TH13664U - โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ - Google Patents

Abstract

การประดิษฐ์นี้เป็นการสร้างโพลีโคลนอลแอนติบอดี (Polyclonal antibodies; PAbs) ที่จำเพาะต่อสารจี ปีโนซายด์ โดยมีวัตถุประสงค์เพื่อจะนำโพลีโคลนอลแอนติบอดีดังกล่าวไปใช้สำหรับการวิธีวิเคราะห์สารจีปีโน ซายด์โฟร์ตีไนน์และสารซาโปนินที่ผลิตขึ้นในปัญจขันธ์ ด้วยวิธีการวิเคราะห์ทางอิมมูโนวิทยา (Immunoassay) อาทิ วิธีอีไลซ่า ซึ่งจะช่วยให้สามารถวิเคราะห์สารจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์และสารสเตอรอยด์ซาโปนินซึ่งเป็น สารสำคัญที่มีอยู่ในปัญจขันธ์ได้อย่างรวดเร็ว ซึ่งโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่ใช้ตรวจสอบสารสำคัญในสมุนไพร นี้เป็นวิธีที่มีความไว แม่นยำสูง และช่วยลดเวลาการเตรียมตัวอย่างในการวิเคราะห์ เนื่องจากโพลีโคลนอล แอนติบอดีที่ใช้ในการวิเคราะห์ถูกสร้างขึ้นให้มีความจำเพาะกับสารที่ต้องการวิเคราะห์ จึงสามารถใช้ในการ วิเคราะห์ได้ทั้งในเชิงคุณภาพวิเคราะห์และปริมาณวิเคราะห์ ได้อย่างรวดเร็วและแม่นยำ

Claims (6)

แก้ไขใหม่ 15/5/2560 1.กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ซึ่งประกอบด้วยขั้นตอนต่อไปนี้ ก) สังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ โดยการใช้สารมาตรฐานจีปีโนซายด์ โฟร์ตีไนน์ 5 มิลลิกรัม เติมเมทานอล 0.5 มิลลิกรัม จากนั้นเติมสารละลายโซเดีนมเพอริโอเดต (NaIO4) (5 มิลลิกรัมในน้ำ 0.5 มิลลิกรัม) ลงไปทีละหยด ผสมให้เข้ากันด้วยแท่งแม่เหล็กสำหรับ กวน ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นเติมสารละลายบีเอสเอ 10.0 มิลลิกรัม ใน 50 มิลลิโมลาร์ บัฟเฟอร์พีบีเอส (พีเอช 9.5-9.7) 2.0 มิลลิลิตร (ใช้อัตราส่วนระหว่างสารจีปีโน ซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ 1 ต่อ 2) แล้วผสมให้เข้ากับที่อุณภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 ชั่วโมง นำสารละลายที่ได้นั้นมาไดอะไลซ์ ในน้ำกลั่น 5 ครั้ง ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส และไลโอ ฟิลไลซ์ (lyophilize) ได้คอนจูนเกตของจีปีโนซายด์โฟตีไนน์กับบีเอสเอ ในช่วง 7-12 มิลลิกรัม ข) การกระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกัน กับกระต่าย จำนวนอย่างน้อย 3 ครั้ง ทุกๆ 20 วัน โดยครั้งที่ 1 เตรียม สารฉีดสร้างภูมิคุ้มกันอัตราส่วน 1:1 จากสารช่วยกระตุ้นชนิดฟรอยนต์แบบไม่สมบูรณ์ และจีปีโน ซายด์โฟตไนน์ที่เชื่อมต่อกับบีเอสเอ 0.4 มิลลิกรัม/มิลลิลตร ฉีดเข้าใต้ผิวหนังส่วนครั้งที่ 2 ใช้ ไอเอฟเอ ส่วนช่วยกระตุ้นชนิดฟรอยนต์แบบไม่สมบูรณ์ แทนสารช่วยกระตุ้นชนิดฟรอยนต์แบบ สมบูรณ์ ฉีดเข้ากล้ามเนื้อ จากนั้น 3 วัน ตรวจสอบสารภูมิคุ้มกันที่จำเพาะต่อ จีปีโนซายด์โดยวิธี เอ็นไซม์ลิงเกตอมมูโนเซอร์แบนเอสเสย์ หรืออีไลซา ซึ่งใช้หลักการการจับกันแบบเฉพาะเจาะจง ของแอนติเจนและแอนติบอดี ฉีดกระตุ้นครั้งที่ 3 หรือ 4 ด้วยจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์ที่เชื่อมต่อกับบี เอสเอ 0.2 มิลลกรัม/มิลลิลิตรที่ละลายในฟอสเฟตบัฟเฟอร์ซาไลน์ พีเอช 7.0-7.5 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เข้าหลอดเลือดที่ใบหู จากนั้น 3 วัน ทดสอบความเข้มข้นของแอนติบอดีด้วยวิธี อีไลซ่า หลังจากการฉีดกระตุ้นในครั้งที่ 3 หรือ 4 ค) การแยกแอนติบอดีให้บริสุทธิ์ โดยการนำเลือดกระต่ายที่ได้จากการเจาะเลือดจากหัวใจ จะได้เลือด ประมาณ 30-50 มิลลิตรต่อกระต่ายหนึ่งตัว นำเลือดไปปั่นที่ความเร็ว 2,000-3,000 รอบต่อนาที แยกเฉพาะส่วนบนหรือซีรั่มมาทำให้บริสุทธิ์ ใช้คอลัมน์โปรตีนจี และแยกสารออกด้วยบัฟเฟอร์ที่มี พีเอชต่ำ ไดอะไลซ์ที่อุณหภูมิในช่วง 4-8 องศาเซลเซียส และทำไลโอฟิลไลซ์ก็จะได้โพลีโคลนอล แอนติบอดีที่บริสุทธิ์ 2. กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง การ สังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ สามารถแทนที่ด้วยการสังเคราะห์คอนจูเกตของจี ปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับเอชเอสเอ โดยเปลี่ยนจากการเติมสารละลายบีเอสเอเป็นสารละลายเอชเอสเอ 3. กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง การสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ สามารุแทนที่ด้วยการสังเคราะห์คอนจูเกต ของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับโอวีเอ โดยเปลี่ยนจากการเติมสารละลายบีเอสเอเป็นสารละลายโอวีเอ 4.การใช้โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ด้วยวิธีการทางอิมมูโนวิทยาในการวิเคราะห์สารสเตียรอยด์ซาโปนินที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกับจีปีโนซายด์ โฟร์ (แก้ไขเดิม) แก้ไข 6/09/2559 (30/8/2559) 1. โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ มีกรรมวิธีการผลิตดังนี้ ก) สังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ หรือสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโน ซายด์โฟรตีไนน์กับเอชเอสเอ หรือสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับโอวีเอ ข) การกระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกัน กับกระต่าย จำนวนอย่างน้อย 3 ครั้ง ทุกๆ 20 วัน โดยครั้งที่ 1 เตรียม สารฉีดสร้างภูมิคุ้มกันอัตราส่วน 1:1 จากสารช่วยกระตุ้นชนิดฟรอยด์แบบไม่สมบูรณ์ และจีปีโน ซายด์โฟร์ตีไนน์ที่เชื่อมต่อกับบีเอสเอ 0.4 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ฉีดเข้าใต้ผิวหนัง ส่วนครั้งที่ 2 ใช้ ไอเอฟเอ สารช่วยกระตุ้นชนิดฟรอยด์แบบไม่สมบูรณ์ แทนสารช่วยสารกระตุ้นชนิดฟรอยด์แบบ สมบูรณ์ ฉีดเข้ากล้ามเนื้อ จากนั้น 3 วัน ตรวจสอบสารภูมิคุ้มกันที่จำเพาะต่อ จีปีโนซายด์โดยวิธี เอ็นไซม์ลิงเกตอิมมูโนซอร์แบนเอสเสย์ หรืออีไลซา ซึ่งใช้หลักการการจับกันแบบเฉพาะเจาะจง ของแอนติเจนและแอนติบอดี ฉีดกระตุ้นครั้งที่ 3 หรือ 4 ด้วยจีปีโนซายด์ไฟร์ตีไนน์ที่เชื่อมต่อกับบี เอสเอ 0.2 มิลลิกรัม/มิลลิลิตรที่ละลายในฟอสเฟตบัพเฟอร์ซาไลน์ พีเอช 7.0-7.5 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เข้าหลอดเลือดที่ใบหู จากนั้น 3 วัน ทดสอบความเข้มข้นของแอนติบอดีด้วยวิธี อีไลซ่า หลังจากการฉีดกระตุ้นในครั้งที่ 3 หรือ 4 ค) การแยกแอนติบอดีให้บริสุทธิ์ โดยการนำเลือดกระต่ายที่ได้จากการเจาะเลือดจากหัวใจ จะได้เลือด ประมาณ 30- 50 มิลลิตรต่อกระต่ายหนึ่งตัว นำเลือดไปปั่นที่ความเร็วรอบ 2,000-3,000 รอบต่อนาที แยกเฉพาะส่วนบนหรือซีรั่มมาทำให้บริสุทธิ์ ใช้คอลัมน์โปรตีนจี และแยกสารออกด้วยบัฟเฟอร์ที่มี พีเอชต่ำ ไดอะไลซ์ที่อุณหภูมิในช่วง 4-8 องศาเซลเซียส และทำไลโอฟิลไลซ์ก็จะได้โพลีโคลนอล แอนติบอดีที่บริสุทธิ์ 2. โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ที่ซึ่ง การสังเคราะห์คอนจูเกต ของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ โดยการใช้สารมาตรฐานจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์ 5 มิลลิกรัม เติมเมทา นอล 0.5 มิลลิลิตร จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมเพอริโอเดต (NaIO4) (5 มิลลิกรัมในน้ำ 0.5 มิลลิลิตร ) ลง ไปทีละหยด ผสมให้เข้ากันด้วยแท่งแม่เหล็กสำหรับกวน ที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นเติมสารละลายบีเอสเอ 10.0 มิลลิกรัม ใน 50 มิลลิโมลาร์ บัฟเฟอร์พีบีเอส (พีเอช 9.5-9.7) 2.0 มิลลิลิตร (ใช้อัตราส่วนระหว่างสารจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ 1 ต่อ 2) แล้วผสมให้เข้ากันที่อุณหภูมิ 25 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 6 ชั่วโมง นำสารละลายที่ได้นั้นมาไดอะไลซ์ ในน้ำกลั่น 5 ครั้ง ที่อุณหภูมิ 4 องศา เซลเซียส และไลโอฟิลไลซ์ (Iyophilize) ได้คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟตีไนน์กับบีเอสเอ ในช่วง 7-12 มิลลิกรัม 3. โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 2 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับเอชเอสเอ โดยเปลี่ยนจากการเติมสารละลายบีเอสเอ เป็นสารละลายเอชเอสเอ 4. โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 3 ข้อใดข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับโอวีเอ โดยเปลี่ยนจากการเติมสารละลายบีเอสเอ เป็นสารละลายโอวีเอ 5. การใช้โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 4 ข้อใดข้อหนึ่ง ด้วยวิธีการทางอิมมูโนวิทยาในการวิเคราะห์สารสเตียรอยด์ซาโปนินที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกับจีปีโนซายด์ โฟร์ -----------------------------------------

1. โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ซึ่งมีความสามารถในการจับจำเพาะกับสารจีปี โนซายด์โฟร์และสเตอรอยด์ซาโปนินจากปัญจขันธ์ในบริเวณอะไกลโคน (Aglycone part)

2. กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก) สังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ (Gypenoside XLIX-BSA conjugates) หรือสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟรตีไนน์กับเอชเอสเอ (Gypenoside XLIX-HSA conjugates) หรือสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับโอวีเอ (Oval Albumin: OVA) ข) การกระตุ้นการสร้างภูมิคุ้มกัน (Immunization) กับกระต่าย จำนวนอย่างน้อย 3 ครั้ง ทุกๆ 20 วัน โดยครั้งที่ 1 เตรียมสารฉีดสร้างภูมิคุ้มกันอัตราส่วน 1:1 จากซีเอฟเอ (Complete Freund's adjuvant; CFA) และจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์ที่เชื่อมต่อกับบีเอสเอ 0.4 มิลลิกรัม/มิลลิลิตร ฉีดเข้าใต้ผิวหนัง ส่วนครั้งที่ 2 ใช้ไอเอฟเอ (Incomplete Freund's adjuvant;IFA) แทนซีเอฟเอ ฉีดเข้ากล้ามเนื้อ จากนั้น 3 วันตรวจสอบสารภูมิคุ้มกันที่จำเพาะต่อ จีปีโนซายด์โดยวิธีเอ็นไซม์ลิงเกตอิมมูโนซอร์ แบนเอสเสย์ (Enzyme linked immunosorbant assay:ELISA) ซึ่งใช้หลักการการจับกันแบบ เฉพาะเจาะจงของแอนติเจนและแอนติบอดี ฉีดกระตุ้นครั้งที่ 3 หรือ 4 ด้วยจีปีโนซายด์ไฟร์ตีไนน์ที่ เชื่อมต่อกับบีเอสเอ 0.2 มิลลิกรัม/มิลลิลิตรที่ละลายในฟอสเฟตบัพเฟอร์ซาไลน์ pH 7.0-7.5 ปริมาตร 1 มิลลิลิตร เข้าหลอดเลือดที่ใบหู จากนั้น 3 วัน ทดสอบความเข้มข้นของแอนติบอดีด้วย วิธี อีไลซ่าหลังจากการฉีดกระตุ้นในครั้งที่ 3 หรือ 4 ค) การแยกแอนติบอดีให้บริสุทธิ์ โดยการนำเลือดกระต่ายที่ได้จากการเจาะเลือดจากหัวใจ จะได้เลือด ประมาณ 30- 50 มิลลิตรต่อกระต่ายหนึ่งตัว นำเลือดไปปั่นที่ความเร็วรอบ 2,000-3,000 รอบต่อนาที แยกเฉพาะส่วนบนหรือซีรั่มมาทำให้บริสุทธิ์ ใช้คอลัมน์โปรตีนจี (column protein G) และแยกสาร ออกด้วยบัฟเฟอร์ที่มีพีเอชต่ำ ไดอะไลซ์ที่อุณหภูมิในช่วง 4-8 องศาเซลเซียส และทำไลโอฟิลไลซ์ก็ จะได้โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่บริสุทธิ์

3. กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 2 ที่ซึ่ง การ สังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ โดยการใช้สารมาตรฐานจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์ 5 มิลลิกรัม เติมเมทานอล 0.5 มิลลิลิตร จากนั้นเติมสารละลายโซเดียมเพอริโอเดต (NaIO4) (5 มิลลิกรัมในน้ำ 0.5 มิลลิลิตร ) ลงไปทีละหยด ผสมให้เข้ากันด้วยแท่งแม่เหล็กสำหรับกวน (magnetic stirrer) ที่อุณภูมิ 25 ํC เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นเติมสารละลายบีเอสเอ 10.0 มิลลิกรัม ใน 50 มิลลิโมลาร์ บัฟเฟอร์พีบีเอส (พีเอช 9.5-9.7) 2.0 มิลลิลิตร (ใช้อัตราส่วนระหว่างสารจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับบีเอสเอ 1 ต่อ 2) แล้วผสมให้เข้า กันที่อุณภูมิ 25 ํC เป็นเวลา 6 ชั่วโมง นำสารละลายที่ได้นั้นมาไดอะไลซ์ (dialyzed) ในน้ำกลั่น 5 ครั้ง ที่ อุณภูมิ 4 ํC และไลโอฟิลไลซ์ (Iyophilize) ได้คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟตีไนน์กับบีเอสเอ ในช่วง 7-12 มิลลิกรัม

4. กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 2 ถึง 3 ข้อใด ข้อหนึ่งที่ซึ่ง การสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับเอชเอสเอ โดยเปลี่ยนจากการเติม สารละลายบีเอสเอเป็นสารละลายเอชเอสเอ

5. กรรมวิธีการผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 2 ถึง 3 ข้อใด ข้อหนึ่ง ที่ซึ่ง การสังเคราะห์คอนจูเกตของจีปีโนซายด์โฟร์ตีไนน์กับโอวีเอ โดยเปลี่ยนจากการเติม สารละลายบีเอสเอเป็นสารละลายโอวีเอ

6. การใช้โพลีโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะต่อสารจีปีโนซายด์ ตามข้อถือสิทธิ 1 ถึง 5 ข้อใดข้อหนึ่ง ด้วยวิธีการทางอิมมูโนวิทยาในการวิเคราะห์สารสเตียรอยด์ซาโปนินที่มีโครงสร้างใกล้เคียงกับจีปีโนซายด์ โฟร์