SU1135431A3 - Способ выделени МВ-изоэнзима креатинкиназы из смеси ее изоэнзимов - Google Patents

Description

1 Изобретение касаетс  способа выделени  МВ изоэнзима крес тиккпназы () из смесн СК изоэнзимов, Известны трл изоэпзима креатникиназы , обозначаемые услоп ю: ММ найденный первоначально в скелетко-мьиаечной ткани, БВ - найденный перв начально ш мозговой ткани и МБ найденный первоначально в сердечной ткани. Наличие повыи ен1гьгх; уровней МБ- изоэнзима в сыворотке  в,п етс  показателем инфаркта NMOKapAa. Известен хроматограф гческий способ разделени  ММ, ВВ- и Ш-изоэнзкмов креатннкиназы путем коитш ткровани  смеси указанных нзоэнзимов (гомогенат ткани человека) с основной анионообменной смолой, представл ющей co6oii макропористьБ-i синтетический полимер (марка AGMP-1 выпускаетс  фирмой Био-Рзд Лабораториз , США), с использованием в качестве элюептов трис-И,С1 буфера с рН 8,2 и 6,9 1. Известен тшоке способ вг и7 еленп  Ш-изоэнзима креатинкииазы 1з смесн ее изоэнзимов путем контактиропа1и   указанной смеси с ионообменными сор бентом - диэтплам1 1озт1и;-за(:Г1генньп СЦП1ТЫМ дёкстраном (ДЭЛЭ-се адекс А-50) - при рН 7,5 с последующим элюированием градиентом NaCl от О до 0,5 М в 0,5 М трис-Н.С1 буфере рН 7,5 С23, В этих хроматограф11ческ х меГода первым элпируем1)П1 нзоэизимом  вл ет с  обычно преобладающий И-нзоэнзим Таким образом, известньй способ тре бует допол}П тельного времени и дополнитель ой стадии дд  выделени  . МВ-изоэнзима креатинкипазы, Цель изобретени  - упрощение про цесса, что достигаетс  за счет элюи ровани  МБ-изоэнзима в виде первой фракщ«1 из сло  ионообменной смолы, ускор   II упроща  анализ и дела  анализ СК-МВ более легко приспоЬабл ваем1лм дл  автоматизации. Указанна  цель достигаетс  спосо бом выделени  МВ-изоэизима креатикк назы из смеси ее изозизимов, предусматривающим контактирование указан ной смеси с ионообменным сорбентом с последуюощм элюированием, согласно кoтopo ry, в качестве сорбента используют смесь слабоосповного аии нообменной смолы - диэт шакмноэт лзамещенного сшитого декстрана и 31I слабо)ислСП KaiHOifvf;MiMiHCM с- .:ь, up еде тапл  юнгей с обог к арОок с;;-;. Cj дер жанргТй гсл мер на OCHOBR мр П-.-чой КИСЛРМ:) и Д :П ИНИЛбегЗО.ГТа S с :i :,06 ,4 н при соотношении смолы И() а эл -ои15овангге осупи С1 вл юг в H.ioкратной среде, В качестве сорбента спользу-;.: : смесь указанных смол при соотиоиеНИИ аиионообменпой смольт к катионообменнои 1:6, Вьгбор criecH смол и paanj/r-irJbie параметры элгоировани , такие как рН размер сло  смолва и образца, скорость элгонрова пи  и т.д.,  вл ютс  взаимозавкси1--ш1адг . В послед- пощем будут описан -. сггец.ифическне смолы и условтш . Поскольку определен выбор смеси смол ;7,п  слогц то ii отп-пзльный параметры элгоироваии  могут быть легко определены. Предпочтительной С - еп аииой смолой сло   вл етс  смесь ДЕМ -тамйщенпой СТШ-5ТОЙ декстранс)Бой аниогюобмеи с й смолы с 1сатионообме Г|ЮЙ смолой, v которой решетка акрилового полимера 3амещепа кислоТ| о 1 фуьл-сцгюиальной группой. Это а5-:ионообь;ениа  смола ,ЦЕМ Са(.1)едекс Л-25 п катионообмеипа  смола Бно-Рекс 70. При iipHTvifineHi-sH смесь  онообт сипых сноп: обычно погр 71саетс  и буфер рИ ,ол  смол ,4. При ншкнеь5 пределе рН и ВВ-изознзимн более легко задерлапзаютс  смолой. При верхнем пределе рН более легко элюнруетс  МВ изоэнзим, но также происходит некоторое э.нопроваггие БВ-пзоэнзима. Под изократпой средой подразумеваетс , что ионна  сила элюеита вода  лк раа - ичпьк буй;ер};ых растворов пе н:змеп етс  з процессе храчатограгри. Вид ионообмешюго сорбента, определенный выше и подготовлепньй к а анизу с помощью бух1)ера5 обеспечивает изократкута среду элгаировани , удельна  проводимость и значентте рН cticTet-gji опредап ют услови  сорбции и элш)дан, Способ ос дествл етс  следующим образом, ДЕ.АЕ-Сафедекс А-25 гидрат-фуетс  в )ере, предпочтительно в морфалинэтилсу/Пзфокислоте , доведенной до рН 6,0, в течение 48 ч, В конце этого периода рИ снова довод т до 6jO с помощью НС , F.Ho-.teKC 70 (100200 меш) (0,149-0.074 мм размер отверсти  по ASTM) гндратнруетс  в том же буфере, доведенном до рН 6,0 в течение того же периода времени, после чего рИ повторно довод т до 6,0 едким натрием. Тонкие частицы удал ют из обеих смол, один объе сло  Сефадекса добавл ют к шести объемам сло  Био-Рекс при спокойном перемешивании, которое продолжают 15 миHj рН доводитс  до 6,0. Слой смолы промывают трем  объемам буфера (по сравнению с объемом сло ) доведенного до рН 6,0. Смолу оставл  ют погруженной в буфере рН 6,0. В этих услови х элюентом, принен емь м дл  элюировани  СК-МБ из колонки,  вл етс  деиониз -фованна  вода. Эти услови   вл ютс  предпочтительными дл  приспособлени  метода разделени  к аналитической набивке, примен емой на автоматическом клиническом анализаторе (ЛКА), продаваемой фирмой ЕЙ Дюпон де Немур эид. KobfflaHii, При м ер 1. Колонки коллекторов анализатора АКА объемом 1,7 мл набивают смесью Био-Рекс 70 и Сефадекс А-25, приготовлеииой, как указано. Кажда  набивка приспособлена дл  приема одного образца объемом 0,34 мл, впрыскиваемым па смолу колонки. Образцы элюируют 2,0 шг деионизированной воды в реакционной камере насадки со скоростью 1,0 мл/мин. Присутствие креатиикиназы в элюен те определ етс  по модификации УФэпзиматического анализа, описанного Оливером И.Т Сз1 и Розалки С.Б. Д Скорость образовани  КАДИ , который поглощает при 340 нм, пропорциональна концентрации креатинкиназы.

Таблица 1 31 Эффективность хроматографического разделени  изоэнзиг ов может быть продемонстнрована следующим образом. Извлечение трех изознзимов креатинкииазы может быть определено путем измерени  их индивидуальной активности до и после элюировани  через колонку со слоем смешанной смолы. Источигасом изоэнзимов, примен емым дл  этих определений,  вл етс  человеческа  ткань. В табл. 1 представлено типичное извлечение изознзимов с применением колонки со слоем смешанной смолы, как указано. Пример 2, При применении той же смеси ионообменных смол и колонки такой же величины с образоваш ем 0,20 ьш и элюировашш колонки объемом 2,0 МП деионизированной воды со скоростью 0,5 мл/мин на сорбенте задерживаютс  почти ролностью CK-lIM и и СК-ВВ, тогда как злюируетс  только СКЧ-И-изоэнзим. Вли ние рН смолы на работу колонки со слоем из смешанной смолы в этих услови х показано в Ta6ji, 2. В табл. 3 дана зависимость результатов э/поции от соотношени  используемых смол. Как В1адио из табл. 3, наг болсе предпочтительным при выделении МВизоэнзима креатинкиназы  вл етс  соoTHomeiine анионообменной смолы к катионообменной 1 г 6, Изобретение позвол ет значительно упростить процесс выделени  МВ-изоэнзима из смеси изознзимов за счет выделени  МБ-изознзима первым из указанной смеси.

(ЗА 286 197 785

1

69

1

46

Изоэнэимы (в человеческой сывоКол онк а вес/о бъемI Коло н к л ротке)

107 297 124

84

241 13

283

95

Выделение

МВ-нзоэнзима i Ь:М--пнозпз - мэ (% загрузки I (% загрузки 90 МЕ/л)I 1000 МЕ/л)

:-L3 6 76

23

69

97 iOO

Claims (2)

1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ MB-ИЗОЭНЗИМА КРЕАТИНКИНАЗЫ ИЗ СМЕСИ ЕЕ ИЗОЭНЗИМОВ,' предусматривающий контактирование указанной смеси с ионообменным сорбентом с последующим элюированием, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сорбента используют смесь слабоосновной анионообменной смолы диэтиламиноэтил-замещенного сшитого декстрана и слабокислой катионообменной смолы, представляющей собой карбоксилсодержащий полимер на основе метакриловой кислоты и дивиннлбензола с pH 6,0-6,4 и при соотношении смол 1:(5-10), а элюирование § осуществляют в изократной среде.

2. Способ ло π.1, отличающийся тем, что, качестве сорбента используют смесь указанных смол при соотношении анионообменной смолы к катионообменной 1:6.

SU ,_т 1135431

I