SU452103A3 - Способ получени -дигидрокси -3-4-фенилаланина - Google Patents

Description

1

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности, а именно к способам получени  Ь- Дигидрокси-3,4-фенилаланина путем микробиологического преобразовани  тирозина .

Известен способ получени  L-дигидрокси3 ,4-фенилаланина, состо щий в культивировании продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода и источник азота, в присутствии тирозина с последующим выделением Ь-дигидрокси-3,4-фенилаланина. При этом в качестве продуцента используют различные микроорганизмы, в частности Microspira tyrosinatica, Gliocladium deliques cens и др.

Однако такой способ дает низкий процент выхода Ь-дигидрсукси-3,4-фенилаланина.

С целью устранени  указанного недостатка предложен способ получени  Ь-дигидрокси-3,4фенилаланина , согласно которому в качестве продуцента используют штамм Vibrio tyrosinaticus АТСС 19378.

Клетки этого штамма имеют удлиненную и искривленную форму, соединены в цепочки. На питательной среде с агар-агаром штамм образует обильную рыхлую культуру белого цвета Vibrio tyrosinaticus АТСС 19378. Разжижает желатин, не гидролизует агар, не образует пигмент на питательной среде с агаром. На питательной среде с агаром и тирозином штамм образует черный пигмент, содержащий

Ь-дигидрокси-3,4-фенилаланин.

Процесс получени  Ь-дигидрокси-3,4-фенилаланина провод т в две фазы при различном значении рН. На первой фазе выращивают указанный продуцент ори рН 6,0-7,8, на второй - преобразовывают тирозин iB L-дигидрокси-3 ,4-фенилаланин при рН 4,0-7,0. При этом тирозин ввод т в виде щелочного и кислотного растворов. На фазе преобразовани  тирозина добавл ют глюкозу, L-аскорбиновую кислоту, антиокисл ющий агент и соли меди.

Предложенный способ осуществл ют следующим образом. На первой фазе культивируют штамм Vibrio

tyrosinaticus АТСС 19378 на питательной среде при рН 6,0-7,8 (предпочтительно между 6,5 и 7,5) преимущественно при 25-26°С.

Выращивание культуры провод т при перемешпвапии и аэрации.

Питательна  среда содержит источник углерода , источник азота и минеральные элементы .

В качестве источников углерода используют глюкозу, мальтозу, декстрины, крахмал, глицерин , мелассу и другие вещества.

Взамен гидроуглеродистых соединений могут быть применены животные и растительные жиры и масла, такие как свиное сало илн соевое масло.

Источниками азота могут быть минеральные или органические соли аммони , мочевина и некоторые аминокислоты.

Они могут быть внесены и в виде казеина, лактобумина, клейковины, соевой, арахисовой и рыбной муки, м сных экстрактов и дрожжей .

В качестве добавл емых в питательную среду минеральных элементов могут быть использованы щелочные и щелочноземельные фосфаты или карбонаты кальци  и магни .

Во второй фазе в нитательную среду добавл ют L-тирозин в количестве, преимущественно , от 3 до 10 г/л. Его внос т п)едпочтнтельно после роста продуцента з течение 16-24 час, использу  одновременно щелочной раствор тирозина и его раствор в сол ной кислоте.

После внесени  щелочного и кислотного растворов тирозина культуру выдерживают, в течение одного-двух дней в тех же услови х.

В начале фазы преобразовани  тирозина в культуру мончет быть дополнительно введена глюкоза и добавка дл  контрол  рН культуры.

Преобразование тирозина можно осуществл ть в присутствии аскорбиновой кислоты, которую добавл ют (в один или несколько приемов в количестве 1-5 г/л) в нериод фазы роста продуцента либо после внесени  в нитательную среду L-тирозина.

После завершени  (фазы преобразовани  тирозина приступают к выделению L-дигидрокси-3 ,4-фенилаланина. Дл  этого сусло после окислени  до рН 2 подвергают фильтрации или центрифугированию. В этом случае L-дигидрокси-3 ,4-фенилаланин может последовательно удерживатьс  на катионообмениой смоле типа сульфидной и на глиноземе в присутствии этилецдиаминотетрауксусной кислоты и метабисульфита натри .

L-дигидрокси - 3,4 - фенилаланин, задержанный на глиноземе, элюируетс  раствором щавелевой кислоты и, после ее удалени , очищаетс  путем перекристаллизации.

Пример 1. Готов т питательную среду следующего состава (г):

Дрожжевой экстракт40

Пептон80

М сной экстракт80

Моногидратна  глюкоза160

Хлорид натри 80

Вода17 (л).

Путем внесени  в среду 22 см едкого натра (10 и) устанавливают рН 7,5.

Приготовленную среду стерилизуют нри 122°С в течение 40 мин.

Охлажденную среду при рН 6,95 засевают 200 см культуры Vibrio tyrosinaticus АТСС 19378 в колбе Эрленмейера. Культура развиваетс  при 26°С в течение 16 час при перемещивании и аэрации стерильным воздухом.

Затем рН культуры довод т до 5,3 путем внесени  стерильного раствора сол ной кислоты 2,4 н. После этого в среду добавл ют 64 г тирознна в виде двух растворов одинакового объема - первый с 20% в сол ной кислоте (2,4 н.) и второй с 20% в едком натре (2,4 н.).

Кроме того, в питательную среду добавл ют 350 см раствора, содержащего 160 г моногидратной глюкозы, и выдерживают культуру в течение 27 час, ноддержива  рН 5,3.

В конечном объеме, составл ющем 14 титрованных литров, содержитс  3,0 г/л L-дигндрокси-3 ,4-фенилаланина.

Пример 2. Часть (1,8л) преобразованной культуры, описанной в примере 1 и содерлсащей 5,4 г L - дигидрокси - 3,4 - фенилаланина,

окисл ют 50 см сол ной кислоты 12 н. при рН 2 и центрифугируют. Собранную жидкость пропускают на столбик смолы Dowex 50W-X в виде кислоты (смола на основе полистиренсульфокислоты с 2% дивинилбензола).

Ь-дигидрокси-3,4-фенилаланин элюируетс  2 н. сол ной КИСЛОТОЙ. Элюат (5,2 л), содержащий небольщое количество непреобразованного тнрознна, очищают, устанавлива  его рН 4,0 за счет введени  800 см едкого натра

(d 1,33), 250 г глинозема, 5 г метабисульфита натри  и 5 г этилендиаминотетрауксусной кислоты в виде двусодистой соли. Смесь перемешивают , довод т рН до 8,6 путем внесени  200 см концентрированной соды и выдержнвают в течение 15 мин.

Глииозем отдел ют путем фильтрации и несколько раз промывают трем  литрами дистиллированной воды. Фильтрат и промывна  жидкость, содержащие в себе тирозин, удал ютс , а Ь-дигидрокси-3,4-фенилаланин отдел етс  при обработке глинозема 2,2 л щавелевой кислоты 2 н. Щавелевый раствор концентрируют в 0,7 л при пониженном до 30 мм рт. ст. давлении путем нагревани  в вод ной

бане. Щавелевую кислоту удал ют фильтрацией . Затем фильтрат обрабатывают 3,7 л этилового спирта, довод т его рН до 5,5 и добавл ют 150 см едкого натра (d 1,33) и 3,7 л ацетона дл  выпадени  минеральных солей.

Полученный осадок фильтрзют, а фильтрат концентрируют под давлением 30 мм рт. ст. путем нагревани  в вод ной бане до 0,8 л. Концентрацию фильтрата заканчивают при нормальном давлении в атмосфере азота ц

нагревании с номощью парафиновой бани до получени  70 см раствора. Полученный раствор выдерживают в течение 10 час при 40°С, после чего из него выдел ют 2,54 г неочищенного Ь-дигидрокси-3,4-фенилаланина.

Очистку этого продукта провод т путем перекристаллизации воды после осветлени  водного раствора с помощью активного углерода. Таким образом получают кристаллизованное вещество Ь-дигидрокси-3,4-фепилаланин с выходом 49 %.