PT86050B

PT86050B - Processo para a regeneracao do girassol mediante embriogenese

Info

Publication number: PT86050B
Application number: PT86050A
Authority: PT
Inventors: Georges Freyssinet; Martine Freyssinet
Original assignee: Rhone Poulenc Agrochimie
Priority date: 1986-10-30
Filing date: 1987-10-30
Publication date: 1990-08-31
Also published as: DK566787A; CN87107542A; US5017491A; DK566787D0; HU200070B; KR880004738A; IL84231A0; MA21093A1; RO100219B1; ES2025200B3; CA1308255C; PT86050A; ZA878095B; FR2605839A1; JPS63129983A; DE3773836D1; TR23032A; AU601774B2; EP0266287B1; TNSN87120A1

Description

A presente invenção diz respeito a um processo para a regeneração de plantas de girassol, a partir de células ou de tecidos, mediante embriogênese somática, A presen te invenção diz igualmente respeito às plantas e sementes de girassol produzidas por este método.

Ainda que se possa regenerar plantas a partir de células isoladas ou de tecidos de um grande número de espécies cultivadas, os esforços com o girassol (Helianthus annuus”) foram quase sempre inúteis. Alguns métodos relativos à regeneração do girassol mediante embriogenése somática encontram-se descritos na literatura, mas estes métodos dizem respeito apenas a raros genotipos, ou híbridos interespecíficos. Os explantes são cultivados em um primeiro meio que induz a formação de um calo. 0 calo ê em seguida transferido para um segundo meio que induz a formação de embriões somáticos e de plântulas. As plântulas são depois transferidas para um terceiro meio que induz a formação de raízes e, neste estádio, as plantas regeneradas podem ser

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passadas para a terra.

PATERSON e EVERETT (Plant Sei.”, 1985, 42, 125) afinaram um meio, optimização do meio de GEORGIEVA-TODOROVA e colab. (Proc. 9^th Int. Sunflower Conference, Torremolinos, Spain, 1980, 122) que induz a regeneração de uma espécie cultivada de girassol, SS 415 B, mediante embrio génese somática a partir de fragmentos de lipocótilos. Os explantes são cultivados na obscuridade durante duas semanas, depois à luz durante 2-4 semanas sobre um meio de Murashige e Skoog (MS) modificado, complementado com 40 mg/1 de adenina-sulfato 1 mg/1 de 6-benzilaminopurina (BAP), 1 mg/1 de ácido naftaleno-acético (ANA) e 0,1 mg/1 de giberclina (GA^). Durante as duas primeiras semanas tem lugar a formação de um calo friável, aparecendo depois à luz manchas verdes que se transformam em rebentos. Um estudo anatómico revela que estas manchas verdes são embriões somáticos semelhantes aos embriões zigéticos.

CHANDLER e JAN (Agronomy Abstr., 1983, 58) descrevem a regeneração do girassol a partir de embriões imaturos resultantes de cruzamentos interespecíficos. Os embriões imaturos (4 a 5 dias) são colocados sobre o meio de crescimento descrito por CHANDLER e BEARD para o salvamento de embriões (Crop. Sei., 1983, 23, 1004). Decorridas duas a três semanas, os embriões que cresceram são transferidos para diferentes formulações tendo por base 0 meio MS, com diferentes doses de auxina e de citocinina. A produção de plantas nestes meios segue diferentes vias e compreende a germinação directa ou a indução de calo seguida de organogê- 3 - C /

nese ou da embriogénese. Os melhores resultados são obtidos com concentrações de ácido indol-acético (AIA) e cinetina compreendidas entre 0 e 1 ppm· A vantagem deste sistema e a produção multiplica de clones a partir de um único embrião.

COOLEf e WILCOX (pedido de patente de invenção europeia N2 0172377) propuseram um processo aplicado a plantas de girassol HA 89 e RHA 274 compreendendo as três etapas descritas antes e efectuadas sobre três meios de cultura diferentes, contendo os meios de cultura das duas primeiras etapas necessariamente uma hormona do tipo auxímico. Contudo, este processo apresenta vários inconvenientes; por um lado ê aplicável a embriões de tamanho compreendido numa zona estreita (de 0,1 a 2 mm) logo com pouca maleabilidade, por outro lado necessita de uma troca de meio entre a primeira e a segunda etapa, finalmente a taxa de regeneração das plântulas obtida continua ainda muito insuficiente.

A presente invenção diz respeito a um processo para a regeneração de plantas de girassol, mais simples e conduzindo a plântuias de capacidade melhorada de retoma da cultura na terra.

Mais particularmente, diz respeiro a um processo para a regeneração de plantas de girassol a partir de embriões imaturos, compreendendo sucessivamente:

- uma primeira etapa de formação de calos embrio génicos a partir de células ou de tecidos mediante cultura em um meio nutritivo de indução contendo uma hormona;

ç

- uma segunda etapa de cultura dos calos embriogénicos para o seu crescimento, o seu desenvol vimento e a sua germinação em um meio contendo uma hormona;

- eventualmente uma terceira etapa consistindo em uma cultura permitindo o crescimento e o desenvolvimento de plantas;

caracterizado pelo facto de as duas primeiras etapas se efectuarem em um meio da mesma natureza e pelo facto de este meio conter uma quantidade eficaz de uma hormona do tipo da citocinina sem hormona auxínica.

No seguimento da presente memória descritiva as percentagens indicadas são, salvo indicação em contrário, expressas em peso volume.

Os tecidos vegetais de onde se pode retirar os '•explantes” para a produção de embriões somáticos são provenientes de plantas de girassol Helianthus annuus¹¹ utilizadas essencialmente nos programas de selecção.

A exemplificação faz-se com oito variedades:

HA 89, HA 290, HA 291, HA 300, HA 303, T 76,

RT 26 e Giant Gray Stripe. A variedade HA 89 provém de Dade Counts, Flórida, as variedades HA 290, HA 291, HA 300, HA 303, T 76 e R T26 de Seedtec Intemational Inc., Woodland, Califórnia e a Giant Gray Stripe de Northrup King Seeds, Fresno, Califórnia.

Os explantes” provêm de plantas cultivadas em estufa e submetidas a uma fecundação controlada. 0 explante” preferido para a produção de calos ê o embrião imaturo. Os embriões imaturos com pericarpos são isolados das inflorescências de girassol logo que eles tenham entre 4 e 21 diasj o seu tamanho está geralmente compreendido entre 0,1 e 5mm. Os embriões imaturos de tamanho importante podem ser cortados em várias partes iguais segundo, planos que passam pelo eixo gémulo radicular, o que multiplica o número de clones obtidos a partir de um único embrião.

processo de acordo com a presente invenção pode utilizar-se do seguinte modo:

Variedades de girassol HÁ 89, HA 290, HA 291, HA 300, HA 303, T 76, RT 26 e Giant Gray Stripe são cultivadas em estufa (26°C, 40 000 lux, fotoperlodo de 15 horas por dia) e submetidas a uma fecundação controlada. Colhem-se os embriões imaturos 4 a 21 dias após a polinização. As sementes separadas dos capítulos são esterilizadas mediante imersão durante 20 minutos em uma solução de água de javel comercial a 3°C1 adicionada de algumas gotas de um agente molhante; lavam-se depois 3 vezes com água destilada estéril. Isolam-se os embriões em seguida sob condições de assepsia, eventualmente cortados, e depositam-se sobre o primeiro meio dito de indução dos embriões.

Este primeiro meio compreende sais minerais, vitaminas, aminoácidos, sacarose e uma hormona em quantidade suficiente para a formação de calos. Os sais minerais compreendem sais dos macro-elementos e sais de oligo-elementos. Os macro-elementos utilizados neste primeiro meio podem escolher -se, por exemplo, entre os seguintes compostos: sulfato de

-* 6 —

ί * magnésio, cloreto de cálcio, fosfato monopotássio, nitrato de potássio e nitrato de amónio. Entre os sais à base de oligo-elementos pode-se citar: o ácido bórico, o sulfato de manganésio, o sulfato de zinco,o molibdato de sódio, o sulfa to cúprico, o cloreto de cobalto, o iodeto de potássio e o quelato de ferro Na EDTA. Esta combinação à base de sais minerais é conhecida sob o nome de Murashige e Skoog (MS).

As quantidades preferidas de macro-elementos e de oligo-elementos para um litro de meio são as seguintes:

- 370 mg de sulfato de magnésio heptahidratado,

-440 mg de cloreto de cálcio dihidratado,

- 170 mg de fosfato monopotássio dihidratado,

- 1900 mg de nitrato de potássio,

- 1,650 mg de nitrato de amónio,

6,2 mg de ácido bórico,

- 22,3 mg de sulfato de manganésio tetrahidratado,

- 8,6 mg de sulfato de zinco heptahidratado,

- 0,25 mg de molibdato de sédio dihidratado,

- 0,025 mg de sulfato cúprico pentahidratado,

- 0,025 mg de cloreto de cobalto hexahidratado,

- 0,83 mg de iodeto de potássio,

- 36,7 mg de quelato de ferro Na EDTA.

primeiro meio contêm também vitaminas tais 00-7 - / / *· mo o ácido nicotlnico, a tiamina, a piridoxina, o mio-inositol e um aminoácido tal como a alamina, glutamina, serina, triptofano, cisteína e, de preferência, a glirina. As quantidades preferidas de vitaminas e de ácido aminado para um litro de meio são:

- 0,5 mg de ácido nicotlnico,

- 0,1 mg de cloridrato de tiamina,

- 0,5 mg de cloridrato de piridoxina,

- 100 mg de mio-inositol,

- 2 mg de glicina.

primeiro meio pode igualmente conter um suplemento de vitamina e de aminoácido; este suplemento não ê indispensável para a formação de embriões somáticos, mas aumenta a sua frequência. Nesta eventualidade, as quantidades preferidas de vitaminas e de aminoácidos para um litro de meio serão:

- 0,5 mg de ácido nicotlnico,

- 0,1 mg de cloridrato de tiamina

- 0,5 mg de cloridrato de piridoxina

- 4000 mg de mio-inositol

- 1000 mg de L-alanina

- 800 mg de L·-glutamina

- 160 mg de L-serina

- 50 mg de L-triptofano

- 10 mg de L-cisteína

- 2 mg de glicina.

A sacarose contida no primeiro meio está presente â razão de 8 a 12%, de preferência 9%.

A hormona do primeiro meio, cuja escolha é uma caracteristica da presente invenção, ê do tipo citocinina, por exemplo a cinetina ou a 6-benzilaminopurina e de preferência esta última. São geralmente vantajosas quantidades compreendidas entre 0,5 e 1 mg por litro. Uma gelose tal como o Phytagar ou o Gelrite ê utilizada para tornar o meio sólido. Uma concentração final de 0,6% para o Phytagar ou de 0,3% para o Gelrite dá bons resultados. 0 pH do meio pode variar entre 5,0 e 6,3 e θ de preferência igual a 5,0.

meio é esterilizado em autoclave com excepção das hormonas que são esterilizadas mediante filtração sobre uma membrana microporosa.

Os embriões imaturos, isolados como jícfescreveu antes, depositados sobre este primeiro meio, são cultivados durante cerca de 2 a 3 semanas na obscuridade,a 26°C. Durante este período os embriões zigóticos desenvolvem-se e os embriões somáticos aparecem ao nível do hipocôtilo e sobre a fase interna dos catilédones no caso de se cultivar a variedade HA 291. Em seguida, os embriões somáticos podem ser isolados e depositados sobre o segundo meio, dito meio de crescimento das plântulas. Cultiva-se o calo embriogénico ou os embriões isolados sobre o segundo meio durante 2 a 3 semanas a 26°C à luz (1500 lux) com um fotoperíodo de 12 a

- 9 16 horas por dia, de preferência 16 horas por dia. Durante

este período, os embriões germinam e as plântulas formadas desenvolvem eventualmente raízes.

segundo meio contêm, tal como o primeiro meio, sais minerais, vitaminas, um aminoácido, sacarose e uma hormona. Os sais minerais compreendem sais de macro-elementos e sais dedligo-elementos. Os macro-elementos, os aligoelementos, as vitaminas e o aminoácido são as mesmos que no primeiro meio, em concentrações idênticas sem complemento. A sacarose encontra-se presente em uma quantidade de preferência inferior à do primeiro meio, por exemplo compreendida entre 2 e 4%, de preferência igual a 3%, A hormona utilizada é a citocinina, de preferência idêntica (mas podendo ser diferente) da do primeiro meio, de preferência a 6-benzilaminopurina. Geralmente, sao vantajosas quantidades compreendidas entre 0,1 e 0,5 mg par litro. Utiliza-se uma gelose tal como Phytagar ou Gelrite para tomar o meio sólido. Uma concentração final de 0,6% para o Phytagar e de 0,3% para o Gelrite dá bons resultados. Esteriliza-se o meio como anteriormente e a um pH compreendido entre 5»0 e 6,3, com preferência para um pH de 5,0.

Decorridas 2 a 3 semanas sobre o segundo meio, os embriões somáticos isolados germinam e transformam-se em plântulas de 2 a 5 cm. As plântulas que desenvolveram raízes podem passar para a terra, em uma mistura estéril de turfa, veimiculite, areia fina (3:2:1) contida em vasos Jiffy, colocam-se os vasos em um banco de areia húmida e cobrem-se com um saco de polietileno transparente para manter um grau

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i de humidade elevado. Coloca-se o conjunto em uma câmara climática a 15°C (6000 lux), com um fotoperíodo de 12 a 16 horas por dia, de preferência 15 horas por dia. Decorridos 10 dias, transferem-se as plantas para vasos maiores e cultivam-se na estufa a 26°C (40 000 lux), com um fotoperíodo de 12 a 16 horas por dia, de preferência 15 horas por dia.

As plantas que não desenvolveram raízes podem ser enxertadas em plantas jovens cultivadas em estufa de acordo com um método clássico (cf., por exemplo, HABERMANN e WALLACE, ”Amer. J. Bot.’·, 1958, 45, 479) ou ser transferidas por um período de 10 a 20 dias para um meio de enraizamento, ou terceiro meio.

terceiro meio compreende sais minerais, vitaminas e sacarose. Os sais minerais compreendem os sais de macro-elementos e sais de oligoelementos. Os macro-elementos utilizados neste terceiro meio podem ser escolhidos entre os seguintes compostos: sulfato de magnésio, cloreto de cálcio, fosfato monossódico, nitrato de potássio e sulfato de amónio. Entre os sais à base de oligoelementos, pode citar-se o ácido bórico, o sulfato de manganésio, o sulfato de zinco, o molibdato de sódio, o sulfato cúprico, o cloreto de cobalto, o iodeto de potássio e o quelato de ferro Ifa EDTA · Esta combinação de sais minerais ê conhecida sob o nome de B5· As quantidades preferidas de macro-elementos e de oligoelementos para um litro de meio são as seguintes:

- 250 mg de sulfato de magnésio heptahidratado,

- 150 mg de cloreto de cálcio dihidratado, /

- 169 mg de fosfato monossódico monohidratado,

- 3000 mg de nitrato de potássio,

- 3 mg de ácido bórico,

- 13,2 mg de sulfato de manganésio tetrahidratado,

- 2. mg de sulfato de zinco heptahidratado,

- 0,25 mg de molibdato de sódio dihidratado,

- 0,025 mg de sulfato cúprico pentahidratado,

- 0,025 mg de cloreto de cobalto hexahidratado,

- 0,75 mg de iodeto de potássio,

- 40 mg de quelato de ferro Na Ε0ΪΑ.

terceiro meio contêm igualmente vitaminas. Estas são 0 ácido nicotínico, a tiamina, a piridoxina e 0 mio-inositol. As quantidades preferidas de vitaminas são, para um litro de meio:

- 1 mg de ácido nicotínico,

- 10 mg de cloridrato de tiamina,

- 1 mg de cloridrato de piridoxina e,

- 100 mg de mio-inositol.

terceiro meio contêm igualmente sacarose e carvão activado/ou uma hormona do tipo auxínico. A sacarose encontra-se presente por exemplo à razão de 1 a 2%, de preferência 1%, e 0 carvão activado à razão de 0,1%. Se se pre-

ί ' ferir utilizar uma hormona em vez do carvão activado, escolher-se-á o ácido 3-indol-acético, em doses compreendidas entre 0,1 e 0,2 mg por litro. Utiliza-se uma gelose tal como Phytagar ou Gelrite para tornar o meio sólido. Uma concentração final de 0,5% para o Phytagar e de 0,25% para a Gelrite é suficiente. 0 pH do meio pode variar entre 5,0 e 6,0 e é de preferência igual a 5,0. 0 meio ê esterilizado em autoclave.

As plantas são cultivadas sobre este meio durante 2 a 3 semanas a 26°C à luz (1500 lux), com um fotoperíodo de 12 a 16 horas por dia, e de preferência 16 horas por dia. As plantas formam então raízes e podem ser transferidas para a terra.

As plantas obtidas por este processo podem ser fenotipicamente diferentes do material inicial, devido ao stress in vitro¹*. As plantas polimerizam-se à mão e conservam-se até à colheita das sementes. Algumas das sementes são plantadas para a análise das novas plantas de girassol e para a selecção de eventuais mutantes interessantes que são então integrados em um programa de selecção variável.

A presente invenção será descrita de maneira mais completa mas não limitativa nos exemplos que se seguem:

Exemplo I - Preparação das soluções-mães

a) Solução-mãe de B5

Prepara-se uma solução B5, 10 vezes concentrada dissolvendo um saquinho de meio B5 sem sacarose de Flow

- 13 Laboratories (contém os sais minerais do B5, 1 mg de ácido nicotlnico, 1 mg de piridoxina HC1, 10 mg de tiamina HC1 e 100 mg de inositol, concentrações finais) em 1000 ml (volume final) de água destilada e desionizada. Divide-se a solução mãe em alíquotas de 100 ml e conserva-se a -20°C.

b) Solução-mãe de BAP

Prepara-se a solução de BAP a 1 g/1 dissolvendo

100 mg de 6-benzilaminopurina em alguns ml de ácido clorídrixo 0,15N, aquecendo ligeiramente, e diluindo até 100 ml com água destilada e desionizada. Esteriliza-se esta solução mediante filtração sobre uma membrana Minisart NML 0,2 mícrom (Sartorius) antes da sua adição aos primeiro e segundo meios.

c) Solução-mãe de AIA

Prepara-se a solução de AIA a 0,2 g/1 dissolvendo 20 mg de ácido 3-indol-acético em alguns ml de etanol puro e diluindo até 100 ml com água destilada e desionizada. Esteriliza-se esta solução mediante filtração sobre uma membrana Minisart NML 0,2 mícrom (Sartorius) antes da sua adição ao terceiro meio.

d) Suplemento de vitamina e aminoácidos de acordo com Chandler e BEARD (crop. Sei.”, 1983, 23 1004)·

Prepara-se uma solução-mãe de vitamina e de aminoácidos, 20 vezes concentrada, dissolvendo conjuntamente g cLe mio-inositol, 10 g de L-alanina, 8 g de L-glutamina, 1,6 g de L-serina, 0,5 g de L-triptofano e 0,1 g de L-cistelna em 500 ml (volume final) de água destilada e desionizada. Dividiu-se a solução-mãe em partes alíquotas de 50 ml e conserva-se a -20°C.

Exemplo II - Preparação dos meios

a) Primeiro meio ou meio de indução dos embriões

Prepara-se mediante dissolução de um saquinho de meio de Murashige e Skoog sem sacarose de Plow Laboratories (contendo os sais minerais de MS, 0,1 mg de tiamina HC1, 0,5 mg de ácido nicotlnico, 0,5 mg de piridoxina HC1, 2 mg de glicina e 100 mg de inositol) e 90 a 120 g de sacarose em água destilada e desionizada. Após adição eventual de 50 ml do suplemento de vitamina e de aminoácidos, ajusta-se o pH a 5,0 com hidróxido de sódio O,1N, leva-se o volume a 1 litro e depois da adição de 6 g de Phytagar (Gibco) ou 3 g de Gelrite (Kelco), aquece-se a mistura no autoclave durante 20 minutos a 120 psi. Quando o meio arrefecer adiciona-se 0,5 a 1 ml da lâ solução e BAP (2,2 - 4,4 micromoles) esterilizada como se descreveu antes. Introduz-se depois a mistura em caixas de Petri.

b) Segundo meio ou meio de crescimento das plântuias

Prepara-se o segundo meio de modo idêntico ao primeiro meio, mediante dissolução de um saquinho de meio MS, 30 g de sacarose e 6 g de Phytagar ou 3 g de Gelrite em um litro de água, e adicionando, após passagem no autoclave,

- 15 0,1 a 0,5 ml da solução de BAP estéril (0,44 -2,2 micromoles). Despeja-se o meio em caixas de Plantcon. k?low Laboratories).

c) Terceiro meio ou meio de enraizamento

Prepara-se o terceiro meio mediante adição de 10 a 20/g de sacarose a 100 ml da solução-mãe de B5, em água destilada e desionizada. Ajusta-se o pH a 5,0 mediante adição de hidróxido de sódio O,1N, lava-se depois o volume a 1 litro e adiciona-se à mistura 5 g de Phytagar e 1 g de carvão activado. Depois da passagem pelo autoclave despeja-se o meio em jarros Mason. Se se desejar utilizar um terceiro meio contendo ΑΙΑ, o carvão activado é omitido quando da preparação deste terceiro meio. Depois da passagem pelo autoclave, adiciona-se ao meio momo 0,5 a 1 ml da solução de AIA (0,57 - 1,14 micromole) estéril. Despeja-se o meio de modo idêntico em jarros Mason.

Uma variante líquida do terceiro meio compreende unicamente os sais minerais do B5 e 1% de sacarose, a pH 5,0. Distribui-se a mistura por fracções de 10 ml em tubos de vidro contendo pontes de papel de filtro, de acordo com o método descrito por CHANDLER e BEARD (Crop. Sei., 19θ3, 23. 1004), e depois passa-se no autoclave.

Exemplo III

Os embriões imaturos coia seus pericarpos separam-se do capítulo de girassol (Helianthus annuus, var. T7ó B) quando atingem entre 0,5 e 1,5 mm. Esterilizam-se as

primeiro meio de acordo com a técnica descrita antes, com g/1 de sacarose e 0,5 mg/1 de BAP (2,2 micromoles).

Incuba-se as caixas de Pétri na obscuridade du rante 3 semanas para induzir a formação de cos senaram-se os embriões somáticos que começaram a germinar do sobre o segundo meio, em caixas de Plantcon. 0 segundo meio, preparedo de acordo com a técnica descrita antes, contêm

0,1 mg de BA? por litro, ou seja 0,44 micromole. Cultivam-se os embriões semanas e diferenciam-se as

Cli· plântulas cm de altura para o terceiro meio para iniciar a formação de raízes. 0 terceiro meio, preparado teriormente, contém mina rior

1985, ae raízes sobre o meio, podam colocar de acordo com a técnica descri

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ta por CHANDLER e BEARD (Crop. Sei. 1983, 2£, 1004). Este dispositivo permite um desenvolvimento importante do sistema de raízes e evita lesá-las quando da sua passagem para a terra.

Exemplo IV

Colhe-se os embriões imaturos de Helianthus annuus. var. HA 89, quando atingem 0,1 a 0,5 mm e depositam-se, com 0 endosperma, sobre 0 primeiro meio. 0 primeiro meio contêm 90 g de sacarose e 0,5 mg de 3 AP por litro, ou seja 2,2 micromoles. Depois de três semanas na obscuridade, isola-se os embriões somáticos e depositam-se sobre o primeiro meio recente, sempre na obscuridade. Embriões somáticos secundários vao formar-se sobre os embriões isolados. Decorridas 3 semanas na obscuridade, isolam-se os embriões somáticos secundários e depositam-se sobre o segundo meio. 0 segundo meio contém 30 g de sacarose e 0,1 mg de BAP por litro (0,44 micromole).

As plântulas que se desenvolverem poderão ser transferidas em seguida para o terceiro meio, liquido ou gelifiçado, para enraizarem. Em seguida serão passadas para a terra.

Exemplo V

Colhe-se os embriões imaturos de Helianthus annuus. var. HA 89, 21 dias depois da polimização; 0 seu tamanho é igual a 5 mm. Separam-se dos seus invólucros e cortam-se em quatro partes iguais, longitudinalmente, segun-18 /

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do dois planos perpendiculares entre si e paralelos ao eixo gêmula-radicula, antes de se depositarem sobre o primeiro meio. Neste caso, o primeiro meio contém 90 g de sacarose e 1 mg de BAP por litro. Depois de 3 semanas na obscuridade, isolam-se os embriões somáticos e depositam-se.

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Claims

1. - Processo para a regeneração de plantas de girassol Helianthus annuus mediante embriogénese somática a partir de células ou de tecidos compreendendo, sucessivamente:

- uma etapa de cultura de tecidos de girassol em um meio nutritivo de indução contendo uma hormona para a formação de calos embriogénicos e de embriões somáticos e para o crescimento dos referidos embriões;

- uma segunda etapa consistindo em uma cultura que permite a germinação dos ditos embriões e o seu desenvolvimento em plantas eventualmente providas de raízes, sobre um meio dito de crescimento das plântulas;

- eventualmente uma terceira etapa para o crescimento ou para a formação de raízes das ditas plantas sobre um meio dito de enraziamento;

caracterizado pelo facto de se realizarem as duas primeiras etapas sobre um meio da mesma natureza e de este meio conter uma quantidade eficaz de uma hormona do tipo citocinina, sem hormona auxínica.

2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os referidos tecidos serem embriões imaturos.

3. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo facto de se escolher a hormona no grupo que compreende a cinetina, a 6-benzil-aminopurina, a 2-isopentiladenina e a zeatina.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se utilizar a hormona 6-benzilaminopurina em concentrações compreendidas entre 0,1 e 8 micromoles nos 1q e 2q meios.

5. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de as concentrações de 6-benzilaminopurina estarem compreendidas entre 2,2 e 4,4 micromoles no primeiro meio e entre 0,44 e 4,4 micromoles no segundo meio.

6. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo facto de os dois primeiros meios conterem sucrose, em concentrações compreendidas entre 8 % e 12 % no primeiro meio e entre 2 % e 4 % no segundo meio.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de as concentrações de sucrose serem de 9 % no 1° meio e de 3 % no segundo meio.

8. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se utilizar como primeiro meio um meio do tipo Murashige e Skoog (MS).

9. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de se utilizar como primeiro meio um meio do tipo Murashige e Skoog (MS) contendo um suplemento em vitamina e ácidos aminados.

10. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo facto de o segundo meio conter sais minerais, vitamina e um aminoácido em quantidades idênticas às do primeiro meio não suplementado em vitaminas e em ácidos aminados .

11. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a

10, caracterizado pelo facto de se cultivar embriões imaturos com 4 a 21 dias e de tamanho compreendido entre 0,1 e 5 mm, e de se poder cortar os ditos embriões em vários fragmentos re-21- generáveis.

12, - Processo de acordo caracterizado pelo facto de se T 76, RT 26, HA 89, HA 290, HA Gray Stripe.

13. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, utilizar culturas das variedades 291, HA 300, HA 303 ou Giant com as reivindicações 1 e 12, caracterizado pelo facto de, após a segunda etapa, se colocar as plantas obtidas em cultura de indução de raízes.

14. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo facto de, após a segunda etapa, se transferir as plantas portadoras de raízes para terra e de se incubar em uma câmara climática a 15°C, com uma intensidade luminosa de 6000 lux e um fotoperíodo de 15 horas por dia.

15. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a

12, caracterizado pelo facto de, após a segunda etapa, se enxertar as plantas obtidas.

Lisboa, 30 de Outubro de 1987

O Aqente Oficial da ProDriedade Industrial

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Resumo

Processo para a regeneração do girassol mediante embriogénese

Descreve-se um processo para a regeneração de plantas a partir de embriões imaturos, caracterizado por compreender três etapas:

- formação de calos embriogénicos em um meio contendo uma hormona do tipo citocinina,