SU1514776A1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДО-1,4-β-МАННАНАЗЫ - Google Patents

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к разИзобретение относится к микробиологической промышленности, а именно, к способу получения эндо-1,4-р-маннаназы, которая может быть использована в пищевой, микробиологической, целлюлозно-бумажной промышленности и сельском хозяйстве.

Цель изобретения — повышение активности и выхода целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Культивируют продуцент --- штамм ВасШиз зпЫШз ВКПМ В-4025 глубинным способом на питательной среде, содержащей, г/л

Крахмал нерастворимый	61,0	65,0
Кукуру шин зкегракт	16,0-	19,0
Аммоний тер НО кислый
дву тамешенный	1,5	3,0
На грнй фосфорно-кислый
дн\ та мешенный	11.0	13,0
Калий еерно кислый	2.0	4,0

2

работке способа получения эндо-1.4^ -маннаназы, которая может быть использована в технологии обработки винограда и внноматериалов. Цель изобретения — повышение активности и выхода целевого продукта. Способ заключается в том, что в качестве продуцента используют штамм ВасНΙιΐ5 5иЫ1Н5 ВКПМ В-4025, который выращивают на среде, содержащей крахмал в качестве источника углерода, а также кукурузный экстракт, минеральные компоненты и кислотный гидролизат БВК, который вносят из расчета концентрации исходного, БВК 20—25 г на 1 л среды. Осаждение целевого продукта из культуральной жидкости осуществляют ацетоном. Способ позволяет получить выход β-маннаназы 189,7 г/л при активности 53,6±3,7 ед/мл. 3 табл.

Магний серно-кислый 0.15—0.25

Марганец серно кислый 0,5-1,5

Кальций хлористый 0,1 —0.3

Кислотный гидролизат

БВК, содержащий 20—

25 г исходного БВК в 50_мл 50 мл

Вода до I л.

Для приготовления среды крахмал осахаривают бактериальной амилазой до отсутствия. реакции на йод. Исходным сырьем для получения кислотного гидролизата служит БВК, который в своем составе содержит, %: белковые вещества 60,4; углеводы 15,2; неорганические вещества 2.8, в т. ч. фосфор 1,68; калий 0,8; натрии 0,15 и др.; рибофлавин 0,35 мг%; тиа мни 0,30 мг% и др.

Кислотный гидролизат БВК готовят и ι

20—25 г БВК. Навеску БВК заливают 5(1

200 см' воды и выдерживают 18 ч при

45°С. Затем ортофосфорной кисло юн дон<>

51) ,,„1514776

3

1514776

4

дят рН до 2, стерилизуют и весь подученный объем кислотного гидролизата вносят

в состав питательной среды.

Введение в питательную среду кислотного гидролизата БВК не только обогащает среду органическим азотом н витаминами, но также является индуктором биосинтеза β-маннаназы, так как дрожжи в структуре клеточных стенок содержат маннан а β-.маннаназа бактерий Вас. зиЬОПз ВКПМ В-4025 является индуцибельным ферментом.

В процессе кислотного гидролиза разрушаются дрожжевые клетки, повышается количество редуцирующих сахаров, в чем и заключается индуцирующее действие гидролизата БВК на биосинтез β-маннаназы.

Влияние ацетона в качестве осадителя β-маннаназы на повышение выхода целевого продукта показано в табл. 1.

В условиях глубинного культивирования штамм-продуцент синтезирует р-маннаназу с активностью 53,6 ед/см’.

Штамм ВасШиз зиЫШз ВКПМ В-4025 выделен из почвы и характеризуется следующими морфологическими и культурально-физиологическими свойствами.

Морфологические признаки. Клетки имеют форму палочек размером 1,7—3,2Х Х0,4—0,75 мкм. Выращенные на богатой питательной среде клетки имеют вид толстых палочек, иногда расположенных в цепочках. Клетки культуры — грамположительные без капсул, подвижные с помощью перитрихальных жгутиков. Споры имеют цилиндрическую или эллипсоидную форму размером 1,2-1,5X0,7—0,9 мкм. Прорастание спор экваториальное, путем разрыва мембраны вдоль экватора.

Культуральные признаки. На мясо-пептонном агаре после 24 ч инкубации при 37^СС образует колонии диаметром 2—7 мм. Колонии сероватые с гладкими краями, непрозрачные, с радиально-морщинистыми складками. На мясо-пептонном бульоне рост в виде поверхностной желтовато-белой тонкой и морщинистой пленки, бульон остается прозрачным.

Физиологические признаки. Дыхание аэробного типа, оптимальная температура роста 37°С при рН 6,8—7,0. Усваивает глюкозу, сахарозу, декстрозу, маннит и левулезу с образованием кислоты, а углеводы — ксилозу, мальтозу, дульцит, адонит, лактозу, сорбит — гидролизует с образованием щелочи. Нитраты восстанавливает до нитритов. Гидролизует крахмал, разжижает желатину, пептонизирует молоко. На среде Кларка образует ацетилметилкарбонил,

Культура поддерживается на ломтиках картофеля и хранится в консервированном виде (на ломтиках картофеля в пробирках, лишенных кислорода, а также в лиофилизированном виде).

Пример 1. Приготовление питательной среды.

Осахаривание крахмала. 63 г нерастворимого крахмала заливают 150 см³ воды, перемешивают и добавляют 0,3 г бактериальной амилазы, подогревают на водяной бане до 85°С и выдерживают при перемешивании в течение 30 мин, далее температуру поддерживают 100°С в течение 1 ч и охлаждают. Осахаренный крахмал не должен дать реакции с йодом.

Приготовление БВК кислотного гидролизата. 20 г БВК заливают 50 см³ воды, подогревают до 45°С и при перемешивании выдерживают в течение 18 ч, рН доводят при помощи ортофосфорной кислоты до 2 и стерилизуют при 130°С в течение 1 ч.

Приготовление раствора натрия фосфорно-кислого. В 100 см' подогретой до 55°С воды растворяют 12 г натрия фосфорнокислого двузамещенного и стерилизуют при 125°С в течение 30 мин.

Приготовление раствора минеральных солей. Минеральные соли растворяют в 200 см³ подогретой до 55°С воды.

Приготовление полной (конечной) питательной среды. 150 см³ осахаренного крахмала, 50 см³ кислотного гидролизата БВК, 200 см³ раствора минеральных солей и 17,5 см кукурузного экстракта заливают водой до объема 900 см³, рН доводят до 6,9 и стерилизуют при 1 15°С в течение 30 мин. После охлаждения к раствору стерильно прибавляют 100 см³ раствора натрия фосфорно-кислого двузамещенного.

Аналогично примеру 1 готовят питательные среды в 2— 5 примерах (см. табл. 2).

Глубинное культивирование штамма Вас. ьиЫШв ВКПМ В-4025 проводят в качалочных колбах с 100 см³ питательной среды при 37°С на круговой качалке <180 200 об/мин) в течение 18 ч. Колбы засевают односуточной культурой продуцента. На 18 ч роста определяют β-маннаназную активность колориметрическим методом.

После ферментации в культуральную жид кость для коагуляции биомассы и балластных веществ прибавляют 2% кальция хлористого, перемешивают, оставляют на 20 мин и фильтруют. В качестве вспомогательного фильтрующего материала используют фидьтроперлит в количестве 2%.

Для получения β-маннаназы фильтрат культуральной жидкости охлаждают до 4°С и осаждают 3 объемами охлажденного до - 10°С ацетона. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и высушивают в вакуумной сушилке.

За единицу β-маннаназной активности

принимают такое количество фермента, которое в условиях опыта увеличивает оптическую плотность супернатанта инкубационной смеси на 0,1.

5

1514776

Как видно из данных, представленных в табл. I, оптимальной питательной средой для биосинтеза β-маннаназы в данных условиях является среда, указанная в примере I. За пределами соотношения компонентов (пример 4) β-маннаназнаяактивность намного меньше активности примера 1, а данные примера 5 близки к данным примера 1. Поэтому нецелесообразно применение питательной среды с повышенной концентрацией компонентов.

Параллельно в аналогичных условиях проводят культивирование известного штамма Вас. зиЫШз 9 — 78 на предлагаемой среде для сравнения показателей β-маннаназ ной активности обоих штаммов. За контроль принимают β-маннаназную активность известного штамма Вас. виЬППэ — 78, выращенного на известной питательной среде (прототип).

В табл. 3 представлены результаты исследования β-маннаназной активности известного и предлагаемого штаммов на среде с гидролизатом БВК (средние данные 8 опытов) и выход целевого продукта. Как видно из данных, приведенных в табл. 3, β-маннаназная активность по предлагаемому 25 способу превышает активность известного штамма Вас. зиМШз 9 — 78 как при культивировании его на известной среде (прототип), так и на предлагаемой среде. Если β-маннаназная активность известного штамма на предлагаемой среде составляет 30 41,8 ед/см³, то активность штамма ВКПМ

В-4025 составляет 53,6 ед/см³ (в 2,5 раза больше активности прототипа).

Представленные в табл. 3 данные о выходе целевого продукта показывают, что 5 выход β-маннаназы при культивировании Вас. зиЫШз ВКПМ В-4025 соответствует 189,7% от контрольного выхода (прототипа) .

Claims (1)

1. Формула изобретения

   Способ получения эндо-1,4^-маннаназы, предусматривающий культивирование продуцента ВасШиз зиЫШз на питательной среде, содержащей в качестве источника 15 углерода крахмал нерастворимый, в качестве источников азота — кукурузный экстракт и аммоний серно-кислый двузамещенный, а также натрий фосфорно-кислый двузамещенный,калий серно-кислый, магний серно-кислый, марганец серно-кислый, кальций хлористый и воду, и последующее выделение фермента из фильтрата культуральной жид кости путем осаждения органическим растворителем, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и выхода целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм ВасШиз зиЫШз ВКПМ В-4025, в питательную среду дополнительно вводят кислотный гидролизат БВК из расчета концентрации исходного БВК 15—25 г на 1 л среды, при осаждении фермента из культуральной жидкости в качестве органического растворителя используют ацетон.

   Таблица 1

   Способ получения Исходная Выход .β-маннаназы препарата актив- ность культуральной жидкое- г/дм³ % ед/г 7° ти, ед/см³ Осаждение аце- ТОНОМ 53,6 25,8 112 300 1 1 1 Осаждение эта- НОЛОМ 53,6 23,0 100 270 100

   7

   1514 77*;

   Τ ,ι ίι .1 и ц а 2

   Концентрация компонентов питательной среды 1 - 5 примеров и β -маннаназпая активность в пределах и за пределами соотношения компонентов ----------------------------- — — ----------- — — Наименование компонентов Концентрация компонентов, г/ ДМ³ № примера ’ I 2 ^{3 4} 5 Нерастворимый крахмал 63,0 61,0 65,0 60,0 66,0 Кукурузный экстракт 17,5 16,0 19,0 15,0 20,0 Аммоний серно-кислый двузамещенный 2,6 1,5 з,о 1,0 3,5 Натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12,0 11,0 13,0 10,0 14,0 Калий серно-кислый 3,0 2,0 4,0 1,0 5,0 Магний серно-кислый 0,2 0,15 0,25 0,05 о,з Марганец серно-кислый 1,0 0,5 1,5 0,1 2,0 Кальций хлористый 0,2 0,1 0,3 0,05 0,35 БВК (до гидролиза) 20,0 15,0 25,0 10,0 30,0 β-маннаназная активность 53,6*3,7 38,0*2, 6 54,4*3, 5 34,7*2, 8 55,3*3,4

   ед/см³ (средние данные 8 опытов)

   ТаблицаЗ

   Штамм

   Количест- ^-манна- % от конт- % от ак- Выход о- во ОПЫТОВ назная рольной тивности ------- ’актив- актив— прототипа г/дм³ ность, ности ед/см³

   маннаназы

   Вас.аиЫНхз 9 - 78 (контроль)

   (прототип) Цас.зиЬТхПз 9^_78 (на предлагаемой питательной среде) 8

   Вас. зиЬсП Ϊ5 87(ВКПМ

   В-4025) 8

   20,8 100

   41,814,9 201

   53,613,7 258

   13,6 100

   100 19,4

   128 25,8

   142,6

   189,7

   I'. пи. η,|· II К

   ΗΙΙΙΙ1Ι1ΙΙ

   Т , ,,, г I¹,·

   ;|| | Л <ч

   |Ц I 14 I

   I ί 311Л Г

   (лставитель Е Воробьева

   Гехрод И. Верес К прре кιпр О

   Гараж 501 ||о ио!саое

   .1111 комшета по изобретениям и огирсннач -(’

   Москва. Ж 35. Раушская наб , ι 1 ‘

   , ч., кий комбинат «Патеш». г Уж;пр·..> ·, ι I

   К р:ОЧ|.

   ι I ΗΙ

   1'