SU1693046A1 - Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L - продуцент моноклонального антитела к фактору Виллебранда системы свертывани крови человека - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к гибридомной технологии и может быть использовано дл  определени  фактора Виллебранда (ФВ) с помощью специфических моноклональных антител. Цель изобретени  - получение штамма гибридомы мыши - продуцента монАТ к ФВ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы РЗХбЗАд 8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных частично очищенным ФВ. МонАТ отбирают методом иммуноферментного анализа на том же антигене. Штамм культивируют в среде ДМЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота. Штамм способен расти в виде асцитных опухолей в организме сингенных мышей. Класс монАТ Jg G1. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) 317Д. fe

Description

Изобретение относитс  к гибридомной технологии и может быть использовано дл  иммунометрического определени  фактора Виллебранда с помощью специфических моноклональных антител (монАТ).

Цель изобретени  - получение штамма гибридомы мыши - продуцента монАТ к ФВ.

Штамм депонирован в ВСКК(П) под № 317Д. Авторское наименование 380Ф2.

Штамм получают следующим способом.

Мышей линии BaLb/c 1,5-2-мес чного возраста иммунизируют дважды, одновременно внутрибрюшинно и подкожно по 6 ЕД на мышь с интервалом в 3 нед. Перва  иммунизаци  антигеном в смеси с полным адьювантом Фрейнда, втора  без адьюван- та. Через 72 ч после последней иммунизации провод т сли ние 100x10 спленоцитов

иммунизированной мыши с 25x10 клеток мышиной миеломы х63Ад8.653.А. обрабатыва  смесь клеток раствором полиэтиленгли- кол  (50%)с молекул рной массой 1000. Дл  выращивани  гибридом используют фидерный слой из перитонеальных макрофагов мышей и среду Игла в модификации Дуль- бекко(ДМЕМ), содержащую 15% инактиви- рованной нагреванием взрослых коров, 20% кондиционированной клетками хбЗ.Ад8.653.А ростовой среды. В среду добавл ют селективные добавки: гипоксан- тин. тимидин и аминоптерин. Тестирование клонов-продуцентов провод т с помощью иммуноферментного анализа. В качестве сажаемого на твердую фазу антигена используют тот же аппарат, что был использован дл  иммунизации. Первичный скрининг

О

ю

со

о

Јь

О

провод т пр мым методом по схеме антиген - мышиные моноклональные антитела клонов-продуцентов - кроличий антимышиный иммунопероксидазный конъюгат. Специфический скрининг провод т конкурентным иммуноферментным методом, использу  коммерческую поликлональную кроличью антисыворотку к фактору УШ человека . В результате из 30 клонов положительных в первичном тексте отбирают 21 клон в специфическом конкурентном методе . Среди них дл  дальнейшей работы берут один клон, который дважды реклонируют методом предельных разведений на слое перитонеальных макрофагов мышей. 100% полученных реклонов позитивны при тестировании на AT к фактору Виллебранда. Один из полученных клонов (авторское название 380Ф2) реклонируют и замораживают .

Штамм характеризуетс  следующими свойствами.

Стандартными услови ми культивировани  штамма  вл ютс : температура 37°С, среда ДМЕМ или MEM с 10% инактивиро- ванной сыворотки крупного рогатого скота, по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина , культивирование в герметично закрываемых флаконах Каррел  или в чашках Петри в атмосфере с 5% СОа в воздухе и 100%-ной влажностью. Культура представл ет собой взвесь одиночных клеток или рыхлых агрегатов по 4-16 и более клеток, легко разъедин ющихс  при встр хивании. Оптимальна  посевна  доза 0,5-1,0х106 клеток в 1 мл среды . Дл  поддержани  культуры в пролифе- рирующем состо нии клетки рассевают 2 раза в неделю с коэффициентом 1/8-1/10. Максимальна  плотность культуры с сохранением жизнеспособности 1,0-1,2х106 кл/мл. Клетки в культуре выгл д т прозрачными , округлыми, часть их прилипает к поверхности культуральных сосудов. Видова  принадлежность штамма подтверждаетс  тем, что гибридные клетки прививаютс  мышам линии BaLb/c. Дл  этого мыши сенсибилизируютс  введением внутрибрюшинно по 0,5 мл на мышь пристана или вазелинового масла за неделю до прививки внутрибрюшинно каждой мыши 5,0х106 клеток. Асцит образуетс  через 2-3 нед. в объеме 1,5-2,0 мл. Проверка штамма на присутствие контаминирующих микроорганизмов, проведенна  на культурах, посто нно выращиваемых без антибиотиков, показывает отсутствие бактерий, грибов, дрожжей и ми- коплазм

Клетки штамма 380Ф2 продуцируют в среду иммуноглобулины IgGi класса. Это показано в твердофазном иммуноферментном

анализе с помощью серии моноспецифических кроличьих антисывороток к мышиным антителам классов IgGi, lgG2a, lgG2B, 1дСз и 1дМ. Специфичность антител оценивают в

конкурентном иммуноферментном анализе с коммерческой сывороткой к фактору УШ R:Ag и методом иммуногистохимического окрашивани  эндотелиальных клеток пуповин ной вены человека.

0 Криоконсервирование штамма провод т в среде следующего состава. %: среда MEM или ДМЕМ 50; сыворотка крупного рогатого скота 40; диметилсульфоксид 10. Замораживание осуществл ют в следую5 щем режиме: клетки в концентрации 1,0- 5,0x10 кл/мл криосреды помещают на 24 ч в низкотемпературный холодильник (-70°С), после чего быстро перенос т в жидкий азот. Дл  размораживани  ампулу из жидкого

0 азота перекладывают в воду с температурой 40°С, через 5 мин клетки центрифугируют и помещают в ростовую среду. Жизнеспособность клеток после размораживани  составл ет 75-80% в тесте с трипановым синим.

5 Основанием дл  выделени  гибридом- ного штамма 380Ф2 в качестве нового штамма  вл етс  то, что клетки этого клона растут на среде с сывороткой крупного рогатого скота, что исключает использование

0 дорогосто щей сыворотки эмбрионов коров , примен емой дл  культивировани  близких штаммов.

Пример 1. Иммуногистохимическое окрашивание криостатных срезов пуповин5 ной вены и кожи человека.

Криостатные срезы пуповинной вены и кожи человека, фиксированные ацетоном и хлороформом в течение 10 мин, инкубируют при комнатной температуре с моноклональ0 ным антителом клона 380Ф2, затем последовательно с кроличьей антисывороткой к иммуноглобулинам мыши RAM (1:50) и РАР- реагентом мыши (1:150). Врем  инкубации с моноклональными антителами 45 мин, да5 лее по 30 мин и между этими процедурами - отмывки в трис-HCI буфере (10 мМ трис, 20 мМ NaCI, pH 7,4) по 15 мин кажда . После последней промывки активность перокси- дазы, вход щей в состав РАР-реагента, вы0  вл ют инкубацией срезов в течение 5 мин в трис-НС1-буфере (50 мМ трис. рН 7,6). содержащем 0,6 мг/мл диаминобензидина и 1 мкл/мл 33%-ного На02. Затем срезы отмывают в дистиллированной воде, окрашива5 ют гемалауном Майера 5 мин, снова промывают в проточной воде и после обезвоживани  заключают в бальзам. Дл  нейт- раллизации эндогенной пероксидазы используют смесь глюкозы (10 мг/мл) и глю- козоксидазы (0.75 ЕД/мл) на трис-НС -буфере (10 мМ трис, 20 мМ NaCI, pH 7,4), котора  наноситс  одновременно с RAM. При микроскопии препаратов установлено, что клетки эндотели  пуповинной вены и сосудов кожи имеют диффузное окрашивание цитоплазмы коричневого цвета. При этом на контрольных срезах (обработка RAM и РАР-реагентом) окрашивание отсутствует.

Пример 2. Использование монокло- нальных антител дл  определени  уровн  фактора Виллебранда в крови здоровых доноров и больных.

Лунки в планшетах заполн ют раствором кроличьих поликлональных антител к фактору Виллебранда в разведении 1:2000 на фосфатно-солевом буфере А (0,14 мМ NaCI, 0,2 мМ KCI, 8 мМ №2Н2РСм, 1,5 мМ КН2Р04. рН 7,2), инкубацию провод т в течение ночи при 4°С. Далее последовательно нанос т человеческую плазму (1:100). мышиные моноклональные антитела к фактору Виллебранда (культуральна  жидкость в разведении 1:1), козий антимышиный конъ- югат в разведении 1:2000. Все разведени  производ т на фосфатно-солевом буфере Б (0,5 мМ NaCI, 2,5 мМ KCL, 8 мМ N32HPCM, 1,5 мМ КН2РСМ, рН 7.2), содержащем 0,1% твина 20. Каждый слой инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, после чего планшеты трижды промывают буфером Б. Все растворы нанос т в лунки по 50 мкл. После последней промывки активность пероксидазы.

вход щей в состав коньюгата, вы вл ют инкубацией в течение 30 мин в цитрэтно-фос- фатном буфере (34 мМ безводной лимонной кислоты, 68 мМ Na2HPG(,pH 5,0), содержащем 0,5 мг/мл ортофенилдиамина и 1мкл/млЗЗ%-ного H2U2. Реакцию тормоз т добавлением в лунки равного объема 12,5%- ного раствора Й2504. Оценку результатов производ т на вертикальном многоканальном спектрофотометре (при 490 нм). Нормальна  человеческа  плазма от 20 здоровых доноров была использована как стандарт. Контроль неспецифического св зывани  был сделан с нормальными мышиными иммуноглобулинами (вместо моноклональных антител).

Результаты показывают, что монАТ в сэндвич-ИФА вы вл ют достовернее повышение содержани  в крови фактора Виллебранда у больных лимфогранулематозом, раком молочной железы, раком головки под- желудочной железы.

МонАТ могут быть использованы в разработке тест-системы дл  количественного

определени  антигена.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L Ns ВСКК(П) 317Д - продуцент моноклонального антитела к фактору Виллебранда системы свертывани  крови человека.