SU1720596A1 - Способ получени регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к культивированию изолированных тканей растений и может быть использовано в селекционной практике дл  создани  новых и улучшени  существующих сортов растений. Целью изобретени   вл етс  повышение выхода растений-регене- рантов и количества зон морфогенеза. Способ предусматривает получение из незрелых зародышей растений регенерантов путем двухэтапного культивировани  на модифицированных питательных средах Му- расиге-Скуга и Гамборга Bs. ы fe

Description

Изобретение относитс  к биотехнологии , в частности к культивированию изолированных тканей растений, и может быть использовано в селекционной практике дл  создани  новых и улучшени  уже известных сортов растений.

Одним из лимитирующих факторов выращивани  изолированных тканей и клеток подсолнечника  вл етс  низка  регенераци  растений.

Известны способы получени  расте- ний-регенерантов подсолнечника путем пр мого и непр мого соматического эмбриогенеза , основанные на подборе типа эксплантата и оптимального состава среды. Было показано вли ние гормонов 6-бензи- ламинопурина (БАП) и 2,4-дихлорфенокси- уксусной кислоты (2,4-Д) на р д эксплантатов синтетического сорта Sannace, а именно на листь , участки котиледонов , апексы побегов, сегменты гипо- котил . Оказалось, что среда (MS) Murashige and Skoog в сочетании с 2,4-Д и БАП и MS с 2,4-Д не вызывает образовани  побегов из каллуса ни дл  одного эксплантата , на среде MS с добавкой 1 мг/л БАП наблюдали регенерацию из глобул рного каллуса, полученного при культивировании

VI

чэ О

ел ю

сегментов гипокотил . Недостаток этого метода в том, что он касаетс  только одного редкого генотипа.

Известен пр мой соматический эмбриогенез и регенераци  растений из незрелых зародышей на среде с повышенным содержанием сахарозы. Через шесть дней начала культивировани  показано образование белых соматических зародышей непосредственно из котиледона зиготических, без образовани  каллуса. Незрелые зародыши на 7-14-й день после опылени  помещали на среды, содержащие MS соли; витамины среды Gamborgs (Bs); различные концентрации сахарозы (3%, 6%, 12%); в качестве добавок - 2,4-Д, дикамба, пиклорам, долил-3-уксусна  кислота (ИУК), и а-наф- тил-уксусна  кислота (НУК). Показано, что образование соматических зародышей не происходило на средах с 3% сахарозы и использованием в качестве добавок ИУК или НУК. Оптимальными  вл лись среды с 6 и 12% сахарозы в сочетании с 1 мг/л 2,4-Д или 3,3 мг/л дикамба. При помещении на данные оптимальные среды зрелых зароды.- шей или тканей асептических проростков (листьев, апексов, гипокотилей) пр мого соматического эмбриогенеза не наблюдалось, Недостатки этого способа в том, что он применим только к определенному типу экс- плантатов, а именно к незрелым зародышам на 7-14 день после опылени  (следовательно, малым гибкость), кроме того , степень регенерации полученных всходов остаетс  еще не очень достаточной.

Из известных способов наиболее близким по своей сущности  вл етс  способ регенерации подсолнечника, применимый к восьми сортам подсолнечника, описываю- щий регенерацию из незрелых зародышей на 4-21-й день после опылени . Культивирование по известному способу осуществл етс  в три этапа. Первый этап - образовани  эмбриогенных каллусов из клеток или тканей путем культивировани  в питательной индуцирующей среде, содержащей соли и витамины MS, аминокислоты, 9% сахарозы, гормон цитокининового типа БАП в концентрации 0,5-1 мг/л. Второй этап - культивирование эмбриогенных каллусов дл  их роста, развити  и прорастани  в среде, содержащей соли и витамины MS, аминокислоты, 3% сахарозы, 0,1-0,5 мг/л БАП. Третий этап состоит в перенесении проростков дл  их роста и развити  на среду , содержащую соли и витамины Bs, 1% сахарозы, гормон ауксинового типа - ИУК в концентрации 0,1-0,2 мг/л.

Недостатки этого способа состо т в необходимости осуществлени  изменений сред между первым, вторым и третьим этапами , что ведет к большей веро тности инфицировани , а также невысокой частоте регенерации.

Целью изобретени   вл етс  повышение выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза.

Способ предусматривает культивирование эксплантата подсолнечника в питательной индуцирующей среде, содержащей гормоны дл  инициации эмбриогенных каллусов и дальнейшее культивирование эмбриогенных каллусов дл  их роста, развити  и прорастани , позвол ющее получить рас- тени -регенеранты.

Использование способа приводит к множественному образованию побегов из одного зародыша путем непр мого соматического эмбриогенеза.

Способ осуществл етс  следующим образом .

Используют восемь генотипов подсолнечника: сорта Передовик, Надежный, Енисей , Ультраскороспелый, Ржаксинский; инбредную линию 36-29; две гибридные линии М 1 65/1 А х НА 234 А х К 3064.

В качестве эксплантата дл  индукции каллуса используют незрелые зародыши на 9-21-й день после опылени . Изолированные в асептических услови х незрелые зародыши помещают на питательную среду MSc3% сахарозы, дополненную5 г/л КМОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП и 5 мг/л НУК с дальнейшим получением морфогенетического каллуса . Каллусную ткань выращивают в термостате при t 26-28° С, далее при фотопериоде 16 ч день - 8 ч ночь при t 26-28° С с перенесением каждые 25-30 дней на свежую питательную среду. Затем после роста каллусной ткани отделенные побеги перенос т на среду дл  корнеобразовани , содержащую соли Вб, 0,5% сахарозы, 2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина HCI.

П р и м е р 1. Растени  подсолнечника сорта Ржаксинский выращивают в теплице в сосудах с почвой. В момент цветени  каждое растение отмечают этикеткой с указанием даты цветени . На 9-21-й день после опылени  сем нки стерилизуют путем погружени  на 1 мин в 50%-ный этанол, далее на 10 мин в 9%-ный раствор продажного хлорамина Б, затем промывают трижды стерильной дистиллированной водой. Изолированные в асептических услови х зародыши размером 0,1-0,8 см помещают на среду, содержащую соли и витамины MS,

3% сахарозы, 4 г/л КМОз, 90 мг/л инозито- ла, 400 мг/л казаминовых кислот, 0,4 мг/л БАП, 4 мг/л НУК. В течение первых 20 дней клеточные культуры выращивают в термостате при t 26-28° С, далее - при фОтопе- риоде 16 ч день - 8 ч ночь при t 26-28° С. Через 25-30 дней выросший каллус пересаживают на свежую питательную среду, одновременно отдел   образовавшиес  побеги и перенос  их на среду дл  корнерб- разовани , содержащую соли Bs, 0,5% сахарозы , 1 мг/л ИМК, 0,4 мг/л пиридоксин HCI. В каждом пассаже учитывают количество полученных растений-регенерантов и образовавшихс  зон морфогенеза.

П р и м е р 2. Способ осуществл етс  аналогично примеру 1, различие состоит в составе питательных сред дл  индукции каллуса и корнеобразовани . Питательна  индуцирующа  среда содержит соли и вита- мины MS, 3 % сахарозы, 5 г/л КМОз, 100 мг/л инозитола, 500 мг/л казаминовых кислот, 0,5 мг/л БАП, 5 мг/л НУК. Втора  среда содержит соли Bs, 0,5% сахарозы, 2 мг/л ИМК, 0,5 мг/л пиридоксина HCI.

ПримерЗ. В среду дл  индукции каллуса, содержащую соли и витамины MS, 3% сахарозы, добавл ют 6 г/л КМОз, 1tO мг/л инозитола, 600 мг/л казаминовых кислот , 0,6 мг/л БАП и 6 мг/л НУК. Среду дл  корнеобразовани , содержащую соли Bs, 0,5 % сахарозы дополн ют Змг/л ИМК и 0,6 мг/л пиридоксин НС.. Остальные приемы осуществл ют аналогично примеру 1.

П р и м е р 4. Незрелые зародыши сорта Енисей, собранные на 9-21-й день после опылени , когда они достигают размеров 0,1-0,8 см. стерилизуют, изолируют в асептических услови х и далее процесс культивировани  ведут по примеру 2.

Аналогично провод т испытани  с другими генотипами подсолнечника.

Предлагаемый способ ускорил в 1,2 раза по сравнению с известным процесс обра- зовани  зон морфогенеза и зачатков побегов путем непр мого соматического эмбриогенеза . Через 12-14 дней наблюдали образование зон морфогенеза и зачатков побегов на индуцирующей питательной среде. Повысилась частота образовани  морфогенетических линий в 1,5 раза, увеличилось число множественных зон морфогенеза в 4-6 раз.

Предлагаемый способ позволит получить регенерацию подсолнечника путем непр мого соматического эмбриогенеза.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ получени  регенерантов подсолнечника в культуре соматических клеток, включающий эксплантацию незрелых зародышей на модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга, получение на ней морфогенетического каллуса, регенерацию побегов, перенос их на модифицированную питательную среду Гамборга Bs дл  корнеобразовани  и адаптацию полученных растений к услови м открытого грунта, отличаю щ и и с   тем, что , с целью повышени  выхода растений-регенерантов и количества зон морфогенеза, получение каллуса и регенерацию побегов осуществл ют в один этап с добавлением в питательную среду 4000-6000 мг/л нитрата кали , 90-110 мг/л инозитола, 400-600 мг/л казаминовых кислот, 0,4-0,6 мг/л 6-бензи- ламинопурина, 4-6 мг/л а-нафтилуксусной кислоты и корнеобразование провод т в присутствии 1-3 мг/л индолилмасл ной кислоты, 0,4-0,6 мг/л пиридоксина HCI.