CN104755633A - 检测野生型和/或突变的靶dna序列的方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从DNA文库中检测第一和/或第二靶DNA序列的方法，不同之处在于突变产生/消除限制性核酸内切酶的限制性位点，包括以下步骤：(a)提供所述DNA文库，其中每个所述DNA序列含有第一序列片段，由所述限制性核酸内切酶切割的基因组DNA的第二序列片段，以及与所述第一序列片段和如果存在的话，所述限制性核酸内切酶的5'悬垂物的结合物反向互补的第三序列片段；(b)通过使用以下各项的PCR扩增DNA序列的所述文库：与所述第一或第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的第一反向引物；与所述第一靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的第二正向引物；包含与所述第二靶序列反正链的第三序列片段的5'端区杂交的第一部分和与所述第二靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的第二部分的第三正向引物，其中所述第三正向引物的第一部分具有相对于所述第三正向引物总长度的20％～80％的长度；(c)检测步骤(b)中扩增的DNA序列。

Description

检测野生型和/或突变的靶DNA序列的方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及检测wt靶DNA序列和/或突变的靶DNA序列的方法和试剂盒，其不同之处在于单个或多个核苷酸取代或删除或插入产生/消除限制性核酸内切酶的限制性位点。
背景技术
单个或数个细胞上的全基因组扩增用于扩增DNA，以允许进行不同类型的遗传分析，包括测序和SNP检测。
通过基于确定性限制性位点的连接介导PCR(LM-PCR)(以下称为DRS-WGA)的全基因组扩增由EP1109938是已知的。
DRS-WGA对于单细胞的扩增已经显示是更好的(参见例如：Lee YS，et al：Comparison of whole genome amplification methods for furtherquantitative analysis with microarray-based comparative genomichybridization.Taiwan J Obstet Gynecol.2008，47(1)：32-41)，并由于固定处理对DNA降解也是更耐受的(参见例如：Stoecklein N.H.et al：SCOMPis Superior to Degenerated Oligonucleotide Primed-PCR for GlobalAmplification of Minute Amounts of DNA from Microdissected ArchivalSamples.American Journal of Pathology 2002，Vol.161，No.1；Arneson N.et al.：Comparison of Whole Genome Amplification methods for analysis ofDNA extracted from microdissected early breast lesions in formalin-fixedparaffin-embedded tissue.ISRN Oncol.2012；2012；710692)。
DRS-WGA DNA文库包含具有图1A中所示通用结构的DNA片段。图1B显示了通过DRS-WGA利用所述限制性核酸内切酶MseI获得的所述DNA文库片段的所述结构的一个具体实例。
DRS-WGA下游的突变检测分析一般通过在所述限制性核酸内切酶(RE)扩增子内设计引物而进行。虽然DRS-WGA在均匀和平衡的扩增方面提供了最好的结果，但是设计用于确定所述突变存在的检测方法在所述突变产生或消除所述RE扩增子内所述DRS-WG限制性核酸内切酶的限制性位点的情况下可能是挑战性的，因为在所述RE扩增子内设计引物的所述平常方式不允许区分所述野生型的和所述突变的DNA。
通过解释说明的方法，引起上述问题的突变实例以下针对所述MseI限制性核酸内切酶的限制性位点TTAA进行显示，然而，使用任何其它限制性位点会出现相同问题。以下实例不旨在限制本发明，因为它也可以适用于DRS-WGA的其它方法，包括使用产生钝端DNA片段的限制性核酸内切酶的方法。
案例A.突变引入新的限制性位点(RS)
取代
取代是一种DNA突变，其中一个(或多个)核苷酸被不同核苷酸错误替代。这会在所述具体DNA位点的所述核苷酸序列中产生变化。
因此所述取代可以在所述突变的(M)DNA序列中引入RS，而在所述野生型(WT)DNA序列中没有RS。
作为单碱基取代的实例：
其中V是A或C或G(非T)，而B是C或G或T(非A)。
删除
DNA突变可以去除一个(或多个)核苷酸，在所述突变的(M)DNA序列中产生RS，而在所述野生型(WT)DNA序列中不存在RS。
例如对于单或多(n)碱基删除：
插入
DNA突变可以插入一个(或多个)核苷酸在所述突变的(M)DNA序列中产生RS，而在所述野生型(WT)DNA序列中不存在RS。
例如对单碱基插入：
WT序列    M序列        案例
VTAA      [insT]TAA    (9)
TTAB      TT[insA]AB   (10)
和以下的相关的不可区分的案例：
VTAA      T[insT]AA    (9')
TTAB      TTA[insA]B   (10')
所有上述突变都会引入RS，导致当使用引物对扩增包含突变位点的区域时通过例如PCR和测序不能在所述DNA文库片段中检测突变，因为只有所述野生型等位基因(如果存在)才会被正确扩增和测序。这种情况概述于图2，案例A，左插图中。
案例B.所述突变从所述野生型(WT)序列中去除所述限制性位点
取代
取代可以去除WT DNA序列中存在的RS。
以上对应于案例(l)-(4)，其中所述M DNA序列和所述WT DNA序列交换(swap)。
删除
DNA突变可以去除一个(或多个)核苷酸以去除RS，而在野生型(WT)DNA序列中存在RS。
例如对于单碱基删除：
WT序列    M序列          案例
VTTAA      V[delT]TAA    (15)
TTAAB      TT[delA]AB    (16)
和以下相关的不可区分的案例：
VTTAA      VT[delT]A     (15')
TTAAB      TTA[delA]B    (16')
插入
DNA突变可以插入一个(或多个)核苷酸以去除RS，而在野生型(WT)DNA序列中存在RS。
正如以上的实例中任何(和许多其它)包括一个或多个碱基删除的案例将会去除存在于WT序列中的RS，而产生非消化的序列。
尽管所述突变的序列可以通过设计扩增包含所述突变位点的DNA序列的引物对而易于识别，但所述野生型等位基因(如果存在)未被扩增，则给出所述基因型的错误评价。这种情况概述于图2，案例B，右插图中。
此外，当不存在突变时，所述PCR将根本不会存在信号，并且将不可能确定在DRS-WGA期间有野生型等位基因的丢失(drop-out)还是所述基因型简单地就是野生型。
EP1350853公开了揭示限制性位点的多态性的扩增的片段长度多态性(AFLP)技术。检测一个或多个基因组之间序列多态性的方法包括通过以下步骤从所述基因组产生核酸指纹：(a)从起始核酸提供具有与至少一种适配子(adaptor)相容的端部的多个适配子可连接的核酸片段，并且其中所述核酸片段通过采用限制性核酸内切酶进行片段化而获得；(b)在所述核酸片段的所述端部和所述至少一种适配子之间进行连接反应以产生适配子连接的核酸片段；(c)通过使用基本上与所述至少一种适配子的核苷酸序列互补的至少一种扩增引物扩增所述适配子-连接的核酸片段；和(d)从所述扩增的适配子-连接的核酸片段产生核酸指纹；针对扩增的核酸片段的存在或不存在，或之间的差异比较所述获得的核酸指纹，从而确定序列多态性的存在。
然而这种方法不允许检测一个特异性多态性位点。
发明内容
因此本发明的一个目的是提供在具有诸如通过DRS-WGA获得的结构的DNA片段文库中检测野生型靶DNA序列和/或突变的靶DNA序列的方法，其中所述野生型靶DNA序列和所述突变的靶DNA序列不同之处在于所述DRS-WGA的限制性核酸内切酶的限制性位点的存在，这以简单有效的方式解决了以上引述的问题。
这个目的通过本发明实现，因为其涉及如权利要求1中所定义的方法。
本发明进一步的目的是提供如权利要求10中所定义的试剂盒。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域内的普通技术人员所通常理解的相同含义。尽管类似或等同于本文描述的方法和材料的许多方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但优选的方法和材料描述如下。除非另外提及，否则本文所描述的适用于本发明的技术是本领域内普通技术人员公知的标准方法。
对于所述术语“限制性位点”或“RS”，是指被所述限制性核酸内切酶(或“RE”)识别的沿着DNA分子的核苷酸序列(通常4-8个碱基对长度)。在所述限制性位点上，所述限制性核酸内切酶通过水解它们之间的磷酸二酯键而切割核苷酸。
对于所述术语“突变-依赖性限制性位点”(或“MDRS”)，是指通过所述突变的作用引入或去除的RS。
对于所述术语“切割位点”(或“CS”)，是指通过所述RE水解的所述磷酸二酯键所定位的所述限制性位点的序列中的位置。
对于所述术语“突变-依赖性切割位点”(或“MDCS”)，是指通过所述突变的作用引入或去除的CS。
对于所述术语“扩增子”，是指通过PCR扩增产生的DNA区域。
对于所述术语“DRS-WGA扩增子”或“WGA扩增子”，是指DRS-WGA期间扩增的DNA片段，包括侧翼为连接的WGA引物的两个RS之间的DNA序列。
对于所述术语“WGA PCR引物”或“通用(universal)WGA引物”或“适配子”，是指连接至通过DRS-WGA中所述限制酶作用产生的每一片段的额外寡核苷酸。
对于所述术语“原始DNA”，是指采用DRS-WGA扩增之前的所述基因组DNA(gDNA)。
对于所述术语“靶序列”，是指所述原始DNA上感兴趣的区域。
对于所述术语“靶序列有义链”，是指从5'至3'的DNA链的片段，其具有与mRNA相同的序列并与所述反义链互补。所述有义链也可以称为“正链”。
为了简化起见，在本说明书中，所述术语“靶序列正链”(TSPS)将与所述以下含义一起使用：
1)随着核苷酸数增加在所述序列上的突变依赖性切割位点的3′侧上发生突变的情况下通过增加核苷酸数，它确定所述基因组DNA序列
2)随着核苷酸数增加在所述序列上的突变依赖性切割位点的5′侧上发生突变的情况下通过增加核苷酸数，它确定所述基因组DNA序列的反向互补序列
相应地，所述术语“靶序列反正链(target sequence antipositive strand)”(TSAS)将用于本说明书中，具有以下含义：
3)随着核苷酸数增加在所述序列上的突变依赖性切割位点的3′侧上发生突变的情况下通过增加核苷酸数，它确定所述基因组DNA序列的反向互补序列
4)随着核苷酸数增加在所述序列上的突变依赖性切割位点位置的所述5′侧上发生突变的情况下通过增加核苷酸数，它通过确定所述基因组DNA序列
所述短语“增加核苷酸数”是指相对于所述染色体位置进行编号(如在序列数据库如UCSC基因组浏览器(UCSC Genome Browser)中找到)。
对于所述短语“序列片段的5'端区”，是指所涉及的核苷酸序列的定位指向所述序列片段的5'末端。
对于所述短语“序列片段的3′端区”，是指所涉及的核苷酸的序列的定位指向所述序列片段的3'末端。
附图说明
图1A显示了当突变依赖性切割位点(MDCS)未发生切割时通过特异性DRS-WGA，使用所述限制性核酸内切酶MseI获得的DNA文库片段的通用结构的草图。首字母缩写如下：FTS＝第一靶序列；CS＝切割位点；RS＝限制性位点；FTSPS＝第一靶序列正链；FTSAS＝第一靶序列反正链；NUCL#＝核苷酸数(根据所述箭头方向增加)；WT＝野生型；MDCS＝突变依赖性切割位点。
图1B显示了当突变依赖性切割位点(MDCS)发生切割时通过特异性DRS-WGA，使用所述限制性核酸内切酶MseI获得的DNA文库片段的通用结构的草图。其它首字母缩写如下：STS＝第二靶序列；MDRS＝突变依赖性限制性位点；M＝突变的；STSPS＝第二靶序列正链；STSAS＝第二靶序列反正链。
图1C显示了所述第一靶序列正和反正链的草图和相关的反向和正向引物的位置。其它首字母缩写如下：R1＝第一反向引物；F2＝第二正向引物。
图1D显示了所述第二靶序列正和反正链的草图和相关的反向和正向引物的位置。其它首字母缩写如下：F3＝第三正向引物；F31＝第三正向引物的第一部分；F32＝第三正向引物的第二部分。
图1E显示了当所述突变通过增加核苷酸数而位于所述序列上的MDCS的5'侧上时，所述第一靶序列正和反正链的草图和相关的反向和正向引物的位置。
图1F显示了当所述突变通过增加核苷酸数而位于所述序列上的MDCS的5'侧上时，所述第二靶序列正和反正链的草图和相关的反向和正向引物的位置。
在图1A-1F中，所指的是所述未切割的序列是WT序列，并且所述切割的序列是突变序列的情况。所述突变序列是未切割的而所述野生型序列是切割的可替代的情况能够很容易地通过WT与M简单交换而获得。
图2显示了包括在所述突变DNA序列中引入(案例A-左插图)或去除(案例B)限制性位点的两种情况的简化图和采用传统突变检测方法的结果。
图3显示了对于实施例1的wt和突变DNA采用二价引物对实施的PCR扩增的分离产物的凝胶电泳的图像。Cnt：WGA反应的空白。C-：PCR反应的空白。
图4A和4B显示了根据本发明的所述方法的工作原理的简化草图。
图4A显示了所述突变在所述序列中引入限制性位点的情况。图4B显示了所述突变在所述序列中去除所述限制性位点的情况。
图5显示了采用包括所述限制性位点的突变的特异性5'引物实施的PCR扩增的分离产物的凝胶电泳的图像，其长度与所述通用WGA引物具有86％的一致性。
图6显示了采用实施例3的野生型特异性5'引物进行的PCR扩增的分离产物的凝胶电泳的图像。
图7显示了采用实施例3的突变的特异性5'引物进行的PCR扩增的分离产物的凝胶电泳的图像。
图8显示了实施例3的野生型等位基因测序的实例。
图9显示了实施例3的突变等位基因测序的实例。
图10显示了总结实施例4的结果的表格。
图11显示了采用实施例5的突变引物对实施的M和WT单独细胞的PCR扩增的分离产物的凝胶电泳的图像。
图12显示了采用实施例5的野生型引物对实施的M和WT单独细胞的PCR扩增的分离产物的凝胶电泳的图像。
图13显示了实施例6的野生型单细胞的反向链(reverse strand)序列的实例。
图14显示了实施例6的突变的单个细胞的反向链序列的实例。
图15显示了总结实施例6的结果的表格。
图16显示了对于突变PCR产物为阳性(即，对于仅PCR产物是假阳性的)的野生型细胞(白细胞)的反向链序列的实例，其通过如实施例6中的检测方法反证为野生型。
具体实施方式
根据本发明的用于从DNA序列文库中检测至少一种第一靶DNA序列和至少一种第二靶DNA序列中的至少一种的方法包括步骤(a)至(c)。所述第一靶DNA序列与所述第二靶DNA序列不同之处在于所述第二序列中的单个或多个核苷酸取代或删除或插入产生限制性核酸内切酶的限制性位点。参照图2，案例A，左插图，和图4A，所述第一靶DNA序列对应于所述野生型DNA序列而所述第二靶DNA序列对应于所述突变的DNA序列，相反参照图2，案例B，右插图，和图4B，所述第一靶DNA序列对应于所述突变的DNA序列而所述第二靶DNA序列对应于所述野生型DNA序列。
在步骤(a)中，提供了所述DNA序列的文库。所述文库的每种DNA序列从5'端至3'端分别包含具有15～50个核苷酸长度的第一序列片段，由所述限制性核酸内切酶切割的基因组DNA的第二序列片段，和与所述第一序列片段和如果存在的话，由所述RE产生的所述5'悬垂物的结合物反向互补的第三序列片段。参照图1A，数字1指示所述第一序列片段，数字2指示所述第二序列片段，而数字3指示所述第三序列片段。在优选的实施方式中所述第一序列片段对应于所述WGA PGR引物。
所述限制性核酸内切酶优选是MseI。
在步骤(b)中，所述DNA序列的文库通过使用以下引物的PCR进行扩增：
-与所述至少一种第一或第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第一反向引物；
-与所述至少一种第一靶序列反正链的第二序列片段的所述3'端区杂交的至少一种第二正向引物；
-包含与所述至少第二靶序列反正链的第三序列片段的5'端区杂交的第一部分和与所述至少一种第二靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的第二部分的至少一种第三正向引物，其中所述至少一种第三正向引物的第一部分具有相对于所述至少一种第三正向引物总长度20％～80％的长度。
所述第三正向引物在下文中有时简称为“杂交引物”。
优选将与所述至少一种第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第四反向引物用于步骤(b)中。
优选所述至少一种第三正向引物的所述第一部分具有相对于所述至少一种第三正向引物总长度40％～60％的长度。
优选所述至少一种第三正向引物的第二部分具有包含在对应于所述限制性核酸内切酶的一致序列减去，如果存在的话，由所述限制性核酸内切酶产生的所述5'悬垂物(overhang)并都除以二的最小值和30个碱基的最大值之间的碱基长度。
参照图4A，所述第一反向引物对应于所述野生型反向引物(WT_R)，所述第二正向引物对应于所述野生型正向引物(WT_F)，所述第三正向引物对应于所述突变的正向引物(M_F)。在一个实施方式中，所述第一反向引物用于不仅扩增所述第一，而且扩增所述第二靶序列正链。然而，在优选的实施方式中，不同于所述第一反向引物的第四反向引物，用于扩增所述第二靶序列正链。在图4A中，所述第四反向引物对应于所述突变的反向引物(M_R)。
相同的原则适用于图4B中，其中所述第一反向引物对应于所述突变的反向引物(M_R)，所述第二正向引物对应于所述突变的正向引物(M_F)，所述第三正向引物对应于所述野生型正向引物(WT-F)，而所述第四反向引物对应于所述野生型反向引物(WT_R)。
在步骤(c)中，检测步骤(b)中扩增的所述DNA序列。步骤(c)可以通过本领域内已知的几种检测方法，如凝胶电泳，毛细管电泳，DNA测序进行实施。优选步骤(c)通过DNA测序方法进行实施。更加优选所述DNA测序方法是桑格测序(Sanger sequencing)，或合成测序法。
本发明的所述方法可以与具有如图1A中所示结构的任何DNA序列文库一起使用。所述方法优选与通过确定性限制性位点全基因组扩增获得的DNA序列文库一起使用。
根据本发明，还提供了包含以上定义的第一和/或第二和/或第三引物的试剂盒包。
更具体而言，用于从DNA序列文库中检测至少一种第一靶DNA序列和至少一种第二靶DNA序列中的至少一种的试剂盒，其中所述第一靶DNA序列与所述第二靶DNA序列不同之处在于所述第二序列中单个或多个核苷酸取代或删除或插入产生限制性核酸内切酶的限制性位点，而其中所述文库的每种DNA序列从5'端至3'端分别包含具有15～50个核苷酸长度的第一序列片段，由所述限制性核酸内切酶切割的基因组DNA的第二序列片段，和与所述第一序列片段和如果存在的话，由所述限制性核酸内切酶产生的5'悬垂物的结合物(union)反向互补的第三序列片段，包含：
-与所述至少一种第一或第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第一反向引物；
-与所述至少一种第一靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第二正向引物；
-包含与所述至少第二靶序列反正链的第三序列片段的5'端区杂交的第一部分和与所述至少一种第二靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的第二部分的至少一种第三正向引物，其中所述至少一种第三正向引物的第一部分具有相对于所述至少一种第三正向引物总长度20％～80％的长度。
所述试剂盒优选进一步包含与所述至少一种第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第四反向引物。
所述试剂盒可以用于检测产生或消除所述文库的DNA片段的第二序列片段的末端的限制性核酸内切酶的限制性位点的任何类型的突变。所述试剂盒优选用于诊断所述(间变型淋巴瘤激酶(anaplastic lymphomakinase))ALK或(表皮生长因子受体)EGFR或(磷脂酰肌醇3-激酶催化α多肽)PIK3CA基因的突变。
实施例
实施例1-二价引物方法
初步测试在SY5Y细胞系(SH-SY5Y ATCC目录号CRL-2266TM)上进行，其在所述ALK基因的密码子1174处具有杂合的C至A取代，将苯丙氨酸转化成亮氨酸(F1174L)；考虑到侧翼序列，所述杂合的取代在所述突变的等位基因中引入了一个新的限制性位点(RS)，而所述野生型等位基因没有任何RS。
图2是通过突变产生的WGA DNA文库中的序列和转化的简化草图。
为了检测在所述RS上发生的突变，测试了以下方法。开发全基因组扩增的通用引物(DRS-WGA引物，SEQ ID NO：1，具有序列AGTGGGATTCCTGCTGTCAGT)用于设计新PCR引物对中的5'引物，其中所述3'引物相对于所述RS重叠3′中的区域。
这种策略由设计包含以下引物的二价引物对构成：
-与所述DRS-WGA引物具有95％一致性的5'引物；和
-可以提供PCR所需的特异性的3'PCR引物，以选择性地扩增靶区域，而不是其它的DRS-WGA扩增子。
这种二价引物对在理论上应该用于野生型(WT)序列和突变型(M)序列的扩增。
实验证据表明，这种方法结果较差和不正确，并且不能保证检测出RS处的突变。如图3中所示，使用二价引物提供非特异性扩增，这导致具有不同尺寸的许多扩增带，以及没有预期尺寸的清晰可辨的条带(例如，在单SY5Y细胞上，携带F1174L杂合突变，用DEPArrayTM分离并且用DRS-WGA扩增。132bp用于所述突变序列，169bp用于所述WT序列)。所述扩增未能在突变的(M)，野生型(WT)和PCR阴性对照(C-)样品中给出清晰的和特异性的条带。WGA(Ctr-)的阴性对照仅显示出非特异性条带。
一种造成这种较差结果的因素是95％对应于所述连接的WGA-引物的5'二价引物存在于所述DRS-WGA文库的所有DNA片段上，而3'二价引物并未给所述PCR反应提供足够的特异性。
作为一个实施例，人类基因组对照物(Homo Sapiens hg 19)包含3,095,693,981个碱基。如果所述基因组采用具有四个碱基限制性位点(例如TTAA)的限制性核酸内切酶消化，则所产生的DNA片段的平均长度为4(可能的碱基)至4(所考虑的消化序列长度)乘方＝256。所产生的DNA文库因此将包含约3,095,693,981/256～12.1百万个不同的片段，简单假设DNA中核苷酸的随机序列。它们都将包含相同的5'引物(对应于所述初级PCR的WGA-引物)。
因此，使用所述二价引物对提供非特异性条带。
实施例2-杂合引物一致性范围限制
扩增测试在与实施例1中所用的相同SY5Y细胞系上进行，但使用本发明的方法。
为了测试DRS-WGA产物中野生型(WT)和突变(M)等位基因二者的扩增，采用DEPArrayTM分离各个SY5Y细胞，这提供纯的单细胞。
使用其长度86％匹配所述WGA通用引物的5'PCR引物的扩增方法提供既不扩增所述WT等位基因也不扩增所述M等位基因的解决方案。如图5中所示，所述扩增在突变的(M)，野生型(WT)和PCR阴性对照(C-)的样品中都未能提供清晰且特异性的条带。所述WGA的阴性对照(Ctr-)仅显示出非特异性条带。
与所述WGA通用引物具有不同一致性百分比的引物进行了测试。所述结果总结于下面的表1中。
表1
在表1中，列F32报告了“第三正向引物的第二部分”，即具有与不包括限制性核酸内切酶悬垂物的原始DNA相同序列的引物部分，的碱基数长度。
由表1中的结果清楚可见，需要确定平衡折衷以满足所述方法的要求。多次测试表明，所述杂交引物与所述WGA通用引物的理想的同一性百分比为20％～80％，更加好的效率范围是40％～60％。
实施例3在突变体等位基因(ALK基因)中引入新RS—检测方 法设计
根据本发明的方法保证了甚至在通过所述限制性核酸内切酶不完全消化的情况下进行扩增(和测序)。事实上，所述限制性核酸内切酶的活性对于所述靶DNA中的所有RS并不能保证，且统计上小百分比的未消化RS存在于所述DRS-WGA中，然而其被DRS-WGA成功扩增，虽然所述WGA-引物(初级-PCR)在另一RS中。
在未消化位点的情况下，针对所述突变体序列设计的仅一个引物对的所述突变检测方法的使用将不会允许对所述靶进行扩增和测序。
扩增测试再次在所述SY5Y细胞系上实施，其-如先前所公开的-在密码子1174处具有杂合的C到A的取代，将苯丙氨酸转化成亮氨酸(F1174L)。因而所述杂合的取代在突变的等位基因中引入了新的RS，而所述野生型等位基因没有任何RS。
所述用于WT和M等位基因扩增的PCR引物序列如表2中所示。对于突变体等位基因正向引物，与所述WGA引物一致的所述引物序列的第一部分以粗体并加下划线显示，而与不包含所述限制性核酸内切酶悬垂物的原始DNA具有相同序列的所述引物的第二部分，(F32＝8个碱基)以方框显示。
表2
为了对DRS-WGA产物中的WT和M等位基因的扩增进行测试，采用DEPArrayTM分离各个SY5Y细胞，这会提供纯的单细胞。
作为所述突变检测的阴性对照，也采用DEPArrayTM分离出单独的淋巴细胞并且采用DRS-WGA进行扩增。
在WT(淋巴细胞)和杂合的M(SY5Y)上的所述WT等位基因的PCR扩增通过使用专门设计的WT 5'引物完美实现，其允许仅扩增所述WT等位基因。
正如图6中能够观察到，没有特异性扩增产物。相反，所预期的PCR条带(132bp)清晰可辨。
所述M-特异性5'引物针对相同的淋巴细胞和SY5Y细胞进行测试以检测由所述设计的跨(straddling)靶序列和所述通用DRS-WGA引物的引物提供的所述扩增的特异性。
正如在图7中可以看出，在这种情况下，正如所预期，仅在所述SY5Y单细胞DRS-WGA DNA中获得了所述特异性扩增。来自淋巴细胞的DRS-WGA DNA(对于所述靶突变是WT)，对于所述预期的扩增呈阴性，并仅存在非特异性PCR扩增。
为了证明所述实现的扩增是特异性的并允许进行测序，所有扩增产物从其3'端进行测序。所述相应的WT或M状态对于所有扩增产物都进行证实，显示采用所述方法实现的特异性。WT等位基因测序的实施例如图8中所示，而M等位基因测序的实施例如图9所示。
结果总结于表3中。
表3
在优选的实施方式中，所述第三正向引物(F3)的第二部分(F32)短于30个核苷酸从而不能在所述第一靶序列反正链(FTSAS)上错误引导(mis-prime)—即，该实施例中的所述野生型序列—，因而启动可能导致假阳性(按照其PCR产物长度和序列)的PCR反应。更优选所述第二部分(F32)的长度短于20个核苷酸。更加优选所述第三正向引物(F3)的所述第二部分(F32)的长度短于或等于10个核苷酸。
所述第三正向引物(F3)的所述第二部分(F32)，不宜过短，以至于不能提供足够的特异性，(参见例如表I中的结果)。具体而言，所述第三正向引物的所述第二部分的长度应该大于所述限制性位点一致序列长度减去所述消化的DNA的5'悬垂物的长度，全部都除以2。为了获得更大的特异性，所述第三正向引物(F3)的所述第二部分(F32)应该是至少3个核苷酸，且甚至更优选至少6个核苷酸，长于所述限制性位点一致序列长度减去所述消化的DNA的5'悬垂物的长度，全部都除以2。
实施例4在所述突变体等位基因(ALK基因)中引入新RS-检测验 证
以上所述方法进一步采用54个单细胞进行验证：
-10个单一的，活性的，新鲜的SY5Y(single live,fresh SY5Y)；
-19个单一SY5Y，预先室温下用2％多聚甲醛(PFA)固定20min，并用Inside Perm(Miltenyi Biotec)透化；
-19个单一SY5Y，预先用CytoChexTM固定，并用Inside Perm透化；
-2个单一的，新鲜的，活性的淋巴细胞；
-2个单一淋巴细胞，预先用2％PFA室温下固定20min，并用InsidePerm(Miltenyi Biotec)透化。
所述方法在100％的SY5Y和淋巴细胞中扩增所述WT等位基因，并且在9/10＝90％的活性(live)SY5Y，用cyto-chex/inside-perm固定&透化的16/19＝84％的SY5Y细胞，用PFA2％20'室温/inside-perm固定&透化的17/19＝89％的SY5Y细胞和0/4＝0％的淋巴细胞中扩增所述突变体等位基因。
结果显示于图10中并总结于表4中。
表4
这些结果表明本发明的所述方法对更大数量的样品的效能和鲁棒性。
实施例5去除突变体等位基因(EGFR基因)中RS-检测方法设计
扩增测试在所述HCC-827细胞系上进行实施，其具有在所述EGFR基因中5个密码子的删除。当将单PCR和引物对用于人类基因组时，所述删除去除了限制性位点(RS)，允许检测所述M等位基因，但不能检测含有RS的所述WT等位基因。
各个HCC827细胞采用DEPArrayTM分离，随同淋巴细胞作为所述WT条件的对照。
靶向所述M等位基因(具有删除的RS)和WT等位基因(仍保留所述RS)的两种不同引物对经过设计并且导致正确识别WT和M条件。
用于WT和M等位基因扩增的PCR引物序列如表5中所示。对于野生型等位基因正向引物，与所述WGA引物一致的所述引物序列的第一部分以粗体并下划线显示，而与不包括所述限制性核酸内切酶悬垂物的原始DNA具有相同序列的所述引物的第二部分，(F32＝16b)以方框显示。
表5
图11显示了采用M引物对对M和WT单独细胞进行PCR扩增的结果，而图12显示了采用WT引物对对M和WT单独细胞进行PCR扩增的结果。
图13显示了相比于用DRS-WGA扩增的所述gDNA，WT单细胞的反向链序列，而图14显示了相比于用DRS-WGA扩增的所述gDNA，M单细胞的反向链序列
实施例6去除所述突变体等位基因(EGFR基因)中RS-检测验证
上述方法采用60个单细胞进行进一步的验证：
-31个单一HCC-827，根据Veridex CellSearch富集方案进行处理；
-11个单一淋巴细胞，根据Veridex CellSearch富集方案进行处理；
-17个单一，新鲜的，活性的淋巴细胞。
所述方法在28/31＝90％的所述单一HCC-827中扩增所述WT等位基因，而在31/31＝100％的所述单一HCC-827中扩增所述M等位基因。
考虑所述11个Veridex-处理的淋巴细胞，11/11＝100％导致对于所述WT PCR的阳性PCR产物(positive PCR product)，3/11＝27％导致对于所述的M-PCR的阳性PCR产物。这些产物经过测序，证实是WT。因此，通过测序检测所述DNA，对Veridex-处理的淋巴细胞的特异性仍是100％，然而，仅依赖于所述PCR阳性，所述特异性(在本测试中)为8/11＝73％。通过凝胶电泳检测所述DNA产物长度将同样允许区分所述长度并确定实际上它就是WT；通过实时PCR检测所述DNA产物在WT和M产物之间将不会区分。考虑所述17个新鲜的淋巴细胞，17/17＝100％导致对于所述WT PCR的阳性PCR产物，0/17＝0％导致对于所述M-PCR的阳性PCR产物。这些产物经过测序，证实是WT。
由于每个淋巴细胞有2个WT等位基因，Veridex-处理的(3/22＝14％)和新鲜淋巴细胞(0/34＝0％)之间未消化的RS的差异是统计学显著性的。
这证明了在不完全RE消化活性的情况下上述方法的鲁棒性
(robustness)。
结果示于图15中并总结于表6中。
表6
(*)所有序列WT
上述实施例表明，根据本发明的方法甚至在所述限制性核酸内切酶的不完全消化活性的情况下都确保所述扩增(和所述测序)。所述RE的活性因为所述细胞经受的处理(如在前面的实施例中)，或因为与所述限制性位点周围的特异性序列相关的其它原因，不能总保证靶DNA中存在的所有RS的有效消化。
统计学上所述DRS-WGA中存在小百分比的未消化RS，然而这是成功的全基因组扩增，尽管通用(初级-PCR)引物连接到另一RS上。
在未消化位点的情况下，对所述第三靶序列仅使用一个PCR(采用所述MDRS)将不会允许所述靶的扩增和测序。在通过所述限制酶不完全DNA消化的情况下，本发明的方法在WT和M等位基因存在于所述DRS-WGA文库中时对二者等位基因都进行检测。
图16显示了对于所述M-PCR呈阳性的3个Veridex-处理的淋巴细胞之一的测序结果的实施例。这是所述第二靶序列(采用所述MDRS，但在WGA期间未消化)采用所述第二正向引物正确扩增和测序的情况。
实施例7在所述突变体等位基因(PIK3CA基因)中引入新RS
作为另一个实施例，源自所述单核苷酸变化ATG/TAAT的所述PIK3CA基因的外显子21的突变M1043I，可以通过根据本发明所述方法进行检测。
通过对本发明所述方法和试剂盒的特性的分析，所得到的优点是显而易见的。
具体而言，依据用于通过PCR扩增DNA序列的所述库的引物的特定设计，本方法允许以较大的特异性和鲁棒性有差别地检测所述第一靶DNA序列和所述第二靶DNA序列(差别之处在于存在所述DRS-WGA的限制性核酸内切酶的限制性位点)。
另外，使用第四反向引物允许更加具有特异性和鲁棒性的检测和基于扩增子尺寸的检测，这是快速的，简单的和成本有效的。
此外，本发明所述方法可以在确定性限制性位点全基因组扩增下游实施从而以特异性和稳健(鲁棒性，robust)的方式检测突变。这些突变以其它方式采用可供使用的传统检测方法不可检测。
此外，使用DNA测序方法，特别是桑格测序或焦磷酸测序(pyrosequencing)，保证了即使在所述DNA文库的限制性核酸内切酶不完全消化的情况下可能发生的假阳性的正确检测。
此外，所述第三正向引物与所述WGA引物20％～80％，更好的是40％～60％的一致性百分比，允许获得最佳的结果。
最后，显而易见的是，可以作出本发明公开和所示的所述方法和试剂盒的修改和变体，而不会因为这偏离了所附权利要求的保护范围。
具体而言，本发明方法可以通过使用不会干扰使用所述第一、第二、第三和可能的第四引物的PCR扩增的其它引物对进行多路复用(multiplex)。
此外，一种或多种所述引物可以进一步包含并并不与所述第一或第二靶序列正或反正链中任何一项杂交的5'端序列。这个特性能够有利地用于一个或多个以下目的：
-用样品标签对所述PCR产物打上条形码，
-在所述PCR产物中引入适配子进行下一代测序
-防止在多路复用(multplexed)靶PCR反应中伪引导(spuriouspriming)。
此外，因为来自所述PCR反应的WGA产物可能会显示出一些背景信号，使用不同引物进行测序可能是有利的。这增加了额外一层特异性，提高了所述序列图的信-噪和可读性。

Claims (12)

1.一种用于从DNA序列的文库中检测至少一种第一靶DNA序列和至少一种第二靶DNA序列中的至少一种的方法，其中所述第一靶DNA序列不同于所述第二靶DNA序列之处在于所述第二序列中的单个或多个核苷酸取代或删除或插入产生限制性核酸内切酶的限制性位点，包括以下步骤：
(a)提供DNA序列的所述文库，每种所述DNA序列从5'端至3'端分别包含具有15～50个核苷酸长度的第一序列片段，由所述限制性核酸内切酶切割的基因组DNA的第二序列片段，以及第三序列片段，所述第三序列片段与所述第一序列片段和如果存在的话由所述限制性核酸内切酶产生的5'悬垂物的结合物反向互补；
(b)通过使用以下各项的PCR扩增DNA序列的所述文库：
-与至少一种第一或第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第一反向引物；
-与至少一种第一靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第二正向引物；
-包含与至少第二靶序列反正链的第三序列片段的5'端区杂交的第一部分和与至少一种第二靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的第二部分的至少一种第三正向引物，其中所述至少一种第三正向引物的第一部分具有相对于所述至少一种第三正向引物的总长度20％～80％的长度；
(c)检测步骤(b)中扩增的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)进一步使用与所述至少一种第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第四反向引物。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中DNA序列的所述文库通过确定性限制性位点全基因组扩增而获得。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中步骤(c)通过DNA测序方法实施。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述DNA测序方法是桑格测序或合成测序。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第三正向引物的第一部分具有相对于所述至少一种第三正向引物总长度的40％～60％的长度。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少一种第三正向引物的所述第二部分具有包含在对应于所述限制性核酸内切酶的一致序列减去如果存在的话由所述限制性核酸内切酶产生的5'悬垂物并都除以2的最小值和30个碱基的最大值之间的碱基长度。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述引物的至少一种进一步包含并未与所述第一或第二靶序列，正或反正链中任一种杂交的5'端区。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述限制性核酸内切酶是MseI。
10.一种试剂盒，包含根据前述权利要求中任一项所述的第一、第二和第三引物。
11.一种用于从DNA序列文库中检测至少一种第一靶DNA序列和至少一种第二靶DNA序列中至少一种的试剂盒，其中所述第一靶DNA序列不同于所述第二靶DNA序列之处在于所述第二序列中的单个或多个核苷酸取代或删除或插入产生限制性核酸内切酶的限制性位点，并且其中所述库的每种DNA序列从5'端至3'端分别包含具有15～50个核苷酸长度的第一序列片段，由所述限制性核酸内切酶切割的基因组DNA的第二序列片段，以及第三序列片段，所述第三序列片段与所述第一序列片段和如果存在的话由所述限制性核酸内切酶产生的5'悬垂物的结合物反向互补，包括：
-与至少一种第一或第二靶序列正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第一反向引物；
-与至少一种第一靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的至少一种第二正向引物；
-包含与至少第二靶序列反正链的第三序列片段的5'端区杂交的第一部分和与至少一种第二靶序列反正链的第二序列片段的3'端区杂交的第二部分的至少一种第三正向引物，其中所述至少一种第三正向引物的第一部分具有相对于所述至少一种第三正向引物总长度20％～80％的长度。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，用于诊断ALK或EGFR或PIK3CA突变。
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