SU1736502A1 - Способ получени полисахаридов, обладающих слабительным действием - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к фармацевтической промышленности и касаетс  получени  биологически активных веществ из растительного сырь . Цель изобретени  - повышение выхода и специфической активности целевого продукта. Способ осуществл етс  путем промывки естественной смеси двух видов ламинарий (Laminaria saccharina и L. digitata L) 1%-ным раствором сол ной кислоты при 30°С в течение 1 ч, экстрагировани  сырь  1%-ным раствором оксалата аммони  при соотношении сырье - экстра- гент 1:20 при 20°С в течение 5 мин при измельчении и перемешивании, мацериро- вани  при 20°С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при 70°С в течение 30 мин, упаривани  экстракта до удельной массы 1,06-1,09, осаждени  целевого продукта из полученного экстракта 96%-ным этанолом в соотношении экстракт-этанол 1:3, фильтрации, промывки и сушки целевого продукта. За вленный способ обеспечивает увеличение выхода целевого продукта в 9,5 раз и повышение специфической активности (по сравнению с контролем активность ламинарида выше на 66,6%, а активность алыината аммони  - на 166,6%). 10 табл. Ьо С

Description

Изобретение относитс  к фармецевти- ческой промышленности и касаетс  получени  биологически активных веществ из растительного сырь .

Наиболее близким по технологии и биологическому - слабительному действию к альгинату аммони   вл етс  способ получени  суммы полисахаридов обволакивающего и м гчительного действи  из морской капусты (L, saccharina L.), лежащей в основе получени  препарата Ламинарид. Данный способ заключаетс  в экстракции Laminaria saccharina водой при 70-90°С в соотношении компонентов 1:30, далее полученный экстракт фильтруют, упаривают до 1 /5 первоначального объема, осаждают целевой продукт равным объемом спирта и выдерживают смесь 2 ч. Выпавший осадок полисахаридов отфильтровывают. Образовавшийс  осадок промывают ацетоном, затем 96%-ным спиртом и высушивают. Выход полисахаридов составл ет 3,3% к сырью.

Указанный способ характеризуетс  низким выходом целевого продукта за счет щад щего режима экстракции и недостаточного объема этанола, используемого дл  обработки экстракта (соотношение экс- тракт:этанол - 1:1), и низкой биологической активностью.

Цель изобретени  - повышение выхода и специфической активности целевого продукта .

Поставленна  цель достигаетс  тем, что согласно способу получени  альгината

СО

а ел о

ю

мони , обладающего слабительным действием , из беломорской ламинарии, представл ющего собою естественную смесь двух видов ламинарий (Laminaria saccharina et Laminaria digitata), осуществл ют путем промывки сырь  1%-ным раствором сол ной кислоты при 30°С в течение 1 ч, экстрагировани  сырь  1%-ным раствором оксалата аммони  при соотношении сырье:экстрагент 1:20 при 20°С в течение 5 мин, при измельчении и перемешивании, мацерируют при 20°С в течение 20 ч с последующим трехкратным экстрагированием при 70°С в течение 30 мин, упариванием экстракта до удельного веса 1,06-1,09, обработкой экстракта 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3, фильтрацией , промывкой и сушкой целевого продукта .

При использовании способа вихревой экстракции в мельэкстракторе одновременно осуществл ютс  два процесса: измельчение и экстракци , причем благодар  наличию двух пар ножей, расположенных горизонтально и под углом 45° к рабочей оси прибора, измельчение сырь  осуществл етс  в двух плоскост х - горизонтальной и под углом 45°, в результате чего происходит тонкое измельчение сырь  до 5 мм с разрывом клеточных стенок, что способствует дополнительно извлечению целевого продукта из клеточного сока, а следовательно , увеличению выхода продукта (табл. 1).

Кроме того, предварительна  промывка сырь  1%-ным раствором сол ной кислоты и использование в качестве экстрагента оксалата аммони  способствуют получению чистого альгината аммони , практически беззольного.

Наиболее важные свойства альгинатов, которые используютс  во многих отрасл х, следующие: загуститель, стабилизатор, об- разователь гел  и пленки.

Предлагаемый способ увеличивает выход целевого продукта в 9,5 раз дл  беломорской ламинарии и в 9,4 раза дл  дальневосточной ламинарии.

Анализ полученного альгината аммони  проводили качественно с помощью цветных реакций, по величине рН раствора альгината аммони , методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), по реакции выделени  аммиака, содержанию общей золы и количественно - методом обратного кислотно-основного титровани .

Результаты идентификации альгината аммони .

I. С помощью цветных реакций.

1.1 Реакци  Молиша. К 1 мл 0,5% водного раствора альгината аммони  добавл ли 2 капли спиртового раствора а-нафтола, затем по стенке пробирки и смеси осторожно приливали 1 мл концентрированной серной кислоты так, чтобы кислота не

смешивалась с водным слоем, По вление красно-фиолетового кольца на границе двух слоев указывало на присутствие углеводной группы.

1.2, Нафторезорционова  проба Толленса .

К 1 мл 0,5% водного раствора альгината аммони  добавл ли 1 мл 1 %-ного спиртового раствора нефторезорцина и такой же объем концентрированной сол ной кислоты.

Смесь осторожно нагревали до кипени  и кип тили 1 мин, затем охлаждали и взбалтывали с эфиром. Эфирный слой окрашивалс  в фиолетовый цвет, что свидетельствовало о наличии уроновых кислот.

II. По величине рН 0,5% водного раствора альгината аммони . Определ ли потен- циометрически: рН раствора составил 7,1.

III.Методы ТСХ.

После кислотного гидролиза альгината аммони  (100°С, 8 ч) уроновые кислоты раздел ли при двукратном хроматографирова- нии на слое, приготовленном из порошка целлюлозы марки MN 300. Система растворителей: изопропанол - пиридин -лед на  уксусна  кислота - вода (8:8:1:4). Про витель - нафторезорцин. Обнаружены 2 п тна с Rf 0,25 и Rf 0,18, которые в сравнении со свидетел ми идентифицированы как маннуронова  и гулуронова  кислоты, со- держащиес  в молекуле альгината аммони .

IV.По выделению аммиака.

К 0,2 г альгината аммони  добавл ют 10

капэль 20%-ного раствора едкого натра,

при этом выдел етс  газообразный аммиак,

окрашивающий синюю лакмусовую бумагу в

красный цвет.

V.По содержанию общей золы, %. Исследуемый альгинат аммони  содержит всего 0,04% золы, что свидетельствует о высокой чистоте целевого продукта.

VI.Количественное определение альгината аммони  проводили методом обратного титровани  раствором гидроксида

натри  избытка серной кислоты, оставшейс  после взаимодействи  ее с альгинатом аммони . Содержание альгината аммони  составило 87,12%.

Изучена зависимость выхода альгината аммони  от р да технологических параметров (табл. 2-7).

Зависимость температуры экстракции и выхода альгината аммони  представлена в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что при 20°С обеспечиваетс  наибольший выход альгината аммони .

Зависимость частоты перемешивани  сырь  и выхода альгината аммони  представлена в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что оптимальной частотой перемешивани  сырь   вл етс  8000 об/мин, так как при этом обеспечиваетс  максимальный выход альгината аммони .

Зависимость времени перемешивани  сырь  и выхода альгината аммони  представлена в табл. 4.

Из табл. 4 следует, что наиболее оптимальной продолжительностью перемешивани  сырь   вл етс  5 мин, при этом обеспечиваетс  максимальный выход альгината аммони .

Зависимость продолжительности мацерации и выхода альгината аммони  представлены в табл. 5.

Из табл. 5 следует, что оптимальна  продолжительность мацерации составл ет 20 ч, так как при этом обеспечиваетс  максимальный выход альгината аммони .

Результаты вли ни  соотношени  сырье:оксалат аммони  на выход альгината аммони  представлены в табл. 6.

Из табл. 6 следует, что оптимальным соотношением сырье: 1 %-ный раствор окса- лата аммони   вл етс  1:20, так как при этом обеспечиваетс  максимальный выход альгината аммони .

Результаты вли ни  соотношени  экстракт: 96%-ный этанол при осаждении целевого продукта на выход альгината аммони  предлагаемым способом представлены в табл. 7.

Из табл. 7 видно, что наиболее полное осаждение целевого продукта (34,15%) происходит при использовании соотношени  экстракт: 96%-ный этанол 1:3.

Дл  сравнени  изучено вли ние различных соотношений экстракт: 96%-ный этанол на выход ламинарида в способе, прин том за прототип.

Результаты вли ни  соотношени  экстракт: 96%-ный этанол при осаждении целевого продукта на выход ламинарида по способу-прототипу представлены в табл. 8.

Из табл. 8 следует, что в способе-прототипе наиболее оптимальное соотношение экстракт: 96%-ный этанол при осаждении ламинарида 1:3, а при соотношении 1:1 выход ламинарида  вл етс  низким.

П р и м е р 1. К 100 г беломорской водоросли (Laminaria saccharina и L. digitata) приливают 400 мл 1 %-ного раствора сол ной кислоты и выдерживают 1 ч при 30°С дл  освобождени  водорослей от растворимых минеральных и органических веществ . Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид- ионов (до отрицательной качественной реакции с нитратом серебра на хлорид-ион в промывных водах). Далее водоросли помещают в Мельэкстрактор, приливают 2 л 1 %-ного раствора оксалата аммони  и перемешивают в приборе при частоте переме0 шивани  8000 об/мин в течение 5 мин (при этом одновременно с измельчением сырь  происходит экстракци  оксалатом аммони ). Затем продолжают экстрагирование без перемешивани  в течение 20 ч при 20°С,

5 после чего смесь нагревают до 70°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (I) фильтруют сначала через марлю , затем - фильтровальную бумагу. И снова к оставшимс  водоросл м приливают

0 1 %-ный раствор оксалата аммони  в объеме 0,5 л, экстрагируют при 70°С в течение 30 мин, экстракт фильтруют через марлю, затем - фильтровальную бумагу, экстракт (II) соедин ют с экстрактом (I). Затем третий

5 раз провод т экстракцию при 70°С в течение 30 мин. Полученный третий экстракт соедин ют с первым и вторым. Объединенный экстракт упаривают под вакуумом при 50°С до сиропообразного состо ни  (удель0 ный вес 1,06-1,09). Из экстракта альгинат аммони  осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3, Осадок отдел ют фильтрованием через бумажный фильтр (красна  лента), промывают спир5 том, затем эфиром (до получени  бесцветного промывного спирта и эфира), сушат на воздухе.

Выход альгината аммони  составил 34,15%, т.е. 34,15 г из 100 г сырь .

0 Целевой продукт - альгинат аммони  - из беломорской ламинарии представл ет собой порошок бледно-желтого цвета, без запаха, слизистого вкуса. Медленно растворим в воде. Нерастворим в органических

5 растворител х: этанол, бензол, ацетон и др. Полученный альгинат аммони  практически не имеет зольности (0,04%). Продолжительность способа 1 сут.

Пример 2. К 100 г беломорской

0 ламинарии (L. saccharina et L digitata) приливают 400 мл 1 %-ного раствора сол ной кислоты и выдерживают 1 ч при 30°С. Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид-ионов. Далее

5 водоросли помещают в Мельэкстрактор, приливают 1 л 1 %-ного раствора оксалата аммони  и перемешивают при частоте перемешивани  6000 об/мин в течение 3 мин. Затем продолжают экстрагирование без перемешивани  втечение 15ч при 10°С, после

чего смесь нагревают до 70°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (I) фильтруют через марлю, затем через фильтровальную бумагу. К оставшимс  водоросл м снова приливают 0,5 л 1 %-ного раствора оксалата аммони , экстрагируют при 70°С в течение 30 мин. Второй экстракт фильтруют и аналогично провод т третью экстракцию (при 70°С в течение 30 мин). Объединенные экстракты упаривают под вакуумом при 50°С (до удельного веса экстракта 1,06-1,09), Из экстракта альгинат аммони  осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Осадок фильтруют через бумажный фильтр, промывают спиртом, эфиром, сушат на воздухе.

Выход алыината аммони  составил 32,74%, т.е. 32,74 г из 100 г сырь .

Пример 3. К 100 г беломорской водоросли (L. saccharina et L digitata) приливают 400 мл 1 %-ного раствора кислоты и выдерживают 1 ч при 30°С. Кислый экстракт сливают. Остаток водорослей промывают от следов хлорид-ионов. Далее водоросли помещают в Мельэкстрактор, приливают 3 л 1 %-ного раствора оксалата аммони  и перемешивают при частоте перемешивани  10000 об/мин в течение 7 мин, затем продолжают экстрагирование без перемешивани  в течение 25 ч при 30°С, после чего смесь нагревают до 70°С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Экстракт (I) фильтру ют через марлю, затем - через фильтровальную бумагу. К оставшимс  водоросл м снова приливают 0,5 л 1%-ного раствора оксалата аммони , экстрагируют при 70°С в течение 30 мин. Второй экстракт фильтруют и аналогично провод т третью экстракцию (при 70°С в течение 30 мин). Объединенные экстракты упаривают под вакуумом при 50°С (до удельного веса экстракта 1,06-1,09). Из экстракта альгинат аммони  осаждают 96%-ным этанолом в соотношении экстракт:этанол 1:3. Осадок фильтруют через бумажный фильтр, промывают спиртом, эфиром, сушат на воздухе.

Выход альгината аммони  составил 34,14%, т.е. 34,14 г на 100 г сырь .

Пример4(с использованием сырь , использующегос  в способе-прототипе). К 100 г Laminaria saccharina приливают400 мл

1%-ного раствора сол ной кислоты и далее поступают аналогично примеру 1.

Выход целевого продукта - альгината аммони  31,06%, т.е. 31,06 г из 100 г сырь .

Пример 5 (способ-прототип). 50 г слоевищ Laminaria saccharina измельчают на частицы размером примерно 0,5 см, помещают в коническую колбу вместимостью

2л, заливают 1,5 л дистиллированной воды.

Колбу с содержимым нагревают на кип щей вод ной бане, при этом температура смеси в колбе составл ет 85°С. Далее экстракт фильтруют через бумажный фильтр, упаривают до 1/5 первоначального объема (примерно 200 мл), осаждают целевой продукт 96%-ным этанолом в соотношении экс- тракт:этанол 1:1, выдерживают смесь 2 ч. Осадок фильтруют через бумажный фильтр,

0 затем промывают последовательно ацетоном , 96%-ным этанолом и сушат.

Выход полисахаридов составл ет 3,3%, т.е. 1,65 г из 50 г сырь .

Пример6(с использованием сырь ,

5 использующегос  в предлагаемом способе). 50 г слоевищ смеси ламинарий L. saccharina и L. digitata измельчают на частицы размером примерно 0,5 см, далее поступают аналогично примеру 5.

0Выход полисахаридов составл ет 3,6%,

т.е. 1,8 г из 50 г сырь .

Изучение острой токсичности альгината аммони , полученного из водорослей, проведено по методу Кербера на 36 белых мы5 шах массой 30-40 г при внутрибрюшинном введении вещества. Согласно методическим рекомендаци м Фармакологического комитета МЗ СССР (М., 1985) максимально допустимым количеством жидкости дл 

0 внутрибрюшинного введени  мышам массой 20-40 г  вл етс  1,0 мл. В этой св зи исследуемое вещество вводилось мышам из расчета 1000 мг/кг в объеме 1,0 мл. После одноразового введени  за состо нием жи5 вотных наблюдали 14дней. За врем  наблюдений гибели животных не отмечалось, что позвол ет определить дл  альгината аммони  SDso -1000 мг/кг.

Согласно классификации токсических

0 веществ исследуемое вещество следует отнести к группе малотоксичных веществ.

Слабительное действие альгината аммони , полученного из беломорских водорослей , проводилось в сопоставлении с

5 действием официального слабительного препарата ламинарида на белых мышах известными методами. В одном случае о слабительной активности веществ судили по величине пассажа (мм) по кишечнику с ис0 пользованием метки. Метка осуществл лась путем введени  зондом в желудок животного 5% взвеси активированого угл  за 20 мин до перорального введени  исследуемых веществ в дозе 200 мг/кг в обьеме

5 0,4 мл физиологического раствора. Животных забивали через 2 ч декапитированием и замер ли степень продвижени  метки (активированного угл ) вдоль кишечника. В других опытах о слабительном действии исследуемых веществ судили по величине дефекации животных (массе и консистенции фекалий), помещенных в специально дл  этих целей клетки. В этом случаеждивотным перорально вводились исследуемые вещества в дозе 200 мг/кг в объеме 0,4 мл физиологического раствора с последующим через 24 ч взвешиванием фекалий (г) и описанием их консистенции. В выборе дозы исследуемых веществ исходили из рекомендаций по применению официального сла- бильного препарата ламинарида. В контрольных опытах в соответствующем количестве вводилс  животным физиологический раствор. Результаты опытов обрабатывались методом вариационной статистики.

Как следует из табл. 8, величина пассажа по кишечнику при введении всех исследуемых веществ была выше, чем в контрольных опытах (на 44,8-50,4%, р 0,01). Причем наиболее выраженное увеличение пассажа наблюдалось в случае введени  альгината аммони  (на 50,4%, р 0,001), однако достоверного различи  по сравнению с эталоном сравнени  (ламинаридом) не отмечалось.

Слабительный эффект альгината аммони  получил подтверждение в опытах с определением величины дефекации (табл. 9). В этих опытах увеличение массы фекалий под вли нием приема альгината аммони  по сравнению с контролем достигало 166,6% (р 0,001) и статистически достоверно превосходило массу фекалий у животных, получавших ламинарид на 66,6%. Однако у животных, получавших альгинат аммони , фекалии становились кашицеобразными и даже жидкими.

Величина пассажа по кишечнику при введении альгината аммони  представлена в табл. 9.

Величина дефекации при введении альгината аммони  представлена в табл. 10.

Таким образом, полученные результаты экспериментов подтверждают, что исследованный альгинат аммони  обладает значительным слабительным действием, превосход щим аналогичный эффект официального слабительного препарата ламинарида . По типу своего действи  альгинат аммони  следует отнести к средствам, вызывающим увеличение объема и разжижение кишечного содержимого, хот  ему свойственно в определенной мере также

вызывать усиление перистальтики с увеличением пассажа содержимого по кишечнику .

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение целевого продукта,

обладающего выраженным слабильным действием, с высоким выходом, чистотой, с использованием в качестве сырь  помимо Laminaria saccharina и L digitata.

20

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ получени  полисахаридов, обладающих слабительным действием, путем промывки слоевища морской капусты, его

   экстракции, фильтрации экстракта, осаждени  из фильтрата целевого продукта 96%- ным этанолом, фильтрации, промывки осадка и его сушки, отличающийс  тем, что, с целью повышени  выхода и специфической активности, в качестве сырь  используют смесь слоевища Laminaria saccharina L и L. digitata, промывку сырь  осуществл ют 1%-ным раствором сол ной кислоты, а экстрагируют 1 %-ным раствором

   оксалата аммони  при соотношении сырье - экстрагент 1:20 в течение 5 мин. при одновременном измельчении и перемешивании сырь , далее сырье мацерируют в течение 20 ч с последующим двукратным экстрагированием 1%-ным раствором оксалата аммони  при 70°С в течение 30 мин, объединенные экстракты упаривают до удельного веса 1,06-1,09, а осаждение этанолом провод т при соотношении сырье этанол 1:3.

   Таблица 1

   Таблица 2

   Таблица 9

   Таблица 10