SE431229B - Sett att separera isoenzymerna av kreatinkinas jemte testsats for separering - Google Patents

Description

7900648-2 2 föredragna blandhartset är en blandning av svagt basiskt anjonbytar- harts och ett svagt surt katjonbytarharts.

Det skall framhållas att valet av en hartsblandning och de olika elueringsparametrarna, såsom pH, hartsbädd- och provstorlek, elue- ringshastighet och liknande, beror av varandra. I efterföljande be- skrivning av föredragna utföringsformer andras specifika hartser och betingelser. Även om dessa parametrar är föredragna, innebär detta inte att andra kombinationer av hartser och hartsblandningar och elu- eringsparametrar ligger utanför uppfinningens ram. När man väl valt en speciell hartsblandning, kan de optimala elueringsparametrarna lätt bestämmas av fackmannen.

Den föredragna hartsblandningen enligt uppfinningen är en blandning av DEAE-substituerat, av tvärbundet dextran uppbyggt anjonbytarharts och ett katjonbytarharts, i vilket ett akrylpolymernätverk är.sub- stituerat med en sur funktionär grupp. Sådana hartser finns på mark- naden och anjonbytarhartset försäljes under varubeteckningen "DEAE- Sephadex® A-25" och katjonbytarhartset under varubeteckningen ?Bio- Rex 70". Ett volymförhållande av 5-10 sjunkstabiliserade bäddvolymer _ katjonbytarharts per sjunkstabiliserad bäddvolym anjonhatarharts föredras och allra helst ett volymförhâllande av ca 6:1.

Färdiga satser som innehåller hartsblandningarna av ovan angivet slag, isynnerhet satser, i vilka hartset är inpackat i förväg i kolonner, ligger också inom uppfinningens ram. Vid användning av hartsbland- ningen enligt uppfinningen är denna vanligen försatt med en buffert.

Föredraget pH-omrâde för de föredragna hartsblandningarna enligt upp- finningen är mellan ca 6,0 och ca 6,4. Vid ett lägre ändvärde av det- ta omrâde kvarhâlles CK-MM och CK-BB lättare av hartset. Vid ett hög- re ändvärde av detta pH-område elueras CK-MB effektivare men det sker även viss eluering av CK-BB. ökad utvinning av CK-MB och CK-BB erhålles ur kolonnen allteftersom satsstorleken ökar.

Enligt en föredragen metod att tillämpa uppfinningen framställes en blandhartsbädd på nedan beskrivet sätt. “DEAE-Sephadex® A-25" hydra- tiseras i en buffert, företrädesvis morfolinetylsulfonsyra inställd' på pH 6,0 under 48 timmar. I slutet av denna period justeras pH-vär- det till 6,0 med HCl. "Bio-Rex 70" (100-200 mesh) hydratiseras i sam- ma buffert som pH 6,0 under samma period, varefter pH-värdet justeras till 6,0 med natriumhydroxid. Fina partiklar avlägsnas från båda hartserna och en sjunkstabiliserad bäddvolym "Sephadex®" 7900648 -2 sättes till sex sjunstabiliserade bäddvolymer "Bio-Rex" under för- siktig,omröring. Denna omröring får fortsätta under 15 minuter och pH-värdet inställes på 6,0. Slutligen tvättas hartsbädden med tre bäddvolymer av bufferten inställd pâ pH 6,0. Hartset får stå nedsänkt i bufferten inställd på pH 6,0. Under dessa betingelser utgöres elu- eringsmedlet som används för att eluera CK-MB ur kolonnen av avjoni- serat vatten. Dessa betingelser föredras för att anpassa separations- tekniken till den testförpackning som användes i analysapparater av typen Automatic Clinical Analyzer försålda av E.I. du Pont de Nemours and Company.

Exempel I Kolonner i samlingsrör hörande till Automatid Clinical Analyzer av ovan beskrivet slag uppvisæmæ en volym av 1,7 ml förpackades med blandningen av "Bio-Rex 70" och “DEAE-Sephadex® A-25" framställd en- ligt ovan. Varje testförpackning anpassades för att kunna ta emot ett enkelt prov, 0,34 ml, insprutat på hartskolonnen. Proven eluerades med 2,0 ml avjoniserat vatten i reaktionskammaren till förpackningen med en hastighet av 1,0 ml/minut.

Närvaron av kreatinkinas i eluatet bestämdes genom en modifiering av den UV-enzymteknik som beskrivs av Oliver, I.T., Biochem J., §l, sid. 116 (1955) och Rosalki, S.B., J. Lab. Clin. Med., gg, sid. 696 (1967).

Hastigheten för bildning av NADH2, som absorberar vid 340 nm, är pro- 'portionell mot koncentrationen av kreatinkinas.

Oliver-Rosalkis metod kan ej skilja mellan CK-isoenzymerna men effek- tiviteten vid den kromatografiska separationen av isoenzymerna kan demonstreras enligt följande.

Utvinningen av de tre CK-isoenzymerna kan bestämmas genom att uppmä- ta deras individuella aktivitet före och efter elueringen genom ko- lonnen med bädden av hartsblandning. De isoenzymer som användes för att göra dessa bestämningar tas från människovävnad. I nedanstående tabell anges representativa värden på utvinningen av isoenzymer med användning av ovan beskrivna blandhartsbädd. 7900648-2 _ Tabell I (Kolonneluering av CK-isoenzymer) Aktüütet Aktrfiiet Gßmamqm (HVU ihflmm (EMU ihflmm mwümüg (i human-serum) före eluering efter eluerínq % MM 134 1 < 1% MB 286 196 69% MM 197 2 1% BB 785 361 46% Exempel II Med användning av samma blandning av jonbytarhartser och samma ko- lonnstorlek men med en provstorlek av 0,20 ml och eluering av ko- lonnen med 2,0 ml avjoniserat vatten i en takt av 0,5 ml/minut kvarhölls i huvudsak all CK-MM och CK-BB, medan endast CK-MB~iso- enzymer utvanns. Effekten av hartsets pH under dessa betingelser återges i nedanstående tabell.

CK-isoenzwn ü.hmmmr&nmm) MM MB BB (Kolonneluering av CK-isoenzymer) T ikdkmn före ehxafing 107 297 124 abell II Aktïwüêt HU/U i.koLmu1efiæx ehmnjng pH hos kolonnhartset 6,1 6,25 6,4 0 2 84- 120 241 183 0 13 95

Claims (7)

79-00648-2 Patentkrav

1. Sätt att separera isoenzymerna av kreatinkinas ur en blandning av isoenzymerna genom att bringa blandningen i kontakt med ett jonbytarharts och selektivt eluera iso- enzymerna ur hartset, k ä n n e t e c k n a t av att iso- enzymblandningen bringas i kontakt med en hartsbädd utgö- rande en blandning av anjonbytarharts och katjonbytarharts och att man som första fraktion eluerar MB-kreatinkinasisoen- zym.

2. Sätt enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att hartset är en blandning av svagt basiskt anjonbytarharts och ett svagt surtkatjonbytarharts.

3. Sätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att anjonbytarhartset är dietylaminoetylsubstituerad tvärbunden dextran och katjonbytarhartset är ett akrylpolymernätverk substituerat med en sur funktionär grupp.

4. Sätt enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t av att volymförhållandet katjonbytarharts till anjonbytarharts ligger mellan 5:1 och 10:1.

5. Sätt enligt krav 3, k ä n n e t e c k n a t av att volym- förhållandet katjonbytarharts till anjonbytarharts är ca 6:1.

6. Sätt enligt krav 4, k ä n n e t e c k n a t av att hartset är buffrat till ett pH mellan ca 6,0 och 6,4.

7. Testsats för separering av MB-kreatinkinasisoenzynur en bland- ning av kreatinkinasisoenzym enligt krav 1, k ä n n e t e c k - n a d av att den väsentligen består av en blandning av ett anjonbytarharts av typen dietylaminoetylsubstituerad tvär- bunden dextran och ett katjonbytarharts innefattande ett akrylpolymernätverk substituerat med en sur funktionell grupp, varvid volymförhâllandet katjonbytarharts till anjonbytar- harts ligger mellan 5:1 och 10:1. 7900648-2 Sammandrag Ett sätt vid analytisk separation av isoenzymerna av kreatinkinas ur en blandning därav medelst jonbyteskromatografi, varvid isoen- zymblandningen bringas i kontakt med en i en jonbytarkolonn place- rad hartsblandning, som består av ett anjonbytarharts och ett kat- jonbytarharts. Vid efterföljande eluering erhålles som första frak- tion MB-isoenzymet av kreatinkinas, medan övriga isoenzymer helt eller delvis kvarhålles. Likaledes en testsats för separering av nämnda enzym bestående av en blandning av ett anjonbytarharts, t.ex. av typen dietylaminoetylsubstituerad tvärbunden dextran och dett katjonbytarharts, tiex. av typen förnätad akrylpolymer uppvi- sande sura funktionella grupper, varvid volymförhâllandet katjon- bytarharts till anjonbytarharts ligger mellan 5:1 och 10:1.