SU1165402A1 - Способ получени малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГВДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, включанхЕЩй вмделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа и повышени  чистоты фермента, очистку фермента провод т с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию провод т при рН 3,9-6,1, а проьывку и десорбцию - фосфатным буферньш раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2. (Л

Description

1 Изобретение относитс  к биохимии и касаетс  способов получени  фер .мекта. малатдегидрогенаэы из митохонд рий jOjiosHoro мозга,. Известен способ получени  малатдеги .црогеиазы из ткани сердца, 1вклю чающий гомогенизирование ткани, отделение супернатакта высаливание сульфатом аммони  отделение ссадкй его перерастворениел диализ, хроматографию на колонке с карбоксиметил цел.п,Н1гюзой,, получение фракций с малатдеп-щрсгеназной активностью, диа лиз фракцш,, хроматографию на колон ке с сефа : ексом С j. Недостатками способа  вл ютс  его миогостадийностЬ; относительно низка  чистота целевого продукта низкий выход. Известен способ получени  малатдегндроген зы из митохондрий головного мозга5 включающий выделение ми тохондрий к очистку фермента с помощью ионообменной хроматеграфии 2 J К недостаткам известного способа относ тс  высока  трудоемкость и мно гостадийность продесса получени  це левого продукт и его низка  удельна  активность. Целью изобретени   вл етс  упрощение спссоба и повышение чистоты целевого продукта. Поставтдвнна  цель достигаетс  тем что при способе получени  малатдегидролсназы из митохондрий головного MO3raj включающем выделение митоходрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии j очистку фермента провод т с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию провод т при рН 599-6, i, а промьюку и десорбцик фосфатным буферным раствором последовательно при рК 5,,,2 6,3-6,7 и 6,,2„ Пример К Из головного мозга получают (-мтохондрии по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4900мг обща  активность 27440 ед, удельна  активность 5р6вд/мг белка. Фракцию митохондрий суспендируют в О.,7м сахарозе (рН 7,4) до концентрации 20 мг/мпо Затем провод т центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2г1,5 М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представл ет собой обогащенную фракцию митохондрий Общий белок 022 718 мг, обща  активность 7811 ед, удельна  активность - 11 ед/мг белка- . Митохондрии,, очищенные от миелина и синаптосом, суспендируют в 0,ОШ фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Полученньш гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин дл  полнего освобождени  раствора от митохондриальных мембран. Супернатант отдел ют от осадка, его общий белок 286 мг, обща  активность 6581 ед, удельна  активность 23 ед/мг белка. Довод т рН супернатанта до 5,9 0,1М сол ной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного -супернатанта , 115,2 мг, обща  активность 3918 ед, удельна  активность 34,ед/мг белка. Супернатант пропускают через стекл нную колонку, заполненную катионитом Биокарб (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4,09 см ), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку про1-1ывают водой до исчезновени  белка в промывных водах (контроль на белок осуществл ют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора при длине волны 280 и 260 им). Десорбцию провод т ступенчатым градиентом рН трем  0,1 М фосфатными бу ферами с рН 5,9; 6,3 и 6,8. Скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 5,9, затем 50 мл с рН 6,3 и наконец 120 мп с рН 6,8, На выходе из колонки отбираютс  фракции по 15 мл, в которых определ ютс  рН, концентраци  белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом), фракции с удельной активностью выше 1000 ед объедин ют . Объем активных фракций 76 МП, общий белок 1,23 мг, обща  активность 3087,3 ед, удельна  активность 2510 ед/мг белка. П р и М е р 2. Получают митохондрии из головного мозга по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4640 мг, обща  активность 269S2 ед, удельна  активность 5,8 ед/мг белка . Фракцшо : штoxoндpий суспендируют 0,7М раствором сахарозы

3

(рН 7,4) до концентрации 18 мг/мл и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы (О,7:1,2:1,5М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представл ет собой митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом . Общий белок 705 мг, обща  активность 8 460 ед, удельна  активность 12 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин дл  полного осаждени  митохондриальных мембран. Супернатант отдел ют, его общий белок 27S мг, обща  активность 6,325 ед, удельна  активность 23 ед/мг белка. Довод т рН супернатанта до 6,0 О,1Н сол ной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мкн дл  осаждени  выпавших в осадок белков. Общий белок полученного супернатанта 118,6 мг, обща  активность 3 795 ед, удельна  активность 32 ед/нг белка. Супернатант пропускают через колонку , заполненную сорбентом Био- карб (внутренний диаметр колонк.и 1,7 см, объем сорбента 3,9 см), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку промывают водой до исчезновени  в промывных водах белка (контроль на белок осуществл ют спектрометрическим методом).

Десорбцию провод т ступенчатым градиентом рН трем  О,1М фосфатными буферами с РН 6,0; 6,5 и 7,0, скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мп буфера с рН 6,0, затем 50 мл с рН 6,5 и наконец 90 мл с рН 7,0. На выходе из колонки отбирают фракции элюата по 15 мл в которых определ ют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом). Фракции с удельной активностью 1000 ед/мг белка и выше объедин ют. Общкй белок 1,22 мг, обща  активность 3080 еде удельна  активность 2524 ед/мг белка.

П р и м е р 3, Митохондрии из головного мозга быка получают по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4980 мг, обща  активность

654024

28386 ед, удельна  активность 5,7 ед/мг белка. Митохондрии суспендируют в 0,7 М сахарозе и центрифугируют в градиенте плотности 5 сахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при

60000 g в течение 2 ч. Осадок представл ет собой обогащенную митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок 10 723 мг, обща  активность 7953 ед, удельна  активность 11 ед/мг белка . Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогеf5 низаторе типа Блендор при

13000 об./мин в течении 5 мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин дл  осаждени  митохондриальных мембран, в дальнейшем работают с супернатантом. Общий белок 281 мг, обща  активность 5901 ед, удельна  активность 21 ед/мг белка. Довод т рН супернатанта до 6,1 0,1Н сол ной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного супернанта 123 мг, обща  активность 4059 ед, удельна  активность 33 ед/мг белка. 30 . Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом Виокарб (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4 см) со скоростью 88 мл/ч. По окончаНИИ сорбции колонку промывают водой до исчезновени  в промывных водах белка (контроль на белок осуществл ют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора 0 при длине волны 280 и 260 им).

Десорбцию провод т ступенчатым градиентом рН трем  О,Ш фосфатными буферами, с рН 6,2; 6,7;7,2. Скорость десорбции 44 мл/ч. Сначала 5 пропускают 50 мл буфера с рН 6,2, затем 50 мл с рК 6,7 и наконец 75 мл с рН 7,2, На выходе из колонки собирают фракции по 15 мл, в которых определ ют рН, концентрацию бел0 ка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и малатдегидро- геназную активность (спектрофотомет-. рическим методом). Фракции с удельной активностью выше чем 1000 ед/мг 5 белка объедин ют, их объем 60 мл. Общий белок 1,22 мг, обща  активность 2908 ед.удельна  активность 2384 ед/мг белка. 5 11654 Активность малатдегидpoгеназы определкют спектрофотометрическим ьктодом по изменению концентрации НАДН в 1 см кювете при длине волны 340 нм. Исследована реакци  окис-s лени  НАДН при рН среды 7,4. Заединицу активности прин то количество фермента, необходимое дл  окислени  10 моль НАДН в 1 мин. Полученный препарат не содержит10 посторонних дегидрогеназных активностей (глютаматдегидрогеназной, лактатдегидрогеназной). Проведенный электрофоретический анализ пре2g парата на гомогенность раствора показывает наличие в растворе двух белков, один из которых идентифицирован как малатдегидрогеназа. Продолжительность опыта с момента получени мозга до получени  фермента 3-4 дн , собственно на очистку фермента необходимо 9-11 ч. Таким образом, предлагаемьй споеоб высоко надежен, прост в исполнении , не требует дорогосто щего оборудовани  и реактивов, позвол ет получать фермент с удельной активностью 2400-2550 ед/мг белка.

Claims (1)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, включающий ввделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чистоты фермента, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию проводят при pH 5,9-6,1, а проьывку и десорбцию - фосфатным буферным раствором последовательно при pH 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2.

   >

   \ .

   1 165402