SU1446159A1 - Вектор рМВ 123 дл получени фрагментов ДНК с произвольными липкими концами и способ его конструировани - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к молекул рной биологии и генетической инженерии и представл ет собой векторную ДНК рМВ 123 дл  получени  фрагментов ДНК с произвольными липкими концами. Полученна  рекомбинантна  плазмидна  ДНК имеет молекул рную массу 1,8 МД и содержит EcoR I - Pst I фрагмент ДНК плазмиды PVR 222 с геном В-лак- тамазы и частью модифицированного гена й-галактозидазы E.coli, а также синтетический полилинкер длиной 38 п.о. Полипинкер включает между попарными сайтами Fok I и Hga 1 набор сайтов дл  эндонуклеаз рестрикции SalG I, Асе I, Hind II, Hind III и Bam HI противоположной пол рности. Целевые фрагменты ДНК получают путем клонировани  субфрагментов в составе сконструированной векторной плазмиды . рМВ 123 по сайтам, содержащимс  между попарными сайтами Fok I и Hga I с последующим их выщеплением с помощью рестриктаз Fok I или Hga I. 2 с.п. ф-лы. (Л

Description

4

О)

СП

со

Изобретение относитс  к молекул рной биологии и биотехнологии, конкретно к получению векторных реком- бинантных ДНК методами генетической инженерии и может найти применение в биотехнологии при создании штаммов- продуцентов целевых продуктов.

GGATGACGCGTCGACAAGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

1 ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA7

с наход щимис  между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal местами дл  эндонуклеаз рестрик Щ1И SalGl, AccI, HindII, Hindlll и BdmHI.

Конструирование вектора рМВ 123 провод т следующим образом.

Расщепл ют ДНК плазмиды pNIMB эн- донуклеазами рестрикции BamHI и EcoRI и лигируют полученный гидроли- зат с синтетическими,олигонуклеоти- дами GATCCGCGTCATCCAG и AATTCTGGAT- GACGCG с помощью ДНК-лигазы бактериофага Т4. Полученной смесью трансформируют клетки E.coli ВМН 7118 или IM 103 и провод т отбор клонов, устойчивых к ампициллину,с фенотипом Lac (промежуточна  плазмида рМВ 121), Из индивидуальных клонов вьщел ют ДН плазмиды рМВ 121, которую расщепл ют эндонуклеазами рестрикции PstI и SalGI и лигируют с рлинонуклеотидами

GGATGACGCG и TCGACGCGTCATCCTGCA.nony

ченной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli и провод т отбор клонов, устойчивых к ампициллину, с фенотипом Lac (плазмида рМВ 123),

Конструкци  рМВ 123 облегчает поиск колоний с рекомбинантными плаз- мидами. Поскольку полипинкер дл  клонировани  субфрагментов расположен в кодируницей последовательности ef - пептида Й-галактозидазы,вставка суб-ч фрагмента может нарущить -его рамку считывани  и привести к изменению фенотипа, полезному дл  селекции рекомбинантов.

В качестве клетки-хоз ина при работе с вектором рМВ 123 удобно ис- попьзовать E.coli с делецией в начал гена й-галактозидазы, например, E.coli Lac Zm 15. Плазмида рМВ 123 благодар  й/-комплементации с -хромосомным геном LacZ сообщает таким бактериальным клеткам фенотип Lac, который при вставке субфрагмента об

6

1592

Цель изобретени  - создание вектора , позвол ющего получать клонируемые в нем фрагменты ДНК с произ- П зльными липки концами,

Сконструирован вектор рМВ 123, состо щий из EcoRl-PstI фрагмента ДНК вектора PVR 222 и полилинкера:

щей длиной Зп±1 п.о., либо если, внутри его находитс  ATG-кодон, содержа- щий Зп или Зп+1 п.о. от этого ATG- кодона до 3 -конца субфрагмента, измен етс  на Lac7, что позвол ет легко отбирать колонии с рекомбинантными плазмидами (не окрашенные на индикаторной среде с X-Gal).

Пример 1. Химический синтез олиг онуклеотидов

GGATGAGGCG;

TG GACGCGTCАТС CTGCА;

GATCCGGGT CATCCAG;

GAATTCTGGATGACGCCG

;провод т твердофазным фосфотриэфирным методом. В качестве носител  используют модифицированный силохром. Наращивание олигонуклеотидной цепи провод т от 3 - к 5 -концу с помощью динуклеозиддифосфатных производных (MeO sTrNp (PhCl)Np(PhC) . Выделение целевого продукта после деблокировани  реакционной смеси провод т путем последовательных хроматографии на Lichrosorb PR 18 сначала в 0,1 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрилаI 15-40%. Затем раствор вьщеленного тритилолигонуклеотида упаривают досуха, раствор ют в 2,5мл 80%-ной водной уксусной кислоте и .выдерживают при комнатной температуре 45 мин.. .Раствор упаривают досуха, раствор ют остаток в 1 мл дистиллиро ванной воды и хроматографируют -на Lichrosorb PR 18 в 0,05 М триэтиламмонийацетате в градиенте ацетонитрила 5-20%.

Конструирование целевой векторной ДНК рМВ 123 состоит из двух этапов. На первом этапе конструируют, промежуточную плазмидную ДНК рМВ 121.

5 ДНК плазмиды pNIMB гидроли- зуют совместно эндонуклеазамн рестрикции BamHI и EcoRl в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 (20 мМ трис-НС1, рН 7,8,10 мМ MgClj, 10 мМ 2-маркапто- этанол) и 100 мМ NaCl при 37°С 1 ч. Реакционную смесь после добавлени  5 мкл 0,4 М ЭДТА, рН 8,0 экстрагируют равным объемом водного фенола и цзо- амилового спирта. Затем к реакционной смеси добавл ют NaAc до концентрации 0,3 М, рН 7,0 и осаждают ДНК двум  объемами этанола. Полученный препарат вектора pNIMB раствор ют в 50 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС1, рН 7,8; 1 мМ ЭДТА).

К 5 мкл раствора вектора pNIMB добавл ют по 20 пмоль олигонуклеоти- дов (III и IV), 2 ед. ДНК-лигазы фа- га ТА в 30 мкл буфера 2 (20 мМ трис- НС1,- рН 7,5, 10 мМ MgCl, 10 мМ 2- маркаптоэтанол и 0,5 tM ATP).

Реакционную смесь вьщерживают 12 ч при 10°С,- затем используют дл  трансформации клеток E.coli ВМН 7118 Суспензию клеток после трансформации высевают на 1,5% LB агар, содержаршй 75 мкг/мп ампициплина и 50 мкг/мп I X-Gal.Чашки инкубируют 12 ч при 37°С, Из колоний, имек цих Lac фенотип, щелочным методом вьщел ют ДНК плазмиды рМВ 12t. Bspl и Fokl : гидролизаты полученной ДНК анализируют в 4% ПААГ. Клон, имеющий дополнительный Fok I- сайт в плазмидной ДНК, выращивают . в 100 мл среды, содержащий 50 мкг/мп апициллина, в течение 16 ч при 37 С на -качалке (200 об/мин). Кретки собирают центрифугированием (6000 об/мин 10 мин, 4°С), плазмидную ДНК рМВ 121 вьздел ют щелочным методом с после5CCCAGATCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAAGAAGTG; (V) 5GAAAATTTTTGATTTGTGCTAAATTCAGCACrrCTTCCAG (VI) 5ACrrACGTCCCCGTGACTTAATCTCCAATATCAACGTTAAT; (VII)

5CCTGTCGACCCTTCAGTTCCAGTACAATTACGTTGATA

Из полинуклеотидов V-VIII получают дуплексы дл  клонировани .

Реакционную смесь, содержащую по 100 пкмоль меченного -у-Р АТР поли- с нуклеотида (V) и фосфорилированного холодным АТР полинуклеотида (VI) в 100 мкл буфера 3 (60 i трис-НС1, 1рН 7,5j 10 Ш MgCli, Ш ЛI 2-меркаптолдующей дополнительной очисткой в градиенте гшотности CsCl.

5 мкг ДНК плазмиды рМВ 121 расщепл ют 10 ед. эндонуклеазы рестрикции PstI в 50 мкл раствора, содержащего буфер 1 и 50 мМ NaCl, 1 ч при 37 С. Затем к реакционной смеси добавл ют NaCl до концентрации 150 tM, 2-меркаптоэтанол до 20 мМ и 10 ед. эндонуклеазы рестрикции SalGI, выдерживают 1 ч при . Реакционную смесь после добавлени  6 мкл 0,4 М ЭДТА} рН 8,0 экстрагируют равным объ- емом,,водного фенола и изоамилового спирта. ДНК вектора рМВ 121 оса да- ют этанолом и раствор ют в 50 мп ТЕ- буфера.

5 мкл раствора ДНК плазмиды рМВ 121 отбирают дл  получени  вектора рМВ 123. К реакционной смеси добавл ют по 20 пкмоль олигонуклеотидов I и II, 2 ед. ДНК-лигазы:фага Т4 в 30 мкл буфера 2 и вьщерживают 12 ч при 10°С. Полученной лигаз ой смесью трансформируют клетки E.coii ВМН 7118. Из колоний (получение см.выше) имеющих Lac фенотип, вх чел ют плазмидную ДНК. После рестрикдаонного анализа с помощью Bspl и Fokl эндо- нуклеаз определ ют ее первичную структуру в районе встроенного полилинкера по методу Максама-Гилберта.

Пример 2. Получение субфраг мента ДНК, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствукицую 60-98 аминокислотам человеческого интерлейкина-2, -с заранее запланированными липкипи концами.

Описанным способом синтезируют и вьдел ют следук цие полинукпеотиды:

(VIII)

этанол), нагревают 10 мин при 50°С, охлаждают до 20°С, добавл ют dNTP до концентрации 250 мкм и 10 ед. ДНК-по- лимеразы 1 (фрагмент Кленова). Реак- 1ЩОННУЮ смесь инкубируют 30 мин при ,, добавл ют 10 мкл 0,4 М ЭДТА-, рИ 8,0 и экстрагируют водным фенолом. ДНК-дуплекс осаждают ацетоном, содер51

жащим 2% LiClO, промывают спиртома высушениьп1 осадок раствор ют в воде, Полученный дуплекс pacntennHror обработкой 200 ед эндонуклеазы Bgl II в 200 мкл буфера 2, содержащего 50 мМ NaCl, в течение 12 ч при 31°С Аналогично получают дуплекс из по- линуклеотидов (VII и VIII), которьй затем расщепл ют обработкой 500 ед. эндонуклеазы SalGI в 200 мкл буфера 2, содержащего 150 мМ NaCl, в течение 12 ч при 37°С. Оба рестрикта выдел ют с помощью гель-электрофореза в 8% ПААГ.

Реакционную смесь,, содержащую по 2 пмоль приготовле; ных дуплексов и 0,25 пмоль векторной ДНК, полученной из рМВ 123 совместным расщеплением эндонуклеазами рестрикдаи BamHI и SalGI (услови  см, выше), обрабатывают 2 ед, ЦНК-лигазы в описанных услови х. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli ВМН 7118 или IM 103 ДНК, вьщеленные

из колонийJ имеющих Las- фенотип5 гибридизуют с Р-мечеными зондами, полученными из полинуклеотидов (V и VIII). ДНК, гибридизуюпщес  с обоими зондами, дополнительно анализи- руют с помощью Bspl и EcoRI+PstI гидролиза..

Колонии, имеющие плазмиды pIL 912 со вставкой требуемого размераj вьфа щивают в 100 мл LB среды. Дл  полу- чени  целевого субфрагмента, коди-- рующего часть гена человеческого IL-2 с заранее запланированными липкими концами, 15 мкг ДНК плазмиды pIL 912 в 150 мкп буфера 1, содержа- щего 50 NaCl, обрабатывают 20 ед. эндонуклеазы регистрикции Fokl или Hgal при 37°С, Целевой фрагмент длиной 114 нуклеотидных пар вьщел ют с, помощью электрофореза в 6% ПААГ,-

Структура полученного фрагмента подтверждена методом Максама-Гилберта.

Пример 3. Контроль на конью гативность плазмиды рМВ 123.

Плазмидную ДНК рМВ-123 трасформи- руют по описанной методике в штамм E.coli ВМН 7118. Колонии, выросшие при 37 С за 16 ч на LB агаре с ампициллином (АР 50 кг/мл), пересевают в LB-среду с тем же антибио тиком.и раст т до плотности Ночную культуру штамма IM 103 засе.вают и раст т .в тех же услови х до плотности 596

, Культуры смешивают в равных объемах по 0,5 МП, инкубируют 1 ч при 37 с, покачива . После чего 100 мкп высевают на LB агар, содержащей антибиотики Ар (50 мкг/ мп) и Str (100 мкг/мл), и оставл ют на ночь при 37°С. Стерильность, на чашках сохран етс . Эффективность коньюгации меньше .

Таким образом, применение векторной пЯазмнды рМВ 123 дл  получени  субфрагментов с заранее запланированными липкими концами имеет существенные преимущества по сравнению с прототипом. Прежде всего конструкци  векторной ДНК рМБ 123, содержаща  между попарными сайтами эндонуклеаз рестрикции -Fokl и Hgal противоположной ориентации, набор сайтов дл  рестрик таз SalGI, AccI, Hinglll, I5amHI дает возможность клонировать фрагмент из нескольких частей и таким образом получать прот женные химически синтезированные последовательности ДНК, В примере 2 субфрагмент гена человеческого интерлейкина-2 получен из двух-дуплексов за одно клонирование. Получение этого же субфрагмента в плазмидах типа pBBv потребует трех клонирований. В этом случае необходимо проклонировать отдельно каждый из тупоконечных дуплексов, а затем после получени  липких концов осуществить сборку в субфрагмент в другом векторе. Применение рМВ 123 дл  получени  целевых последовательносте ДНК позвол ет уменьшить объем биохимической и генно-инженерной работы в несколько раз. Несомненным преимуществом  вл етс  использование при получении пвоизвольньк липких концов субфрагментов коммерчески доступных эндонуклеаз рестрикции Fokl и Hgal.

Векторна  плазмида рМВ 123, позвол юща  получать субфрагменты с заранее запланированными липкими концами находит применение при получении .генов и их фрагментов, ценных белков, конструировании регул торных элементов транскрипции и трансл ции.

Claims (2)

1. Вектор рМВ 123 дл  получени  фрагментов ДНК с, произвольными липкими концами смол массой 1,8 МД, содержащий -Ecorl-PstI фрагмент ДНК

плазмиды pVR 222 с репликоном плазми- ды pVR 222 геном В-лактамазы и частью модифицированного гена В-галактозида-

GGATGACGCGTCGACAAGGCTTGGATCCGCGTCATCCAG

ACGTCCTACTGCGCAGCTGTTCGAACCTAGGCGCAGTAGGTCTTAA

между попарными сайтами эндонукпеаз рестрикции Fokl и Hgal которого расположены сайты дл  эндонукпеаз рестрикции SalGI, AccI, Hingll, Hinglll и BanHI противоположной пол рности

фрагменты размером fl, 80, 100, .174, 257 (область полилинкера), 267, 290, 434, 457, 587 п.о., образукищес  после расщеп;1ени  эндонукпеазы Bspl;

фрагменты размером 26, 34, 67, 110, 147, 200, 242, 404, 420 (область полилинкера) 489, 500 п.о., образующиес  после расщеплени  эндонуклеазы ДНК,

фрагменты размером 8, 84, 181, 244, 287, 614, 1254 п.о., образующес  после,расщеплени  эндонуклеазы Fokl;

вставку субфрагмента дл  клонировани  по Sal, GI и BamHI-сайтам полилинкерной области;

ген В-лактомазы, определ ющий устойчивость к ампициплину; .

емкость не менее 622 n.o.j

- ью -

1446159«

зы Echerichia coli, синтетический полилинкер размером 38 п.о., имеющий структуру

штаммы-хоз ева: штаммы E.coli с LacZ /1М15 фенотипом.

2. Способ конструировани  вектора рМВ 123 дл  получени  фрагментов ДНК с произвольными липкими концами, заключй ющийс  в том,что ДНК pNIMB расщепл ют с помощью эндонукпеаз рестрикции EcoRI и BamHI, полученную векторную ДНК лигируют с синтетическими олигонуклеотидами GATCCGCGTCATCCAG H AATTCTGGATGAGGCG с помощью

ДНК-лигазы фага Т4, лйгазной смесью трансформируют клетки E.coli, из трансформанты, именлцих фенотип Lac, вьздел ют ДНК, расщепл ют эндонуклеа- зами рестрикции PstI и SalGI, выдел ют векторную ДНК, которую лигируют с синтетическими олигонукпеотидами GGATGACGCGTGGACGCGTCATCCTGCA с помощью ДНК-лигазы фага Т4, вновь трансформируют клетки E.coli, среди транс формантов, устойчивых к ампициллину и имеющих фенотип Lac, отбирают клоны, имеющие целевую первичную структуру ДНК в райЪне полилинкера плазмиды.