uzunluk polimorfizmi (AFLP) teknigi açiklanmaktadir. Bir veya daha fazla genom arasindaki dizi polimorfizmlerini tespit etmeye yönelik yöntem, (a) nükleik asit fragmentlerinin restriksiyon endonükleazlar ile fragmente edilmesi ile elde edildigi, bir baslangiç nükleik asidinden, uçlari en az bir adaptör ile uyumlu olan birden çok adaptöre baglanabilir nükleik asit fragmentleri saglayarak; (b) adaptöre bagli nükleik asit fragmentleri olusturacak sekilde söz konusu nükleik asit fragmentlerinin söz konusu uçlari ile söz konusu en az bir adaptör arasinda bir Iigasyon reaksiyonu gerçeklestirerek; (c) temelde söz konusu en az bir adaptörün nükleotid dizisini tamamlayici en az bir amplifikasyon primeri kullanma yoluyla söz konusu adaptöre bagli nükleik asit fragmentlerini amplifiye ederek; ve (d) söz konusu amplifiye edilmis adaptöre bagli nükleik asit fragmentlerinden bir nükleik asit parmak izi olusturarak söz konusu genomlardan nükleik asit parmak izi üretilmesini; dizi polimorfizmlerinin varligini belirleyecek sekilde amplifiye edilmis nükleik asit fragmentlerinin varligi veya yoklugu veya aralarindaki farklar için elde edilen nükleik asit parmak izlerinin karsilastirilmasini içermektedir.
Bununla birlikte, bu yöntem spesifik bir polimorfik bölgenin tespitine imkan vermemektedir.
Quiang Nie ve arkadaslari, bir EGFR polimorfizmi için RFLP-PCR analizini açiklamaktadir.
Bu teknik, polimorfizmi barindiran ilgilenilen bölgeleri amplifiye etmek 'üzere spesifik primer çiftlerini kullanmakta ve ardindan amplifiye edilen fragmente spesifik bir restriksiyon endonükleaz uygulamaktadir.
US 6420117 B1 dokümani, degistirilebilir elemanlardan kaynaklanan tekrarli polimorfizmlerin tespitine yönelik bir yöntemi açiklamaktadir. Bu yöntem bir DNA parmak izi saglamaktadir ve adaptörleri içeren birden çok restriksiyon fragmentinin saglanmasini; bir primer çifti ile restriksiyon fragmentlerinin en azindan bir kisminin amplifiye edilmesini, ki burada primer çiftine ait bir primerin nükleotid dizisi ilgilenilen bir dizinin bir kismini tamamlayicidir ve bahsedilen primer çiftinin diger primeri ise 5' ucunda adaptörün en parmak izi üretmek üzere amplifiye edilmis fragmentlerin çözülmesini içermektedir.
Dolayisiyla mevcut bulusun bir amaci, DRS-WGA'nin restriksiyon endonükleazi için bir restriksiyon bölgesi varliginda yabanil tip hedef DNA dizisi ve mutasyona ugramis hedef DNA dizisinin farklilastigi, DRS-WGA ile elde edilen gibi bir yapiya sahip bir DNA fragmenti kütüphanesindeki yabanil tip bir hedef DNA dizisi ve/veya mutasyona ugramis bir hedef DNA dizisinin tespit edilmesine yönelik, yukarida siralanan problemleri basit ve verimli bir sekilde çözen bir yöntem saglamaktir.
Bu amaca, istem 1'de tanimlandigi gibi bir yöntemle ilgili oldugu için mevcut bulus ile ulasilmaktadir.
Mevcut bulusun baska bir amaci ise istem 10'da tanimlandigi gibi bir kit saglamaktir.
Aksi belirtilmedigi sürece, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler, bu bulusa iliskin teknikte olagan bir kisinin yaygin bir sekilde anlayacagi sekilde ayni anlama gelmektedir. Mevcut bulusun uygulanmasi veya test edilmesinde burada açiklananlara benzer veya denk birçok yöntem ve malzeme kullanilabilecek olsa da, tercih edilen yöntemler ve malzemeler asagida açiklanmistir. Aksi belirtilmedigi sürece, söz konusu bulus ile birlikte kullanilmak üzere burada açiklanan teknikler, teknikte olagan kisilerin iyi bildigi standart metodolojilerdir. tarafindan taninan bir DNA molekülündeki nükleotid dizileri (tipik olarak uzunlukça 4-8 baz çifti) belirtilmektedir. Restriksiyon bölgesinde, restriksiyon endonükleaz nükleotidleri, aralarinda bir fosfodiester bag hidrolize ederek kesmektedir. olusturulan veya kaldirilan RS belirtilmektedir. aldigi restriksiyon bölgesinin dizisindeki pozisyon belirtilmektedir. olusturulan veya kaldirilan CS belirtilmektedir. 4010/EPITR belirtilmektedir. tarafindan kusatilan iki RS arasindaki bir DNA dizisini içeren, DRS-WGA sirasinda amplifiye edilmis bir DNA fragmenti belirtilmektedir.
WGA'daki restriksiyon enziminin faaliyeti ile olusturulan her bir fragmente bagli ilave oligonükleotid belirtilmektedir. belirtilmektedir. anlamli zinciri tamamlayici olan, 5“ - 3' isleyen DNA zincirinin segmenti belirtilmektedir.
Anlamli zincir “pozitif zincir” olarak da ifade edilebilmektedir.
Basitlik bakimindan, mevcut bulusta “hedef dizi pozitif zincir” (TSPS) terimi asagidaki anlamlarda kullanilacaktir: 1) artan nükleotid sayisi olan dizideki mutasyona bagimli kesme bölgesinin 3' tarafinda mutasyonun meydana gelmesi durumunda, artan nükleotid sayisi ile genomik DNA dizisini tanimlamaktadir 2) artan nükleotid sayisi olan dizideki mutasyona bagimli kesme bölgesinin 5' tarafinda mutasyonun meydana gelmesi durumunda, artan nükleotid sayisi ile genomik DNA dizisinin ters tamamlayicisini tanimlamaktadir Tutarli olarak, “hedef dizi antipozitif zincir” (TSAS) terimi mevcut açiklamada asagidaki anlamlarda kullanilacaktir: 4010/EPITR 3) artan nükleotid sayisi olan dizideki mutasyona bagimli kesme bölgesinin 3' tarafinda mutasyonun meydana gelmesi durumunda, artan nükleotid sayisi ile genomik DNA dizisinin ters tamamlayicisini tanimlamaktadir 4) artan nükleotid sayisi olan dizideki mutasyona bagimli kesme bölgesinin 5' tarafinda mutasyonun meydana gelmesi durumunda, artan nükleotid sayisi ile genomik DNA dizisini tanimlamaktadir. belirtmektedir (UCSC Genom Tarayicisi gibi dizi veri tabanlarinda bulunan gibi). lokalizasyonunun, dizi segmentinin 5' terminal ucuna dogru oldugu belirtilmektedir.
Sekillerin Kisa Açiklamasi Sekil 1A, bir mutasyona bagimli kesme bölgesi (MDCS) kesilmedigi zaman restriksiyon endonüklazi Msel kullanilarak, spesifik bir DRS-WGA ile elde edilen bir DNA kütüphanesi fragmentinin genel yapisina ait bir çizimi göstermektedir. Kisaltmalar belirtildigi gibidir: FTS = birinci hedef dizi; CS = kesme bölgesi; RS = restriksiyon bölgesi; FTSPS = birinci hedef dizi pozitif zincir; FTSAS = birinci hedef dizi antipozitif zincir; NUCL# = nükleotid sayisi (ok yönünde artmaktadir); WT = yabanil tip; MDCS = mutasyona bagimli kesme bölgesi.
Sekil 18, bir mutasyona bagimli kesme bölgesi (MDCS) yarildigi zaman restriksiyon endonüklazi Msel kullanilarak, spesifik bir DRS-WGA ile elde edilen bir DNA kütüphanesi fragmentinin genel yapisina ait bir çizimi göstermektedir. Ilave kisaltmalar belirtildigi gibidir: STS = ikinci hedef dizi; MDRS = mutasyona bagimli restriksiyon bölgesi; M = mutasyona ugramis; STSPS = ikinci hedef dizi pozitif zincir; STSAS = ikinci hedef dizi antipozitif zincir.
Sekil 1C, birinci hedef dizi pozitif ve antipozitif zincirlerin bir çizimini ve ilgili geri ve ileri primerlerin konumunu göstermektedir. Ilave kisaltmalar belirtildigi gibidir: R1 = birinci geri primer; F2 = ikinci ileri primer. 4010/EPITR Sekil 1D, ikinci hedef dizi pozitif ve antipozitif zincirlerin bir çizimini ve ilgili geri ve ileri primerlerin konumunu göstermektedir. Ilave kisaltmalar belirtildigi gibidir: F3 = üçüncü ileri primer; F31 = üçüncü ileri primerin birinci kismi; F32 = üçüncü ileri primerin ikinci kismi.
Sekil 1E, artan nükleotid sayisi ile mutasyon dizideki MDCS'nin 5” tarafinda yer aldigi zaman birinci hedef dizi pozitif ve antipozitif zincirlerin bir çizimini ve ilgili geri ve ileri primerlerin konumunu göstermektedir.
Sekil 1F, artan nükleotid sayisi ile mutasyon dizideki MDCS'nin 5' tarafinda yer aldigi zaman ikinci hedef dizi pozitif ve antipozitif zincirlerin bir çizimini ve ilgili geri ve ileri primerlerin konumunu göstermektedir.
Sekiller 1A-1F'de, kesilmemis dizinin WT dizi, kesilmis dizinin ise Mutant dizi oldugu duruma atifta bulunulmustur. Mutasyona ugramis dizinin kesilmemis oldugu ve yabanil tip dizinin kesildigi alternatif durum, WT ile M kolayca degistirilerek kolaylikla elde edilebilmektedir.
Sekil 2, mutasyona ugramis DNA dizisindeki bir restriksiyon bölgesinin olusturulmasini (Vaka A - soldaki ekli resim) veya çikarilmasini (Vaka B) içeren iki durumun basitlestirilmis bir çizimini ve geleneksel mutasyon tespit yöntemleri ile sonuçlari göstermektedir.
Sekil 3, Örnek 1'deki wt ve mutasyona ugramis DNA için bir bivalan primer çifti ile gerçeklestirilen bir PCR amplifikasyona ait ayrilmis ürünlerin jel elektroforezinin bir görüntüsünü göstermektedir. Cnt: WGA reaksiyonunun boslugu. C-: PCR reaksiyonunun boslugu.
Sekil 4A ve 48, bulusa uygun yöntemin çalisma prensiplerinin basitlestirilmis görünümünü göstermektedir. Sekil 4A, mutasyonun dizide bir restriksiyon bölgesi olusturdugu durumu göstermektedir. Sekil 48, mutasyonun dizideki restriksiyon bölgesini kaldirdigi durumu göstermektedir.
Sekil 5, evrensel WGA primere uzunlugunca %86 homolog olan, restriksiyon bölgesi dahil olmak üzere mutasyona ugramis bir spesifik 5' primer ile gerçeklestirilen bir PCR amplifikasyonuna ait ayrilmis ürünlerin bir jel elektroforezinin bir görüntüsünü göstermektedir.
Sekil 6, Örnek 3'teki yabanil tip spesifik 5' primer ile gerçeklestirilen bir PCR amplifikasyonuna ait ayrilmis ürünlerin bir jel elektroforezinin bir görüntüsünü göstermektedir. 4010/EPITR Sekil 7, Örnek 3`teki mutasyona ugramis spesifik 5' primer ile gerçeklestirilen bir PCR amplifikasyonuna ait ayrilmis ürünlerin bir jel elektrforezinin bir görüntüsünü göstermektedir.
Sekil 8, Örnek Siteki bir yabanil tip alelin dizilenmesine ait bir örnegi göstermektedir.
Sekil 9, Örnek 3'teki mutasyona ugramis bir alelin dizilenmesine ait bir örnegi göstermektedir.
Sekil 10, Örnek 4'ün sonuçlarini özetleyen bir tabloyu göstermektedir.
Sekil 11, Örnek 5'teki mutasyona ugramis primer çifti ile gerçeklestirilen M ve WT münferit hücrelerin PCR amplifikasyonuna ait ayrilmis ürünlerin jel elektroforezinin bir görüntüsünü göstermektedir.
Sekil 12, Örnek 5'teki yabanil tip primer çifti ile gerçeklestirilen M ve WT münferit hücrelerin PCR amplifikasyonuna ait ayrilmis ürünlerin jel elektroforezinin bir görüntüsünü göstermektedir.
Sekil 13, örnek öidaki bir yabanil tip tek hücrenin ters zincir dizisinin bir örnegini göstermektedir.
Sekil 14, örnek 6'daki mutasyona ugramis bir tek hücrenin ters zincir dizisinin bir örnegini göstermektedir.
Sekil 15, Örnek 6'nin sonuçlarini özetleyen bir tabloyu göstermektedir.
Sekil 18, mutant PCR ürünü için pozitif bir yabanil tip hücrenin (bir Iökosit) (yani, yalniz PCR ürünü için yanlis pozitif) ters zincir dizisinin bir örnegini göstermektedir, ki bunun, Ornek 6'de oldugu gibi deney ile yabanil tip oldugu onaylanmistir.
Bulusun Ayrintili Açiklamasi Mevcut bulusa göre bir DNA dizisi kütüphanesinden en az bir birinci hedef DNA dizisinden ve en az bir ikinci hedef DNA dizisinden en az birisinin tespit edilmesine yönelik yöntem, (a) ila (0) adimlarini içermektedir. Ikinci dizideki tek bir veya çok sayida nükleotid substitüsyonu veya delesyonu veya insersiyonunun, bir restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi olusturarak, restriksiyon endonükleaz tarafindan kesilmesi durumunda olusturulan restriksiyon bölgesinin bir birinci kesilmis ikinci hedef diziyi 3' ve olusturulan restriksiyon bölgesinin bir ikinci kesilmis ikinci hedef dizisiyi 5' meydana getirmesi noktasinda, birinci hedef DNA dizisi ikinci hedef DNA dizisinden ayrilmaktadir. Soldaki ekli resimde vaka A'yi gösteren Sekil 2'ye, ve Sekil 4A'ya atifla, birinci hedef DNA dizisi yabanil tip DNA dizisine karsilik gelmekte, ikinci hedef DNA dizisi ise mutasyona ugramis 4010/EPITR DNA dizisine karsilik gelmekteyken; sagdaki ekli resimde vaka B'yi gösteren Sekil 2'ye, ve Sekil 4B'ye atifla, birinci hedef DNA dizisi mutasyona ugramis DNA dizisine, ikinci hedef DNA dizisi ise yabanil tip DNA dizisine karsilik gelmektedir. (a) adiminda DNA dizisi kütüphanesi saglanmaktadir. Kütüphanenin her bir DNA dizisi, sirasiyla 5' ucundan 3' ucuna, 15 ila 50 nükleotidlik bir uzunluga sahip olan bir birinci dizi segmenti, restriksiyon endonükleaz ile kesildigi üzere genomik DNA'nin bir ikinci dizi segmenti, bahsedilen birinci dizi segmenti ile, eger mevcut ise RE tarafindan olusturulan ' çikintisi birlesimini ters tamamlayici bir üçüncü dizi segmenti içermektedir. Sekil 1A'ya atifla, (1) sayisi birinci dizi segmentini, (2) sayisi ikinci dizi segmentini, (3) sayisi ise üçüncü dizi segmentini göstermektedir. Tercih edilen bir uygulamada söz edilen birinci dizi segmenti WGA PCR Primere karsilik gelmektedir.
Restriksiyon endonükleaz tercihen Msel'dir. (b) adiminda, DNA dizisi kütüphanesi asagidakiler kullanilarak amplifiye edilmektedir: - en az bir birinci hedef dizi pozitif zincir veya en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3, ucu bölgesine hibridize olan en az bir birinci geri - en az bir birinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir ikinci ileri primer; - en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin üçüncü dizi segmentinin 5` ucu bölgesine hibridize olan bir birinci 5' kismi ve en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir ikinci 3' kismi içeren en az bir üçüncü ileri primer; ki burada en az bir üçüncü ileri primerin birinci kisminin uzunlugu, en az bir üçüncü ileri primerin toplam uzunluguna göre %20 ila Üçüncü ileri primer bundan sonra kimi durumlarda kisaca “hibrid primer" olarak adlandirilacaktir. 4010/EPITR Tercihen, (b) adiminda en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir dördüncü geri primer kullanilmaktadir.
Tercihen, en az bir üçüncü ileri primerin birinci kisminin uzunlugu, en az bir üçüncü ileri primerin toplam uzunluguna göre 40 ila %60'tir.
Tercihen, en az bir üçüncü ileri primerin ikinci kisminin baz olarak uzunlugu, restriksiyon endonükleazin konsens'üs dizinin, mevcut ise, restriksiyon endonL'ikIeaz ile olusturulan 5' çikinti ile farkinin yarisina karsilik gelen bir minimum ile 30 bazlik bir maksimum arasindadir.
Sekil 4A”ya atifla, söz edilen birinci geri primer yabanil tip geri primere (WT_R) karsilik gelmekte, ikinci ileri primer yabanil tip ileri primere (WT_F) karsilik gelmekte, üçüncü ileri primer mutasyona ugramis ileri primere (M_F) karsilik gelmektedir. Bir uygulamada birinci geri primer yalnizca birinci hedef dizi pozitif zinciri degil, ayni zamanda birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zinciri de amplifiye etme görevi üstlenmektedir. Bununla birlikte, tercih edilen bir uygulamada bahsedilen birinci ters primerden farkli bir dördüncü geri primer, birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zinciri amplifiye etmek 'üzere kullanilmaktadir. Sekil 4A'da, söz edilen dördüncü geri primer mutasyona ugramis geri primere (M_R) karsilik gelmektedir.
Ayni prensip, birinci geri primerin mutasyona ugramis geri primere (M_R) karsilik geldigi. ikinci ileri primerin mutasyona ugramis ileri primere (M_F) karsilik geldigi, üçüncü ileri primerin yabanil tip ileri primere (WT_F) karsilik geldigi ve dördüncü geri primerin yabanil tip geri primere (WT_R) karsilik geldigi Sekil 4B'de de geçerlidir. (c) adiminda, (b) adiminda amplifiye edilen DNA dizileri tespit edilmektedir. (0) adimi; örnegin jel elektroforez, kapiler elektroforez, DNA dizileme gibi teknikte bilinen birçok tespit yöntemi ile gerçeklestirilebiImektedir. (c) adimi tercihen bir DNA dizileme yöntemi ile gerçeklestirilmektedir. Daha çok tercih edildigi haliyle DNA dizileme yöntemi Sanger dizileme veya sentez ile dizilemedir. 4010/EPITR Mevcut bulusun yöntemi, Sekil 1Afda gösterilen yapiya sahip herhangi bir DNA dizisi kütüphanesi ile kullanilabilmektedir. Yöntem tercihen, deterministik restriksiyon bölgesi tüm genom amplifikasyonu ile elde edilen bir DNA dizisi kütüphanesi ile kullanilmaktadir.
Mevcut bulusa göre, yukarida açiklandigi gibi bir birinci ve/veya biri ikinci ve/veya bir Üçüncü primeri içeren bir kit de saglanmaktadir.
Daha spesifik olarak, ikinci dizideki tek bir veya çok sayida nükleotid substitüsyonu veya delesyonu veya insersiyonunun, bir restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi olusturarak, restriksiyon endonükleaz tarafindan kesilmesi durumunda olusturulan restriksiyon bölgesinin bir birinci kesilmis ikinci hedef diziyi 3' ve olusturulan restriksiyon bölgesinin bir ikinci kesilmis ikinci hedef diziyi 5' meydana getirmesi noktasinda, birinci hedef DNA dizisinin ikinci hedef DNA dizisinden ayrildigi, ve kütüphanenin her bir DNA dizisinin, sirasiyla 5' ucundan 3' ucuna, 15 ila 50 nükleotidlik bir uzunluga sahip olan bir birinci dizi segmenti, restriksiyon endonükleaz ile kesildigi üzere genomik DNA'nin bir ikinci dizi segmenti, ve bahsedilen birinci dizi segmenti ile, eger mevcut ise restriksiyon endonükleaz tarafindan olusturulan 5' çikintisi birlesimini ters tamamlayici bir üçüncü dizi segmenti içerdigi, bir DNA dizisi kütüphanesinden en az bir birinci hedef DNA dizisinden ve en az bir ikinci hedef DNA dizisinden en az bir tanesini tespit etmeye yönelik kit olup, asagidakileri içermektedir: - en az bir birinci hedef dizi pozitif zincir veya en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir birinci geri - en az bir birinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir ikinci ileri primer; - en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin üçüncü dizi segmentinin 5' ucu bölgesine hibridize olan bir birinci 5' kismi ve en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir ikinci 3, kismi içeren en az bir üçüncü ileri primer; ki burada en az bir üçüncü ileri primerin birinci kisminin uzunlugu, en az bir üçüncü ileri primerin toplam uzunluguna göre %20 ila 4010/EPITR Söz edilen kit tercihen, en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir dördüncü geri primeri de içermektedir.
Kit, kütüphanedeki DNA fragmentlerinin ikinci dizi segmentinin uçlarinin restriksiyon endon'ükleazi için bir restriksiyon bölgesini olusturan veya ortadan kaldiran herhangi türden bir mutasyonu tespit etmek üzere kullanilabilmektedir. Bahsedilen kit tercihen, ALK (anaplastik Ienfoma kinaz) veya EGFR (epidermal büyüme faktörü reseptörü) veya PIKSCA (fosfatidilinozitol 3-kinaz katalitik alfa polipeptid) genindeki mutasyonlarin teshisinde kullanilmaktadir.
Ornekler Ornek 1 - Sivalan primer vaklasimi ALK geninin kodon 1174'ünde heterozigot Cyden A'ya substit'usyonu barindiran SY5Y hücre hatlari (SH-SY5Y ATCC Catalog No. CRL-2266TM) 'üzerinde ön testler yürütülmüs, bir Fenilalalin bir Lösin'e (F1174L) döndürülmüstür; komsu diziye bakildiginda, heterozigot substitüsyon mutasyona ugramis alelde yeni bir restriksiyon bölgesi (RS) olustururken, yabanil tip alel herhangi bir RS'ye sahip degildir.
Sekil 2, mutasyon ile 'üretilen WGA DNA kütüphanesindeki dizilerin ve dönüsümlerin basitlestirilmis bir çizimidir.
RS üzerinde meydana gelen mutasyonlari tespit etmek için asagidaki yaklasim test edilmistir. 3” primerin RS'ye göre 3' içerisindeki bir bölgenin üstüne bindigi yeni bir PCR primer çiftinde bir 5' primer tasarlamak için tüm genom amplifikasyonunun evrensel primerinden (AGTGGGATTCCTGCTGTCAGT dizisine sahip olan DRS-WGA primeri, Bir bivalan primer çiftinin tasarlanmasinda olusan strateji, - DRS-WGA primeri ile %95 homolojiye sahip bir 5' primer; ve - diger DRS-WGA amplikonlar yerine hedef bölgeyi seçime bagli olarak amplifiye etmek amaciyla, PCR için gerekli olan özgüllügü saglamasi gereken bir 3' PCR primeri 4010/EPITR içermektedir.
Bu bivalan primer çifti teoride yabanil tip (WT) dizinin ve mutant (M) dizinin amplifikasyonunda görev almaktadir.
Deneysel kanitlar bu yaklasimin zayif ve uygunsuz oldugunu, ve R8,de mutasyon tespitini garanti etmedigini göstermektedir. Sekil 3'te gösterildigi üzere, bir bivalan primer kullanimi bandi ve istenilen boyutta açikça ayit edilebilir bandin olmamasi ile sonuçlanmaktadir (örnegin, bir F1174L heterozigot mutasyon tasiyan, DEPArrayTM ile izole edilen ve DRS- WGA ile amplifiye edilen tek SY5Y hücrelerinde. Mutasyona ugramis dizi için 132bp, WT dizi için 169 hp). Amplifikasyon hem mutasyona ugramis (M), hem de yabanil tip (WT) ve PCR negatif kontol (C-) numunelerinde açik ve özgül bir bant vermeyi basaramamistir.
Negatif WGA (Ctr-) kontrolü yalnizca özgül olmayan bir bandi göstermektedir.
Bu zayif sonuca etki eden bir faktör, %95 Iigate edilmis WGA primere karsilik gelen 5” bivalan primerin, DNA-WGA kütüphanesindeki tüm DNA fragmentlerinde mevcut olmasi ve 3, bivalan primerin yeterli özgüllüge sahip PCR reaksiyonunu saglamamasidir. içermektedir. Eger genom dört bazlik bir restriksiyon bölgesi (mesela TTAA) ile bir restriksiyon endonükleaz ile parçalanirsa, olusturulan DNA fragmentlerinin ortalama uzunlugu 4tün (olasi bazlar) 4. kuvveti (düsünülen parçalanma dizisi uzunlugu) =256'dir.
Olusturulan DNA kütüphanesi bu nedenle, DNAtdaki rastgele bir nükleotid dizisine ait fragmenti içerecektir. Bunlarin tümü ayni 5' primeri (birincil PCR”dan WGA primere karsilik gelmektedir) içerecektir.
Dolayisiyla bivalan primer çiftinin kullanimi özgül olmayan bantlari vermektedir.
Amplifikasyon testleri Örnek 1,de kullanilan ile ayni SY5Y hücre hattinda, ancak mevcut bulusa ait yöntem kullanilarak yürütülmüstür. 4010/EPITR DRS-WGA ürünlerindeki hem yabanil tip (WT) hem de mutasyona ugramis (M) alellerin amplifikasyonunu test etmek üzere münferit SY5Y hücreleri saf tek hücre saglayan DEPArrayTM ile izole edilmistir.
WGA evrensel primeri ile uzunlugunca %86 eslesen bir 5' PCR primer kullanarak amplifikasyon yaklasimi, ne WT ne de M aleli için bir çözüm sunmustur. Sekil 5'te gösterildigi üzere amplifikasyon, hem mutasyona ugramis (M) hem de yabanil tip (WT) ve PCR negatif kontrol (C-) numunelerinde açik ve spesifik bir bant vermeyi basaramamistir.
Negatif WGA (Ctr-) kontrolü yalnizca 'Özgül olmayan bir bandi göstermektedir.
WGA evrensel primeri ile farkli yüzdelerde homolojiye sahip primerler test edilmistir.
Sonuçlar asagida Tablo 1tde özetlenmistir.
Primer WGA primere Orijinal DNA ya Homoloji F32 [# TEST Homoloji baz] Tablo 1'de, F32 sütunu ”üçüncü ileri primerin ikinci kisminin”, yani restriksiyon endonükleaz çikintisi disinda orijinal DNA ile ayni diziye sahip primer kisminin baz sayilarindaki uzunlugu bildirmektedir.
Tablo 1'deki sonuçlara göre, yöntem gerekliliklerini karsilamak üzere dengeli bir uzlasinin tanimlanmasi gerektigi açiktir. Birçok test WGA evrensel primeri ile hibrid primer kimliginin ideal yüzdesinin %20 ila %80 oldugunu, %40 ila %60 araliginda ise daha iyi verim alindigini göstermektedir. tasarimi 4010/EPITR Bulusa göre yöntem, restriksiyon endonükleaz parçalanmayi tamamlamasa dahi amplifikasyonu (ve dizilemeyi) garanti etmektedir. Aslinda restriksiyon endonükleaz aktivitesi hedef DNA'daki tüm RS'Ier için garanti edilmemekte, ve WGA primeri (birincil PCR) bir diger RS”de olsa da, DRS-WGA'da, DRS-WGA tarafindan yine de basarili bir sekilde amplifiye edilmis istatiksel olarak küçük yüzdede bir parçalanmamis RS mevcuttur.
Parçalanmamis bir bölge durumunda mutasyon deneyi için mutant dizi için tasarlanan yalnizca bir primer çifti kullanmak hedefin amplifikasyonuna ve dizilenmesine izin vermeyecektir. Önceden açiklandigi üzere kodon 1174'te heterozigot Ciden Aiya substitüsyonu barindiran SY5Y hücre hatti üzerinde yine amplifikasyon testleri yürütülmüs, bir Fenilalalin bir Lösin'e (F1174L) döndürülmüstür. Heterozigot substitüsyonu dolayisiyla mutasyona ugramis alelde yeni bir RS olustururken, yabanil tip alel herhangi bir RS'ye sahip degildir.
WT ve M alellerin amplifikasyonu için kullanilan PCR primer dizileri Tablo 2'de gösterilmistir. Mutant alel ileri primer için, WGA primerine homolog olan primer dizisinin birinci kismi kalin ve alti çizili bir sekilde gösterilirken, orijinal DNA ile ayni diziye sahip olan primerin ikinci kismi, restriksiyon endonükleaz çikintisi hariç, (F32 = 8 baz) kutu içerisinde gösterilmistir.
Primer Adi Dizi ALK_WT_F SEQ ID No:2 5' CCTCTCTGCTCTGCAGCAAAT 3, ALK_WT_R SEQ ID No:3 5, TCTCTCGGAGGAAGGACTTGAG 3' ALK_M1_F SEQ ID No:4 5' TGCTGTCAGTTA AACCACCA 3' ALK_M1_R SEQ ID No:5 5' GGTCTCTCGGAGGAAGGACT 3, DRS-WGA ürünlerindeki hem WT hem de M alellerinin amplifikasyonunu test etmek üzere münferit SY5Y hücreleri saf tek hücre saglayan DEPArrayTM ile izole edilmistir.
Mutasyon tespiti için negatif kontrol olarak, münferit Ienfositler de DEPArrayTM ile izole edilmis ve DRS-WGA ile amplifiye edilmistir. 4010/EPITR Hem WT (Ienfositler) hem de heterozigot M (SY5Y) üzerindeki WT”nin PCR amplifikasyonu, spesifik olarak tasarlanmis WT 5' primerinin kullanimi ile mükemmel bir sekilde gerçeklestirilmis, bu da WT alelin özel amplifikasyonuna izin vermistir.
Sekil 6'de gözlemlenebilecegi gibi spesifik amplifikasyon ürünü bulunmamaktadir. Bunun yerine, istenilen PCR bandi (132 bp) açikça ayirt edilebilirdir.
Hedef diziyi ve evrensel DRS-WGA primerini destekleyecek sekilde (straddle) tasarlanan primer tarafindan saglanan amplifikasyonun özgüllügünü tespit etmek amaciyla ayni lenfositler ve SY5Y hücreleri için M-spesifik 5' primeri test edilmistir.
Sekil 7'de görülebilecegi gibi, bu durumda, beklenildigi üzere, spesifik amplifikasyon yalnizca SY5Y tek hücre DRS-WGA DNA”da gözlenmistir. Hedef mutasyon için WT olan, Özgül olmayan PCR amplifikasyonlari mevcut olmustur.
Gerçeklestirilen amplifikasyonun spesifik oldugunu ve dizilemeye izin verdigini göstermek durumu, açiklanan yöntem ile gerçeklestirilen özgüllügü gösteren tüm amplifikasyon ürünleri için onaylanmistir. Bir WT alelin dizilenmesine yönelik bir örnek Sekil 87de gösterilmis, bir M alelin dizilenmesine yönelik bir örnek Sekil 9'de gösterilmistir.
Sonuçlar Tablo 3'te özetlenmistir.
Tek Hücre Replikatlari M-Spesifik 5, primer ile WT-Spesifik 5, primer WBC 1 PCR ürünü yok WT 2 PCR ürünü yok WT 3 PCR 'ürünü yok WT SY5Y 1 M WT 4010/EPITR Tercih edilen bir uygulamada, birinci hedef dizi antipozitif zincirde (FTSAS), yani bu örnekte yabanil tip dizide, hatali bir baslangiç yapmayacak (mis-prime) sekilde, üçüncü ileri primerin (F3) ikinci kismi (F32) 30 nükleotidden kisadir, böylelikle bir yanlis pozitif (PCR 'ürünü uzunlugu ve dizisi itibariyla) ile sonuçlanabilecek bir PCR reaksiyonu baslatilmaktadir. Daha çok tercih edildigi haliyle, bahsedilen ikinci kismin (F32) uzunlugu nükleotidden kisadir. Daha da çok tercih edildigi haliyle, söz konusu üçüncü ileri primerin (F3) söz konusu ikinci kisminin (F32) uzunlugu 10 nükleotidden kisa veya buna Söz edilen üçüncü ileri primerin (F3) ikinci kismi (F32), yeterli özgüllügü saglayamayacak kadar kisa olmamalidir (örnegin tablo 1'deki sonuçlara bakiniz). Özellikle, üçüncü ileri primerin söz konusu ikinci kisminin uzunlugu, restriksiyon bölgesi konsensüs dizisi uzunlugu eksi parçalanmis DNA'nin 5' çikintisinin uzunlugunun yarisindan büyük olmalidir. Daha fazla özgüllük elde etmek amaciyla, üçüncü ileri primerin (F3) ikinci kismi (F32) en az 3 nükleotid, ve daha çok tercih edildigi haliyle en az 6 nükleotid; restriksiyon bölgesi konsensüs dizisi uzunlugu eksi parçalanmis DNA'nin 5' çikintisinin uzunlugunun yarisindan daha uzun olmalidir. Örnek 4 Mutant alelde (ALKgeni) yeni bir RS olusturulmasi - deney dogrulama Yukarida açiklanan yöntem 54 tek hücre ile de dogrulanmistir: - 10 tek canli, yeni SY5Y; - oda sicakliginda 20 dakika %2 paraformaldehit (PFA) ile önceden tespit yapilan ve - CytoChexT'VI ile önceden tespit yapilan ve Inside Perm ile geçirgen hale getirilen 19 tek SY5Y; - 2 tek yeni, canli lenfosit; - oda sicakliginda 20 dakika %2 PFA ile önceden tespit yapilan ve Inside Perm (Miltenyi Biotec) ile geçirgen hale getirilen 2 tek lenfosit.
Yöntem SY5Y ve Ienfosit hücrelerinin %IOO'ünde WT alelini amplifiye etmis, ve mutant alel canli SY5Y'nin 9/10=%90'inda, cyto-Chex/inside-perm ile tespit yapilan ve geçirgen hale getirilen SY5Y hücrelerinin 16/19=%84,ünde, oda sicakliginda/inside-perm ile 20 4010/EPITR dakika %2 PFA ile tespit yapilan ve geçirgen hale getirilen SY5Y hücrelerinin 17/19=%89'unda ve Ienfositlerin O/4=%0'inda amplifiye edilmistir.
WT Alelin PCR,I F1174L M Alelin PCR'i SYSY Canli 100% 90% PFA, Inside Perm 100% 89% Lymphocytes Canli 100% 0% PFA, Inside Perm 100% 0% Bu sonuçlar, mevcut bulusun çok sayida numune üzerindeki etkinligini ve dayanikliligini göstermektedir. Örnek 5 Mutant alelde (EGFR qeni) bir RS,nin çikarilmasi- deney tasarimi EGFR geninde 5 kodon delesyonunu barindiran HCG-827 hücre hattinda amplifikasyon testleri yürütülmüstür. Insan genomunda tek bir PCR ve primer çifti kullanildigi zaman, delesyon bir restriksiyon bölgesini (RS) kaldirarak M alelin tespitine imkan verirken, RStye sahip olan WT alelin tespitine imkan vermemektedir.
WT durumunun bir kontrolu olarak Ienfositlerle birlikte münferit HCG-827 hücreleri DEPArrayTM ile izole edilmistir.
M aleli ve (çikarilan RS ile) WT aleli (RS'yi hala tutan) için hedeflenen iki farkli primer çifti tasarlanmis ve hem WT hem de M durumlarinin dogru identifikasyonuna yönlendirilmistir.
WT ve M alellerinin amplifikasyonu için kullanilan PCR primer dizileri Tablo 5'te gösterilmistir. Yabanil tip aIeI ileri primerde, WGA primerine homolog olan primer dizisinin birinci kismi kalin ve alti çizili bir sekilde gösterilirken, orijinal DNA ile ayni diziye sahip olan primerin ikinci kismi, restriksiyon endonükleaz çikintisi hariç, (F32 = 18b) kutu içerisinde gösterilmistir. 4010/EPITR Primer Adi Dizi Ex19_M_F SEQ ID No:6 51TAAAATTCCCGTCGCTATCAA3' Ex19_M_R SEQ ID No:7 5'TGTGGAGATGAGCAGGGTCTAGS, Ex19_WT_F SEQ ID No:8 5'CTGTCAGTTAA GAGAAGCAACATCTCC 3, Ex19_WT_R SEQ ID No:9 5'AGAGCAGCTGCCAGACATGAG3' Sekil 11 M ve WT münferit hücrelerin M primer çiftleri ile PCR amplifikasyonunun sonuçlarini göstermekte iken, Sekil 12 M ve WT münferit hücrelerin WT primer çiftleri ile PCR amplifikasyonunun sonuçlarini göstermektedir.
Sekil 13 DRS-WGA ile amplifiye edilen gDNAtya nazaran bir WT tek hücrenin bir ters zincir dizisini göstermekte iken, Sekil 14 DRS-WGA ile amplifiye edilen gDNA'ya nazaran bir M tek hücrenin bir ters zincir dizisini göstermektedir. Örnek 6 Mutant alelde (EGFR qeni) bir RSinin çikarilmasi- deney dogrulama Yukarida açiklanan yöntem 60 tek hücre ile de dogrulanmistir: - Veridex CeIISearch zenginlestirme protokolüne göre isleme sokulan 31 tek HCC-827; - Veridex CellSearch zenginlestirme protokolüne göre Isleme sokulan 11 tek Ienfosit; 31/31=%100'ünde M alelini amplifiye etmistir. 11 Veridex ile isleme sokulan Ienfositler dikkate alindiginda, 11/11=%100 WT PCR'i için pozitif bir PCR ürünü ile sonuçlanmis, 3/11=%27 ise M-PCR için pozitif bir PCR ürünü ile sonuçlanmistir. Bu ürünler dizilenmis ve WT oldugu onaylanmistir. Dolayisiyla, DNAiyi dizileme ile tespit ederek Veridex ile isleme sokulan Ienfositlerin özgüllügü halen %100 iken, yalnizca PCT pozitivitesinin dogruluguna güvenildiginde bu özgüllük (bu testte) 8/11=%73,tür. Jel elektroforez ile DNA ürünü uzunlugunu tespit etme, ayni sekilde uzunlugu ayirt etmeye ve bunun gerçekten WT oldugunu belirlemeye izin verecektir; DNA ürününü gerçek zamanli PCR ile tespit etme, WT ve M ürünlerini ayiramayacaktir. 17 yeni 4010/EPITR sonuçlanmis, 0/17=%O ise M-PCR için pozitif bir PCR ürünü ile sonuçlanmistir. Bu ürünler dizilenmis ve WT oldugu onaylanmistir.
Lenfosit basina 2 WT alel bulundugu için, Veridex ile isleme sokulan (3/22=%14) ve yeni Bu durum, tamamlanmamis RE parçalanma aktivitesi durumunda yukarida açiklanan yöntemin saglamligini göstermektedir.
Sonuçlar Sekil 15'te gösterilmis ve Tablo 6“da özetlenmistir.
EGFR Exon19 Islem n WT Alelin PCR'i DeI.E746_A750 M Alelin PCR'i HCG-827 Veridex 31 %90 % WBC Yeni 17 %100 %0 (*) Tüm diziler WT Yukaridaki örnekler, mevcut bulusa göre yöntemin retriksiyon endonükleazin tamamlanmamis parçalanma aktivitesi durumunda dahi amplifikasyonu (ve dizilemeyi) garanti ettigini göstermektedir. Hücrelerin tabi tutulmus oldugu islemden (önceki örnekte oldugu gibi) veya restriksiyon bölgesi etrafindaki spesifik diziye bagli diger sebeplerden dolayi, RE aktivitesi, hedef DNA”da bulunan tüm RSiler için etkili parçalanmayi her zaman garanti edememektedir.
Istatiksel olarak DRS-WGA'da küçük yüzdede bir parçalanmamis RS mevcuttur; evrensel (birincil -PCR) primer bir diger RSiye baglansa da, bunlara basarili bir sekilde Tüm Genom Amplifikasyonu yapilmistir.
Parçalanmamis bir bölge durumunda üçüncü hedef dizi (MDRS ile) yalnizca bir PCR kullanilmasi söz konusu hedefin amplifikasyonuna ve dizilenmesine izin vermeyecektir.
Restriksiyon enzimi ile tamamlanmamis DNA parçalanmasi durumunda, bulusa uygun yöntem, DRS-WGA kütüphanesinde mevcut olduklarinda hem WT hem de M aIeIin tespitine imkan vermektedir.
Sekil 16, M-PCR için pozitif üç adet Veridex ile isleme sokulmus Ienfositin birisinin dizileme sonuçlarini göstermektedir. Bu, ikinci Ileri primer ile dogru bir sekilde amplifiye edilmis ve dizilenmis ikinci hedef dizi (MDRS ile, ancak WGA sirasinda parçalanmamis) Örnek 7 Mutant alelde (PIKSCA geni) yeni bir RS olusturulmasi.
Baska bir örnek olarak, tek nükleotid degisimi ATG/TAAT'den kaynaklanan PIKBCA geninin ekson 21iinin mutasyonu, M1043I mevcut bulusa göre yöntem ile tespit edilebilmektedir.
Mevcut bulusa ait yöntemin özellikleri ve kitinin analizi yoluyla ortaya çikan avantajlar belirgindir. Özellikle, DNA dizileri kütüphanesini PCR ile amplifiye etmek üzere kullanilan primerlerin belirli tasarimi sayesinde, bahsedilen yöntem birinci hedef DNA dizisini ve ikinci hedef DNA dizisini (DRS-WGA'nin restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi varliginda farklilasan) yüksek özgüllük ve saglamlik ile farkli açilardan tespit etmeye imkan vermektedir.
Bunlarin yani sira, dördüncü bir geri primerin kullanilmasi, hizli, basit ve uygun maliyetli olan daha da spesifik ve saglam bir tespite ve amplikon-boyutu bazli tespite imkan vermektedir.
Bunlarin yani sira, mevcut bulusa ait yöntem mutasyonlari spesifik ve saglam bir sekilde belirlemek üzere deterministik restriksiyon bölgesi tüm genom amplifikasyonunun asagi yönüne uygulanabilmektedir. Bu mutasyonlarin aksi taktirde mevcut geleneksel tespit yöntemleri ile tespit edilmesi imkansizdir.
Dahasi, bir DNA dizileme yönteminin, özellikle Sanger dizileme veya pirodizilemenin kullanilmasi, DNA kütüphanesinin restriksiyon endonükleazinin tamamlanmamis parçalanmasi durumunda olusabilecek yanlis pozitiflerin dahi dogru sekilde tespit Ilave olarak, WGA primeri ile üçüncü ileri primerin %20 ila %80, daha iyi sekilde %40 ila Son olarak, ekli istemlerin koruma kapsamindan ayrilmadan, açiklanan ve gösterilen yöntemin ve kitin modifikasyonlari ve varyantlarinin yapilabilecegi açiktir.
Ozellikle, yöntem birinci, ikinci, üçüncü ve olasi dördüncü primer ile PCR amplifikasyonuna karismayan primer çiftleri de kullanilarak katlanabilmektedir.
Ek olarak, söz konusu primerlerin bir veya daha fazlasi, söz konusu birinci veya ikinci hedef dizi pozitif veya antipozitif zincire hibridize olmayan 5” ucu dizisini de kapsayabilmektedir. Bu özellik avantajli bir sekilde asagida belirtilen amaçlarin biri veya daha fazlasi için kullanilabilmektedir: - PCR ürünlerini bir numune etiketi ile barkodlama, - sonraki jenerasyon dizileme için PCR ürününde bir adaptör olusturma - katlanmis hedef reaksiyonda taklitçi olgunlasmayi önleme.
Bunlarin yani sira, PCR reaksiyonundan WGA ürünleri birtakim arka plan sinyali gösterebildigi için, dizileme için farkli bir primer kullanmak avantajli olabilmektedir. Bu ekstra özgüllük katmani ekleyerek, sinyal-gürültüyü ve dizi grafiginin okunabilirligini gelistirmektedir.

Claims (11)

ISTEMLER
1. (a) Her biri, sirasiyla 5' ucundan 3' ucuna, 15 ila 50 nükleotidlik bir uzunluga sahip olan bir birinci dizi segmenti, restriksiyon endonükleaz ile kesildigi üzere genomik DNA'nin bir ikinci dizi segmenti, bahsedilen birinci dizi segmenti ile, eger mevcut ise restriksiyon endonükleaz tarafindan olusturulan 5' çikintisi birlesimini ters tamamlayici bir üçüncü dizi segmenti içeren DNA dizilerinin kütüphanesini saglama; (b) - en az bir birinci hedef dizi pozitif zincir veya en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir birinci geri primer; - en az bir birinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3” ucu bölgesine hibridize olan en az bir ikinci ileri primer; - en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin üçüncü dizi segmentinin 5' ucu bölgesine hibridize olan bir birinci 5' kismi ve en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir ikinci 3' kismi içeren, birinci kisminin uzunlugu, en az bir üçüncü ileri primerin toplam uzunluguna göre %20 ila %80 olan en az bir üçüncü ileri kullanarak PCR ile DNA dizisi kütüphanesini amplifiye etme (c) (b) adiminda amplifiye edilen DNA dizilerini tespit etme adimlarini içeren, ikinci hedef dizideki tek bir veya çok sayida nükleotid substitüsyonu veya delesyonu veya insersiyonunun, bir restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi olusturarak, bu restriksiyon endonükleaz tarafindan kesilmesi durumunda olusturulan restriksiyon bölgesinin bir birinci kesilmis ikinci hedef dizisini 3' ve olusturulan restriksiyon bölgesinin bir ikinci kesilmis ikinci hedef dizisini 5' meydana getirmesi noktasinda, birinci hedef DNA dizisinin ikinci hedef DNA dizisinden ayrildigi, bir DNA dizisi kütüphanesinden, en az bir birinci hedef DNA dizisinden ve en az bir ikinci hedef DNA dizisinden en az bir tanesini tespit etmeye yönelik bir yöntem.
2. (b) adiminin, en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir dördüncü geri primer de kullandigi, istem 1'e göre yöntem.
3. DNA dizisi kütüphanesinin, deterministik restriksiyon bölgesi tüm genom amplifikasyonu ile elde edildigi, istem 1 veya istem 2'ye göre yöntem.
4. (c) adiminin bir DNA dizileme yöntemi ile gerçeklestirildigi, istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre yöntem.
5. DNA dizileme yönteminin, Sanger dizileme veya sentez ile dizileme oldugu, istem 4'e göre yöntem.
6. En az bir üçüncü ileri primerin birinci kisminin uzunlugunun, bahsedilen en az bir üçüncü ileri primerin toplam uzunluguna göre %40 ila %60 oldugu, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem.
7. En az bir üçüncü ileri primerin söz konusu ikinci kisminin baz olarak uzunlugunun, söz konusu restriksiyon endonükleazin konsensüs dizisinin, eger mevcut ise, bu restriksiyon endonükleaz ile olusturulan 5' çikinti ile farkinin yarisina karsilik gelen bir minimum ile 30 bazlik bir maksimum arasinda oldugu, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem.
8. Söz konusu primerlerden en az bir tanesinin, söz konusu birinci veya ikinci hedef dizi, pozitif veya antipozitif zincirden hiç birisine hibridize olmayan 5' ucu bölgesini de içerdigi, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem.
9. Restriksiyon endonükleazin Msel oldugu, önceki istemlerden herhangi birine göre yöntem.
10. - En az bir birinci hedef dizi pozitif zincir veya en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi pozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir birinci geri - en az bir birinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan en az bir ikinci ileri primer; - en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin üçüncü dizi segmentinin 5, ucu bölgesine hibridize olan bir birinci 5' kismi ve en az bir birinci kesilmis ikinci hedef dizi antipozitif zincirin ikinci dizi segmentinin 3' ucu bölgesine hibridize olan bir ikinci 3, kismi içeren, birinci kisminin uzunlugu, en az bir üçüncü ileri primerin toplam uzunluguna göre ikinci hedef dizideki tek bir veya çok sayida nükleotid substitüsyonu veya delesyonu veya insersiyonunun, bir restriksiyon endonükleaz için bir restriksiyon bölgesi olusturarak, restriksiyon endonükleaz tarafindan kesilmesi durumunda olusturulan restriksiyon bölgesinin bir birinci kesilmis ikinci hedef dizisini 3' ve olusturulan restriksiyon bölgesinin bir ikinci kesilmis ikinci hedef dizisini 5' meydana getirmesi noktasinda, birinci hedef DNA dizisinin ikinci hedef DNA dizisinden ayrildigi, ve kütüphanenin her bir DNA dizisinin, sirasiyla 5' ucundan 3' ucuna, 15 ila 50 nükleotidlik bir uzunluga sahip olan bir birinci dizi segmenti, restriksiyon endonükleaz ile kesildigi üzere genomik DNA'nin bir ikinci dizi segmenti, bahsedilen birinci dizi segmenti ile, eger mevcut ise restriksiyon endonükleaz tarafindan olusturulan 5' çikintisi birlesimini ters tamamlayici bir üçüncü dizi segmenti içerdigi, bir DNA dizisi kütüphanesinden, en az bir birinci hedef DNA dizisinden ve en az bir ikinci hedef DNA dizisinden en az bir tanesini tespit etmeye yönelik kit.
11. ALK veya EGFR veya PIKSCA mutasyonlarinin teshisinde kullanima yönelik, istem 10'a göre kit.
TR2018/06959T 2012-10-31 2013-10-31 Yabanıl tip ve/veya mutasyona uğramış bir hedef dna dizisini tespit etmeye yönelik yöntem ve kit. TR201806959T4 (tr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT000962A ITTO20120962A1 (it) 2012-10-31 2012-10-31 Metodo e kit per rivelare una sequenza di dna bersaglio wild-type e/o mutata

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TR201806959T4 true TR201806959T4 (tr) 2018-06-21

Family

ID=47471949

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TR2018/06959T TR201806959T4 (tr) 2012-10-31 2013-10-31 Yabanıl tip ve/veya mutasyona uğramış bir hedef dna dizisini tespit etmeye yönelik yöntem ve kit.

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9938574B2 (tr)
EP (1) EP2914747B1 (tr)
JP (1) JP6352277B2 (tr)
KR (1) KR102089640B1 (tr)
CN (1) CN104755633B (tr)
CA (1) CA2889439C (tr)
DK (1) DK2914747T3 (tr)
ES (1) ES2674122T3 (tr)
IL (1) IL238514B (tr)
IT (1) ITTO20120962A1 (tr)
PT (1) PT2914747T (tr)
SG (2) SG10201703325XA (tr)
TR (1) TR201806959T4 (tr)
WO (1) WO2014068519A1 (tr)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITUA20162640A1 (it) 2016-04-15 2017-10-15 Menarini Silicon Biosystems Spa Metodo e kit per la generazione di librerie di dna per sequenziamento massivo parallelo
CN109207571B (zh) * 2017-06-30 2022-01-04 深圳华大生命科学研究院 一种检测核酸内切酶酶切位点的方法
EP3431611A1 (en) * 2017-07-21 2019-01-23 Menarini Silicon Biosystems S.p.A. Improved method and kit for the generation of dna libraries for massively parallel sequencing
CN107577921A (zh) * 2017-08-25 2018-01-12 云壹生物技术（大连）有限公司 一种肿瘤靶向基因测序数据解析方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100267023A1 (en) * 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
DK1109938T3 (da) * 1998-09-18 2002-05-27 Micromet Ag DNA-amplificering af en enkelt celle
US6420117B1 (en) * 1999-09-14 2002-07-16 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Miniature inverted repeat transposable elements and methods of use
US7022475B2 (en) * 2001-03-29 2006-04-04 St. Jude Children's Research Hospital Genotyping assay to predict CYP3A5 phenotype
EP1350853A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-08 ID-Lelystad, Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V. Detection of polymorphisms
JP2007521003A (ja) * 2003-07-02 2007-08-02 ケイヘーネ・エヌ・ブイ スプライス部位ａｆｌｐ
JP5560503B2 (ja) * 2008-01-28 2014-07-30 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 黒毛和種の成長に関わる遺伝子変異
ES2637385T3 (es) * 2013-12-04 2017-10-13 Menarini Silicon Biosystems S.P.A. Método y kit para determinar la integridad del genoma y/o la calidad de una biblioteca de secuencias de ADN obtenidas por amplificación de genoma completo mediante sitios de restricción determinísticos

Also Published As

Publication number Publication date
DK2914747T3 (en) 2018-06-14
JP6352277B2 (ja) 2018-07-04
US9938574B2 (en) 2018-04-10
WO2014068519A1 (en) 2014-05-08
ITTO20120962A1 (it) 2014-05-01
SG11201502944RA (en) 2015-05-28
KR102089640B1 (ko) 2020-03-17
IL238514A0 (en) 2015-06-30
CN104755633A (zh) 2015-07-01
US20150368709A1 (en) 2015-12-24
PT2914747T (pt) 2018-05-28
CN104755633B (zh) 2017-07-14
CA2889439A1 (en) 2014-05-08
EP2914747A1 (en) 2015-09-09
ES2674122T3 (es) 2018-06-27
IL238514B (en) 2019-06-30
JP2015532838A (ja) 2015-11-16
CA2889439C (en) 2021-10-05
KR20150099722A (ko) 2015-09-01
EP2914747B1 (en) 2018-03-21
SG10201703325XA (en) 2017-05-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018005983A1 (en) Compositions and methods for detection of nucleic acid mutations
AU2008303400B2 (en) Polynucleotide primers for detecting PIK3CA mutations
JP6914831B2 (ja) 標的核酸の高感度検出方法
KR20140006844A (ko) 돌연변이 분석
CA3135726A1 (en) Markers for identifying and quantifying of nucleic acid sequence mutation, expression, splice variant, translocation, copy number, or methylation changes
TR201806959T4 (tr) Yabanıl tip ve/veya mutasyona uğramış bir hedef dna dizisini tespit etmeye yönelik yöntem ve kit.
Tetzner et al. Control of carry-over contamination for PCR-based DNA methylation quantification using bisulfite treated DNA
JP6543253B2 (ja) ゲノムの完全性及び／又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたｄｎａ配列のライブラリの質を判定する方法及びキット
TR201815755T4 (tr) Allele özgü reaktif primer kullanan nükleik asit amplifikasyon yöntemi.
Vendelbosch et al. Novel insights in the genomic organization and hotspots of recombination in the human KIR locus through analysis of intergenic regions
US20160060696A1 (en) Method for the identification by molecular techniques of genetic variants that encode no d antigen (d-) and altered c antigen (c+w)
Laughlin et al. Rapid method for detection of mutations in the nucleophosmin gene in acute myeloid leukemia
Frigerio et al. SNPs and real-time quantitative PCR method for constitutional allelic copy number determination, the VPREB1 marker case
Nikiforova et al. Amplification-based methods
US20240301481A1 (en) Synthetic polynucleotides and methods for selectively amplifying alleles
US11873533B2 (en) Method of detecting and quantifying geonomic and gene expression alterations using RNA
Old Hematological Applications
JP2012044965A (ja) ウイルス感染に対して抵抗性を有するニワトリの遺伝情報による選抜方法