SU1755194A1 - Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ - Google Patents
Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ Download PDFInfo
- Publication number
- SU1755194A1 SU1755194A1 SU904782178A SU4782178A SU1755194A1 SU 1755194 A1 SU1755194 A1 SU 1755194A1 SU 904782178 A SU904782178 A SU 904782178A SU 4782178 A SU4782178 A SU 4782178A SU 1755194 A1 SU1755194 A1 SU 1755194A1
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- genotoxicity
- specific radioactivity
- water
- substances
- ciliates
- Prior art date
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Использование: микробиологии, водна токсикологи , биологический контроль за токсичными водорастворимыми веществами , контроль сточных и природных вод, оценка генотоксичности. Сущность изобретени ; определение генотоксичности провод т . внесением исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий Tetrahymena pyrlformis и экспозицией с меченным предшественником. После чего определ ют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий, по изменению удельной радиоактивности нуклеиновых кислрт суд т о генотоксич- ности исследуемых веществ. Дополнительно могут быть использованы водоросли Chlorella vulgaris. 2 табл.
Description
Изобретение относитс к микробиологии , водной токсикологии и предназначено к использованию дл биологического контрол за токсичными водорастворимыми веществами, а также может быть использовано дл контрол сточных и природных вод и при оценке генотоксичности водорастворимых веществ при исследовании генетических основ адаптации организмов йГ измен ющимс услови окружающей среды ...
Известен способ оценки теста на гёно- токсичность, использующий определение разрывов нитей ДНК в клетках лимфрмы мыши при щелочной денатурации с элю- цией через оксиапатит.
Этот известный способ затруднительно использовать дл контрол сточных и природных вод вследствие необходимости введени их во внутрь организма и, кроме того, не каждый последующий токсикант приводит к разрывам ДНКГ -,
Известен способ биологической оценки токсичности водьХ согласно которому производ т экспозицию рач ков-дафний в исследуемой воде и по числу погибших дафний и длительности экспозиции суд т о степени токсичности исследуемой воды.
Недостатком этого способа вл етс его невысока чувствительность, т.к. по гибели дафний возможно оценивать только
NJ (Л СЛ
О
ь
высокие дозы токсиканта, что ограничивает область использовани .
Известен также способ определени токсичности водорастворимых веществ, согласно которому инфузории Tetrahymena pyrlformis диспергируют в культуральной среде, регистрируют динамику изменени величин светопропускани культуры до и после экспозиции с исследуемым веществом и по изменению двигательной активности при воздействии исследуемого вещества различной концентрации оценивают его токсичность.
Недостатком этого способа вл етс низка чувствительность и недостаточность интерпретации полу внных результатов, т.к. двигательна активность инфузорий вл етс интегральным показателем. Этим способом не обеспечиваетс оценка гено- токсичности, что ограничивает область использовани ,
Цель изобретени - повышение чувствительности и достоверности определени и расширени области использовани .
Способ осуществл етс следующим образом .
В суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformls, растущую на пеп- тонной среде (пептон 20 г, дрожжевой экстракт 1 мл, глюкоза 5 г, NaCI - 1 г, вода дистиллированна до 1 л, рН 7,1) при 27° С и содержащую 60-80 тыс. особей в 1 мл, или 5-суточную культуру Chlorella vulgaris, культивируемую на солевой среде Успенского (КМОз 0,025 г, MgSCM 0,025 г, Са(МОз)2 0,1 г. КНаР04 0,025, К2СОз 0,0345, вода дистиллированна до 1 л, рН после стерилизации 7,0-7,3) в люминостате с освещенностью 2000 люкс и содержащую 5-10 клеток в. 1 мл, внос т растворы испытуемых веществ в различных дозах (0,001; 0,01 и 1.0 мг/л). Спуст 30-40 мин после внесени испытуемых веществ в культуру инфузорий внос т по 2,97 МБк Н3-тимидина и 2,97 МБк Н3 - УТФ на 150 мл культуральной жидкости и производ т инкубацию в течение 30 мин при 27-28° С. После окончани инкубации каждую пробу раздел ют на 3 равные части, соответственно по 50 мл каждую, охлаждают и внос т хлорную кислоту до 5% конечной концентрации. Образцы охлаждают в течение 30 мин и сформировавшийс осадок собирают центрифугированием при 1000 g в течение 10 минут. Полученные осадки трижды промывают 5% хлорной кислотой , после чего из осадков извлекают тотальную РНК. Дл этого к ним прибавл ют 0,3 н гидрат окиси кали , суспендируют и производ т инкубацию образцов при 37° С в течение 1,5 ч. После окончани инкубации
пробы охлаждают и внос т хлорную кислоту до 5% концентрации, через 15 мин их центрифугируют при 1000 g в течение 10 минут, затем собирают надосадочную жидкость,
5 котора представл ет нуклеотиды РНК. Полученные осадки промывают 2 мл 5% HCI04, после чего осадки объедин ют с первой надосадочной жидкостью и в общем объеме определ ют содержание РНК по из0 вестному методу Спирина.
По 0,5 мл из каждого образца внос т во флаконы с диоксановым сцинтилл тором и определ ют радиоактивность на сцинтил- л ционном счетчике, результаты выражают
5 в импульсах в минуту на 1 мг РНК (удельна радиоактивность РНК).
Осадок, полученный после выделени РНК, гидролизуют в 5% HCI04 на вод ной бане при 90-95° С в течение 20 мин с
0 обратным холодильником. Надосадочную жидкость перенос т в чистые пробирки и определ ют содержание ДНК и удельную радиоактивность.
Полученные значени дл трех парал5 лельных проб усредн ют и сравнивают удельные радиоактивности контрольных и опытных образцов. Уменьшение величин удельной радиоактивности свидетельствует об угнетении скорости синтеза нуклеиновых
0 кислот, а в случае увеличени удельной радиоактивности - об увеличении скорости синтеза РНК или ДНК.
Достоверное увеличение или уменьшение удельной радиоактивности нуклеино5 вых кислот по сравнению с контролем указывает на про вление генотоксичности исследуемых веществ.
Пример1.В 3-х суточную культуру Tetrahymena pyriformls, растущую на пеп0 тонной среде при 27° С, вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и 2,97 МБк Н3-УТФ и выдерживали в термостате при 28° С. Спуст 20, 40, 60, 80 и 100 мин извлекали пробы, охлаждали и в каждую из проб вносили
5 хлорную кислоту до конечной концентрации 5%. Из полученных осадков щелочным или кислотным гидролизами извлекали РНК и ДНК и определ ли их удельную радиоактивность .
0 В 5-ти суточную культуру водорослей Chlorella vulgaris вносили по 2,97 МБк Н3- тимидина и 2,97 МБк Н3-УТФ и спуст 10,20, 30 и 40 мин извлекали пробы, охлаждали и вносили в каждую из них хлорную кислоту
5 до конечной концентрации 5%. Осадки собирали центрифугированием, из них извлекали РНК и ДНК и определ ли их удельную радиоактивность.
В табл. 1 приведены результаты опреде- лени удельной радиоактивности ДНК и
РНК в клетках водорослей и в клетках инфузорий при различности времени экспозиции и эти приведенные данные показывают, что при экспозиции до 30 минут удельна радиоактивность ДНК и РНК в клетках водорослей увеличиваетс , а при дальнейшем увеличении времени экспозиции эта величина остаетс неизменной, а в клетках инфузорий эта величина увеличиваетс при экспозиции до 60 мин.
Данные опытов показывают, что доза изотопов 2,97 МБк вл етс достаточнрй, чтобы получить высокую удельную радиоактивность нуклеиновых кислот в клетках водорослей и инфузорий соответственно. видно из полученных результатов, оптимальным времени экспозиции вл етс 30- 60 мин.
П р и м е р 2. В 3-х суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformis, растущую на пептонной среде при 27° С, вносили 0,5 мг/л меди и спуст 10, 20, 30 и 40 минут извлекали пробы культуры. В каждую из проб вносили 2,97 МБк Н -тимидина и 2,97 МБк Н3-УТФ. Затем производили инкубацию каждых образцов в течение 60 минут при 28° С, после чего охлаждали и вносили холодный раствор хлористой кислоты до 5% конечной концентрации. Через 30 мин осадок собирали центрифугированием при ЮООд в течение 10 мин, после чего дл каждого образца определ ли удельную радиоактивность ДНК и РНК в клетках инфузорий с разной продолжительностью экспозиции.
Результаты опытов приведены в табл. 2.
Данные опытов показывают, что при внесении 0,5 мг/л меди в среду с инфузори ми и экспозиции их до 20-30 мин до внесени в культуральную среду меченных предшественников нуклеиновых кислот, наблюдаетс достоверное снижение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот, Это снижение коррелируют с угнетением роста культуры через 24 и 48 ч после внесени токсиканта,
При сравнении вли ни 0,5 мг/л меди на удельную радиоактивность нуклеиновых кислот и отдельно на подвижность инфузорий , определ емую способом по прототипу, обнаружено, что если подвижность измен етс на 26%, то удельна радиоактивность ДНК измен етс через несколько минут после внесени токсиканта на 50%. Таким образом, изменение удельной радиоактивности нуклеиновых кислот е клетках инфузорий или водорослей фиксируют внесением радиоактивных предшественников в культуральную среду через 20-30 мин после внесени токсиканта, что в несколько раз быстрее по сравнению с учетом численности клеток.
Предлагаемый способ обеспечивает большую чувствительность по сравнению с оценкой токсичности, проводимой по изменению подвижности тест-обьектов, кроме
того, он позвол ет оценить не только общую токсичность, но и генотоксичность, т.е. токсичность , затрагивающую генетическую систему клеток.
ПримерЗ. Культуру водорослей
0 Chlorella vulgaris, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20° С, раздел ли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили Соответственно 0,005; 0,01; 0,1 или
5 0,5 мг/л ртути. Спуст 30 мин после внесени токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и через 30 мин культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определ ли удель0 ную радиоактивность ДНК.
Результаты опытов, представленные на фиг. 1 и 2. показывают, что ионы ртути в концентрации 0,005 и 0,01 мг/л не оказали вли ни на скорость синтеза ДНК, а доза в
5 0,1 мг/л подавл ла скорость ДНК на 96%. Увеличение дозы токсиканта в 5 раз полностью подавл ло включение радиоактивной метки в ДНК (на 99%). Вли ние этих доз ртути на численность клеток водорослей че0 рез 3, 6, 9 и 12 суток после начала эксперимента не оказывалось, что указывает на существование механизма адаптации.
Генотоксичность, определ ема через 30-60 мин после внесени токсиканта по
5 скорости синтеза ДНК. позвол ет оценить пр мое вли ние испытуемых веществ на функцию генетического аппарата без наложени адаптивных способностей тест-объектов .
0 Таким образом, предлагаемый способ позвол ет определ ть концентрации веществ , оказывающих вли ние на генетический аппарат водорослей,
П р и м е р 4. Культуру водорослей
5 Chlorella vulgaris, растущую на среде Успенского в люминостате с освещенностью 2000 люкс при температуре 20° С, раздел ли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 и
0 1,0 мг/л кадми . Спуст 30 минут после внесени токсиканта в каждую из проб вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и через 30 мин культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой, после чего определ ли удель5 ную радиоактивность ДНК.
Таким образом, предлагаемый способ оценки генотоксичности позвол ет в короткое врем дать ответ о вли нии испытуемых веществ на функцию генетического аппарата тест-объектов.
П р и м е р 5. 3-суточную культуру инфузорий Tetrahymena pyriformls, растущую на пептонной среде, раздел ли на отдельные пробы, в каждую из которых вносили соответственно 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л ионов меди. Спуст 30 мин после внесени токсиканта вносили по 2,97 МБк Н3-тимидина и Н3- УТФ. После 60 минут инкубации культуру охлаждали и клетки осаждали хлорной кислотой , после чего определ ли удельную радиоактивность ДНК и РНК,
Медь в концентрации 0,1 мг/л снижает удельную радиоактивность ДНК и клетках инфузорий на 34%, а увеличение концентрации до 0,5 и 1,0 мг/л уменьшает этот показатель на 65 и соответственно. Удельна радиоактивность тотальной РНК при внесении 0,1 мг/л меди понизилась на 50% по сравнению с контролем. Увеличение концентрации меди в среде в 5 и 10 раз не приводило к дальнейшему изменению удельной радиоактивности РНК клеток инфузорий . Инкубаци клеток с ионами меди в концентрации 0,1 мг/л снижало численность инфузорий на 60% через 24 ч после ее внесени в культуральную среду. Дальнейшее увеличение концентрации меди в среде не вли ло на интенсивность размножени инфузорий.
Таким образом, медь обладает ге- нотоксичностью, и предлагаемый способ оценки генотоксичности позвол ет в короткое врем дать ответ о вли нии испытуемых
веществ на функцию генетического аппарата инфузорий.
Claims (2)
- Формула изобретени Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ, включающийвнесение исследуемых веществ в культуральную среду инфузорий Tetrahymena pyrlformis и экспозицию их с исследуемым веществом,отличающийс тем,что,с целью повышени чувствительности и достоверности определени и расширени области использовани , после внесени исследуемого вещества в культуральную среду дополнительно через 20-30 мин производ т инкубацию инфузорий в течение30-60 мин с меченным предшественником, после чего определ ют удельную радиоактивность тотальных ДНК и РНК в клетках инфузорий, а о генотоксичности исследуемых веществ суд т по оценке их вли ни наудельную радиоактивность нуклеиновых кислот инфузорий,
- 2. Способ поп. 1,отличающийс тем, что культуральна среда дополнительно содержит водоросли Chtorella vulgarlsТаблица 1Продолжение табл.1
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904782178A SU1755194A1 (ru) | 1990-01-15 | 1990-01-15 | Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU904782178A SU1755194A1 (ru) | 1990-01-15 | 1990-01-15 | Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SU1755194A1 true SU1755194A1 (ru) | 1992-08-15 |
Family
ID=21491467
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU904782178A SU1755194A1 (ru) | 1990-01-15 | 1990-01-15 | Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
SU (1) | SU1755194A1 (ru) |
-
1990
- 1990-01-15 SU SU904782178A patent/SU1755194A1/ru active
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Evalutlon of a genotoxlclti test measuring OHA-strand breaks in mouse lumphoma celts by alkaline unwinding and hydroxyaparatlte elutlon / Garberg Per, Akerblom Eva-Lena, Bolesfokfl . // Mutat Res. Environ. Mutatgenes and Relat. Subj. 1988. 203, № 3, p. 155-176. Авторское свидетельство СССР Nfe 1507275, кл. A 01 К 61 /00, G 01 N 33/18, 1989. Авторское свидетельство СССР № 1257518, кл. G 01 N-33/48, 1986. * |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
d'Herelle | The bacteriophage, its role in immunity | |
Ross | Vitamin B12 assay in body fluids using Euglena gracilis | |
JPH0231892A (ja) | 好気性活性汚泥型の排水処理工程の制御法 | |
SEAMAN | Some aspects of phagotrophy in Tetrahymena | |
SU1755194A1 (ru) | Способ определени генотоксичности водорастворимых веществ | |
Colley | Widespread foodborne cyclosporiasis outbreaks present major challenges. | |
Tsuchiya | Further studies on the cultivation of Endameba histolytica and a complement fixation test for amebiasis | |
RU2315113C2 (ru) | Способ диагностики чувствительности mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам | |
RU2247987C2 (ru) | Способ определения бактерицидной активности сыворотки крови | |
US5707824A (en) | Method of determining the presence or absence of a paraffinophilic microorganism | |
RU2099425C1 (ru) | Способ определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза | |
RU2086982C1 (ru) | Способ определения патологических нарушений в организме | |
RU2034296C1 (ru) | Способ определения мутагенности растворов | |
RU2164026C2 (ru) | Способ определения состояний шока и контроля за ходом лечения пациентов в состоянии шока | |
RU2070934C1 (ru) | Способ идентификации гриба candida albicans и гриба candida tropicalis | |
Helman | Emergency screening of urine, plasma, or gastric contents for barbiturates | |
SU1659851A1 (ru) | Способ определени мембранотоксического действи химических веществ | |
SU1483374A1 (ru) | Способ определени степени т жести кандидоза | |
RU2084533C1 (ru) | Способ выявления helicobacter pylori для диагностики обусловленной ими гастродуоденальной патологии | |
RU2027994C1 (ru) | Способ диагностики бактериального сепсиса у детей | |
SU859927A1 (ru) | Способ количественного определени полиэтиленоксида | |
RU1824583C (ru) | Способ диагностики гнойно-септических заболеваний | |
SU1476382A1 (ru) | Способ определени токсичности сыворотки крови | |
SU1291876A1 (ru) | Способ определени вирусной этиологии хронического гепатита | |
SU1307337A1 (ru) | Способ определени биологической активности выделений водорослей |