SU738861A1 - Способ получения фракции'сывороточного альбумина 1 - Google Patents

Description

Изобретение относится к медицине^· а именно гематологии.

Известен способ получения фракции сывороточного альбумина.путем адсорбции на нерастворимых в воде поперечно сшитых полиэлектролитных сополимерах этилена с ангидридом малеиновой кислоты с содержанием дополнйтельных диметиламйнопропиловых функциональных групп с последующим элюированием целевого продукта (1] .

Однако известный способ не обеспечивает высоких чистоты и выхода целевого продукта (67%) .

Целью изобретения является повышение чистоты и выхода целевого Продукта.

Это достигается тем, что адсорбцию проводят на сополимере при рН 5,0-5,5 и температуре 65-72°С в течение 1-4 ч и затем устанавливают рН смеси 3,5-4,5.

Сывороточный альбумин получают из крови, кровяной плазмы, кровяной сыворотки и их фракций, содержащих альбумин. Так как при нагревании возможно денатурирование содержащихся в обрабатываемом материале глобулинов, то сначала выделяют опре^е2

ленные необходимые глобулиновые фракции, как γ -глобулины. Другие фракции крови, как факторы свертывайся крови, и протромбиновый компб леке также выделяют иэ плазменного ' исходного материала.

Нерастворимые в воде поперечносшитые полиэлектролитные сополимеры являются сополимерами этилена

10 с ангидридом малеиновой кислоты с содержанием дополнительных диметилами нопропиловых функциональных групп. Основной сополимер этилена с ангидридом Малеиновой кислоты

15 (ЭАМК) получают путем взаимодействия этилена с ангидридом малеиновой кислоты в присутствии катализатора на основе перикиси в соответствующем растворителе. Основной сополи30 мер этилена с ангидридом малеиновой кислоты затем подвергают взаимодействию с’ метилиминобиспропиламином, содержащим две первичные аминовые группы, получая поперечно

25 сшитый ЭАМК)-сополимер. Желательные диметиламинопропиловые функциональные группы могут быть затем добавлены в поперечно сшитый полимер путем взаимодействия диметиламинопроίθ пиламина с ангидридными группами

3

736861

4

ЭАМК-сопалимера. Полиэлектролитный

сополимер предпочтительно превращают в солянокислую соль для достижения большей технологичности продукта.

Предпочтительный полиэлектролитный сополимер содержит около 5 метиламинобиспропиламиновых сшивающих групп и около 90 дополнительных диметиламинопропиламиновых функциональных групп на 100 ед. ангидрида малеиновой кислоты в ЭАМК-сополимере. Полиэлектролитный сополимер способен в основном полностью адсорбировать весь альбумин кровяной фракции, после чего альбумин можно выделять с выходом выше 90% с 94%-ной чистотой, применяя способ горячей обработки и селективного элюирования.

Полиэлектролитные сополимеры смешивают с кровяной плазмой или сывороткой, или альбуминсодержащими Фракциями крови, предпочтительно в концентрациях 1-5% сополимера. Регулировкой значения рН смолисто-белковой смеси иа разные уровни вначале удаляют выборочные белки. При рН 5,5-7,5 смолой адсорбируются альоуьшн, и р -глобулины и фибриноген, в то время как большая, часть -глобулина остается не поглощенной и может быть выделена из остатка для терапевтических целей. Первоначальное выделение у¹ -глобулина осуществляют при рН 6, Часть поглощенных^ и р -глобулинов и фибриногена выделяют Доведением рН смолисто-белковой смеси примерно до 4,7 с последующим сбором десорбированного остатка.

Значение рН смолисто-белковой смеси затем доводят до 5,0-5,5 с нагревом до температуры примерно 65-72°С в течение 1-4 ч, рН регулируют в пределах 5,2-5,3 с нагреванием смолисто-белковой смеси примерно при 72°С в течение 1ч.

При осуществлений стадии горячей обработки остаточные глобулины, в основном с*. и р, -глобулины, денатурируются, в то время как альбумин

не денатурируется и легко поддается выделению. После обработки нагревом рН доводят до 3,5-4,5 для элюирова/ ния из смолисто-белковой смеси желательного альбумина. Смолисто-белковую смесь перед регулировкой рН охлаждают, после чего значение рН доводят до 4. Выделяют альбумин осаждением, фильтрацией или центрифугированием, предпочтительным способом является фильтрация смолисто-белновой смеси с отрегулированным рН, промывка' жмыха и сбор фильтрата в виде желательной альбуминовой фракции, высокой степени чистоты. Регулировку рН на необходимый уровень осуществляют обработкой кислотным

или щелочным буфером, например буфером на основе ацетата натрия - уксусной кислоты или же лимонной кислоты, а целях подкисления или обработкой бикарбонатом натрия или гидроокисью натрия для подщелачивания. Предпочтительным является применение стабилизаторов альбумина, как натрийацетилтриптофанат и натрийкаприлат смеси смола-белок во время обработки нагревом с учетом их стабилизирующих свойств.

Пример 1. Полиэлектролитный полимер состоит иэ смолистого продукта взаимодействия в основном эквимолярных частей этилена с ангидридом малеиновой кислоты (АМК), поперечно сшитого метилиминобиспропиламином (МИБПА) и затем подвергнутого взаимодействию с диметиламинопропиламином (ДМПА) таким образом чтобы образовалось около пяти МИБПАсшивающих групп и около 90 ДМПА-дополнительных групп на 100 ед. АМК в АМК-сополимере, и превращенного в солянокислую соль. Вначале полиэлектролитный сополимер промывают в 0,04 М хлористом натрии. Плазму, полученную из смешанной человеческой крови, разбавляют с применением 3 частей воды на 1 часть плазмы,после чего примешивают 2 вес.% промытого полиэлектролитного сополимера (2 г/100 мл). Значение рН смеси смола-плазма доводят до 6,0, затем 30 мин перемешивают, фильтруют и , промывают 0,002 М хлористым натрием. Фильтрат, в основном состоящий из у-глобулинов,β -глобулинов,фибриногена и ассоциированных кровяных факторов , выделяют из полученного смолисто-белкового остатка на фильтре. Последний, содержащий адсорбированный альбумин, подкисляют до рН 5,2, Для достижения 0,012 М концентрации к адсорбированному смолой белку примешивают надлежащее количество стабилизатора на основе каприлата натрия, дпя достижения 0,002 М концентрации добавляют хлористый натрий. После этого в течение 1 ч при 70°С поглощенный смолой белок нагревают, потом материал фильтруют, фильтрат выбрасывают,

Альбумин элюируют из оставшегося смолисто-белнового жныха путем подкисления до рН 4,0 в 0,002 М хлористом натрии лимонной кислотой, затем 30 мин перемешивают и фильтруют. Фильтрат собирают в виде желательной альбуминовой фракции с выходом 96,6% (в пересчете на концентрацию альбумина в первоначальной плазме) при степени чистоты 98,5%. Степень чистоты элюированного из смолы альбумина определяют агар-гель-электрофорезом в буфере на основе диэтилбарбитуровой кисло5

736861

6

ты при рН 8,6 с применением электро форезного устройства. Счет произво·*· дят при 600 нм с помощью денситометра. Синий типа Соотащйе ВгЧШАпЬ В€че й 250 является протеиновым красителем высокой чувствительности.

За счет высокой степени чувствительности синий типа Соотаз5»е βΓ-ίξείάηί ВЕие И 250 допускает определение белковых примесей в альбуминовом продукте с очень большой точностью, а проведенный количественный анализ подтверждает получение альбумина высокой степени чистоты.

Пример 2. Повторяют способ примера 1 за исключением того, что исходная плазма представляет собой АНР-обедненную плазму. Выход и степень чистоты альбуминового продукта в Основном такие же, как в примере 1.

Пример 3. Повторяют способ примера 1 за исключением того, что

' включают промежуточную стадию между первой фильтрацией и горячей обработкой в целях удаления дополнительных глобулинов и фибриногена иэ плазмы. На этой промежуточной стадии рН смолисто-белкового остатка на фильтре от первой фильтрации доводят до 4,7 в 0,002 М хлористом натрии лимонной кислотой, перемешивая затем в течение 30 мин. Смесь фильтруют, проьывают и потом подвергают обработке нагревом, затем стадиям примера 1. Фильтрат от обработки с достижением рН 4,7 содержит Лир -глобулины и фибриноген, которые собирают для использования в различных известных терапевтических и диагностических целях. Целевой альбумин получают с выходом и степенью чистоты в основном аналогичными примеру 1.

Следуя способу выделения очищенн.оГо альбуминового продукта, альбумин концентрируют до требуемого уровня, рН концентрированного продукта доводят до физиологически приемлемого значения и содержания электролита, затем нагревают для

. уничтожения вирусов, доводят до ⁵ прозрачного состояния фильтрацией

или иными способами для получения клинически пригодного вещества, соответствующего требованиям, предъявляемым к ойгчнощг сывороточному ма¹⁴ териалу. К предпочтительному способу концентрирования, применяемому на практике, относятся лиофилизация с последующим кере&астворенкем до желательной концентрации, например

15 5 или 25%-яая ультрафильтрация.

Предлагаемый сйесо.б позволяет повысить выход целевого продукт? дО 96,6% при степени чистоты 98,5%.

20

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения фракции сывороточного альбукгаиа путем адсорбция

   25 на нерастворимых в воде поперечно сшитых полиэлектролитных сополимерах этилена с ангидридом малеиновой кислоты с содержанием дополнительных даметиламинопропиловых фун’'__ циональных групп с последующим элюироваьием целевого продукта, о τη ичающийся тем, что, с целью повьвиения чистоты и выхода целевого продукта, адсорбцию проводят

   • на сополимере при рН 5-5,5 и темпе³⁵ ратуре 65-72°С в течение 1-4 ч и затем устанавливают рН смеси 3,54,5.