SU1510859A1

SU1510859A1 - Способ получени сорбента дл иммобилизации липолитических ферментов

Info

Publication number: SU1510859A1
Application number: SU874213794A
Authority: SU
Inventors: Мирзаатхам Мирзахакимович Рахимов; Хасан Турсунович Хасанов; Искандер Тахирович Якубов; Николай Алексеевич Латышев; Валерий Николаевич Акулин; Леонид Менделевич Эпштейн; Сергей Павлович Касьянов
Original assignee: Ташкентский Государственный Университет Им.В.И.Ленина
Priority date: 1987-03-19
Filing date: 1987-03-19
Publication date: 1989-09-30

Abstract

Изобретение относитс к способу получени сорбента дл иммобилизации и позвол ет повысить каталитическую активность иммобилизованной липазы и увеличить ее стабильность в водно-органических средах. Полиамид раствор ют в концентрированной НС1, выдерживают с лизопористым кремнеземом в течение 1,5-2 ч при перемешивании, удал ют неадсорбированный полиамид, активируют в 2,0-3,0 н. НС1 ПРИ 40-45°С В ТЕЧЕНИЕ 1,5-2 Ч. СОРБЕНТ ПРОМЫВАЮТ ВОДОЙ, УРАВНОВЕШИВАЮТ С 0,1 М БОРАТНЫМ БУФЕРОМ РН 8,5-9,5, ЗАТЕМ МОДИФИЦИРУЮТ ЕГО ГЛУТАРОВЫМ АЛЬДЕГИДОМ ПРИ 15-20°С В ТЕЧЕНИЕ 2 Ч. КОВАЛЕНТНОЕ СВЯЗЫВАНИЕ БИОСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЛИГАНДА - ПЕФАЛИНА ПРОВОДЯТ В ТОМ ЖЕ БУДЯРНОМ РАСТВОРЕ ПРИ 2-6°С В ТЕЧЕНИЕ 24-30 Ч. 5 ТАБЛ.

Description

Изобретение относитс к технической биохимии и биотехнологии и может быть использовано в пишевой и микробиологической промышленности дл получени иммобили- зированных липаз.

Цель изобретени - повышение каталитической активности иммобилизованной липазы , увеличение ее стабильности в водно- органических средах.

Способ получени сорбента дл иммобилизации ферментов заключаетс в следую- шем.

Полиамид, растворенный в концентрированной НС1, выдерживают с силикагелем в течение 1,5-2 ч при перемешивании, неадсорбированный полиамид удал ют, активируют полученный носитель в 2,0-3,0 н. растворе сол ной кислоты при 40-45°С в течение 1;5-2,0 ч. Сорбент промывают водой, уравновешивают с 0,1 М боратным буфером, рН 8,5-9,5, затем модифицируют его глута- ровым диальдегидом при 15-20°С в течение

2 ч. Ковалентное св зывание биоспецифического лиганда - кефалина провод т в том же буферном растворе при 2-6°С в течение 24-30 ч.

Пример 1. К 100 г силикагел марки КСК № 2 со средним диаметром пор 14 нм, удельной поверхностью 338 и размером частиц от 160- до 250 мкм приливают 10 г полиамида, растворенного в концентрированной НС1 (200 мл), выдерживают при перемешивании в течение 2 ч, затем добавл ют 40 /о-ный водный ацетон. Надосадочную жидкость удал ют декантацией, сорбент промывают дистиллированной водой до нейтральной среды. Зате.м полученный сорбент активируют 2 н. НС1 при 45°С в течение 2 ч, промывают дистиллированной водой. К влажному сорбенту добавл ют 60 мл 0,1 М борат- ного буфера, рН 8,5 содержащего 3,14 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида, и оставл ют при перемешивании на 2 ч. Несв завшийс глутаровый альдегид от.мывают

сл

00

сд

500 мл того же буферного раствора. Дл присоединени лиганда к модифицированному полиамиду добавл ют 60 мл раствора кефа- лина с концентрацией 40 мг/мл в 0,1 М буфере , рН 8,5, содержащем 50% этанола и оставл ют при перемешивании на 24 ч при 4°С. Несв занный кефалин удал ют последовательным промыванием сорбента 500 мл этилового спирта и 500 мл 0,1 М боратного буфера , рН 8,5. Дл блокировани оставшихс свободных альдегидных групп к полученному сорбенту добавл ют 60 мл 0,1 М боратного буфера, рН 8,5, содержаш,его 3,5 мл этаноламина и оставл ют при перемешивании на 24 ч при 4°С. Избыток этаноламина

10

В табл. 2 представлены данные по вли нию соотношени силикагел и полиамида при синтезе сорбента на удельную активность иммобилизованной липазы на этих носител х.

Из табл. 2 видно, что оптимальным вл етс массовое соотношение носител и полиамида 10:1.

В табл. 3 приведены данные о вли нии массового соотношени сорбент-лиганд на положительный эффект.

Из представленных результатов видно, что оптимальным вл етс соотношение сорбента и лиганда (кефалина) 10:1.

В табл. 4 представлены данные о вли нии

удал ют промыванием сорбента 30 мл того 15 диаметра пор на каталитическую активность

же буферного раствора.

Пример 1. Синтез сорбента провод т, как в примере 1, с той разницей, что покрытие силикагел полиамидом провод т в соотношении от 10:0,5 до 10:5.

Пример 3. Синтез сорбента провод т, как в примере 1, но на стадии присоединени лиганда к модифицированному сорбенту количество кефалина в инкубационной смеси составл ет от 0,5 до 1,5 г в 60 мл 0,1 М боиммобилизованной липазы.

Наиболее высока удельна активность наблюдаетс в том случае, когда в качестве твердой подложки используют кремнеземы 2Q с размером пор не ниже 8-10 нм, но и при 3,2 нм предложенный способ превосходит известный , т.е. мезопористый кремнезем обеспечивает положительный эффект.

В табл. 5 приведены результаты применени иммобилизованных липаз в конкретных

ратном буфере, рН 8,5, содержаш,ем 50% процессах (гидролиз и переацилирование ры

бьего жира и льн ного масла) дл получени продуктов обогащенными полиеновыми жирными кислотами.

этанола.

Пример 4. Синтез сорбента провод т, как в примере 1, с той разницей, что в качестве твердой подложки используют силикагель со средним диаметром пор 3,2 нм.

Пример 5. Синтез сорбента провод т, как в при.мере 1, с той разницей, что в качестве твердой подложки используют силикагель со средним диаметром пор 8 нм.

В табл. 1 представлена сравнительна характеристика сорбентов, синтезированных предлагаемым и известным способом, при использовании дл иммобилизации липазы из гриба.

Из представленных данных в табл. I видно , что иммобилизованна липаза из гриба на предлагаемом сорбенте сохран ет в вод

ной среде высокую (85%) активность, а в случае проведени реакции в водно-ацетоновой среде даже повышает свою активность. При использовании сорбента синтезированных по известным методам иммобилизованна липаза обладает низкой удельной активностью .

В табл. 4 представлены данные о вли нии

диаметра пор на каталитическую активность

иммобилизованной липазы.

Наиболее высока удельна активность наблюдаетс в том случае, когда в качестве твердой подложки используют кремнеземы с размером пор не ниже 8-10 нм, но и при 3,2 нм предложенный способ превосходит известный , т.е. мезопористый кремнезем обеспечивает положительный эффект.

процессах (гидролиз и переацилирование ры

Дл проведени , реакции переацилирова- НИИ к исходным веществам добавл ют равное количество (1:1, по массе) фракции жирных кислот с содержанием эйкозопентаено- вых кислот 95%.

Claims

Формула изобретени

35

40

Способ получени сорбента дл иммобилизации липолитических ферментов, включающий активацию полиамидсодержащего носител , обработку его глутаровым альдегидом и ковалентное присоединение лиганда , отличающийс тем, что, с целью повышени каталитической активности иммобилизованной на сорбенте липазы и увеличени ее стабильности в водно-органических 45 средах, в качестве носител используют мезопористый кремнезем с нанесенным полиамидом .

Таблица 1

Показатели

Удельна активность липаз,

мкмоль/ч на г носител :

водна среда1101200

25%-на водпо-спиртова средаО1000

25%-на водно-ацетонова средаО2100

% сохранени активности

после иммобилизации в водной среде2385

Врем полуинактивации, мин,

при в 25% спиртовом

растворе2585

Удельна поверхность носител , м2/г18600-750

Содержание кефалина, мкмоль,

на 1 г сорбента2,2-2,5 0,25-0,28

Адсорбционна емкость

кефалина в ед. липазы

на мкмоль лиганда2305520

Б качестве субстрата используют триглицериды рыбьего жира.

Таблица2

Массовое соотношение

силикагель:полиамид 10:0,1 10:0,5 10:1 10:3 10:5

,г--- ,л 1-л,11м лл-1Л- im - -T.-i., ги1У..м-- -- т-1----.-1-ы-- -и--rij --ти-ч..,1т и---т т.иг-«-Чжг--ч1 --| |Ч г-Удельна активность

МКМОЛЬ/Ч на 1 г

носител 760 1050 1200 1150 1200

В качестве субстрата используют триглицериды рыбьего жира.

ТаблицаЗ

Массовое соотношение

сорбент:лиганд 20:1 10:1 7:1 4:1

Удельна активность,

мкмоль/ч на 1 г,

носител 1020 1210 1200 1190

Сорбент по Известный

способз

Предлагаемый

Исходное вещество Глубина превращени , % Содержание полиеновых жирных кислот в дигли- церидах, %

Та6лица4

ТаблицаЗ

Льн ное масло 25,4 64

52,0

20