JP2015532838A - 野生型及び/又は変異型の標的dna配列を検出する方法及びキット - Google Patents
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Abstract
Description
置換
置換は、1つ(又は複数)のヌクレオチドが異なるヌクレオチドと誤って置き換えられるDNA変異である。これは、特定のDNA部位のヌクレオチド配列における変化を生じる。
WT配列 M配列 ケース
VTAA TTAA (1)
TVAA TTAA (2)
TTBA TTAA (3)
TTAB TTAA (4)
(ここで、Vは、A又はC又はGであり(Tではない)、Bは、C又はG又はTである(Aではない))。
DNA変異は、野生型(WT)DNA配列中にRSが存在しない場合、変異型(M)DNA配列中のRSを産生する1つ(又は複数)のヌクレオチドを除去する場合がある。
WT配列 M配列 ケース
T[V]nTAA TTAA (5)
TT[V]nAA TTAA (6)
TT[B]nAA TTAA (7)
TTA[B]nA TTAA (8)
DNA変異は、野生型(WT)DNA配列中にRSが存在しない場合、変異型(M)DNA配列中のRSを産生する1つ(又は複数)のヌクレオチドを挿入する場合がある。
WT配列 M配列 ケース
VTAA [insT]TAA (9)
TTAB TT[insA]AB (10)
及び関連の区別できないケース:
VTAA T[insT]AA (9’)
TTAB TTA[insA]B (10’)
置換
置換は、WT DNA配列中に存在するRSを除去する場合がある。
WT配列 M配列 ケース
TTAA VTAA (11)
TTAA TVAA (12)
TTAA TTBA (13)
TTAA TTAB (14)
DNA変異は、RSが野生型(WT)DNA配列中に存在する場合、RSを除去する1(又は複数)のヌクレオチドを除去する場合がある。
WT配列 M配列 ケース
VTTAA V[delT]TAA (15)
TTAAB TT[delA]AB (16)
及び関連の区別できないケース:
VTTAA VT[delT]AA (15’)
TTAAB TTA[delA]B (16’)
DNA変異は、RSが野生型(WT)DNA配列中に存在する場合、RSを除去する1(又は複数)のヌクレオチドを挿入する場合がある。
WT配列 M配列 ケース
TTAA T[insV]nTAA (17)
TTAA TT[insV]nAA (18)
TTAA TT[insB]nAA (19)
TTAA TTA[insB]nA (20)
他に特に定義がなければ、本明細書に用いられる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は同等の多くの方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を下に記載している。特段の言及がない限り、本発明と共に使用される本明細書に記載される技法は、当業者によく知られている標準的な方法論である。
1)ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位の3’側に変異が起こる場合において、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムDNA配列を同定する。
2)ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位位置の5’側に変異が起こる場合、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムDNA配列の逆相補を同定する。
3)ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位の3’側に変異が起こる場合、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムDNA配列の逆相補を同定する。
4)ヌクレオチド番号の増加に伴ってその配列上の変異依存型切断部位位置の5’側に変異が起こる場合、ヌクレオチド番号の増加によりゲノムDNA配列を同定する。
少なくとも1つの第1標的配列又は第2の標的配列のプラス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも1つの第1のリバースプライマー、
少なくとも1つの第1の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のフォワードプライマー、
少なくとも第2の標的配列のマイナス鎖の第3の配列セグメントの5’末端領域にハイブリダイズする第1部分と、少なくとも1つの第2の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする第2部分とを含む少なくとも1つの第3のフォワードプライマーであって、上記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの第1部分が、上記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの全長に対して20%〜80%の長さを有する、少なくとも1つの第3のフォワードプライマー、
を使用するPCRによって増幅する。
第1の標的DNA配列が、第2の配列における単一又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失若しくは挿入が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる点で第2の標的DNA配列と異なり、
ライブラリの各々のDNA配列が、それぞれ、5’末端から3’末端に、15ヌクレオチド〜50ヌクレオチドの長さを有する第1の配列セグメント、上記制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムDNAの第2の配列セグメント、及び該第1の配列セグメントと、もしあれば、該制限エンドヌクレアーゼによって生じた5’オーバーハングとの融合体に逆相補的な第3の配列セグメントを含む、DNA配列のライブラリから少なくとも1つの第1の標的DNA配列及び少なくとも1つの第2の標的DNA配列の少なくとも一方を検出するキットが、
上記少なくとも1つの第1標的配列又は第2の標的配列のプラス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも1つの第1のリバースプライマー、
上記少なくとも1つの第1の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のフォワードプライマー、
上記少なくとも第2の標的配列のマイナス鎖の第3の配列セグメントの5’末端領域にハイブリダイズする第1部分と、上記少なくとも1つの第2の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする第2部分とを含む少なくとも1つの第3のフォワードプライマーであって、上記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの第1部分が、上記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの全長に対して20%〜80%の長さを有する、少なくとも1つの第3のフォワードプライマー、
を含む。
ALK遺伝子のコドン1174におけるヘテロ接合型のCからAへの置換を有し、フェニルアラニンをロイシンにする(F1174L)、SY5Y細胞株(SH−SY5Y ATCCカタログ番号CRL−2266(商標))に対して予備試験を行った。フランキング配列を考慮すると、ヘテロ接合型置換は変異型アレル中に1つの新たな制限部位(RS)を導入するのに対し、野生型アレルはRSを全く有しない。
DRS−WGAプライマーと95%の相同性を有する5’プライマーと、
他のDRS−WGA増幅産物に代えて標的領域を選択的に増幅するため、PCRに必要な特異性を提供する3’PCRプライマーと、
を含む二価プライマー対の設計にある。
実施例1で使用されたものと同じSY5Y細胞株に対してであるが、本発明の方法を使用して、増幅試験を行った。
本発明による方法は、制限エンドヌクレアーゼによる不完全な消化の場合であっても増幅(及びシークエンシング)を保証する。実際、制限エンドヌクレアーゼの活性は、標的DNAにおいて全てのRSについては保証されず、DRS−WGAによる増幅に成功するにもかかわらず、WGAプライマー(一次PCR)が別のRS中にあっても、統計学的にごく一部の消化されていないRSがDRS−WGAに存在する。
上述の方法を54個の単一細胞を用いて更に確認した。
10個の単一の生存する新鮮なSY5Y、
予め室温にて20分間2%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定し、Inside Perm(Miltenyi Biotec)で透過処理した、19個の単一SY5Y、
予めCytoChex(商標)で固定し、Inside Permで透過処理した、19個の単一SY5Y、
2個の単一の新鮮な生存するリンパ球、
予め室温にて20分間2%PFAで固定し、Inside Perm(Miltenyi Biotec)で透過処理した、2個の単一リンパ球。
EGFR遺伝子における5つのコドンの欠失を有するHCC−827細胞株に対して、増幅試験を行った。上記欠失は、制限部位(RS)を除去し、ヒトゲノムに対して単一のPCR及びプライマー対を使用する場合には、Mアレルの検出を可能とするが、RSを有するWTアレルの検出はできない。
上述の方法を60個の単一細胞を用いて更に確認した。
Veridex CellSearch濃縮プロトコルに従って処理した31個の単一のHCC−827、
Veridex CellSearch濃縮プロトコルに従って処理した11個の単一のリンパ球、
17個の単一の新鮮な生存するリンパ球。
別の実施例として、単一のヌクレオチドの変化ATG/TAATに起因するPIK3CA遺伝子のエクソン21の変異M1043Iを、本発明による方法によって検出することができる。
試料タグによりPCR産物をバーコード付けする、
次世代シークエンシング用にPCR産物中にアダプターを導入する、
多重化標的PCR反応において偽性プライミングを回避する、
ため使用することができる。
Claims (12)
- DNA配列のライブラリから少なくとも1つの第1の標的DNA配列及び少なくとも1つの第2の標的DNA配列の少なくとも一方を検出する方法であって、
前記第1の標的DNA配列が、第2の配列における単一又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失若しくは挿入が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる点で前記第2の標的DNA配列と異なり、前記方法が、
(a)各々のDNA配列が、それぞれ、5’末端から3’末端に、15ヌクレオチド〜50ヌクレオチドの長さを有する第1の配列セグメント、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムDNAの第2の配列セグメント、及び該第1の配列セグメントと、もしあれば、該制限エンドヌクレアーゼによって生じる5’オーバーハングとの融合体に逆相補的な第3の配列セグメントを含む、前記DNA配列のライブラリを準備する工程と、
(b)前記少なくとも1つの第1の標的配列又は第2の標的配列のプラス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも1つの第1のリバースプライマー、
前記少なくとも1つの第1の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のフォワードプライマー、
前記少なくとも第2の標的配列のマイナス鎖の第3の配列セグメントの5’末端領域にハイブリダイズする第1部分と、前記少なくとも1つの第2の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする第2部分とを含む少なくとも1つの第3のフォワードプライマーであって、前記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの第1部分が、前記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの全長に対して20%〜80%の長さを有する、少なくとも1つの第3のフォワードプライマー、
を使用するPCRによって前記DNA配列のライブラリを増幅する工程と、
(c)工程(b)で増幅されたDNA配列を検出する工程と、
を含む、方法。 - 工程(b)が、前記少なくとも1つの第2の標的配列のプラス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする少なくとも1つの第4のリバースプライマーを更に使用するものである、請求項1に記載の方法。
- 前記DNA配列のライブラリが確定的制限部位全ゲノム増幅により得られる、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(c)がDNAシークエンシング法によって行われる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAシークエンシング法がサンガーシークエンシング又は合成によるシークエンシングである、請求項4に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの第1部分が、少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの全長に対して40%〜60%の長さを有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの第2部分が、前記制限エンドヌクレアーゼのコンセンサス配列に対応し、もしあれば、前記制限エンドヌクレアーゼによって生じた5’オーバーハングを引いて、いずれも2で除した最小と、最大30塩基との間に含まれる塩基単位の長さを有する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つの前記プライマーが、前記第1の標的配列又は第2の標的配列のプラス鎖又はマイナス鎖のいずれにもハイブリダイズしない5’末端領域を更に含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記制限エンドヌクレアーゼがMseIである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の第1のプライマー、第2のプライマー、及び第3のプライマーを含むキット。
- DNA配列のライブラリから少なくとも1つの第1の標的DNA配列及び少なくとも1つの第2の標的DNA配列の少なくとも一方を検出するキットであって、
前記第1の標的DNA配列が、第2の配列における単一又は複数のヌクレオチドの置換又は欠失若しくは挿入が制限エンドヌクレアーゼに対する制限部位を生じる点で前記第2の標的DNA配列と異なり、
前記ライブラリの各々のDNA配列が、それぞれ、5’末端から3’末端に、15ヌクレオチド〜50ヌクレオチドの長さを有する第1の配列セグメント、前記制限エンドヌクレアーゼによって切断されるゲノムDNAの第2の配列セグメント、及び該第1の配列セグメントと、もしあれば、該制限エンドヌクレアーゼによって生じた5’オーバーハングとの融合体に逆相補的な第3の配列セグメントを含み、前記キットが、
前記少なくとも1つの第1の標的配列又は第2の標的配列のプラス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする、少なくとも1つの第1のリバースプライマー、
前記少なくとも1つの第1の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする少なくとも1つの第2のフォワードプライマー、
前記少なくとも第2の標的配列のマイナス鎖の第3の配列セグメントの5’末端領域にハイブリダイズする第1部分と、前記少なくとも1つの第2の標的配列のマイナス鎖の第2の配列セグメントの3’末端領域にハイブリダイズする第2部分とを含む少なくとも1つの第3のフォワードプライマーであって、前記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの第1部分が、前記少なくとも1つの第3のフォワードプライマーの全長に対して20%〜80%の長さを有する、少なくとも1つの第3のフォワードプライマー、
を含む、キット。 - ALK又はEGFR又はPIK3CAの変異の診断における使用のための請求項10又は11に記載のキット。
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