SU1165713A1 - Способ получени рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОЗО-JФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА путем.гомогенизации листьев в буфере, многократного фракционировани  сульфатом .аммони , диализа н ионообмен- I ной хроматографии на ДЗАЭ-целлкотозе, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  способа и повышени  выхода целевого продукта, в качестве буфера использзтот трис-HClj экстракт двзгкратно фракционируют сульфатом аммони  при насыщении 3767% , активную фракцию фермента прогревают , провод т диализ против дистиллированной воды -однократно в те- . чение 40 ч, вновь двукратно фракционируют сульфатом аммони  при насыщении 40-85%, а ионообменную хроматографию провод т однократно.

Description

а сд Kj

со

I. 1

Изобретение относитс  к производству ферментов, касаетс  технологии их получени , и может быть использовано дл  получени  рибозо-5-фосфата, а также при моделировании системы карбоксилирующей фазы фотосинтеза.

Цель изобретени  - упрощение способа и повышение выхода целевого продукта .

Пример. 100 г листьев шпината промывают охлажденной водой, затем дистиллированной водой и подсушивают с помощью фильтровальной бумаги . Приливают 100 мл 0,05 М трис-НС1 буфера рН 8,5и гомогенезируютв ступке или гомогенизаторе рт-1, полученный гомогенат фильтруют через четыре сло  марли. Добавл ют к нему твердый сульфат аммони  из расчета 23 г на 100 мл полученного гомогената. После растворени  сульфата аммони  гомогенат центрифугируют на центрифуге (любой ) при 8000 g в течение 25-30 мин. Полученньй осадок отбрасывают, а в супернатант добавл ют твердый сульфЬт аммони  из расчета 19 г на 100 мл супернатанта.

После растворени  сульфата аммони  помутневший супернатант вновь Центрифугируют при 8000 g в течение 2530 мин. Ползп1енньй супернатант отбра1сывают , а осадок раствор ют в дистиллированной воде из расчета 65 мл на 100 г вз тка листьев. Полученный раствор.(70 мп) прогревают на вод ной бане 95С 1-1,5 мин, чтобы температура раствора достигла 60°С и вьщерживают в течение 10 мин в бане . Затем быстро охлаждают в лед ной бане до +4С и центрифугируют при 8000 g в течение 20-25 мин на любой центрифуге. Полученньш осадок отбрасьшают, а супернатант диализуют в диализных мешках против 10-12 л дистиллированной воды (воду по 1,52 л мей ют 6-8 раз втечение 40 ч). Помутневший раствор насыщают твердым сульфатом аммони  .из расчета 29 г на 100 мл, затем центрифугируют при 8000 g в течение 25-30 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант

132

вновь насыщают сульфатом аммони  из расчета 32 г на 100 мл. Вновь центрфугируют при тех же услови х.

Полученный осадок раствор ют в минимальном (3-5 мл) объеме 0,02 М трис-НС1 буфера рИ 8-8,5 и обессоливают , использу  диализ против 0,02 М трис-НС1 буфера рН 8,0 или, что лучше - обессоливают на колонке 1,5x25 см, заполненной сефадексом Q 50 и забуференной тем же буфером. Обессоленный белок нанос т на колонку с предварительно обработанной и забуференной ДЭАЭ-целлюлозой 0,02 М трис-НС рН 8,0. После св зывани  с целлюлозой пропускают градиент концентраций NaCl 0-0,5 М в том же буфере общим объемом 300 мл (на колонку 2,5x15 см Активные фракции по вл ютс  после прохождени  примерно 150 мл градиента . Все остальные фракции (примерно 150 мл) объедин ют и приливают к ним нacьш eнный раствор сульфата аммони  мл, предварит-ельно оттированный аммиачной водой до рН 7,5. Помутневший раствор центрифугируют. Полученный осадок - очищенна  рибозо-5-фосфат изомераза может быть растворена в буфере, обессолена и использована дл  дальнейщей работы (ее практического применени ). Выхо составл ет 1-2 мг.

В таблице представлены сравнителные данные дл  предлагаемого и известного способов.

Полученный ферментный препарат характеризуетс  электрофоретической однородностью в 5%, 7,5% и 10%-ном полиакриламидном гел х, имеет хара1 терную молекул рную массу в 53 000 дальтон и близкий аминокислотный состав к ферменту из табака.

Таким образом, предлагаемьй спос вьщелени  рибозо-5-фосфат изомеразы из листьев шпината позвол ет получать однородный высокоактивный ферментньй препарат со значительно меньшими затратами во времени и реактивах по сравнению с известным способом.

Количество затраченного

времени, ч

Количество очищенного

фермента на 100 г

листьев, мг

Электрофоретическа 

однородностьУдельна  активность,

нкат/мг белка

Количество растительного материала дл  получени  1 мг очищенного фермента г/листьев

2,1 раза

60,65

1,4

5,83 раза

1500

80

5 раз

Claims (1)

1. . СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОЗО-jФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ ИЗ ЛИСТЬЕВ ШПИНАТА путем гомогенизации листьев в буфере, многократного фракционирования сульфатом аммония, диализа и ионообмен- I ной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе, отличающийся тем, что,' с целью упрощения способа и повыше ния выхода целевого продукта, в качестве буфера используют трис-НС1; экстракт двукратно фракционируют сульфатом аммония при насыцении 3767%, активную фракцию фермента прогревают, проводят диализ против дистиллированной воды однократно в те- . чение 40 ч, вновь двукратно фракционируют сульфатом аммония при насыщении 40-85%, а ионообменную хроматографию ' _Λ проводят однократно. 5