SU1727514A3

SU1727514A3 - Способ регенерации растений подсолнечника

Info

Publication number: SU1727514A3
Application number: SU874203619A
Authority: SU
Inventors: Фрейссине Жорж; Фрейссине Мартин
Original assignee: Рон-Пуленк Агрошими (Фирма)
Priority date: 1986-10-30
Filing date: 1987-10-29
Publication date: 1992-04-15
Also published as: EP0266287A1; ATE68317T1; HU200070B; NZ222330A; ES2025200B3; RO100219B1; KR880004738A; TR23032A; ZA878095B; TNSN87120A1; CS276396B6; DK566787D0; CN1019165B; PT86050A; US5017491A; MA21093A1; DK566787A; IL84231A0; YU198487A; JPS63129983A

Abstract

Изобретение относитс к биотехполо гии, о частности к выращиванию растений in vitro, а более конкретно к способу регенера- ции растений подсолнечника из незрелых зародышей путем соматического эмбриоге неза. Целью изобретени вл етс повыше ние выхода регенератов, а также повышение частоты образовани зон эм( рио- и морфогенеза. Способ предусматри вает получение из незрелых зародышей соматических эмбриоидов и последующую регенерацию из них побегов на модифици рованных средах Мурасиге-Скуга и дат, нейшее корнеобразование H.I модифицированной среде Гамборга Вг, Способ позвол ет получить массовую регенерацию растений подсолнечника. 3 з.п.Ф- лы, 1 табл. (Л С

Description

Изобретение относитс к биотехнологии , в частности к выращиванию растений in vitro, более конкретно оно относитс к способу регенерации растений подсолнечника из незрелых зародышей путем саматическо- го эмбриогенеза,

Известен р д работ по регенерации растений подсолнечника . Так, известно получение регенерантов из сегментов сол до- лей и гипотил , апексов побегов.

Недостатком данного способа вл етс невысокий выход регенератив при высокой трудоемкости культивировани /

Известен также способ регенерации побегов подсолнечника из незрелых зародышей.

Однако данный способ не о6еспечив;ип стабильного получени растений-регтт- рантов.

Известен способ получени регенерли тов подсолнечника из незрелых зародышей путем их предварительной эксплантации и получени из них фертильш ix растений.

Однако данный способ не позполнег получить массовую регенерацию растений ввиду низкого коэффициенту размножени при использовании данного метода

Цель изобретени повышение выхода регенерантов, а также пш чшеиие частоты образовани зон эмбриог - рфоге.неэа.

-ч

ю

vj (Л

GO

Поставленна цель достигаетс путем использовани трех последовательных этапов: первый этап образовани эмбриоген- ных каллусов из клеток или тканей путем культивировани в питательной индуцирую- щей среде, содержащей гормон; второй этап культивировани эмбриогенных каллусов дл их роста, из развити и их прораста- ни в среде, содержащей гормон; в известных случа х, третий этап, состо щий в культивировании, позвол ющем осуществл ть рост и развитие растений; два первых этапа осуществл ют в среде одной и той же природы и эта среда содержит гормон пито- кининового типа без гармона ауксина.

Растительные ткани, откуда можно извлекать эксплантаты дл продуцировани соматических зародышей, происход т из культиваторов подсолнечника Hellanthus annuus, используемых главным образом в программах селекции. В качестве примера использовали 8 культиваторов (сортов), НА 89, НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, РТ 26 и Giant Gray stripe Сорт НА 89 происходит от Dade Counts Флорида, сорта НА 290, НА 291. НА 300. НА 303, Т 76, и РТ 26 происход т от Scedtec International I he Калифорни , и Giant Gray stripede northrup Kind seeds Калифорни .

Эксплантаты происход т от растений, культивируемых в теплице и подвергнуты контролированному оплодотворению. Предпочтительным эксплантатом дл продуцировани каллуса вл етс недоразви- тый зародыш. Недоразвитые зародыши с околоплодниками выдел ют из головок подсолнечника , когда они имеют возраст 4-21 день, их размер обычно составл ет 0..1-5 мм. Недоразвитые зародыши значительно- го размера могут, быть разрезаны на несколько равных частей согласно плоскости, проход щей по оси перышка зародышевого корешка, что размножает число клонов , полученных из одного зародыша..

Спошб согласно изобретению осуществл етс следующим образом.

Сорта подсолнечника НА 89, НА 290, НА 291. НА 300. НА 303, Т 76, РТ26 и Giant Gray Stripe культивируют -в теплице (26°С, 40 000 лк, фотопериод 15 ч в 1 день) и подвергают контролируемому оплодотворению. Недоразвитые зародыши извлекают спуст 4-21 день после опылени . Отделенные от головок зерно стерилизуют путем погружени на 20 мин в раствор жавелевой воды с 3° CI, в который добавлено несколько капель смачивател , затем промывают 3 раза стерильной дистиллированной водой. Зародыши затем изолируют в асептических услови х, в известных случа х разрезают и помещают

в первую среду - среду индукции зародышей .

Эта перва среда включает минеральные соли, витамины, аминокислоты,сахарозу и гормон в количестве, достаточном дл . образовани каллуса. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли- гоэлементов. Макроэлементы, используемые в этой первой среде, могут быть выбраны, например, среди следующих соединений: сульфат магни , хлорид кальци , монофосфат кали , нитрат кали и нитрат аммони . Из солей на основе олигозлемен- тов можно назвать: борна кислота, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдан натри , сульфат меди (II),хлорид кобальта-, иодид кали и хелат желеэа-Ма-ЭЛТК. Эта комбинаци минеральных солей известна под названием Murashige и Skoog (MS).

Предпочтительные количества макроэлементов и олигоэлементов на. 1 л среды следующие, мг: 370 гептагидратированный сульфат магни , 440 дигидратированный хлорид кальци , 170 дигидративный моносульфат кали , 1900 нитрат кали , 1650 нитрат аммони , 6,2 борна кислота, 22,3 тетрагидратированный сульфат марганца, 8,6 гептагидратированный сульфат цинка, 0,25 дигидратированный молибдат натри . 0,025 пентагидратированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированкый хлорид кобальта , 0,83 иодид кали , 36,7 хелат железо- Na-ЭТЛК.

Перва среда содержит также витамины , такие как никотинова кислота, тиамин, пиридоксин, мио-инозитол, и аминокислоту, такую как аланин, глутамин, серии, триптофан , цистеин и предпочтительно глицин. Предпочтительными количествами витаминов и аминокислот на 1 л среды вл ютс , мг: 0,5 никотинова кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 100 мио-инозитола, 2 глицина.

Перва среда также может содержать добавку витамина и аминокислот. Эта добавка не вл етс необходимой дл образовани соматических зародышей, но она увеличивает их частоту. В этом случае предпочтительными количествами витаминов и аминокслот на 1 л среды вл ютс , мг: 0,5 никотинова кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина , 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 4000 мио- ниозитол, 1000 1-аланин, 800 1-глутамин, 160 1-серин, 50 триптофан, 10 1-цистеин; 2 глицин.

Сахароза, содержаща с в первой среде , имеетс в количестве 8-12%, предпочтительно 9%.

Гормон первой среды, выбор которого вл етс характеристикой изобретени пит& ининового типа, например кинетин или 6-бензиламинопурин, и предпочтительно последний. Обычно пригодны количества 0,5-1 мг на 1 л среды. Агар, Phytagar или Gelrite используетс дл создани твердой среды. Конечна концентраци 0,6% дл Phytagar или 0,3% дл Gelrite дает хорошие результаты. рН-значение среды может мен тьс от 5,0 до 6,3 в предпочтительно составл ет 5,0. .

Среду стерилизуют в автоклаве за исключением гормонов, которые стерилизуют путем фильтрации через микропористую мембрану.

Недоразвитые зародыши, выделенные как описано выше, помещают в эту первую среду, культивируют в течение около 2-3 недель в темноте при 26°С. В течение этого периода зиготические зародыши развиваютс и соматические зародыши по вл ютс на уровне гипокотил и на внутренней поверхности сем долей в случае культи&ара (сорта) ПА 291. Затем соматические зародыши могут быть изолированы и помещены во вторую среду-среду роста проростков. Эм- бриогенный каллус или выделенные зародыши культивируют во второй среде в течение 2-8 недель при 26°С и на свету (1500 лк) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. В течение этого периода зародыши прорастают и образовавшиес ростки развивают в известных случа х.корни.

Втора среда, как и перва , содержит минеральные соли, витамины/аминокислоту , сахарозу и гормон. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли- гоэлементов. Макроэлементы, олигоэле- менты, витамины и аминокислота те же, что и в первой среде, и идентичных концентраци х без добавлений. Сахароза имеетс в количестве предпочтительно ниже такого первой среды, например 2-4%, предпочтительно 3%.

Используемым гормоном вл етс ци- тонинин, предпочтительно идентичный или отличный от первой среды, предпочтительно 6-бензиламйнопурин. Обычно пригодны количества 0,1-0,5 мг на лист. Агар Phytagar или Gelrite используетс дл создани твердой среды. Конечна концентраци 0,6% дл Phytagar и 0,3% дл Gelrite дает хорошие результаты. Среду стерилизуют как и ранее, рН среды 5,0-6,8, предпочтительно рН 5,0.

Спуст 2-5 недели пребывани во второй среде, выделенные соматические зародыши прорастают и превращаютс в ростки 2-5 см. Ростки, которые развили корни, могут быть высажены в землю, стерильную

смесь торфа, вермикулита, тонкодисперсного песка (3:2:1), содержащуюс в горшках Jibbi. Горшки помещают в бак,. запоппем- ный влажным песком, и покрывают пролрач- 5 ным полиэтиленовым пакетом дл поддержани высокой степени влажности. Всю совокупность помещают в климатическую камеру с температурой 15°С (6000 л к) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпоч0 тительно 15 ч в 1 день. Спуст 10 дней растени помещают в более крупные горшки и культивируют в теплице при 26°С (40000 л к) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпоч- тител ьно 15 ч в 1 день.

5Растени , которые не развили корней,

могут быть привиты к молодым растени м, культивируемым в теплице, согласно классическому методу либо помещены на период 10-20 дней в среду дл укоренени или н

0 третью среду.

Треть среда включает минеральные соли , витамины и сахарозу. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли гоэлементов. Используемые в этой третьей

5 среде макроэлементы могут быть выбраны среди следующих соединений сульфат магни , хлорид кальци , мононатрийфосфат. нитрат кали и сульфат аммони . Среди солей на основе олигоэлейентов можно на

0 звать борную кислоту, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдат натри , сульфаг меди-(II), хлорид кобальта, иодид кали и хелат Fe-Na-ЭТЛК. Эта комбинаци миме ральных.солей известна под названием В

5 5. Предпочтительные количества макроэлс ментов и олигоэлементов на 1 литр среды следующие мг,: 250 гептагидратированный сульфат магни , 150 дигидратированный хлорид кальци , 169 моногидратированный

0 мононатрийфосфат, 3000 нитрат кали , 3 борна кислота, 13,2 тетрагидратирован- ный сульфат марганца, 2. гептагидратированный сульфат цинка,- 0,25 дигидратированный молибдат натри , 0,025

5 пентагидрэтированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта , 0,75 иодид кали , 40 хелатэ Fe-Na

эдтк.

Треть среда также содержит витамины.

0 Это никотинова кислота, тиамин, пиридок- син, и мио-инозитол. Предпочтительными количествами витаминов на 1 л среды вл ютс , мг: 1 никотиновой кислоты, 10 хлоргидрата тиамина, 1 хлоргидрата пиридоксина и 100

5 мио-инозитола.

Треть среда содержит также сахарозу и активированный уголь и/или гормон аук- синового типа. Сахароза имеетс , например , в количестве 1-2%. предпочтительно 1%, а активированный уголь в количестве

0,1 %. Если использовать гормон вместо активированного угл , то выбирают 3-индол- уксусную кислоту в дозах OJ-0.2 мг на 1л. Агар Phytagar или Gel rite. ИСПОЛЬЗУЮТ дл создани твердой среды . Конечна концентраци 0,5% дл Phytagar и 0,25% дл Gelrite достаточна . рН среды может измен тьс от 5.0 до 6.0 и предпочтительно составл ть 5,0. Среду стерилизуют в автоклаве.

Растени культивируют в этой среде в течение 2-3 недель при 26°С на свету (1500 л к) с фотопериодом Т2-Шв 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. Растени образуют корни и могут быть высажены в землю.

Полученные этим способом растени могут быть фенртипически отличными от исходного материала вследствие стресса ин витро. Растени опыл ют вручную и выдерживаютс вплоть до сбора сем н. Несколько единиц зерен сажают дл анализа новых растений подсолнечника и селекции возможных интересных мутантов, которых затем вовлекают в программу селекции разновидностей;

Пример 1, Приготовление маточных растворов

а.Маточный раствор В5. Маточный раствор В5, концентрированный дес тикратно, готов т растворением пакетика со средой В5 без сахарозы Flow Laboratories (содержит минеральные соли В5, 1 мгникотиновой кислоты, 1 мг пиридиксина - Н01, 10 Мл триамина. HCI и 100 мг инозитола. в конечных концентраци х) в 100 мл (конечный объем ) дистиллированной в деионизированной воды. Маточный раствор раздел ют на алик- воты по 100 мл и хран т при -20°С.

б.Маточный раствор ВАР. Раствор ВАР с 1 г/л готов т путем растворени 100. мг б-бензиламинопурина в нескольких мл 0,15 и HCI, слегка нагрева , и разбавлени 100 мл дистиллированной и деионизированной воды. Этот раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Mlnisart NML 0.2 микрона (Sartortus) перед его добавлением к первой и второй средам.

в.Маточный раствор А1 А. Раствор А1А с 0,2 г/л готов т растворением 20 мг 3-ин- дол-уксусной кислоты в нескольких миллиметрах чистого этанола и разбавлением 100 мл дистиллированной и деионизированной воды. Этот раствор стерилизуют фильтрацией через мембрану Mlnlsart NML 0,2 мкм (Sartorlus) перед добавлением к третьей среде.

г. Добавка витамина и аминокислот согласно Chandler и BEARD.

Исходный раствор витамина и аминокислот , двадцатикратно концентрированный , готов т растворением совокупности 30 г мио-инозетола 10 г L-аланина, 8 г L-глута- мина, 1,6 г L-серина, 0,5 L-триптофана и 0,1 г L-цистеина в 500 мл (конечный объем) дие- тиллированной и деионизированной воды. Исходный раствор раздел ют на аликвот- ныё части по 50 мл и хран т при -20°С . П р и м е р 2. Приготовление сред.

а.Перва среда или среда индукции за- родышей. Среду готов т растворением пектина со средой Murashlge и Skoog без сахарозы Flow Laboratories, содержит минеральные соли MS 0,1 мг тиамина, HCI 0,5 мг никотиновой кислоты, 0,5 мг пиридоксина.

HCI, 2 мг глицина и 100 мг инозитола и 90-120 г сахарозы в дистиллированной и деионизированной воде. После возможного добавлени 50 мл добавки витамина и аминокислот , рН довод т до 5,0 с помощью 0,1

н. раствора гидроксида натри , обьем довод т до 1 л и после добавлени 6. г Phytagar (Clbco) или 3 г Gelrite (Kelco) смесь выдерживают в автоклаве в течении 20 мин при 120 psi. Когда смесь остыла, в нее добавл ют

0,5-1 мл раствора ВАР (2,2-4,4 мкмоль), стерилизованного , как описано выше. Смесь затем выливают в чашки Петри.

б.Втора среда или среда роста проростков . Вторую среду готов т идентичным

первой среде образом, раствор совокупность пакетика со средой М, 30 г сахарозы и 6 г Phytagar или 3 г Gelrite в 1 л воды, добавл ют после выдерживани в автоклаве 0,1-0,5 мл стерильного раствора ВАР

(0,44-2,2 мкмоль). Среду выливают в чашки planteon (Flow Laboratories).

в.Треть среда или среда укоренени . Третью среду готов т добавлением 1020 г сахарозы на 100 мл исходного раствора

В5, в дистиллированной и деионизированной воде. рН довод т до 5,0 с помощью 0.1 н. раствора гидроксида натри , затем объем довод т до 1 л и добавл ют смесь 0,5 г Phytagar и 1 г алкированного .угл . После

прохождени автоклава, среду выливают в Mason jars. Если хот т использовать третью среду, содержащую А1А, то активированный уголь не употребл ют во врем приготовлени этой третьей среды. После

прохождени автоклава в остывшую среду добавл ют 0,5-1 мл стерильного раствора А1А (0,57-1,14 мкмоль). Среду выливают идентичным образом в Mason jars.

Жидкий вариант третьей среды включает только минеральные соли в 5 м 1 % сахарозы , при рН 5,0. Смесь распредел ют на фракции по 10 мл в стекл нные трубки, содержащие мостики из фильтровальной бумаги , согласно способу, описанному

CHANDLER и BEARD, затем выдерживают.в автоклаве.

П р и м е р 3. Недоразвитые зародыши с их околоплодниками отдел ют от головки подсолнечнике (Hellanthus annuus, разновидность Т76В), когда они достигают размера 0,5-1,5 мм. Зерна стерилизуют в течении 20 мин в растворе кавелевой воды в с 3° С и споласкивают дистиллированной водой. Недоразвитые зародыши отдел ют от их оболочек и помещают в чашки Петри на первую среду. Перва среда получена описанным образом, с 90 г/л сахарозы и 0.5 мг/л В АР (2,2 -мкмоль).:

Чашки Петри инкубируюг в темноте в течение 3 недель дл того, чтобы привести к образованию соматических зародышей.

В этой стадии, соматические зародыши, которые начали прорастать, отдел ют от зи- готического зародыша и помещают на вторую среду в чашки Planteon. Втора среда, приготовленна как описано выше, содержит 0,1 мг ВАР на 1 л или 0,44 мкмоль. Зародыши культивируют на свету в течение 3 недель и они дифференцируютс по росткам .

Ростки высотой 2-5 см затем перенос т на третью среду дл инициировани образованием корней. Треть среда, приготовленна как описано выше, содержит предпочтительно 10 г сахарозы. В случае застудневани среды добавка 1 г/л активированного угл удал ет остаточное вли ние ВАР, осуществл емое в предыдущей среде MAENE .И DEBERGH, Plant CEII Tissue Organ Culture и благопри тствует быстрому росту корней. Спуст примерно 2 недели ростки могут быть высажены в землю.

Если ростки начали развивать корни на второй среде, то они могут быть введены в контакт с третьей жидкой средой, согласно технике, описанной. CHNDLER и BEARD. Это устройство позвол ет значительно развивать корневую систему и избегать повреждени корней во врем высадки в землю.:

Пример 4. Недоразвитые зародыши HeJianthus annuus разновидность НА 89 отбирают , когда они достигают роста 0,1-0,5 мм, с эндоспермом на первую среду. Перва среда содержит 90г сахарозы и 0,5 мг ВАР на 1 литр или 2,2 мкмоль. Спуст 3 недели в темноте соматические зародыши изолируют и помещают на первую свежую среду все врем в темноте. Вторичные соматические зародыши образовываютс на изолированных зародышах. Спуст 3 недели пребывани в темноте вторичные соматические зародыши изолируют и помещают на вторую среду. Втора среда содержит 30 г харозы и 0,1 мг на 1 л (0,44 мкмоль).

Ростки, которые развиваютс . затем могут быть перенесены на третью сроду жид 5 кую или, подвергнутую засгуднепапию длч укоренени , затем будут пересажены н зем- лю.

Пример 5. Недоразвитые зародыши Helianthus annuus, разновидность НА 89 от 0 бирают спуст 21 день после опылени , они размер 5 мм. Их отдел ют от их оболочек и до внесени на первую среду разрс зают на четыре равные части продольно согласно двум перпендикул рным плоско 5 ст м между ними и параллельным оси перышка первичного корешки. В этом случае перва среда содержит.90 г сахарозы и 1мг ВАР на 1 л. Спуст 3 недели в темноте сома тические зародыши изолируют и помещают 0 на вторую среду. .Втора среда содержит 30 г сахарозы и 0,5 мг ВАР на 1 л.

Ростки, которые развиваютс , затем могут быть перенесены на третью среду (жидкую или подвергнутую застудневанию) дл 5 укоренени , затем высажены в землю. Ростки , которые не имеют корней, могут оыгь привиты к молодому растению согласно мо тоду,описанному HABEIMANN и WaLl.acn.

Примеры 6-27. Приведенные приме- 0 ры дают комбинации, которые можно осу ществл ть, использу различные описании : примеры.

Предлагаемый способ позвол ет получить массовую регенерацию растений под- 5 солнечника из незрелых зародышей путем соматического эмбриогенеза.

В таблице представлены результаты исследований действи способа на различных лини х подсолнечника. 0Формул а изобретени

1. Способ регенерации растений подсолнечника , включающий три последовательных этапа, при этом первый этап

5 предусматривает получение из эксплантоп эмбриогенных каллусов и соматических ом- бриоидов с последующим их ростом ил модифицированной питательной среде Мурасиге - Скуга, второй этап - формиропа0 ние проростков и развитие их в растени на модифицированной питательной среде Мурасиге - Скуга и третий этап - формирование и рост корней у полученных растений на питательной среде, содержащей источники

5 азота, фосфора, кали , углерода, микроэлементы , витамины и стимул торы роста, отличающийс тем, что, с целью повышени выхода регенерантов, в качестве эксплан- тов используют незрелые зародыши в возрасте от 4 до 21 дн размером 0,1-5 мм.

первый этап осуществл ют на питательной среде в присутствии 2,2- 4,4 моль/л 6-бензи- ламинопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты , 0.1 мг/л хлоргидрата тиамина, 0,5 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоино- зитола, 2 мг/л глицина.при содержании сахарозы 9-12%, второй этап осуществл ют в присутствии 0,44- 4,4 ммоль/л 6-бензила- минопурина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 0,1 мг/л хлоргидрата тиамина, 0,5 мг/л хлор- гидрата пиридоксина, 100 мг/л миокнозито- ла, 2 мг/л глицина, при содержании сахарозы 3%, третий этап осуществл ют на 1 мг/л модифицированной никотиновой кислоты , 10 мг/л хлоргидрата тиамина, 1 мг/л хлоргидрата пиридоксина, 100 мг/л миоино- зитола, 0,1-0,2 мг/л индолил-3-уксуской кислоты , при содержании сахарозы 1-2%, при этом после второго этапа полученные растени прививают,2. Способ по п. 1. j т л ичающийс тем, что, с целью поьышени

частоты образовани зон эмбрио-4 морфогенеза , на первом этапе в питательную среду дополнительно внос т 3900 мг/л

миоинозитола, 1000 мг/л L-эланида, 160

мг/л L-серина, 800 мг/л L-глутамина, 50

мг/л L-триптофана, 10 мг/л L-цистеина.

3.Способ по пп. 1 и 2, отличающи- и с тем, что используют линии подсолнечника Т 76, РТ26, НА 89, НА 291, Giant Gray Strlne.

4.Способ по пп. 1-3, отличаю щи й- с тем, что после второго этапа растени ,

имеющие корни, высаживают в землю и инкубируют в климатической камере при 15°С, интенсивности освещени 6000 лк с 15-часовым фотопериодом.

Claims

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к выращиванию растений In vitro, более конкретно оно относится к способу регенерации растений подсолнечника из незрелых зародышей путем соматического эмбриогенеза.

Известен ряд работ по регенерации растений подсолнечника . Так, известно получение регенерантов из сегментов солядолей и гипотиля, апексов побегов.

Недостатком данного способа является невысокий выход регенератив при высокой трудоемкости культивирования/

Известен также способ регенерации побегов подсолнечника из незрелых зародышей.

Однако данный способ не обеспечивает стабильного получения растений-регенерантов.

Известен способ получения ретоперли тов подсолнечника из незрелых зародышей путем их предварительной эксплантации и получения из них фертильных растений.

Однако данный способ не позволяет получить массовую регенерацию растений ввиду низкого коэффициента размножения при использовании данного метода.

Цель изобретения ·· повышение выхода регенерантов, а также повышение частоты образования зон эмбриотморфогенеза.

1727514 АЗ

Поставленная цель достигается путем использования трех последовательных этапов: первый этап образования эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивирования в питательной индуцирующей среде, содержащей гормон: второй этап культивирования эмбриогенных каллусов для их роста, из развития и их прорастания в среде, содержащей гормон: в известных случаях, третий этап, состоящий в культивировании, позволяющем осуществлять рост и развитие растений; два первых этапа осуществляют в среде одной и той же природы и эта среда содержит гормон питокининового типа без гармона ауксина.

Растительные ткани, откуда можно извлекать эксплантаты для продуцирования соматических зародышей, происходят из культиваторов подсолнечника Hellanthus annuus, используемых главным образом в программах селекции. В качестве примера использовали 8 культиваторов (сортов), НА 89, НА 290, НА 291, НА 300, НА 303. Т 76, РТ 26 и GiantGray stripe Сорт НА 89 происходит от Dade Counts Флорида, сорта НА 290, НА 291, НА 300, НА 303, Т 76, и РТ 26 происходят от Scedtec International I he Калифорния, и Giant Gray stripede northrup Kind seeds Калифорния.

Эксплантаты происходят от растений, культивируемых в теплице и подвергнуты контролированному оплодотворению. Предпочтительным эксплантатом для продуцирования каллуса является недоразвитый зародыш. Недоразвитые зародыши с околоплодниками выделяют из головок подсолнечника, когда они имеют возраст 4-21 день, их размер обычно составляет 0,1-5 мм. Недоразвитые зародыши значительного размера могут, быть разрезаны на несколько равных частей согласно плоскости, проходящей по оси перышка зародышевого корешка, что размножает число клонов , полученных из одного зародыша.

Спосо.6 согласно изобретению осуществляется следующим образом.

Сорта подсолнечника НА 89, НА 290, НА 291. НА 300, НА 303, Т 7б, РТ 26 и Giant Gray Stripe культивируют в теплице (26°С, 40 000 лк. фотопериод 15 ч в 1 день) и подвергают контролируемому оплодотворению. Недоразвитые зародыши извлекают спустя 4-21 день после опыления. Отделенные от головок зерно стерилизуют путем погружения на 20 мин в раствор жавелевой воды с 3° CI, в который добавлено несколько капель смачивателя. затем промывают 3 раза стерильной ’дистиллированной водой. Зародыши затем изолируют в асептических условиях, в известных случаях разрезают и помещают в первую среду - среду индукции зародышей.

Эта первая среда включает минеральные соли, витамины, аминокислоты,сахарозу и гормон в количестве, достаточном для. образования каллуса. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов. Макроэлементы, используемые в этой первой среде, могут быть выбраны, например, среди следующих соединений: сульфат магния, хлорид кальция, монофосфат калия, нитрат калия и нитрат аммония. Из солей на основе олигоэлементов можно назвать: борная кислота, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдан натрия, сульфат меди (II) .хлорид кобальта·, иодид калия и хелат железа-№-ЭЛТК. Эта комбинация минеральных солей известна под названием Murashige и Skoog (MS).

Предпочтительные количества макроэлементов и олигоэлементов на. 1 л среды следующие, мг: 370 гептагидратированный сульфат магния. 440 дигидратированный хлорид кальция, 170 дигидративный моносульфат калия, 1900 нитрат калия, 1650 нитрат аммония, 6,2 борная кислота, 22,3 тетрагидратированный сульфат марганца. 8,6 гептагидратированный сульфат цинка. 0,25 дигидратированный молибдат натрия. 0,025 пентагидрагированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,83 иодид калия. 36.7 хелат железоNa-ЭТЛК.

Первая среда содержит также витамины, такие как никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, мио-инозитол, и аминокислоту, такую как аланин, глутамин, серин, триптофан, цистеин и предпочтительно глицин. Предпочтительными количествами витаминов и аминокислот на 1 л среды являются, мг: 0,5 никотиновая кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 100 мио-инозитола, 2 глицина.

Первая среда также может содержать добавку витамина и аминокислот. Эта добавка не является необходимой для образования соматических зародышей, но она увеличивает их частоту. В этом случае предпочтительными количествами витаминов и аминокслот на 1 л среды являются , мг: 0,5 никотиновая кислота, 0,1 хлоргидрат тиамина, 0,5 хлоргидрат пиридоксина, 4000 миониозитол, 1000 1-аланин, 800 1-глутамин, 160 1-серин, 50 триптофан, 10 1-цисгеин; 2 глицин.

Сахароза, содержащаяся в первой среде, имеется в количестве 8-12%, предпочтительно 9%.

Гормон первой среды, выбор которого' является характеристикой изобретения 5

172751Ί.

питсхининового типа, например кинетин или 6-бензиламинопурин, и предпочтительно последний. Обычно пригодны количества 0,5-1 мг на 1 л среды. Агар. Phytagar или Gelrite используется для создания твердой 5 среды. Конечная концентрация 0,6% для Phytagar или 0,3% для Gelrite дает хорошие результаты. pH-значение среды может меняться от 5,0 до 6,3 в предпочтительно составляет 5,0. . 10

Среду стерилизуют в автоклаве за исключением гормонов, которые стерилизуют путем фильтрации через микропористую мембрану.

Недоразвитые зародыши, выделенные 15 как описано выше, помещают в эту первую среду, культивируют в течение около 2-3 недель в темноте при 26°С. В течение этого периода зиготические зародыши развиваются и соматические зародыши появляются 20 на уровне гипокотиля и на внутренней поверхности семядолей в случае культивара (сорта) ПА 29’1. Затем соматические зародыши могут быть изолированы и помещены во вторую среду-среду роста проростков. Эм- 25 бриогенный каллус или выделенные заро- ; дыши культивируют во второй среде в течение 2- 8 недель при 26°С и на свету (1500 лк) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. В течение 30 этого периода зародыши прорастают и образовавшиеся ростки развивают в известных случаях.корни.

Вторая среда, как и первая, содержит минеральные соли, витамины, аминокисло- 35 ту, сахарозу и гормон. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли олигоэлементов. Макроэлементы, олигоэлементы, витамины и аминокислота те же, что и в первой среде, и идентичных концентра- 40 циях без добавлений. Сахароза имеется в количестве предпочтительно ниже такого первой среды, например 2-4%, предпочтительно 3%.

Используемым гормоном является ци- 45 тонинин, предпочтительно идентичный или отличный от первой среды, предпочтительно 6-бензиламйнопурин. Обычно пригодны количества 0,1-0,5 мг на лист. Агар Phytagar или Gelrite используется для создания твер- 50 дой среды. Конечная концентрация 0,6% для Phytagar и 0,3% для Gelrite дает хорошие результаты. Среду стерилизуют как и ранее, pH среды 5,0-6,8, предпочтительно pH 5,0. 55

Спустя 2-5 недели пребывания во второй среде, выделенные соматические зародыши прорастают и превращаются в ростки
2-5 см. Ростки, которые развили корни, могут быть высажены в землю, стерильную смесь торфа, вермикулита, тонкодисперсного песка (3:2:1), содержащуюся в горшках Jibbi. Горшки помещают в бак, заполненный влажным песком, и покрывают прозрачным полиэтиленовым пакетом для поддержания высокой степени влажности. Всю совокупность помещают в климатическую камеру с температурой 15°С (6000 лк) с фотопериодом 12-16 ч в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день.
Спустя 10 дней растения помещают в более крупные горшки и культивируют в теплице при 26°С (40000 лк) с фотопериодом 12—16 ч в 1 день, предпочтительно 15 ч в 1 день. ·

Растения, которые не развили корней, могут быть привиты кмолодым растениям, культивируемым в теплице, согласно классическому методу либо помещены на период 10-20 дней в среду для укоренения или в третью среду.

Третья среда включает минеральные соли, витамины и сахарозу. Минеральные соли включают соли макроэлементов и соли оли гоэлементов. Используемые в этой третьей среде макроэлементы могут быть выбраны среди следующих соединений сульфат магния, хлорид кальция, мононатрийфосфат. нитрат калия и сульфат аммония.
Среди солей на основе олигоэле1йентов можно на звать борную кислоту, сульфат марганца, сульфат цинка, молибдат натрия, сульфа! меди- (II), хлорид кобальта, иодид калия и хелат Fe-Na-ЭТЛК. Эта комбинация мине ральных.солей известная под названием В
5. Предпочтительные количества макроэлс ментов и олигоэлементов на 1 литр среды следующие мг,: 250 гептагидратированный сульфат магния, 150 дигидратированный хлорид кальция, 169 моногидратированный мононатрийфосфат, 3000 нитрат калия, 3 борная кислота, 13,2 тетрагидратированный сульфат марганца, 2 гептагидратированный сульфат цинка,· 0.25 дигидратированный молибдат натрия, 0,025 пентагидратированный сульфат меди (II), 0,025 гексагидратированный хлорид кобальта, 0,75 иодид калия, 40 хелата Fe-Na ЭДТК.

Третья среда также содержит витамины. Это никотиновая кислота, тиамин, пиридоксин, и мио-инозитол. Предпочтительными количествами витаминов на 1 л среды являются, мг: Г никотиновой кислоты. 10 хлоргидрата тиамина, 1 хлоргидрата пиридоксина и 100 мио-инозитола.

Третья среда содержит также сахарозу и активированный уголь и/или гормон ауксинового типа. Сахароза имеется, например, в количестве 1-2%. предпочтительно 1%, а активированный уголь в количестве

0.1%. Если использовать гормон вместо активированного угля, то выбирают 3-индолуксусную кислоту в дозах 0,1-0,2 мг на 1л. Агар Phytagar или Gelrite. используют для создания твердой среды . Конечная концентрация 0,5% для Phytagar и 0,25% для Gelrite достаточная. pH среды может изменяться от 5,0 до 6,0 и предпочтительно составлять 5,0. Среду стерилизуют в автоклаве.

Растения культивируют в этой среде в течение 2-3 недель при 26°С на свету (1500 лк)с фотопериодом 12-16 в 1 день, предпочтительно 16 ч в 1 день. Растения образуют корни и могут быть высажены в землю.

Полученные этим способом растения могут быть фенотипически отличными от исходного материала вследствие стресса ин витро. Растения опыляют вручную и выдерживаются вплоть до сбора семян. Несколько единиц зерен сажают для анализа новых растений подсолнечника и селекции возможных интересных мутантов, которых затем вовлекают в программу селекции разновидностей;