TH31111B - รีคอมบิแนนท์เอนไซม์ทนความร้อนที่ปลดปล่อยทรีฮาโลสจากนอนรีดิวซิงแซคคาไรด์ - Google Patents

Abstract

ได้เปิดเผยถึงรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ทนความร้อนที่มีน้ำหนักโมเลกุลประมาณ 54,000 ถึง 64,000 คอลตัน และ PI ประมาณ 5.6-6.6 และปลดปล่อยทรีฮาโลสจากนอนรีดิวซิง แซคคาไรด์ที่มีโครงสร้างทรีฮาโลสเป็นหน่วยทางปลาย และมีดีกลูโคสพอลิเมอไรเซชันของ อย่างน้อยเป็น 3 เอนไซม์มีความเสถียรต่อความร้อนที่สูงในระดับที่น่าพอใจ นั้นคือมันถือได้ ว่าไม่ถูกทำให้หมดฤทธิ์แม้ว่าจะบ่มในสารละลายเอเคียส (pH 7.0) ที่ 85 ํซ เป็นเวลา 60 นาที และสิ่งนี้เสริมการสร้างทรีฮาโลสในระดับอุตสาหกรรม และในผลผลิตที่สูงเป็นที่น่าพอใจ

Claims (8)

1. รีคอมบิแนนท์เอนไซม์ทนความร้อนที่มีสมบัติทางเคมีฟิสิกส์ดังต่อไปนี้ (1) การออกฤทธิ์ ปลดปล่อยทรีฮาโลสจากนอนรีดิวซิงแซคคาไรด์ที่มีโครงสร้างทรีฮาโลสเป็น หน่วยทางปลายและมีดีกรีกลูโคสพอลิเมอไรเซชันอย่างน้อยเป็น 3 (2) น้ำหนักโมเลกุล ประมาณ 54,000 ถึง 64,000 คอลตันบนโซเดียมโคเดซิลซัลเฟตพอลิอะคริ ลาไมด์เจลอีเลคโทรโฟเรซิส (SDS-PAGE) (3) จุดไอโซอีเลคทริค (pI) ประมาณ 5.6 ถึง 6.6 บนไอโซอีเลคโทรโฟเรซิส และ (4) ความเสถียรต่ออุณหภูมิ ไม่ถูกทำให้หมดฤทธิ์อย่างมีนัยสำคัญ แม้บ่มในสารละลายเอเควียส (pH7.0) ที่ 85 ํซ เป็นเวลา 60 นาที 2. รีคอมบิแนนท์เอนไซม์ที่ทนความร้อนตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 1 ที่มีลำดับ กรดอะมิโนที่เลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วยลำดับกรดอะมิโนจากปลายด้าน N ใน SEQ ID NO : 1 และลำดับกรดอะมิโนที่ฮอมอโลกัสต่อมัน 3. ดีเอนเอที่ประมวลรหัสของรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ที่ทนความร้อน ตามที่อ้างสิทธิไว้ในข้อถือสิทธิ ที่ 1 4. ดีเอนเอที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 3 ที่มีลำดับเบสที่เลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วยลำ ดับเบสจากปลาย 5\' ใน SEQ ID NO : 2 ลำดับเบสที่ฮอมอโลกัสต่อมันและลำดับเบสที่ เป็นคู่สมต่อลำดับเบสเหล่านี้ 5. ดีเอนเอที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 3 ที่มีการแทนที่เบสหนึ่งตัวหรือมากกว่าในลำดับ SEQ ID NO:2 ด้วยเบสตัวอื่นโดยดีเจนเนอเรซีของรหัสทางพันธุกรรมโดยไม่มีการเปลี่ยน ลำดับกรดอะมิโนใน SEQ ID NO:1 6. ดีเอนเอที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 3 ที่อนุพันธ์จากกุลชีพของสกุล Sulfolobus 7. ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองที่มีเวกเตอร์ที่สามารถจำลองตัวได้เองและดีเอนเอที่ ประมวลรหัสของรีคอมบีแนนท์เอนไซม์ทนความร้อนของข้อถือสิทธิ์ที่ 1 8. รีคอมบิแนนท์ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 7 ที่มี ค่าดับเบสที่เลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วยลำดับเบสจากปลาย 5\' ใน SEQ ID NO:2 ลำดับ เบสที่ฮอมอโลกัสต่อมันและลำดับเบสที่เป็นคู่สมต่อลำดับเบสเหล่านี้ 9. รีคอมบิแนนท์ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 7 ที่ซึ่งการ แทนที่เบสหนึ่งตัวหนือมากกว่าในลำดับ SEQ ID NO:2 ด้วยเบสตัวอื่นโดยดีเจเนอเรซีของ รหัสทางพันธุกรรมโดยไม่มีการเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนใน SEQID NO:1 1 0. รีคอมบิแนนท์ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองที่มีเวกเตอร์ที่สามารถจำลองตัวได้เอง และ DNA ที่ประมวล รหัสของรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ทนความร้อนของข้อถือสิทธิที่ 1 ที่ซึ่งดีเอนเอดังกล่าวอนุพันธ์จากจุลชีพของสกุล Sulfolobus 1 1. รีคอมบิแนนท์ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 7 หรือข้อถือสิทธิที่ 10 ที่ซึ่ง เวกเตอร์ที่สามารถจำลองตัวได้เองดังกล่าวเป็นพลาสมิดเวกเตอร์บลูคริพท์ II SK(+) 1 2. ทรานสฟอร์แมนท์ที่สามารถได้โดยการใส่รีคอมบิแนนท์ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองซึ่งมีเวกเตอร์ ที่สามารถจำลองตัวได้เองและดีเอนเอที่ประมวลรหัสของรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ที่ทนความร้อนของข้อถือสิทธิที่ 1 เข้าไปในเจ้าบ้านที่เหมาะสม 1 3.ทรานสฟอร์แมนท์ตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 12 ที่ซึ่งดีเอนเอดังกล่าวมีลำดับเบสที่เลือกจากลุ่มที่ ประกอบด้วยลำดับเบสจากปลาย 5\' ใน SEQ ID NO:2 ลำดับเบสท่ฮอมอโลกัสต่อมันและ ลำดับเบสที่เป็นคู่สมต่อลำดับเบสเหล่านี้ 1 4.ทรานสฟอร์แมนท์ตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 12 ที่ซึ่งเตรียมดีเอนเอดังกล่าวโดยมีการแทนที่เบสหนึ่งตัว หรือมากกว่าในลำดับ SEQ ID NO:2 ด้วยเบสตัวอื่นโดยดีเจเนอเรซีของรหัสทางพันธุกรรมโดยไม่มีการเปลี่ยน ลำดับกรดอะมิโนโน SEQ ID NO:1 1 5. ทรานสฟอร์แมนท์ตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 12 ที่ซึ่งดีเอนเอดังกล่าวอนุพันธ์ จากจุลชีพของสกุล Sulfolobus 1 6. ทรานสฟอร์แมนท์ตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 12 ที่ซึ่งเวกเตอร์ที่สามารถจำลองตัวได้เอง ดังกล่าวเป็นพลาสมิคเวกเตอร์บลูสคริพท์ II SK (+) 1 7. ทรานสฟอร์แมนท์ตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 12 ที่ซึ่งเจ้าบ้านดังกล่าวเป็น จุลชีพของสปีชีส์ Escherichia coli 1 8. กรรมวิธีสำหรับเตรียมรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ทนความร้อนที่ประกอบด้วยการเพาะเลี้ยง ทรานสฟอร์แมนท์ที่เตรียมโดยการใส่รีคอมบิแนนท์ดีเอนเอที่สามารถจำลองตัวได้เองซึ่งมีเวกเตอร์ที่ สามารถจำลองตัวได้เองและดีเอนเอที่ประมวลรหัสของรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ที่ทนความร้อนของ ข้อถือสิทธิที่ 1 เข้าไปในเจ้าบ้านที่เหมาะสม และเก็บรีคอมบิแนนท์แอนไซม์ที่ทนความร้อนที่ก่อรูปนั้น จากเซลล์เแพาะลี้ยง 1 9.กรรมวิธีตามที่อ้างสิทธิไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 18 ที่ซึ่งดีเอนเอดังกล่าวมีลำดับเบสที่เลือกจากกลุ่มที่ ประกอบด้วยลำดับเบสจากปลาย 5\' ในSEQ ID NO:2 ลำดับเบสที่ฮอมอโลกัสต่อมันและ ลำดับเบสที่เป็นคู่สมต่อลำดับเบสเหล่านี้ 2 0. กรรมวิธีตามที่อ้างสิทธิไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 18 ที่มีเตรียมดีเอนเอดังกล่าวโดยมีการแทนที่เบส หนึ่งตัวหรือมากกว่าในลำดับ SEQ ID NO:2 ด้วยเบสตัวอื่นโดยอาศัยดีเจเนอเรซีของรหัสทางพันธุกรรม โดยไม่มีเปลี่ยนลำดับกรดอะมิโนใน SEQ ID NO:1 2

1. กรรมวิธีตามที่อ้างสิทธิไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 18 ที่ซึ่งดีเอนเอดังกล่าวอนุพันธ์จากจุลชีพของสกุล Sulfolobus 2

2. กรรมวิธีตามที่อ้างสิทธิไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 18 ที่ซึ่งเวกเตอร์ที่สามารถจำลองตัวได้เองดังกล่าวเป็น พลาสมิดเวกเตอร์บลูสคริพท์ II SK (+) 2

3. กรรมวิธีตามที่อ้างสิทธิไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 18 ที่ซึ่งเจ้าบ้านดังกล่าวเป็นจุลชีพของสปีชีส์ Escherichia coli 2

4. กรรมวิธีตามที่อ้างสิทธิ์ไว้ในข้อถือสิทธิ์ที่ 18 ที่ซึ่งมีการเก็บรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ที่ทนความร้อนที่ผลิต ได้โดยเทคนิคหนึ่งอย่างหรือมากกว่าที่คัดเลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วย การปั่นเหวี่ยง การกรอง การทำให้เข้มข้น การเอาเกลือออก ไดแอไลซิส การแยกโดยการให้ นอนก้น โครมาโตกราฟีแลกประจุ เจลฟิลเตรชันโครมาโตกราฟี ไฮโดรโฟบิดโครมาโต กราฟี โครมาโตกราฟีสันบรรคภาพ เจลอีเลคโทรโฟเรซิส และไอโซอีเลคโทรโฟเรซิส 2

5. วิธีสำหรับการเปลี่ยนด้วยเอนไซม์ที่มีขั้นตอนที่ปล่อยให้รีคอมบิแนนท์เอนไซน์ ที่ทนความ้อนของข้อถือสิทธิที่ 1 ออกฤทธิ์ต่อนอน - รีดิวซิงแซคคาไรด์ที่มีโครงสร้างทรีฮาโลสเป็น หน่วยปลายและดีกรีกลูโคสพอลิเมอไรเซซันอย่างน้อยเป็น 3 เพื่อให้ปลดปล่อยทรีฮาโลสออกมา 2

6. วิธีตามที่อ้างสิทธิ์ในข้อถือสิทธิ์ที่ 25 ที่มีขั้นตอนของการปล่อยให้รีคอมบิแนนท์ เอนไซม์ที่ทนความร้อนดังกล่าวอยู่ร่วมในสารละลายเอเควียสที่มีนอนรีดิวซิงแซคคาไรด์ดังกล่าว 50 w/w% หรือต่ำกว่า โดยยึดตามน้ำหนักของแข็งแห้งและปล่อยให้รีคอมบิแนนท์เอนไซม์ ที่ทนความร้อนดังกล่าวออกฤทธิ์ต่อนอน -รีดิวซิงแซคคาไรด์ดังกล่าวที่อุณหภูมิสูงกว่า 55 ํซ 2

7. วิธีตามที่อ้างสิทธิ์ในข้อถือสิทธิ์ที่ 25 ที่ซึ่งนอนรีดิวซิงแซคคาไรด์ดังกล่าวได้รับ การนำไปให้ผ่านการออกฤทธิ์โดยเอนไซม์ที่ก่อรูปนอนรีดิวซิงแซคคาไรด์และก่อรูปน่อนรีดิวซิง แซคคาไรด์ที่ได้ให้ผ่านการออกฤทธิ์ของรีคอมบิแนนท์เอนไซม์ที่ทนความร้อนดังกล่าว 2

8. วิธีตามที่อ้างสิทธิ์ในข้อถือสิทธิ์ที่ 25 ที่ซึ่งนอนรีดิวซิงแซคาไรด์ดังกล่าวเป็น สมาชิกที่เลือกจากกลุ่มที่ประกอบด้วย 4-กลูโคซิลทรีฮาโลส, 4-มอลโตซิลทรีฮาโลส , 4-มอลโตไทรโอซิลทรีฮาโลส, 4-มอลโตเททราโอซิล-ทรีฮาโลส, 4-มอลโตเพนตะ โอซิล ทรีฮาโลส และของผสมของมัน