SU1165402A1 - Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга - Google Patents

Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга Download PDF

Info

Publication number
SU1165402A1
SU1165402A1 SU833645225A SU3645225A SU1165402A1 SU 1165402 A1 SU1165402 A1 SU 1165402A1 SU 833645225 A SU833645225 A SU 833645225A SU 3645225 A SU3645225 A SU 3645225A SU 1165402 A1 SU1165402 A1 SU 1165402A1
Authority
SU
USSR - Soviet Union
Prior art keywords
protein
units
activity
total
enzyme
Prior art date
Application number
SU833645225A
Other languages
English (en)
Inventor
Елена Михайловна Хватова
Алехандро ГАРСИЯ
Original Assignee
Горьковский государственный медицинский институт им.С.М.Кирова
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Горьковский государственный медицинский институт им.С.М.Кирова filed Critical Горьковский государственный медицинский институт им.С.М.Кирова
Priority to SU833645225A priority Critical patent/SU1165402A1/ru
Application granted granted Critical
Publication of SU1165402A1 publication Critical patent/SU1165402A1/ru

Links

Landscapes

  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГВДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, включанхЕЩй вмделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа и повышени  чистоты фермента, очистку фермента провод т с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию провод т при рН 3,9-6,1, а проьывку и десорбцию - фосфатным буферньш раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2. (Л

Description

1 Изобретение относитс  к биохимии и касаетс  способов получени  фер .мекта. малатдегидрогенаэы из митохонд рий jOjiosHoro мозга,. Известен способ получени  малатдеги .црогеиазы из ткани сердца, 1вклю чающий гомогенизирование ткани, отделение супернатакта высаливание сульфатом аммони  отделение ссадкй его перерастворениел диализ, хроматографию на колонке с карбоксиметил цел.п,Н1гюзой,, получение фракций с малатдеп-щрсгеназной активностью, диа лиз фракцш,, хроматографию на колон ке с сефа : ексом С j. Недостатками способа  вл ютс  его миогостадийностЬ; относительно низка  чистота целевого продукта низкий выход. Известен способ получени  малатдегндроген зы из митохондрий головного мозга5 включающий выделение ми тохондрий к очистку фермента с помощью ионообменной хроматеграфии 2 J К недостаткам известного способа относ тс  высока  трудоемкость и мно гостадийность продесса получени  це левого продукт и его низка  удельна  активность. Целью изобретени   вл етс  упрощение спссоба и повышение чистоты целевого продукта. Поставтдвнна  цель достигаетс  тем что при способе получени  малатдегидролсназы из митохондрий головного MO3raj включающем выделение митоходрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии j очистку фермента провод т с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию провод т при рН 599-6, i, а промьюку и десорбцик фосфатным буферным раствором последовательно при рК 5,,,2 6,3-6,7 и 6,,2„ Пример К Из головного мозга получают (-мтохондрии по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4900мг обща  активность 27440 ед, удельна  активность 5р6вд/мг белка. Фракцию митохондрий суспендируют в О.,7м сахарозе (рН 7,4) до концентрации 20 мг/мпо Затем провод т центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2г1,5 М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представл ет собой обогащенную фракцию митохондрий Общий белок 022 718 мг, обща  активность 7811 ед, удельна  активность - 11 ед/мг белка- . Митохондрии,, очищенные от миелина и синаптосом, суспендируют в 0,ОШ фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Полученньш гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин дл  полнего освобождени  раствора от митохондриальных мембран. Супернатант отдел ют от осадка, его общий белок 286 мг, обща  активность 6581 ед, удельна  активность 23 ед/мг белка. Довод т рН супернатанта до 5,9 0,1М сол ной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного -супернатанта , 115,2 мг, обща  активность 3918 ед, удельна  активность 34,ед/мг белка. Супернатант пропускают через стекл нную колонку, заполненную катионитом Биокарб (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4,09 см ), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку про1-1ывают водой до исчезновени  белка в промывных водах (контроль на белок осуществл ют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора при длине волны 280 и 260 им). Десорбцию провод т ступенчатым градиентом рН трем  0,1 М фосфатными бу ферами с рН 5,9; 6,3 и 6,8. Скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 5,9, затем 50 мл с рН 6,3 и наконец 120 мп с рН 6,8, На выходе из колонки отбираютс  фракции по 15 мл, в которых определ ютс  рН, концентраци  белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом), фракции с удельной активностью выше 1000 ед объедин ют . Объем активных фракций 76 МП, общий белок 1,23 мг, обща  активность 3087,3 ед, удельна  активность 2510 ед/мг белка. П р и М е р 2. Получают митохондрии из головного мозга по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4640 мг, обща  активность 269S2 ед, удельна  активность 5,8 ед/мг белка . Фракцшо : штoxoндpий суспендируют 0,7М раствором сахарозы
3
(рН 7,4) до концентрации 18 мг/мл и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы (О,7:1,2:1,5М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представл ет собой митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом . Общий белок 705 мг, обща  активность 8 460 ед, удельна  активность 12 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин дл  полного осаждени  митохондриальных мембран. Супернатант отдел ют, его общий белок 27S мг, обща  активность 6,325 ед, удельна  активность 23 ед/мг белка. Довод т рН супернатанта до 6,0 О,1Н сол ной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мкн дл  осаждени  выпавших в осадок белков. Общий белок полученного супернатанта 118,6 мг, обща  активность 3 795 ед, удельна  активность 32 ед/нг белка. Супернатант пропускают через колонку , заполненную сорбентом Био- карб (внутренний диаметр колонк.и 1,7 см, объем сорбента 3,9 см), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку промывают водой до исчезновени  в промывных водах белка (контроль на белок осуществл ют спектрометрическим методом).
Десорбцию провод т ступенчатым градиентом рН трем  О,1М фосфатными буферами с РН 6,0; 6,5 и 7,0, скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мп буфера с рН 6,0, затем 50 мл с рН 6,5 и наконец 90 мл с рН 7,0. На выходе из колонки отбирают фракции элюата по 15 мл в которых определ ют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом). Фракции с удельной активностью 1000 ед/мг белка и выше объедин ют. Общкй белок 1,22 мг, обща  активность 3080 еде удельна  активность 2524 ед/мг белка.
П р и м е р 3, Митохондрии из головного мозга быка получают по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4980 мг, обща  активность
654024
28386 ед, удельна  активность 5,7 ед/мг белка. Митохондрии суспендируют в 0,7 М сахарозе и центрифугируют в градиенте плотности 5 сахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при
60000 g в течение 2 ч. Осадок представл ет собой обогащенную митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок 10 723 мг, обща  активность 7953 ед, удельна  активность 11 ед/мг белка . Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогеf5 низаторе типа Блендор при
13000 об./мин в течении 5 мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин дл  осаждени  митохондриальных мембран, в дальнейшем работают с супернатантом. Общий белок 281 мг, обща  активность 5901 ед, удельна  активность 21 ед/мг белка. Довод т рН супернатанта до 6,1 0,1Н сол ной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного супернанта 123 мг, обща  активность 4059 ед, удельна  активность 33 ед/мг белка. 30 . Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом Виокарб (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4 см) со скоростью 88 мл/ч. По окончаНИИ сорбции колонку промывают водой до исчезновени  в промывных водах белка (контроль на белок осуществл ют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора 0 при длине волны 280 и 260 им).
Десорбцию провод т ступенчатым градиентом рН трем  О,Ш фосфатными буферами, с рН 6,2; 6,7;7,2. Скорость десорбции 44 мл/ч. Сначала 5 пропускают 50 мл буфера с рН 6,2, затем 50 мл с рК 6,7 и наконец 75 мл с рН 7,2, На выходе из колонки собирают фракции по 15 мл, в которых определ ют рН, концентрацию бел0 ка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и малатдегидро- геназную активность (спектрофотомет-. рическим методом). Фракции с удельной активностью выше чем 1000 ед/мг 5 белка объедин ют, их объем 60 мл. Общий белок 1,22 мг, обща  активность 2908 ед.удельна  активность 2384 ед/мг белка. 5 11654 Активность малатдегидpoгеназы определкют спектрофотометрическим ьктодом по изменению концентрации НАДН в 1 см кювете при длине волны 340 нм. Исследована реакци  окис-s лени  НАДН при рН среды 7,4. Заединицу активности прин то количество фермента, необходимое дл  окислени  10 моль НАДН в 1 мин. Полученный препарат не содержит10 посторонних дегидрогеназных активностей (глютаматдегидрогеназной, лактатдегидрогеназной). Проведенный электрофоретический анализ пре2g парата на гомогенность раствора показывает наличие в растворе двух белков, один из которых идентифицирован как малатдегидрогеназа. Продолжительность опыта с момента получени мозга до получени  фермента 3-4 дн , собственно на очистку фермента необходимо 9-11 ч. Таким образом, предлагаемьй споеоб высоко надежен, прост в исполнении , не требует дорогосто щего оборудовани  и реактивов, позвол ет получать фермент с удельной активностью 2400-2550 ед/мг белка.

Claims (1)

  1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, включающий ввделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чистоты фермента, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию проводят при pH 5,9-6,1, а проьывку и десорбцию - фосфатным буферным раствором последовательно при pH 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2.
    >
    \ .
    1 165402
SU833645225A 1983-09-21 1983-09-21 Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга SU1165402A1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU833645225A SU1165402A1 (ru) 1983-09-21 1983-09-21 Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU833645225A SU1165402A1 (ru) 1983-09-21 1983-09-21 Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SU1165402A1 true SU1165402A1 (ru) 1985-07-07

Family

ID=21082871

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU833645225A SU1165402A1 (ru) 1983-09-21 1983-09-21 Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга

Country Status (1)

Country Link
SU (1) SU1165402A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004073724A1 (fr) * 2003-02-19 2004-09-02 Nina Maksimovna Pinigina Composition pharmaceutique endogene, obtenue par une activation dirigee des mediateurs humoraux de terminaisons nerveuses du cortex

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
l.Glatthaar а. The: preparation of the cytoplasmic and mitohond rial forms of malatedehydrogenase and aspartate aminotransferase, fromr pig heart by a single;procedure- Analytical Biodumistry, 1974 vol.57, p.432-451. 2.Kashiwamata S., Niuwa F,, Katoh R., Higashida H., Malate dehydrogenase of fovine.cerebtum |inhihition by bilirubin,- Journal of Neurodumistry. 1975, vol.24, p.189-191. SU „„1165402 4(М) А 61 К 35/30// А 6i К 37/48 rv. *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004073724A1 (fr) * 2003-02-19 2004-09-02 Nina Maksimovna Pinigina Composition pharmaceutique endogene, obtenue par une activation dirigee des mediateurs humoraux de terminaisons nerveuses du cortex

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Schoenenberger et al. A naturally occurring delta-EEG enhancing nonapeptide in rabbits: X. Final isolation, characterization and activity test
SU946389A3 (ru) Способ получени тромбиноподобных ферментов
SU1165402A1 (ru) Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга
Sraer et al. Prostaglandin synthesis by glomeruli isolated from rats with glycerol-induced acute renal failure.
CN1289666C (zh) 基因重组蛋白血红素加氧酶的分离纯化的方法
CN1333294A (zh) 一种新的提取纯化羊胎素工艺和检测其生物活性的方法
US4308204A (en) Process for preparing the third component of the complement from human blood plasma
EP0383645B1 (fr) Procédé de fabrication du facteur antihémophilique (FVIIIc) ayant une très haute pureté.
PL85201B1 (ru)
RU1799599C (ru) Способ получени лектина
CN1088472C (zh) 沙蚕激酶及其提取方法和用途
JP2651942B2 (ja) 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法
SU1175965A1 (ru) Способ выделени урокиназы из биологических источников
Lundblad et al. Purification of cathepsin B from oocytes and mature eggs of the sea urchin Brissopsis lyrifera by means of gel filtration
Lin et al. Multiple forms of fumarase of pig heart
SU1108102A1 (ru) Способ получени пероксидазы
CN102242098A (zh) 一种来源于矛头蝮蛇毒凝血酶原激活物的提取方法
KR950012897B1 (ko) 스트렙토키나제와 스트렙토도르나제의 정제방법
SU1359298A1 (ru) Способ получени двух молекул рных форм карбоангидразы
SU1165713A1 (ru) Способ получени рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината
SU653265A1 (ru) Способ выделени гликозидаз
SU1643554A1 (ru) Способ получени авидина
SU1663024A1 (ru) Способ получени цитохрома С из дрожжей вида CaNDIDa VaLIDa
RU2175195C1 (ru) Способ выделения белковой фракции, обогащенной ангиогенином
SU890248A1 (ru) Способ выделени аутопротромбина с