CN108164598B - 岩白菜素的偶联物及其制备方法与应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
岩白菜素的偶联物及其制备方法与应用。本发明公开了一种通式(I)的岩白菜素的偶联物，由岩白菜素与产生免疫原性的载体物质钥匙孔蓝蛋白(KLH)偶联构成，其中n为与一个钥匙孔蓝蛋白分子结合的岩白菜素的分子数，KLH为钥匙孔蓝蛋白，分子量范围是450KDa～13000KDa。本发明还公开了所述的偶联物的制备方法，即将岩白菜素与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物。本发明的岩白菜素的偶联物通过免疫新西兰大白兔，制备了效价达到1∶16000的抗血清，其最低检测限为16.03ng/ml。本发明具有简便，快捷，特异，准确的特点，为制备岩白菜素的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种小分子半抗原的偶联物及其制备方法与应用，尤其涉及岩白菜素的偶联物及其制备方法与应用。
背景技术
本发明涉及的下列名称适用于整个说明书和权利要求书：
岩白菜素：中国标准品质检所产品
KLH：钥匙孔蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)，Sigma公司产品
CDI：N，N′-羰基二咪唑，Sigma公司产品
DMAP：4-二甲氨基吡啶，Sigma公司产品
DMF：二甲基甲酰胺，北京百灵威(J&K)公司产品
透析袋：北京索莱宝(Solarbio)公司产品
PBS：磷酸缓冲液(Phosphate Buffer Saline)(0.01M，pH＝7.40)。
岩白菜素(Bergenin)又称岩白菜内酯、矮茶素、佛手配质，为虎耳草科植物岩白菜、岩陀、鬼灯檠、落新妇、百两金、矮地茶等草药的有效成分。岩白菜最早载于清《分类草药性》，中医和临床广泛用于治疗咳嗽、吐血、便血、肠炎、白带、肿毒等，外用治疗疮毒、疥癣。岩白菜素有中等强度的止咳作用，其初提物对“咳、痰、喘、炎”四症作用明显，治疗气管炎有独到之处。目前岩白菜素已有多种制剂作为镇咳祛痰药用于临床治疗慢性支气管炎，其生理活性显著。因此，以岩白菜素为指标性成分对地道药材进行相关质量检测和鉴定分析有着重要的意义。
岩白菜素常用的测定方法有紫外分光光度法、比色法和薄层扫描法等，这些定量分析方法操作繁杂，专属性不强，准确度不高。目前，对岩白菜素的含量测定研究大多是采用高效液相色谱法，该方法准确，稳定，可靠，但是由于仪器法价格昂贵，费事较长，且造成有机溶剂污染，需要大型仪器设备，需要专门的技术人员，所以难于应用于现场操作。酶联免疫检测法(ELISA)提供了一种极好的检测手段，该方法具有快速，准确，简易，不需要专人操作等优点，这使得ELISA法成为一种理想的检测手段。酶联免疫检测法的核心是需要高质量的抗体。岩白菜素是一种小分子有机化合物，不具有免疫原性，称之半抗原。所以，必须把岩白菜素转化为能引发动物免疫系统产生抗体的免疫原(又称之为完全抗原)。经检索，世界上尚未有关于岩白菜素的免疫原合成及抗体制备过程的报道，不能满足检测需要，因此研究岩白菜素的免疫原的合成显得格外重要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明要解决的问题是：提供一种能引发动物免疫系统产生针对岩白菜素有特异反应的抗体的免疫原，即岩白菜素的偶联物及其制备方法。同时，本发明还提供了所述的岩白菜素的偶联物作为免疫原在制备岩白菜素特异反应抗体中的应用。
本发明的岩白菜素的偶联物，由岩白菜素半抗原与产生免疫原性的载体物质偶联而成，所述载体物质为优选蛋白质，蛋白片段，合成多肽或半合成多肽。
上述的岩白菜素的偶联物，其中所述产生免疫原性的载体物质是钥匙孔蓝蛋白。
本发明所述的岩白菜素的偶联物，其结构通式如(I)
其中，n为与一个钥匙孔蓝蛋白结合的岩白菜素的分子个数，KLH为钥匙孔蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)，分子量范围是450KDa～13000KDa；
上述偶联物显示出如下物化特征：
(1)外观：白色粉末状固体；
(2)紫外吸收光谱：343nm。
上述的岩白菜素的偶联物的制备方法是：将岩白菜素与产生免疫原性的载体物质连接起来，结合为具有诱发动物免疫系统产生抗体的偶联物，并保持该偶联物的生物活性不变。
上述的岩白菜素的偶联物的制备方法具体步骤如下：
(1)溶液A的制备：将10.0mg岩白菜素，9.88mg N，N′-羰基二咪唑(CDI)，0.37mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)以摩尔比1∶2∶0.1溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，反应生成岩白菜素与N，N′-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
(2)溶液B的制备：将30mg KLH溶于10ml 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，备用；
(3)在室温下，将溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应6h，得溶液C；
(4)溶液C转移到透析袋中，用上述磷酸缓冲液搅拌透析72h，之后更换用蒸馏水透析20～30h，每6h更换一次透析液，透析过程在4℃下进行；
(5)冻干透析液，得到白色岩白菜素的偶联物。
在上述制备中，岩白菜素与N，N′-羰基二咪唑，4-二甲氨基吡啶摩尔比为1∶2∶0.1。
在上述制备中，岩白菜素与钥匙孔蓝蛋白的质量数比为1∶3。
本发明所述的岩白菜素的偶联物作为免疫原在制备岩白菜素特异反应抗体中的应用。
利用本发明的技术方案可以成功地把半抗原岩白菜素与载体蛋白特别是钥匙孔蓝蛋白KLH偶联起来，从而合成了能够在动物体内引发免疫反应，产生抗体的完全免疫原——岩白菜素的偶联物。
利用本发明所述的岩白菜素的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔，成功地获得了对半抗原岩白菜素有特异反应的抗体。经ELISA实验鉴定，利用本发明所述的岩白菜素的偶联物作为免疫原制备的岩白菜素特异反应抗体，其抗血清效价达到1∶16000，其最低检测限为16.03ng/ml。
上述的岩白菜素的偶联物以及高效价的岩白菜素特异反应抗体的制备成功，为制备岩白菜素的酶联免疫检测试剂盒提供了基础。由于本发明所述方法具有简易，快速，特异，准确的特点，可用于地道药材中岩白菜素的含量测定，可现场操作，节省大量的检测时间，弥补了仪器法费时较长，需要大型仪器设备支持的不足。
具体实施方式：
实施例1
(1)溶液A的制备：将10.0mg岩白菜素，9.88mg N，N′-羰基二咪唑(CDI)，0.37mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)以摩尔比1∶2∶0.1溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，反应生成岩白菜素与N，N′-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
(2)溶液B的制备：将30mg KLH溶于10ml 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，备用；
(3)在室温下，将溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应6h，得溶液C；
(4)溶液C转移到透析袋中，用上述磷酸缓冲液搅拌透析72h，之后更换用蒸馏水透析20～30h，每6h更换一次透析液，透析过程在4℃下进行；
(5)冻干透析液，得到白色岩白菜素的偶联物。通过紫外吸收光谱(吸收值)确定产物的偶联情况，本发明的岩白菜素的偶联物在343nm处有特征紫外吸收峰。
实施例2
抗体的制备及酶联免疫检测
1.抗体的制备
选择上述实施例1所制备的岩白菜素的偶联物作为免疫原进行动物免疫实验以制备抗体。
取1mg/ml的岩白菜素的偶联物的溶液1ml，加入等体积的弗氏完全佐剂，充分乳化后，经皮下多点注射给6只体重2kg的雄性健康新西兰大白兔，1ml/只，21天以后，以0.5mg/ml的岩白菜素的偶联物溶液1ml与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行二免，二免以后，每隔15天加强免疫一次，共免疫5次。最后一次免疫7天后，心脏取血，室温静置1小时，4℃过夜，10000转/分离心15分钟，收集血清，-20℃保存，备用。
2.抗体的酶联免疫检测
(1)效价测定
在96孔的酶标板上，每孔加入100ul的岩白菜素与牛血清白蛋白的偶联物(2ug/ml)，37℃下孵育2h。取出后使用洗液PBST(1000ml pH 7.4、浓度0.01M的PBS+体积百分比是0.05％Tween 20)洗涤3次；加入封闭液(1000ml PBS+质量体积百分比是5％脱脂奶粉)250ul/孔封闭，37℃孵育2h，取出后重复洗板过程，加入抗体及阴性血清的同比例稀释液(1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600，1∶3200，1∶6400，1∶12800，1∶25600，1∶51200，1∶102400)，每孔100ul，37℃孵育0.5h，洗板；在洗去抗体及阴性血清之后，每孔加入1∶10000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 100ul，37℃孵育0.5h，洗板后加入底物四甲基联苯胺显色，每孔100ul，室温放置显色10min，加入终止液100ul/孔，在450nm处用酶标仪读数。
经测定：本发明所述的岩白菜素的偶联物抗体效价达1∶16000。
效价的判定以P/N大于2∶1的血清最高稀释倍数为该抗体的酶联免疫检测效价。
其中：上述P为待测血清在某一稀释倍数测定的吸光度值，上述N为阴性对照在相应稀释倍数测定的吸光度值。
(2)特异性测定：
测定步骤与效价测定类似，在上述最佳的包被抗原与抗体浓度条件下，加抗体的同时加入岩白菜素梯度溶液(10-2-106ng/ml)，与包被抗原竞争结合有限的抗体，岩白菜素的浓度越高，抗体与包被抗原就结合得越少，从而显色越浅，吸光度值越低。再与空白对照(只加抗体，未加岩白菜素的吸光度值)相比较，以确定抗体特异性。
通过测定抗体特异性较好，其最低检测限可达到16.03ng/ml，检测灵敏度较高。
Claims (2)
1.岩白菜素的偶联物和岩白菜素特异反应抗体用于制备岩白菜素的酶联免疫检测试剂盒的用途，
所述的岩白菜素的偶联物的结构通式如(I)：
其中，n为与一个钥匙孔蓝蛋白结合的岩白菜素的分子个数，KLH为钥匙孔蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin)，分子量范围是450KDa～13000KDa；
所述的岩白菜素的偶联物的制备方法包括：
(1)溶液A的制备：将10.0mg岩白菜素，9.88mg N，N′-羰基二咪唑(CDI)，0.37mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)以摩尔比1∶2∶0.1溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，反应生成岩白菜素与N，N′-羰基二咪唑的活性中间体，备用；
(2)溶液B的制备：将30mg KLH溶于10ml 0.01M磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，备用；
(3)在室温下，将溶液A逐滴加入到不断搅拌状态下的溶液B中，反应6h，得溶液C；
(4)溶液C转移到透析袋中，用上述磷酸缓冲液搅拌透析72h，之后更换用蒸馏水透析20～30h，每6h更换一次透析液，透析过程在4℃下进行；
(5)冻干透析液，得到白色岩白菜素的偶联物；
所述的岩白菜素特异反应抗体是所述的岩白菜素的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔获得。
2.如权利要求1所述的用途，其特征是：所述的岩白菜素与钥匙孔蓝蛋白的质量数比为1∶3。
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| Development of a monoclonal antibody-based enzyme-linked immunosorbent assay for luteoloside detection in Flos Lonicerae Japonicae.;Bo Zhang et al.;《Anal Bioanal Chem》;20160218;6053-6061 * |
| 多效唑人工抗原的合成与鉴定;王晓芬 等;《食品科学》;20160415;第37卷(第07期);134-139 * |
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