JPS6137029A - 胚形成および器官形成によるヒマワリの再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 〔発明の分野」 本発明は、胚形成および器官形成によって細胞または組
織培養からヒマワリ植物体を再生する方法に関する。さ
らにとりわけ、ヒマワリ植物体の細胞または組織を培養
してカルスを生成する。次いで、とのカルスを長期間に
わたり培養する。次いで、とのカルスを予備コンディシ
ヨニング培地で培養する。この予備コンディシヨニング
したカルスを培養して苗条を生成し、との苗条を培養し
て根を生成し、これによってヒマワリ植物体を生成する
。本発明は、本方法によって生成されるヒマワリの植物
体およびその種子にも関する。

〔従来技術の記載〕

従来の技術において、ヒマワリの再生を生ずるいくつか
の方法が述べられてきた。これらの方法はすべて器官形
成の使用を含んでいた。しかしながら、これらの方法は
、極めて有効というわけではないように思われ、また、
数個体の再生された植物体を形成するだけである。器官
形成において、植物体の部分を第１の培地で培養してカ
ルス形成を誘起する。次いで、カルスを第２培地へ移し
て苗条形成を誘起することができる。次いで、苗条を第
３培地へ移已て根形成を誘起Ｉ〜、この時点で再生した
苗木（植物体）を土壌へ移すことができる。

無効果の器官形成の一例は、サデュ（５ａｄｕ　）、（
１９７４年６月）に見い出すことができる。サデュは、
茎の髄組織を培養してカルスを形成し、これを分化させ
て苗木を形成することによるヒマワリの再生を報告し泥
。培地は再生の全工程を通じて同一のものであった。

カルスを形成しそして植物体に分化させるために用いた
培地は、１　ｐｐｍのホルモン、インドール酢酸（ＩＡ
Ａ　）ｆ含有する変成したホワイトの培地であった。こ
の変成ホワイト培地は培地ｌｌ中に下記の成分を含んで
いた。

以１″余白 ２　、４−−）クロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）は
、カルスの成長を促進するがカルスの分化は支持しない
ことが見い出された。０．１　ｐｐｍ０カイネチンの添
加により、カルスの成長は生じたが分化は生じなかった
。

チャンドラ−（Ｃｈａｎｄｌｅｒ）およびジャン（Ｊａ
ｎ）は、種間交雑種の未熟胚からのヒマワリの再生を述
べている。この未熟胚は、下記のチャンドラ−およびペ
アード（Ｂｅａｒｄ）によって述べられた成長培地で成
長させる。２〜３週間後、大きくなった胚を、通常はそ
れぞれ０．３ｐｐｍおよび１．０　ｐｐｍの濃度で用い
るＩＡＡおよびカイネチンを含有するＭＳ培地（ＭＳ無
機塩、ビタミンおよびシヨ糖）を含有するチー−ブヘ移
す。このチーープを光照射下に２８℃で培養してカルス
を生成し、次いで苗条を形成する。通常、苗条は、ホル
モンは含ま　′ないが０．２％活性炭を含むＭＳ培地へ
移して根形成を惹起する。次いで、この苗木を土壌へ移
す。

ヒートン（Ｈｅａｔｏｎ）は、栽培用ヒマワリ、ヘリア
ンタ冬　アンナス　エル−（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａ
ｎｎｕｍ　Ｌ、）の未熟胚からの再生を開示している。

この未熟胚を、ジブコ　ムラシダ　シュート−ティップ
　ルーティング　メディウム（Ｇｉｂｅｏ　Ｍｕｒａｍ
ｈｌｇｅＳｈｏｏｔ−Ｔｉｐ　Ｒｏｏｔｉｎｇ　Ｍｅｄ
ｌｕｍ）上にプレートした。３チのシヨ糖、０．３〜４
のＩＡＡおよび１．０号′ノのカイネチンを用いてカル
ス形成を誘起した。

胚を２週間暗所に保ち、次いで１日肖り１２時間゛　明
所に保った。５週間後、苗条がカルスに形成された。苗
木生成のために、この苗条を発根培地へ移した。

１０１．１１９頁（１９８１年）は、プロトプラストか
らのヒマワリへりアンタス　アンナスの苗条の再生を記
載している。プロトプラストをｖ−ＫＭ培地で培養して
カルスを形成し、とのカルスを低浸透圧培地へ移した。

この低浸透圧培地は、１５μＭ６−ベンジルアミノプリ
ン（ＢＡ）を有するＢ５培地を含んでいる。苗条はこの
培地で形成した。

ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）等、イン　ビト」−（ハＶ
ｌｔｒｏ）　９　、４６３頁（１９７４年）は、へりア
ンタス　アンナスにおけるカルスからの根の生成を記載
している。これは、植物組織を順次に３種の培地で培養
することによって実施された。第１の培地は、１■４の
α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ　）、ＩＷｌのカイネチン
および５ｍ９／ｌの２．４−Ｄを有するＭＳ基礎培地を
含んでいる。第２の培地は、０．５ｍ１ｌのカイネチン
および２ｍｇ／ｌ　ＩＡＡを有するＭＳ基礎培地を含ん
でいる。第３の培地は、０．０５Ｗｉｔのカイネチンお
よび０．　Ｉ　Ｔ９’ｌのＩＡＡを含んでいる。この方
法によっては、植物体全体は生成されなかった。

胚からヒマワリ植物体を生成するための方法がもう１つ
記載されている。この方法は、不和合性の種の交雑育種
から生ずる種子の休眠または胚の　′発育停止のだめに
、もとの植物体自体においては発育しない胚から植物体
を生成することに用途を見い出した。この方法は、胚培
養であり、チャン（Ｔｈｅ　５ｕｎｆ１ｏｖｒｅｒ）、
４５〜４７頁（１９８０年載されていた。この方法は、
胚を発育停止前に保膜し、次いで胚を成熟させ発芽させ
て植物体を形成することを含んでいる。

この方法において、若い胚を受粉の３〜７日後に単離し
た。これらの胚の直径は、通常０．１ｍ＋よシ小さかっ
た。これらの胚を、０．０５ｍｇ／ｌの濃度のオーキシ
ンα−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、Ｂ５塩、ビタミン、
アミノ酸および１２チシヨ糖を含んだ固形の成長培地上
にプレートした。１２チに代えて９チのシ璽糖を用いか
つＮＡＡに代えて１．　ＯＷｌのインドール酢酸（ＩＡ
Ａ）を用いた場合には、若い胚が胚の代わシに未分化の
カルスとして成長する傾向を有していることが見い出さ
れた。さらに、極めて若い胚も、この後者の培地で早ま
って発芽した。

１〜２週間後、大きくなった（直径２〜６ｍの）胚を、
胚を植物体に発芽させるだめの液体培地へ移した。この
大きくなる間、根形成および色素合成を開始する胚があ
った。胚は、植物体形成を達成する目的で子葉期まで成
熟させた。液体の発芽培地は、Ｂ５塩および１％７ｗ糖
を含んでいた。

胚が根および苗条を発生させた後、これを土壌に移植し
た。

本発明は、胚形成および器官形成を用いることによる、
ヒマワリ植物体を得るための、すなわち、ヒマワリを再
生するだめの常法の最初のものである。ヒマワリの植物
体および種子は本方法によって生成される。本方法から
得られるヒマワリ植物体は、体細胞クローンの（ｓｏｍ
ｏｃｌｏｎａｌ）変化の結果として出発の植物材料とは
異なっていることがある。本方法は、さらに、種々の選
択方法の使用を可能にして一層の変化を与えることにお
いても有用である。次いで、生成される植物体を、常用
の育株プログラムに用いることができる。

１ＲｔＪ＠（７）ｉ旧１１ 本発明は、ヒマワリの再生方法に、とシわけ、栽培用ヒ
マワリの品種、へりアンタス　アンナスの再生に関する
。本方法は胚形成および器官形成を用いる。本方法は、
誘起培地でヒマワリ植物体の組織からカルス形成を誘起
する工程、カルスを維持する工程、予備コンディシヨニ
ング培地でカルスを培養する工程、苗条形成培地で苗条
を形成する工程および根形成培地で根を形成する工程を
含んでいる。

さらにとりわけ、本方法は下記の（ａ）〜（＠）の工程
を含んでいる： （ａ）　　胚性のカルスの形成を確実にするに十分な量
のホルモン、無機塩、ビタミン、アミノ酸およびシヨ糖
を含む第１培地でヒマワリ植物体から得られた組織を培
養する； （ｂ）　　胚性のカルスを維持するに十分な量のホルモ
ン、無機塩、ビタミン、アミノ酸およびシヨ糖を含む維
持培地で前記カルスを任意に継代培養する、 （ｃ）　　前記カルスを予備コンディシヨニングするに
十分な量のホルモン、無機塩、ビタミン、アミノ酸およ
びシヨ糖を含む第２培地でカルスを継代培養する、 （ｄ）　　苗条形成を確実にするに十分な量のホルモン
、無機塩、ビタミンおよびシヨ糖を含む第３培地で前記
カルスを継代培養する、および（、）　　根形成を確実
にするに十分な量のホルモン、無機塩、ビタミンおよび
シヨ糖を含む第４培地で前記苗条を継代培養することに
よって、植物体を得る。

組織の供給源は、好ましくは、ヘリアンタスアンナス　
のＢＡ３００、ＲＨＡ　２７１　、およびＩ（Ａ８９栽
培品種の未熟胚である。第１、維持および第２培地は、
好ましくは、前掲のチャンドラ−およびペアードにより
記載のアミノ酸、ビタミンおよび変成り５無機塩を含ん
でいる。第３培地は、好ましくは、変成された、ヘンダ
ーソンに記載の、ＭＳ無機塩およびビタミンを含んでい
る。第４培地は、好ましくは、ＭＳ無機塩を含んでいる
。

好ましいホルモンは、第１培地においてけ２，４−Ｄお
よびアプシジン酸（ＡＢＡ）、維持培地においてはＡＢ
Ａ、第２培地においてはＢＡまたはＡＢＡおよびＢＡ、
第３培地においてはＩＡＡおよびカイネチン、および第
４培地においてはＩＡＡである。

ｉメｙ匡」り動ＩＬ虹・ 本発明は、胚形成および器官形成による、ヒマワリ、と
りわけ栽培用ヒマワリ　へりアンタス、アンナス　の再
生方法に関する。本方法において、胚性のカルスを形成
し、これを予備コンディシヨニングして組織培養から最
初に苗条を得、次いで根を得る。次いで、この植物体を
、成長して成熟するように、土壌に植える。本発明は、
本方法により得られたヒマワリ植物体およびこれらの植
物体から得られた種子にも関する。

通常、本方法は下記の（ａ）〜（ｅ）の工程を含んでい
る：（ａ）ヒマワリ植物体から得られた組織を第１培地
で培養して胚性のカルスを生成する、（ｂ）任意にカル
スを維持培地で培養して胚性のカルスを維持する、（Ｃ
）カルスを第２培地で培養してカルスを予備コンディシ
ヨニングする、（ｄ）予備コンディシヨニングしたカル
スを第３培地で培養して苗条を生成する、および（ｅ）
苗条を第４培地で培養して根を生成する。苗木が発育し
た後、これを土壌で成長させることができる。

カルスの生成に用いるに好ましい植物体組織は、未熟胚
である。胚が０．５〜２．０叫の範囲にあるとき、ヒマ
ワリの頭部から果皮を有する未熟胚全単離する。胚を漂
白剤で滅菌し滅菌水ですすぐ。この未熟胚を、果皮から
単離しで、以下第１培地と称する胚性カルス誘起培地に
プレートする。

培地は、カルス形成に十分量のホルモン、無機塩、ビタ
ミン、アミノ酸およびシヨ糖を含んでいる。無機塩は、
多量成分および少量成分を含んでいる。第１培地に用い
る多量成分は下記の化合物であることができる：硫酸マ
グネシウム、塩化カルシウム、リン酸一ナトリウム、硝
酸カリウムおよび硫酸アンモニウム。この培地に含まれ
ている少量成分は下記のものである：硼酸、硫酸マンガ
ン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム（■）、硫酸銅
（■）、塩化コバルト、ヨウ化カリウム、硫酸鉄（ＩＩ
’）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ニナト
リウム。この無機塩の組合せはＢ５無機塩として当業者
に公知である。第１培地において、Ｂ５無機塩は、培地
が標準のＢ５無機塩より少量の鉄、銅、ヨウ素およびＥ
ＤＴＡを含むように変成されている。

１ノの培地を調製するために用いる多量成分および少量
成分の好ましい量は次の通りである：硫酸マグネシウム
七水和物２５０■、塩化カルシウムニ水和物１５０■、
リン酸一す）　ＩＪウムー水和物１５０ｍ９、硝酸カリ
ウム２５００１Ｑ、硫酸アンモニウム１３４ｍ９、硼酸
３ｍ９、硫酸マンガン−水利物１０１ｎ９、硫酸亜鉛七
水和物２ｒｎ９、モリブデン酸ナトリウム（■）二水和
物０．２５■、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．００２５■
、塩化コバルト六水和物０．０２５■、ヨウ化カリウム
０．０７５■、硫酸鉄（ＩＩ）七水和物２．７８■、お
よびニナ）　ＩＪウム−ＥＤＴＡ　　３．７３　ｍ９゜ 第１培地はビタミンも含んでいる。用いるビタミンは、
ニコチン酸、チアミン、ピリドキシンおよびｍｙｏ−イ
ノシトールを含んでいる。ビタミンは、前掲のチャンド
ラ−およびペアードによって述べられている。１１の培
地を調製するために必要とされるビタミンの好ましい量
は次の通りである：ニコチン酸１■、チアミン塩酸塩１
０■、ピリドキシン塩酸塩１ｍ９およびｍｙｏ−イノシ
トール４０００〜。このビタミンの組合せ全チャンドラ
−のビタミンと称する。

第１培地はさらにアミノ酸を含んでいる。アミノ酸は次
のものである：アラニン、グルタミン、セリン、ドリフ
トファンおよびシスティン。これらのアミノ酸は、他に
指示のない限り、すべてＬ型のものである。アミノ酸は
、前掲のチャンドラ−およびペアードによって述べられ
ている。１１の培地を調製するために用いるアミノ酸の
好ましい量は次の通りである：アラニン１０００Ｔｎ９
、グルタミン８００■、セリン１６０■、トリゾトフＣ
２０） アン５０ｍ９、およびシスティン１０■。このアミノ酸
の組合せをチャンドラ−のアミノ酸と称する。

第１培地はシヨ糖およびホルモンも含んでいる。

シヨ糖は７％〜１４ｑ６の量で用いるが１２チが好まし
い。用いることができるホルモンは、ＡＢＡと２．４−
Ｄとの混合物であり、ＡＢＡ１．０〜７．０μＭおよび
２．４−０５．０〜１２．０μＭを用いる。好ましくは
、ＡＢＡ　５μＭおよび２．４−ＤＩＯμＭを用いる。

培地を凝固させるために寒天を用いる。

０．７％の最終濃度が十分に適切であることが見い出さ
れた。培地は５．５〜６．０のＰｌｌを有しており、５
．８の声が好ましい。

微孔質膜濾過によって滅菌されるビタミンおよびアミノ
酸以外のすべての成分をオートクレーブ処理することに
よって培地を滅菌する。

未熟胚を第１培地にプレートし暗所で約７〜１４日間培
養する。７〜１０日間の培養を行なうことが好ましい。

この期間中に、胚は脱分化してカルスを形成する。

胚を第１培地で培養した後、形成されたカルスを、任意
に、第２培地へ移す前に維持培地へ移してそこで継代培
養を行なうことができる。この工程を実施する場合、カ
ルスをこの培地で暗所において約２週間継代培養する。

カルスは、約２週間の間隔で移しかえることにより長期
間にわたりこの培地で継代培養することができる。

この維持培地は、胚性のカルスを維持するに十分量のホ
ルモン、無機塩、ビタミン、アミノ酸およびシヨ糖を含
んでいる。無機塩は多量元素と少量元素とを含んでいる
。この多量元素および少量元素は第１培地について記載
したものである。ビタミンおよびアミノ酸は第１培地に
ついて記載したものである。シヨ糖濃度は７−〜１４チ
であり、１２％が好ましい。ホルモンは好ましくはＡＢ
Ａであり、００５〜１．０μＭの楡で用いる。１μＭの
ＡＢＡを用いることが好ましい。培地を凝固させるため
に培地に寒天を添加する。０．７％の濃度が十分な濃度
である。培地は５．５〜６．０のＰＨを有しており、５
．８の−が好ましい。培地を前述した如くに滅菌する。

カルスを、２週間または所望の複数回のその間隔の間、
維持培地で培養した後、以下第２培地と称スる予備コン
ディシヨニング培地へ移しそこで継代培養する。カルス
を暗所において１〜２週間、好ましくは１週間この培地
で継代培養する。第１培地からのカルスを維持培地で培
養しない場合には、カルスを直接第２培地へ移す。

第２培地は、カルスを予備コンディシヨニングする量の
ホルモン、無機塩、ビタミン、アミノ酸およびシヨ糖を
含んでいる。無機塩、ビタミンおよびアミノ酸は、第１
培地について記載したものである。シヨ糖濃度は４チ〜
８チであり、６％が好ましい。ホルモンは、好ましくは
、０．５〜２．０μの量のＢＡまたはＡＢＡ　１．　Ｏ
〜４．０μＭおよびＢＡ０．５〜２．０μＭの混合物で
ある。ＡＢＡ　３μＭおよびＢＡＩμＭを用いることが
好ましい。培地を凝固させるために培地に寒天を加える
。０，７チが十分量であることが見い出された。培地は
５．６〜６．０の−を有しており、５．８が好ましい。

培地を前述したようにして滅菌する。

カルスを第２培地で培養した後、以下第３培地と称する
苗条形成培地へ移してそこで継代培養を行なう。カルス
を明所において２〜４週間第３培地で継代培養する。そ
の際、光照射時間を１日当り１２〜１６時間、好ましく
は１日当り１６時間とする。この継代培養の間、苗条が
カルスに形成される。

第３培地は、苗条形成に十分量のＩＡＡ、無機塩、ビタ
ミンおよびシヨ糖を含んでいる。無機塩は多量成分およ
び少量成分を含んでいる。第４培地に用いる多量成分は
次のものである：硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、
リン酸一カリウノ・、硝酸カリウムおよび硝酸アンモニ
ウム。この培地に含まれている少量成分は次のものであ
る：硼酸、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナト
リウム（■）、硫酸銅（■）、塩化コバルト、ヨウ化カ
リウム、硫酸鉄（ＩＩ）およびニナトリウム−ＥＤＴＡ
、この無機塩の組合わせは、ＭＳ無機塩として当業者に
公知である。

１１の培地を調製するために用いる多量成分および少量
成分の好ましい量は下記の通りである：硫酸マグネシウ
ム七水和物３７０■、塩化カルシウムニ水和物４４０■
、リン酸一カリウム１７０■、硝酸カリウム１９００ｍ
９、硝酸アンモニウム１６５０■、硼酸６，２■、硫酸
マンガン−水和物１６．９１１１ｐ、硫酸亜鉛七水和物
８．６１ｎ９、モリブデン酸す）　ＩＪウム（■）二水
和物０．２５■、硫酸銅（ＩＩ）五水和物０．０２５ｍ
９、塩化コバルト六水和物０．０２５■、ヨウ化カリウ
ム０．８３■、硫酸鉄（Ｉ［）七水和物２７．８■、お
よびニナ）　ＩＪウムーＥＤＴＡ３７．３■。

第３培地はさらにビタミンを含んでいる。この培地中に
存在しているビタミンは、チアミン、ピリドキシン、ｍ
ｙｏ−イノシトール、リボフラビン、ノ臂ントテン酸塩
、ｐ−アミノ安息香酸、ナイアシン、コリン、葉酸およ
びビオチンを含んでいる。

これらのビタミンは、前掲のヘンダーソン等によって述
べられたものである。１ノの培地を調製するために用い
るビタミンの好ましい量は次の通りである：チアミン塩
酸塩０．５１１１ｐ、ピリドキシン塩酸塩０．１　ＩＱ
、ｍｙｏ−イノシトール１００．５ｍ９、リボフラビン
０．０５■、パントテン酸カルシウム０．８■、ｐ−ア
ミノ安息香酸０．０５■、ナイアシン０．５■、コリン
塩酸塩０．ＩＴｖ、葉酸０．１■、およびビオチン０．
００５■。このビタミンの組合せはヘンダーソンのビタ
ミンと称されており、ここでＩｒ１１００Ｔｎ９／１以
上のｍｙｏ−イノシトールおよび０、４　ｍ９／１以上
のチアミン塩酸塩を含むように変成されている。

第３培地は、好ましくはＩＡＡおよびカイネチンの混合
物であるホルモンおよびシヨ糖も含んでいる。シヨ糖は
２％〜４チの量で用いるが、３チが好ましい。ＩＡＡは
０．３〜３．０μＭの菫で用い、カイネチンは０．５〜
９．０μＭの量で用いる。０，３μＭのＩＡＡおよび５
μＭのカイネチンを用いることが好ましい。培地に寒天
を加えて培地を凝固させる。

０．７−の濃度がこの目的に対し十分な濃度である。

培地は５．５〜６．０の−を有しているが、５．８の−
が好ましい。培地は前述のようにして滅菌する。

苗条が２ｃｎ＋の長さになったとき、これを第３培地か
ら第４培地へ移す。苗条が適当に伸長していなかった場
合または苗条が試験管内で花成を開始した場合には、そ
の苗条は、新たな第３培地かまたは（ａ）前述した量の
ｉＡおよび減量したカイネチン（通常、０，５〜４．５
μＭで２．０μＭが好ましい）を含む、もしくは（ｂ）
１５〜２５μＭのアデニン硫酸塩を含みかつＩＡＡを含
まない第３培地へ移すことができる。苗条は、以下第４
培地と称する固形の根形成培地で継代培養する。苗条は
この培地で明所において６〜１０日間継代培養する。そ
の際、光照射時間を１日当り１２〜１６時間、好ましく
は１日当り１６時間とする。

第４培地は、無機塩、ビタミン、シヨ糖およびホルモン
を含んでいる。無機塩は多量成分および少量成分を含ん
でいる。多量成分および少量成分は第３培地について述
べたものである。ビタミンはｍｙｏ−イノシトールおよ
びチアミンである。好ましくは、これらは１００■／ｌ
のｍｙｏ−イノシトールおよび０．４ｍｙ／ｌのチアミ
ン塩酸塩の量で存在している。シヨ糖濃度は２チ〜３チ
であるが、２チが好ましい。寒天を加えて培地を凝固さ
せる。

０．７チの濃度がこの目的に対（〜で十分な濃度である
。ホルモンは、好壕しくはＩＡＡであり、０．０５〜０
．５μＭの量で用いるが０１μＭの量が好ましい。第４
培地は、オートクレーブ処理によって滅菌する。この第
４培地は５．５〜６９．０のｐＨｋ有しているが、５．
８のＰＨが好ましい。

第４培地で５〜１４日間培養した後、苗木を土壌および
温室に移すことができる。これは、通常、苗木を高湿度
室内に含まれている十分に湿った土壌に移すことにより
達成される。苗木を苗立ちさせた後、これを高湿度室か
ら移して土壌に移植し、成長させて成熟させる。この成
熟植物体によって種子がつくられる。

前記方法は、多くの栽培用ヒマワリの品種の組織から苗
木を再生させるのに有効である。本方法は、へりアンタ
ス　アンナス　の栽培品ｆｆｆｉＨＡ８９、ＨＡ３００
およびＲＨＡ２７１から苗木を再生するのにとりわけ有
効である。

本発明を、以下の限定的でない実施例に言及することに
よってさらに述べる。材料を明所において培養する場合
、他に指示のない限りは、１日当りの照射時間１６時間
および２５℃〜２９℃の温度において光の照射を行なう
ことを意味するものと理解されたい。

瀘衾狙 〔実施例１〕 貯蔵溶液の調製 １、無機塩 Ａ、変成り５ 下記の成分を１０００１ｎｌの蒸留した脱イオン水中に
溶解することによって、１０Ｘの変成り５無機塩貯蔵溶
液を調製した。

以下シｊ、白 この貯蔵溶液を１００−アリコートに分けた。

チャンドラ−のビタミンおよびアミノ酸の４０Ｘの貯蔵
溶液を調製した。５００−の蒸留した脱イオン水中に下
記の成分を溶解することによってこの貯蔵溶液を調製し
た。

成分　　重量（ロ）　成分　　重量Ｇ）ニコチン酸　　
　　０．０２　グルタミン　　１６チアミン・ＨＣｌ　
　　０．２セリン　　　　３．２ピリドキシン・ＨＣｌ
　　　　０．０２）リプトファン　　　　１．０ｍｙｏ
−イノシトール　　８０　　　　システィン　　　０．
２アラニン　　　　２０ この溶液は、培地に添加する前に、０．２μのｒルマン
（Ｇ・１ｍａｎ）　濾過器を用いた膜ヂ過によって滅菌
した。

２００−の蒸留した脱イオン水中に下記の成分を溶解す
ることによってヘンダーソンのビタミン（未変成）の１
００ＯＸの貯蔵溶液を調製した。

チアミン・ＨＣｌ　　　　２０　　　ｐ−アミノピリド
キシン・ＨＣｌ　　　　　２０　　　安息香酸　　　　
１゜ｍｙｏ−イノシトール　　　１００　　　ナイアシ
ン　　　１００リボフラビン　　　　１０　　　コリン
・ＨＣｌ　　　２０ＣＩＬ／臂ントテン酸塩　　　１６
０　　　　葉酸　　　　　　　２゜ビオチン　　　　１ この溶液は、前述の如くに使用前に膜濾過によって滅菌
した。

３、　ホルモン Ａ、　　２ｓｉｕ）ＩＭＫＯＨ中１ｃ２　、４−　Ｄ　
０．１１．０５ｇを溶解しそして蒸留した脱イオン水を
用いて５００７！まで稀釈することによって２．４−Ｄ
の１ｍＭ貯蔵溶液を調製した。

Ｂ、２ｍｌのＩＭＫＯＨ中にＩＡＡ　０．０８７６、ｌ
ｉｔを溶解しそして蒸留した脱イオン水を用いて２５０
−まで稀釈することによってＩＡＡの２ｍＭ貯蔵溶液を
調製した。

Ｃ，２−のＩＭＨＣｚ中にカイネチン０．ｉｏｓｇを溶
解しそして蒸留した脱イオン水を用いて５００ｇｇｔで
稀釈することによってカイネチンの１　ｍＭ貯蔵溶液を
調製した。

０、　２−のＩ　Ｍ　ＫＯＨ中にＡＢＡ　０．１３２ｇ
を溶解しそして蒸留した脱イオン水を用いて５００−ま
で稀釈することによってＡＢＡの１ｍＭ貯蔵溶液を調製
した。

Ｌ　　２−のＩ　Ｍ　ＨＣｚ中にＢＡ０．１１３ｇを溶
解しそして蒸留した脱イオン水を用いて５００−まで稀
釈することによってＢＡの１ｍＭ貯蔵溶液を調製した。

Ｆ、蒸留した脱イオン水１００ｍ中にアデニン硫酸塩１
００ｒｎ９を溶解することによってアデニン硫酸塩の１
１−貯蔵溶液を調製した。

〔実施例２〕 培地の調製 人、第１培地すなわちカルス誘起培地 前記の変成り５貯蔵溶液１００−に２　、４−Ｄ貯蔵溶
液１０ｍ／、ＡＢＡ貯蔵溶液５−、シ冒糖１２０ｇおよ
び寒天７ｇを加え、そして蒸留した脱イオン水を用いて
容量を９７５−にすることによって第１培地を調製した
。声をＩＭＫＯＨを用いて５．８に調整し、この混合物
を１５分間８．４４　ｋｌ？／ｚ２（１２０プサイ）で
オートクレーブ処理した。前述のように滅菌したチャン
ドラ−のビタミンおよびアミノ酸貯蔵溶液２５ｆｎｌを
、冷却培地に加え、次いでこれをベトリ皿に注いだ。

種々の濃度の２．４−ＤおよびＡ、ＢＡを有する第１培
地を調製するだめに、適量の２．４−ＤおよびＡＢＡ貯
蔵溶液を用いた。例えば１０μＭの２．４−〇および５
μＭのＡＢＡに代えて５μＭの２．４−Ｄおよび１μＭ
のＡＢＡを有する第１培地を調製するために、２．４−
Ｄの貯蔵溶液５　ｍｅおよびＡＢＡの貯蔵溶液１　ｍｅ
を用いた。

Ｂ、カルス維持培地 前記の変成り５貯蔵溶液１００−にＡＢＡ貯蔵溶液１．
、Ｉｅ１シヨ糖１２０ｇおよび寒天７ｇを加え、そして
蒸留した脱イオン水を用いて容量を９７５ｍ１にするこ
とによって維持培地を調製した。−をＩＭＫＯＨを用い
て５．８に調整し、この混合物を１５分間８．４４　ｋ
ｌ？Ａｒ＋＋２（１２０ゾサイ）でオートクレーブ処理
した。前述のように膜沖過によって滅菌したチャンドラ
−のビタミンおよびアミノ酸貯蔵溶液２５−を冷却培地
に加え、次いでこれをベトリ皿に注いだ。

種々の濃度のＡＢＡを有する維持培地を調製するため、
適量のＡＢＡ貯蔵溶液を前述した方法で用いた。

Ｃ６第２培地すなわちカルス予備コンディシヨニング培
地 前記の変成り５貯蔵溶液１００−にＡＢＡ貯蔵溶液３−
１ＢＡ貯蔵溶液１−、シ璽糖６ｏｇおよび寒天７ｇを加
え、そして蒸留した脱イオン水を用いて容量を９７５艷
にすることによって第２培地を調製した。ＩＭＫＯＨを
用いて−を５．８に調整し、この混合物を１５分間８．
４４　ｋｇ／ｃｍ２（１２０プサイ）でオートクレーブ
処理した。前述の如くに膜濾過によって滅菌したチャン
ドラ−のビタミンおよびアミノ酸貯蔵溶液２５−を冷却
培地に加え、次いでこれをベトリ皿に注いだ。

種々の濃度のＡＢＡおよびＢＡを有する第２培地を調製
するために、前述した方法で適量のＡＢＡおよびＢＡ貯
蔵溶液を用いた。

Ｄ、第３培地すなわち苗条形成培地 シヨ糖を含まない粉末ムラシダ最小有機質培地（ジブコ
　ラボラトリーズ（Ｇｉｂｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）社から入手；ＭＳ無機塩、ｍｙｏ−イノシトール
１００１ｎ？およびチアミン塩酸塩０．４ｍ９含有）１
パンク、シヨ糖３０９および寒天７ｇを蒸留した脱イオ
ン水５００−中に溶解することによって第３培地を調製
した。次いで、ＩＡＡ貯蔵溶液０．０５ｔｄおよびカイ
ネチン貯蔵溶液５−を加え、蒸留した脱イオン水を用い
て容量を９９９−にした。ＩＭＫＯＨを用いて声を５．
８に調整し、この混合物を１５分間８．４４　ｋｇ／ｃ
ｍ２（１２０７’サイ）でオートクレーブ処理した。前
述の如くに滅菌したヘンダーソンのビタミン貯蔵溶液１
１ｎｌを冷却培地に加えた。

次いで、この混合物をペトリ皿に注いだ。

前述した方法を用いて、種々のＩＡＡおよびカイネチン
濃度を有する第３培地を調製した。

ＬＡＡおよびカイネチンに代えてアデニン硫酸塩を含む
第３培地を調製するために、工ＡＡおよびカイネチン貯
蔵溶液に代えて所望量のアデニン硫酸塩貯蔵溶液を加え
た。例えば、２２μＭのアデニン硫酸塩を有するこの培
地を調製するために、４ｍのアデニン硫酸塩貯蔵溶液を
用いた。

Ｅ、第４培地すなわち根形成培地 シヨ糖を含まない粉末ムラシゲ最小有機質培地１パツク
、シ冒糖２０９および寒天７ｇを蒸留した脱イオン水１
００〇−中に溶解することによって第４培地を調製した
。次いで、ＩＡＡ貯蔵溶液０．０５−を加えた。ＩＭＫ
ＯＨを用いて声を５．８に調整した。この混合物を１５
分間８．４４　ｋｇ／ａｍ２（１２０プサイ）でオート
クレーブ処理した。この冷却培地をベトリ皿に注いだ。

種々のＩＡＡ濃度を有する第４培地を調製するために、
前述の如くに適量の貯蔵溶液を加えた。

〔実施例３〕 ヒマワリ再生 果皮を有する未熟胚を、それが０．５〜２ｍの大きさに
なったとき、ヒマワリ　へりアンタス　アンナス栽培品
種ＲＨＡ２７１の頭部から単離した。ＲＨＡ　２７１は
シダコ　リサーチ社（Ｓｉｇｃｏ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋
　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）から入手した。果皮を有
する胚を２０％漂白溶液を用いて１０分間滅菌した。次
いで、これを滅菌水ですすいだ。果皮、胚乳および胚の
うから未熟胚を分離し、これをベトリ皿に含まれている
第１培地上にプレートした。第１培地は、１０μＭの２
．４−Ｄおよび５μＭのＡＢＡを用いて、先行する実施
例に述べたようにして調製した。Ｋ）　ＩＪ皿を暗所に
置き、１０日間培養してカルスを形成した。

この時点で、各カルスを、１μＭのＡＢＡを用いて前述
した如くに調製ｌ〜だ、同様にペトリ皿に含まれている
維持培地に移した。カルスを、この培地で暗所において
１０日間培養した。

次いで、各カルスを第２培地へ移した。第２培地は、３
μＭのＡＢＡおよび１μＭのＢＡを用いて、実施例２に
記載の如くに調製した。カルスを、この培地で暗所にお
いて１０日間培養した。

この時点で、各カルスを０．３μＭのＩＡＡおよび５μ
Ｍのカイネチンを用いて前述した如くに調製した、同様
にペトリ皿に含まれている第３培地へ移した。カルスを
この培地で明所において１４日間培養した。カルスは分
化して苗条を形成した。

次いで長さ２ｃｍの苗条を、同様にペトリ皿に含まれて
いる第４培地へ移した。第４培地は、０．１μＭのＩＡ
Ａを用いて前述の如くに調製した。苗条をこの培地で明
所において９日間培養した。この期間中に、苗条は根を
形成した。２ｃｒｎの長さに満たなかったまたは試験管
内で化成を開始した苗条は、０．３μＭのＩＡＡおよび
２μＭのカイネチンを含む新たな第３培地に移し、そし
て第４培地へ移す前８日間にわたり明所で培養した。

９日後、苗木を温室内の土壌へ移した。苗木を立方形状
物（ｃｕｂｅ）に植え、そして土を十分に湿らせた。立
方形状物を発汗箱内に置き、別の発汗箱で覆いをして高
湿度環境を維持した。土壌を５日間十分に湿った状態に
保った後、苗木を３０５ａｍ　（１２インチ）のポット
へ移した。ピントに、毎週３回水をやり、１０日毎に肥
料をやった。植物を人工受粉させ、種子が成熟するまで
植物体を維持した。次いで、種子を収穫し、今後の使用
に保存した。１本の再生体から収穫した種子を植え、発
芽させてヒマワリ植物体をつくった。

〔実施例４〜１８〕 前記方法は、本質的に、培養期間において種々の栽培品
種および種々のホルモン濃度を用いる所定の変化を伴っ
ている。ヘリアンタ乙　アンナス栽培品種ＨＡ８９およ
びＨＡ３００はシダコ　リサーチ社から入手した。

以下余白 数個体のＨＡ８９再生体から得た所定量の種子を植え、
発芽させヒマワリ植物体をつくった。

本発明を、その特定の態様に関して述べてきたが、一層
の変形を行ない得ることが理解されるであろう。本願は
、一般的に本発明の原理に従う本発明の任童の変化、使
用または適用を包含し、そして本発明が属する技術分野
における公知および通例の実施に入いるような本開示か
らの発展を含めることを意図するものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、胚形成および器官形成によつて細胞または組織培養
   からヒマワリ植物体を再生する方法であつて、下記の（
   ａ）〜（ｄ）の工程： （ａ）カルスの形成を確実にするに十分な量のＡＢＡと
   ２，４−Ｄとの混合物、無機塩、ビタミン、アミノ酸お
   よびシヨ糖を含有する第１培地で、ヒマワリ植物体から
   得られた組織を培養する工程； （ｂ）カルスの予備コンデイシヨニングを確実にするに
   十分な量のＡＢＡとＢＡとの混合物またはＢＡ、無機塩
   、ビタミン、アミノ酸およびシヨ糖を含有する第２培地
   で前記カルスを継代培養する工程； （ｃ）苗条形成を確実にするに十分な量のＩＡＡとカイ
   ネチンとの混合物、無機塩、ビタミンおよびシヨ糖を含
   有する第３培地で前記予備コンデイシヨニングしたカル
   スを継代培養する工程、および （ｄ）根形成を確実にするに十分な量のＩＡＡ、無機塩
   、ビタミンおよびシヨ糖を含有する第４培地で前記苗条
   を継代培養することによつて植物体を得る工程 を含んでいるヒマワリ植物体の再生方法。 ２、前記組織が未熟胚である、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、前記カルスを、前記第２培地で継代培養する前に、
   カルスの維持を確実にするに十分な量のＡＢＡ、無機塩
   、ビタミン、アミノ酸およびシヨ糖を含有する維持培地
   で継代培養する、特許請求の範囲第１項または第２項記
   載の方法。 ４、前記ＡＢＡ、２，４−Ｄ、ＩＡＡ、ＢＡおよびカイ
   ネチンの濃度が、 （１）前記第１培地において２，４−Ｄ５．０〜１２．
   ０μＭおよびＡＢＡ１．０〜７．０μＭ、 （２）前記維持培地においてＡＢＡ０．０５〜１．０μ
   Ｍ、 （３）前記第２培地においてＢＡ０．５〜２．０μＭま
   たはＡＢＡ１．０〜４．０μＭおよびＢＡ０．５〜２．
   ０μＭ （４）前記第３培地においてＩＡＡ０．３〜３．０μＭ
   およびカイネチン０．５〜９．０μＭおよび （５）前記第４培地においてＩＡＡ０．０５〜０．５μ
   Ｍである、特許請求の範囲第１項から第３項までのいず
   れかに記載の方法。 ５、前記ＡＢＡ、２，４−Ｄ、ＢＡ、ＩＡＡおよびカイ
   ネチンの濃度が、 （１）前記第１培地において２，４−Ｄ１０μＭおよび
   ＡＢＡ５μＭ、 （２）前記維持培地においてＡＢＡ１μＭ、 （３）前記第２培地においてＢＡ１μＭまたはＡＢＡ３
   μＭおよび１μＭＢＡ、 （４）前記第３培地においてＩＡＡ０．３μＭおよびカ
   イネチン５．０μＭ、および （５）前記第４培地においてＩＡＡ０．１μＭである、
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６、前記シヨ糖の濃度が、 （１）前記第１培地において７％〜１４％、 （２）前記維持培地において７％〜１４％、 （３）前記第２培地において４％〜８％、 （４）前記第３培地において２％〜４％、および （５）前記第４培地において２％〜３％ である、特許請求の範囲第１項から第５項までのいずれ
   かに記載の方法。 ７、前記シヨ糖の濃度が、 （１）前記第１培地において１２％、 （２）前記維持培地において１２％、 （３）前記第２培地において６％、 （４）前記第３培地において３％、および （５）前記第４培地において２％ である、特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８、前記第１、維持および第２培地の前記無機塩が硫酸
   マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸一ナトリウム、
   硝酸カリウム、硫酸アンモニウム、硼酸、硫酸マンガン
   、硫酸亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、硫酸銅、塩化コ
   バルト、ヨウ化カリウム、硫酸鉄および二ナトリウム−
   ＥＤＴＡを含んでいる、特許請求の範囲第１項から第７
   項までのいずれかに記載の方法。 ９、前記無機塩が、硫酸銅、硫酸鉄、ヨウ化カリウムお
   よび二ナトリウム−ＥＤＴＡの濃度が最初の濃度の１０
   ％であるように変成されたＢ５無機塩である、特許請求
   の範囲第８項記載の方法。 １０、前記第１、維持および第２培地の前記ビタミンが
   ニコチン酸、チアミン、ピリドキシンおよびｍｙｏ−イ
   ノシトールを含んでいる、特許請求の範囲第１項から第
   ９項までのいずれかに記載の方法。 １１、前記ビタミンがチヤンドラーのビタミンである、
   特許請求の範囲第１０項記載の方法。 １２、前記第１、維持および第２培地の前記アミノ酸が
   アラニン、グルタミン、セリン、トリプトフアンおよび
   システインである、特許請求の範囲第１項から第１１項
   までのいずれかに記載の方法。 １３、前記アミノ酸がチヤンドラーのアミノ酸である、
   特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １４、前記第３および第４培地の前記無機塩が硫酸マグ
   ネシウム、塩化カルシウム、リン酸−カリウム、硝酸カ
   リウム、硝酸アンモニウム、硼酸、硫酸マンガン、硫酸
   亜鉛、モリブデン酸ナトリウム、硫酸銅、塩化コバルト
   、ヨウ化カリウム、硫酸鉄および二ナトリウム−ＥＤＴ
   Ａを含んでいる、特許請求の範囲第１項から第１３項ま
   でのいずれかに記載の方法。 １５、前記無機塩がＭＳ無機塩である、特許請求の範囲
   第１４項記載の方法。 １６、前記第３培地の前記ビタミンがチアミン、ピリド
   キシン、ｍｙｏ−イノシトール、リボフラビン、パント
   テン酸カルシウム、ｐ−アミノ安息香酸、ナイアシン、
   コリンおよび葉酸である、特許請求の範囲第１項から第
   １５項までのいずれかに記載の方法。 １７、前記ビタミンが、１００ｍｇ／ｌ以上のｍｙｏ−
   イノシトールおよび０．４ｍｇ／ｌ以上のチアミン塩酸
   塩を含むように変成されたヘンダーソンのビタミンであ
   る、特許請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、前記第４培地の前記ビタミンがｍｙｏ−イノシト
   ールおよびチアミンである、特許請求の範囲第１項から
   第１７項までのいずれかに記載の方法。 １９、特許請求の範囲第１項から第１８項までのいずれ
   かに記載の方法によつて生成されたヒマワリ植物体。 ２０、特許請求の範囲第１９項記載のヒマワリ植物体か
   ら生成された種子。