TH12061U - กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัส Infectious Spleen and Kidney Necrosis Virus ก่อโรคในปลา - Google Patents

Abstract

แก้ไข 19/02/2559 การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัส ISKNV ในปลาด้วยเทคนิคแลมป์เปลี่ยนสี ของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยาแลมป์ก่อนเริ่มปฏิกิริยา โดยมีกรรมวิธีใน การทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มีความจำเพาะต่อลำดับเบสบนยีน MCP ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และองค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจ วินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในปลาเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ง่ายต่อผู้ใช้ ไม่ ต่อใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน --------------------------------- คำขอใหม่ปรับปรุง การประดิษฐ์นี้พัฒนากรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัส Infectious spleen and kidney necrosis virus ในปลาด้วยเทคนิคแลมป์เปลี่ยนสีของสารไฮดรอกซีแนปทอลบลูที่ผสมลงในสารละลายปฏิกิริยาแลมป์ ก่อนเริ่มปฏิกิริยา โดยมีกรรมวิธีในการทำปฏิกิริยาขั้นตอนเดียว ด้วยการออกแบบไพร์เมอร์ที่มีความจำเพาะ ต่อลำดับเบสบนยีน MCP ทั้งหมด 8 ตำแหน่ง และองค์ประกอบและสภาวะที่เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา ทำให้วิธีการตรวจวินิจฉัยเชื้อแบคทีเรียก่อโรคในปลาเศรษฐกิจมีความจำเพาะ รวดเร็ว มีวิธีการวิเคราะห์ที่ ง่ายต่ออผู้ใช้ไม่ต้องใช้เครื่องมือที่ยุ่งยากซับซ้อน

Claims (1)

แก้ไข 19/2/59 1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อแบคทีเรีย Infectious spleen and kidney necrosis virus ก่อในโรคปลา ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัดดีเอ็นเอ 2 โมล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้ จนกว่าน้ำยาสกัดสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน หรือเลือดปลาที่ต้องการตรวจที่ไม่มีสารกันเลือดแข็งปริมาตร 100 ไมโครลิตร บดด้วย น้ำยาสกัดดีเอ็นเอ (สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 0.025 นอร์มอล และสารละลาย โซเดียมโดเดคซิลซัลเฟต 0.0125%) ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้ จนกว่าน้ำยาสกัดดีเอ็นเอสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. นำหลอดตรวจจากข้อ ก. ที่ใส่ตัวอย่างที่บดละเอียดแล้วไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นน้ำหลอดตรวจดังกล่าวไปแช่ในน้ำแข็งอีก 5 นาที ค. นำส่วนใส่ซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอ มาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่ เหมาะสมในการทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่น ปริมาตร 490 ไมโครลิตร ง. นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา จากข้อ ค. ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงในสารละลายแลมป์ ประกอบด้วย - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ F3 ลำดับเบส 5’ – AGATCCCCTCCATCACATCC-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ B3 ลำดับเบส 5’ – TGTAGCCAGCTGTTTGCTG-3’ 0.2 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ FIP ลำดับเบส 5’ – ACCGACACCTCCTCCACTAGCTTTTTGGAGAACAGCTACATCCGC-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ - อินเนอร์ไพร์เมอร์ BIP ลำดับเบส 5’ – TTAACGACCTGGTGGCACAGACTTTTCATGCAGGCGTTCCAGAAG-3’) 2.0 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ LF ลำดับเบส 5’-GCATCAGATTGTCGCACCA-3’ 2.0 ไมโครโมล่าร์ - ลูปไพร์เมอร์ FB ลำดับเบส 5’-CCTCACCAGCGAGTTCCT-3’ 2.0 ไมโครโมล่าร์ - บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCL 20 มิลลิโมล่าร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิโมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซ็นต์, pH 8.8) - สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟต 4.0 มิลลิโมล่าร์ - สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ - สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ - เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย - สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ จ. นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที ฉ. อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อไวรัส ISKNV สารละลายปฏิกิริยาจะ เปลี่ยนจากสีม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก) ------------------------------------------------------ คำขอใหม่ปรับปรุง

1. กรรมวิธีการตรวจหาเชื้อไวรัส Infectious spleen and kidney necrosis virus ก่อโรคในปลา ประกอบด้วยขั้นตอนดังนี้ 1.1 การเตรียมสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลาที่ต้องการตรวจ ที่ประกอบด้วย ก. ตัดเนื้อเยื่อจากส่วนอวัยวะของปลาที่ต้องการตรวจประมาณ 50 มิลลิกรัม บดด้วยน้ำยาสกัด ดีเอ็นเอ 2 โมล่าร์ สารละลายกัวนิดีนไธโอไซยาเนต ปริมาตร 250 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่ เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดสามารถบดตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ข. หรือเลือดปลาที่ต้องการตรวจที่ไม่มีสารกันเลือดแข็งปริมาตร 100 ไมโครลิตร บดด้วยน้ำยา สกัดดีเอ็นเอ ปริมาตร 200 ไมโครลิตร หรือสามารถใส่เพิ่มได้จนกว่าน้ำยาสกัดดีเอ็นเอสามารถบด ตัวอย่างได้จนเป็นเนื้อเดียวกัน ค. นำหลอดตรวจจากข้อ ก หรือ ข ที่ใส่ตัวอย่างที่บดละเอียดแล้วไปต้มที่ 95 องศาเซลเซียส นาน 5 นาที จากนั้นนำหลอดตรวจดังกล่าวไปแช่ในน้ำแข็งอีก 5 นาที ง. นำส่วนใสซึ่งเป็นสารละลายดีเอ็นเอ มาเจือจาง 50 เท่า เพื่อให้ได้ปริมาณดีเอ็นเอที่เหมาะสม ในการทำปฏิกิริยา โดยดูดส่วนใสปริมาตร 10 ไมโครลิตร มาผสมกับน้ำกลั่นปริมาตร 490 ไมโครลิตร 1.2 นำเอาส่วนใสของสารละลายดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่างปลา ปริมาตร 2 ไมโครลิตร เติมลงใน สารละลายแลมป์ ที่ประกอบด้วย ก. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ ISKNV-F3 ลำดับเบส (5'-AGATCCCCTCCATCACATCC -3') 0.2 ไมโคร โมล่าร์ ข. เอาท์เทอร์ไพร์เมอร์ ISKNV -B3 ลำดับเบส (5'-TGTAGCCAGACTGTTTGCTG-3') 0.2 ไมโคร โมล่าร์ ค. อินเนอร์ไพร์เมอร์ ISKNV -FIP ลำดับเบส (5'- ACCGACACCTCCTCCACTAGATTTTTGGAGAACAGCTACATCCGC-3') 2.0 ไมโคโมล่าร์ ง. อินเนอร์ไพร์เมอร์ ISKNV -BIP ลำดับเบส (5'- TTAACGACCTGGTGGCACAGACTTTTCATGCAGGCGTTCCAGAAG -3') 2.0 ไมโครโมล่าร์ จ. ลูปไพร์เมอร์ ISKNV -LF ลำดับเบส (5' –GCATCAGATTGTCGCACCA -3') 2.0 ไมโครโมล่าร์ ฉ. ลูปไพร์เมอร์ ISKNV -LB ลำดับเบส (5'-CCTCACCAGCGAGTTCCT-3') 2.0 ไมโครโมล่าร์ ช. บัฟเฟอร์ที่ความเข้มข้น 1 เท่า (Tris-HCl 20 มิลลิโมลาร์, (NH4)2SO4 10 มิลลิโมล่าร์, KCl 10 มิลลิโมล่าร์, MgSO4 2 มิลลิโมล่าร์, Triton X-100 0.1 เปอร์เซนต์, pH 8.8) ซ. สารละลายแมกนีเซียมซัลเฟส 4.0 มิลลิโมล่าร์ ฌ. สารเบตาอีน 0.5 โมล่าร์ ญ. สาร dNTPs 1.4 มิลลิโมล่าร์ ฎ. เอ็นไซม์ Bst ดีเอ็นเอ โพลีเมอเรส 8 หน่วย ฏ. สารละลายไฮดรอกซีแนปทอลบลู 120 ไมโครโมล่าร์ 1.3 นำส่วนประกอบทั้งหมดอุ่นที่อุณหภูมิ 65 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 45 นาที 1.4 อ่านผลด้วยตาเปล่าทันที โดยตัวอย่างที่มีการติดเชื้อไวรัส ISKNV สารละลายปฏิกิริยาจะเปลี่ยนจากสี ม่วง (ผลทดสอบลบ) เป็นสีฟ้า (ผลทดสอบบวก)